UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Katedra farmakognosie. Kristýna Sojková. Kultury léčivých rostlin in vitro XI.

Transkript

1 UNIVERZITA KARLVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakognosie Kristýna Sojková Kultury léčivých rostlin in vitro XI. Diplomová práce Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc. ponent: Datum odevzdání: Počet stran: 62

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum: Podpis: 2

3 Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí mé diplomové práce Doc. PharmDr. Lence Tůmové, CSc. za odborné vedení diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat kolektivu Katedry farmakognosie za laskavý přístup při vypracování praktické části diplomové práce. 3

4 bsah bsah ÚVD CÍL PRÁCE TERETICKÁ ČÁST Explantátové kultury Dělení explantátových kultur Kultivační média Kultivace suspenzních kultur Vyuţití explantátových kultur Fyziologie stresu u rostlin Elicitace Elicitory abiotické Elicitory biotické Ionty kovů jako elicitory Stříbrné ionty stropestřec mariánský (Silybum marianum L. (Gaertn.)) Flavonolignany a terapeutické vyuţití Kručinka barvířská (Genista tinctoria L.) Isoflavonoidy a terapeutické vyuţití EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Pomůcky a přístroje Chemikálie Rostlinný materiál Ţivná média Ţivné médium dle Murashigeho a Skooga Ţivné médium dle Schenka a Hildebrandta Příprava elicitoru Kultivace suspenzních kultur Elicitace suspenzních kultur Stanovení obsahu Stanovení obsahu flavonolignanů Stanovení obsahu isoflavonoidů

5 4.8.3 Kalibrační křivky Statistické zpracování dat VÝSLEDKY Tabulky Grafy DISKUSE ZÁVĚR BIBLIGRAFIE ABSTRAKT

6 1 ÚVD Člověk jiţ na počátku svého vývoje docházel k poznatku, ţe některé rostliny můţe vyuţít jako potravu, některé k léčebným účelům, ale postupně objevoval i takové, které pro něho mohou být toxické. Na začátku vývoje lidstva se léčivé rostliny pouţívaly pouze v nezpracované podobě. Dokladem o prvopočátcích technologické úpravy rostlin svědčí Ebersův papyrus ze starého Egypta (1500 před n. l.), který uvádí seznam receptů na zpracování léčivých rostlin. V Evropě pak z tohoto seznamu vycházeli antičtí učenci. Velký význam pro rozšíření počtu léčivých rostlin měly zámořské objevy, kdy se do Evropy dostaly rostliny, které se uţívají dodnes (např. Cortex chinae). Zároveň sehrál velkou roli objev knihtisku, díky kterému se získané vědomosti mohly dále rozšiřovat. V té době byl nejrozšířenější knihou herbář botanika Petra ndřeje Mattthioliho. (1) Lidé si léčivých rostlin velmi váţili a mnohdy jim přisuzovali aţ čarovné účinky. (2) Současná lékařská věda zkoumá obsahové látky rostlin spolu s jejich mechanismy účinků a podle výsledků pak upřesňuje indikace při určitých nemocech. (2) Velký počet rostlinných látek je pro člověka nenahraditelný jako farmaka, a proto se hledají nové způsoby získávání těchto látek. Jedním z těchto způsobů jsou biotechnologické postupy. Výzkum explantátových kultur přináší řadu výhod v porovnání pěstování rostlin v podmínkách polní produkce. (3) Nevýhodou však je mnohdy nízká produkce obsahových látek při kultivaci in vitro. Ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů se pouţívá metoda elicitace, kdy působením stresorů rostlina zvýší tvorbu sekundárních metabolitů. (4) 6

7 2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je seznámit se s metodikou kultivace rostlin in vitro. Dále je cílem práce zjistit vliv působení abiotického elicitoru roztoku dusičnanu stříbrného ve třech koncentracích v různých časových intervalech na produkci sekundárních metabolitů v suspenzních kulturách rostlin ostropestřec mariánský (Silybum marianum L. (Gaertn.)) a kručinka barvířská (Genista tinctoria L.) a v ţivných médiích. 7

