Spektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS

Transkript

1 Spektroskopické é techniky a mikroskopie Spektroskopie metody zahrnující interakce mezi světlem (fotony) a hmotou (elektrony a protony v atomech a molekulách Typy spektroskopických metod IR NMR Elektron-spinová rezonance Cirkulární dichroismus Ramanova spektroskopie Fluorescence 1

2 Základní pojmy Lambert-Beerův zákon vlnová délka vlnočet transmitance absorbance optická hustota (OD) jednopaprskový přístroj jediná optická dráha, měří se zvlášť referenční a zvlášť měřený vzorek uspořádání dvoupaprskový přístroj oddělené dráhy pro referenční paprsek a pro vzorek detektory s diodovým polem rozklad světla až po průchodu vzorkem kdy lze čekat problémy???? Faktory ovlivňující absorpci ph ionty rozpouštědla konformace molekul Odchylky od ideálního chování polymerizace agregace elektrostatické interakce denaturace 2

3 nejčastější chyby nedostatečně nahřátá lampa špatně zvolená vlnová délka nesprávně zvolený slepý vzorek nesprávně zvolený standard chyby v ředění špinavé nebo poškrábané kyvety chybný výběr materiálu kyvety špatné umístění kyvety... nejčastější chyby kalibrační přímka neprochází nulou 55 y = 6,9948x - 2,1509 R 2 = 0, y = 6,9948x - 2,1509 R 2 = 0, y = 6,6875x R 2 = 0, y = 6,6875x R 2 = 0, nejčastější chyby kalibrační křivka není přímka y = 5,2657x R 2 = 0, y = 5,9423x R 2 = 0, y = 5,2657x R 2 = 0, y = 5,9423x R 2 = 0,

4 diferenční spektrofotometrie změna ve spektrálních vlastnostech při změně podmínek změna ph, teploty, přítomnost rozpouštědel, detergentů, denaturačního činidla,... diferenční spektrofotometrie teplotně perturbační diferenční spektra diferenční spektrofotometrie perturbace vlivem rozpouštědla 4

5 diferenční spektrofotometrie sledování disociace tyrosinových zbytků liší se absorpční maxima disociované a nedisociované formy maxima 193, 222 a 275 nm pro nedisociovanou formu a 200, 240 a 293 nm pro disociovanou formu absorpční koeficienty srovnatelné derivační spektrofotometrie 3 absorbance a její derivace deriv deriv deriv deriv vlnová délka (nm) 2nd derivative wavenumber (cm-1) Refraktometrie založené na rozdílech v indexu lomu měření pomocí lomu světla pro kapalné i pevné vzorky měření mezního úhlu pro měření koncentrací 5

6 Světelná mikroskopie zvýšení kontrastu barvení konkrétních sloučenin technika temného pole polarizační mikroskopie interferenční mikroskopie metoda fázového kontrastu Světelná mikroskopie mikroskopie v temném poli Světelná mikroskopie Světelná mikroskopie metoda fázového kontrastu 6

7 Světelná mikroskopie polarizační mikroskopie Světelná mikroskopie interferenční mikroskopie Světelná mikroskopie histologické barvení hematoxylin BAZICKÁ BARVIVA nukleové kyseliny, modré zbarvení methylenová modř kyselé mukopolysacharidy eosin oranž G kyselý fuchsin stříbro zlato KYSELÁ BARVIVA kolagen bazické části proteinů cytoplazmy POKOVOVÁNÍ neurony, černé zbarvení kolagen, hnědé zbarvení retikulární vlákna, černé zbarvení 7

8 Elektronová mikroskopie transmisní přímé pozorování a snímání obrazu Elektronová mikroskopie rastrovací nepřímé pozorování a snímání obrazu Elektronová mikroskopie příprava vzorku TEM ultratenké řezy ( nm) pro zvýšení kontrastu barvení nebo pokovení pozitivní / negativní barvení SEM potažení tenkou vrstvou kovu (20 30 nm) 8

9 Rastrovací elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie 9

10 Transmisní elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie Transmisní elektronová mikroskopie 10