8 3 TERETICKÁ ČÁST 3.1 Explantátové kultury Podle Sikyty a Duška je definice explantátů následující: Jako explantáty se označují různé typy in vitro kultivovaných orgánů vyňatých z rostlin, jejich částí, meristematických pletiv, buněk, protoplastů a kalusů. Podstatou explantátových kultur je totipotence rostlinných buněk, coţ znamená, ţe kaţdá buňka obsahuje veškerý genetický materiál, ze kterého potom můţe vzniknout celá rostlina. Tato diferenciace vzniká díky tzv. diferenciační genové aktivitě, kdy jsou aktivovány nebo inaktivovány různé geny daného rostlinného druhu. (3, 5) Dělení explantátových kultur Podle anatomické struktury lze explantátové kultury rozdělit na: rgánové: Jedná se o orgánové systémy, orgány nebo jejich části, které jsou pěstovány v podmínkách in vitro tak, aby byla umoţněna jejich diferenciace a zachována jejich stavba a funkce Tkáňové (pletivové, kalusové): Jsou tvořeny různě soudrţnými, morfologicky dezorganizovanými mnohobuněčnými komplexy tkáně, které jsou kultivovány na polotuhých nebo pevných nosičích nasycených ţivnou půdou, výjimečně v tekutém médiu. Suspenzní: Jsou to volné buňky a buněčné shluky, které jsou společně pomnoţované, volně rozptýlené v tekutém ţivném médiu za stálého promíchávání a provzdušňování. Buněčné: Jedná se o volné jednotlivé a identifikovatelné buňky, které jsou pomnoţovány v tekutém nebo polotuhém médiu, případně na nosiči nasyceném půdou. Protoplastů: Jsou to kultury buněk, které jsou zbaveny buněčných stěn a obsah buňky je ohraničen pouze elastickou plasmalemou. (6) Kultivační média Pro rostlinné kultury pěstované in vitro je velmi důleţité sloţení kultivačního média, které má na vliv růst, vývoj a tvarové změny explantátových kultur. Ţivná média se liší podle účelu kultivace a podle toho, pro které druhy rostlin jsou určena. Nejčastěji pouţívaná jsou média, která připravili White (1963), Murashige a Skoog (MS, 1962), 8

9 Gamborg a spol. (B5, 1968), Gautheret (1942), Schenk a Hildebrandt (SH, 1968), Nitsch a Nitsch (1969) a Lloyd a McCown (1981). (5, 7) Kultivační média jsou tvořena třemi základními sloţkami: základní prvky a minerály, dodávané ve formě solí zdroj vázaného uhlíku, obvykle ve formě sacharosy organické sloučeniny ve formě vitamínů a aminokyselin (7) Sloţení kultivačních médií: (5, 7) Makroelementy: Mezi média, která obsahují vysoké mnoţství makroelementů, patří médium MS, SH a B5. Makroelementy jsou v ţivných mediích důleţité pro rostlinný růst a vývoj. Mezi makroelementy patří tyto prvky: dusík, fosfor, draslík, hořčík, vápník, síra. Dále se zde řadí i uhlík, který je však dodáván odděleně ve formě sacharosy. Jednotlivé rostlinné druhy poţadují pro svůj maximální růst různé koncentrace těchto prvků. Dusík se do média přidává ve formě nitrátů i ve formě amonných solí. Redukovaná forma je pro růst některých druhů nezbytná, ačkoli vysoké koncentrace amonných solí mohou být pro explantátové kultury toxické, protoţe dochází k vychytávání amonných iontů z média a tím k acidifikaci média. Redukované formy dusíku se do média dostávají také z aminokyselin. bvyklá koncentrace nitrátů v médiu je mm, amonných solí 2-20 mm. Jako optimální koncentrace draslíku se udává hodnota mm. Fosfor, hořčík, síra a vápník se dodávají do média v rozmezí koncentrací 1-3 mm. Fosfor je nejčastěji dodáván ve formě fosfátů amonných, sodných nebo draselných. Vyšší koncentrace fosfátů však mohou vést k precipitaci s prvky média a vytvořit tak nerozpustné fosfáty. Mikroelementy Nezbytnou součást ţivných médií tvoří tyto mikroelementy: ţelezo, mangan, zinek, bor, měď, molybden. Ve formě chelátových sloučenin se přidává ţelezo a zinek. Dalšími mikroelementy, které se do médií mohou dodávat, ale jejich obsah není pro růst rostlinné buňky nezbytný, jsou kobalt, jód, sodík a chlor. Koncentrace mědi a kobaltu v médiu je 0,1 µm, ţeleza a molybdenu 1 µm, jódu 5 µm, koncentrace zinku se pohybuje kolem 5-30 µm, manganu µm a boru µm. 9

10 Zdroj uhlíku Vzhledem k tomu, ţe schopnost fotosyntézy je u rostlinných explantátů velmi omezena, je nutno do ţivných médií sacharidy dodávat. Jako nejefektivnější se osvědčilo pouţívání sacharosy. Jedná se o levný, snadno dostupný a relativně stálý zdroj uhlíku a energie. ptimální koncentrace sacharosy v ţivném médiu je 2-3 %. Pokud je nutno sacharosu nahradit, pak se k tomuto účelu pouţívá glukosa nebo fruktosa. Vitamíny Vitamíny slouţí jako katalyzátory řady metabolických procesů. Jako nezbytné vitamíny při pěstování kultur in vitro jsou uváděny thiamin a myo-inositol. Pouţívaná koncentrace thiaminu je 0,1-10,0 mg/l a koncentrace myo-inositolu mg/l. Thiamin je důleţitý pro růst tkáňových kultur, myo-inositol pro stimulaci růstu. Další vitamíny uţ jsou přidávány hlavně z tradičních důvodů. Mezi ně patří např. kyselina nikotinová, biotin, kyselina listová, kyselina pantotenová. Aminokyseliny Rostlinné kultury jsou schopny si aminokyseliny syntetizovat samy. Jejich přídavek však urychlí buněčný růst. Velmi často se do médií přidává kasein hydrolyzát, coţ je směs několika aminokyselin. bvyklá koncentrace kasein hydrolyzátu se pohybuje kolem 0,05-0,1 %. Dále se do médií samostatně přidává L-glutamin, L-asparagin, glycin a adenin. Nedefinované sloţky médií Urychlit růst explantátových kultur mohou různé organické extrakty, mezi které patří např. sladový extrakt, pomerančové nebo rajčatové šťávy, kokosové mléko či extrakt z banánů. Jejich pouţití se však příliš nedoporučuje, protoţe nelze zaručit, ţe při jejich opakovaném podání bude sloţení těchto sloţek úplně stejné. Další látkou, která se do médií někdy přidává, je aktivní uhlí. Aktivní uhlí ovlivňuje explantátové kultury jak stimulačně tak inhibičně. Stimulační vliv je způsoben vychytáváním toxických fenolových látek, které explantáty produkují. Inhibiční vliv je vyvolán absopcí růstových regulátorů aktivním uhlím. Aktivní uhlí také způsobuje ztmavnutí média. Pokud se přidává do média, tak je to v koncentraci 0,5-3,0 %. 10

11 Látky zpevňující médium Podle typu explantátové kultury se volí typ média, které můţe být buď v tekuté nebo pevné formě. Ke zpevnění média se nejčastěji pouţívá agar, který je získáván z mořských řas. Mezi výhody agaru patří, ţe je stabilní za teplot, které se pouţívají ke kultivaci a nedochází k ţádným reakcím s médiem ani rostlinnými enzymy. bvyklá koncentrace agaru v médiu se pohybuje kolem 0,8-1,0 %. Pro přípravu tuhého média lze také pouţít syntetické látky agarosu, Phytagel nebo Gerlite. Jejich výhodou je, ţe hotové médium rychleji tuhne, je vysoce čisté, a tím lze snadněji detekovat kontaminaci média. Růstové regulátory (5, 7, 8) Růstové regulátory jsou důleţitou součástí ţivných médií, protoţe jejich přítomnost a vzájemný obsahový poměr určují směr vývoje rostlinných buněk. Nejčastěji se pouţívají rostlinné hormony nebo jejich syntetické analogy. Rostlinné regulátory se dělí do pěti skupin: auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová a ethylen. Auxiny Nejdůleţitější v přírodě se vyskytující auxin je β-indolyloctová kyselina (IAA). Její pouţití je omezeno z důvodu tepelné i světelné nestability, coţ se řeší vytvořením konjugátu s aminokyselinami L-alaninem nebo L-glycinem, které zvyšují stabilitu. Hlavním účinkem IAA je podpora prodluţovacího růstu. V praxi se pouţívají syntetické analogy, kterými jsou kyseliny 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D), indolylmáselná (IBA), naftyloctová (NAA), fenyloctová a fenylmáselná. Cytokininy Hlavním účinkem cytokininu je stimulace buněčného dělení spojená se zrychlenou syntézou DNA. Tento účinek se projevuje především za přítomnosti IAA. Důleţitý je vzájemný poměr auxinu a cytokininu v médiu. Pokud je poměr auxinu k cytokininu vysoký, tak dochází k iniciaci tvorby kořenů, embryogenezi. Při vyváţeném obsahu těchto růstových regulátorů se tvoří kalus. Pokud však je vzájemný poměr nízký, dochází k indukci tvorby adventivních či axilárních prýtů. Cytokininy jsou svou strukturou odvozené deriváty purinu. V přírodě se vyskytuje 11

12 zeatin a N-(2-isopentyl)adenin (2iP). Převáţně se však pouţívají syntetické látky furfurylaminopurin (kinetin) a benzylaminopurin (BAP). Gibereliny Gibereliny jsou diterpenické kyseliny, jejichţ nejdůleţitějším zástupcem je kyselina giberelová (GBA 3). Do kultivačních médií se přidává, aby stimulovala růst explantátů, pokud je suspenzní kultura nedostatečně hustá a také, aby podporovala tvorbu kalusu. Kyselina abscisová Kyselina abscisová (ABA) patří svou chemickou strukturou mezi seskviterpeny. V přírodě je přirozeným inhibitorem. U explantátových kultur však záleţí na druhu rostliny, protoţe můţe jak stimulovat tak inhibovat růst kalusu. Ethylen Ethylen je přírodní regulátor zrání plodů. Jeho vyuţití v kultivaci explantátových kultur není rozšířené, spíš se jedná o problém. Některé explantátové kultury ethylen produkují, a tím zároveň inhibují svůj růst a vývoj kultury. Vhodným řešením je pak kultivace v nádobách s vhodným uzávěrem, který zajistí výměnu plynů s okolní atmosférou Kultivace suspenzních kultur Buněčné suspenzní kultury jsou tvořeny homogenní populací buněk nebo malými shluky buněk, které jsou kultivovány v tekutém ţivném médiu. Tento typ kultur se vyuţívá ke studiu procesů sekundárního metabolismu, genové exprese, indukce a izolace enzymů. (5) Buněčné suspenzní kultury se připravují z dostatečně narostlého kalusu. Výhodou je, pokud je kalus volně rozpadavý, poté vzniká homogenní suspenzní kultura. Velikost inokula nesmí být příliš velká, jelikoţ by došlo k úhynu kultury z důvodu uvolňování toxických produktů. (7) Kultivační nádoby jsou umístěny na roller nebo na třepačku, tím se zajistí, aby kultury byly kontinuálně provzdušňovány a vyţivovány. Zároveň je zabráněno tvorbě buněčných agregátů. (5) 12

13 3.1.4 Vyuţití explantátových kultur Uplatnění rostlinných explantátů je především v těchto oblastech: Získávání sekundárních metabolitů z rostlin, které probíhá za řízených podmínek bez závislosti na klimatu, ročním období nebo půdních poměrech. Zároveň produkty neobsahují ţádné kontaminující látky, které se v přírodě běţně vyskytují (mikroorganismy, hmyz, chemikálie). Usnadňuje se také selekce kultivarů, s vyšším obsahem sekundárních metabolitů. (9) Zisk obsahových látek z rostlin, které se obtíţně pěstují v podmínkách polní produkce. Izolace nových látek, které mateřské rostliny původně neobsahovaly. Produkce nových látek je způsobena změnami metabolismu rostlinných buněk explantátových kultur. Získávání produktů pomocí metody biotransformace. Explantátové kultury jsou schopny pomocí speciálních enzymů, které nelze chemickou cestou nahradit, z exogenně dodaných substrátů vytvořit farmaceuticky významné látky. Produkce rostlin metodou mikropropagace poskytuje řadu výhod. Mezi ně patří odvození kultur z malých částí rostlin, kultury prosté kontaminantů, přesně definované postupy in vitro zvyšující výnosy, nezávislost na ročním období, mnohem niţší nároky na prostor a průběţnou péči při pěstování in vitro proti tradičním metodám vegetativního mnoţení. Klonové rozmnoţování je procesem, kdy se izolovaný explantát, který se kultivuje in vitro, hromadně rozmnoţí bez ztráty genetické stability a poté se přenáší zpět do nesterilních půdních podmínek. (3) 3.2 Fyziologie stresu u rostlin Stres je stav fyziologické zátěţe organismu vyvolaný jedním nebo několika mimořádně nepříznivými vlivy, tzv. stresovými faktory neboli stresory. Pokud je stres dlouhodobý nebo velmi silný, můţe dojít k poškození aţ k úhynu rostliny. (10) Rostliny v porovnání se ţivočichy nemají moţnost před stresem uniknout. Proto, aby došlo k přeţití rostliny, musí na stresové faktory zareagovat. Mechanismy těchto obranných reakcí jsou různé, coţ vyplývá z široké mezidruhové variability a rozmanitosti vnitřního prostředí (buněk, pletiv). Také je časté, ţe v přírodě působí na rostliny zároveň více stresorů. (11) 13

14 Reakce na stres lze rozdělit na tři typy. Stress avoidance je to schopnost vyhnout se stresu. Stresory mohou různým způsobem pronikat do vnitřního prostředí rostlin, protoţe se v tomto případně jedná většinou o dlouhodobý proces, proto si rostlina vytvoří svůj vlastní pasivní způsob ochrany. Pro jednotlivé rostlinné druhy je charakteristické např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, tvorba rezervoárů vody. Stress tolerance jedná se o mechanismus aktivní odolnosti, kdy se rostliny snaţí omezit nepříznivý vliv stresových faktorů aţ po jejich proniknutí k plazmatické membráně a do symplastu. Následuje sled procesů, které se nazývají stresová reakce. Její průběh závisí na adaptační schopnosti rostliny, kdy intenzita i délka působení stresoru a zároveň genetická vybavenost rostliny hrají zásadní roli. Stresová reakce má několik fází. Zahajuje ji poplachová fáze, která vzniká po začátku působení stresoru, kdy dojde k narušení buněčných struktur a funkcí. Následuje restituční fáze, ve které se mobilizují kompenzační mechanismy a dochází ke zvýšení odolnosti organismu. Pokud však působení stresoru je dlouhodobé a velmi intenzivní, začíná fáze vyčerpání. Nutno však dodat, ţe v kterékoli z těchto fází můţe dojít k úhynu rostliny, pokud je překročena hranice intenzity stresoru. Aklimace představuje pojem pro přechodné zvýšení odolnosti získané působením stresoru. (11) Zvýšení odolnosti po působení stresových faktorů probíhá těmito způsoby: tvorba stresových proteinů (molekulární chaperony, proteázy, ubikvitin) tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku tvorba stresových fytohormonů (kyselina abscisová, ethylen) tvorba osmoregulačních sloučenin (cukry, polyalkoholy, jednoduché dusíkaté látky. (11) 3.3 Elicitace Mnohdy je produkce sekundárních metabolitů explantátových kultur nedostatečná, proto se hledají metody, jak tvorbu obsahových látek zvýšit. Dobrých výsledků dosahuje metoda elicitace. Elicitace vyvolává u rostlinných buněk stresové 14

15 reakce, které následně vedou ke změnám transkripce genů kódujících enzymy, které ovlivňují biosyntézu sekundárních metabolitů. (12) Elicitor je specifický metabolit, který je uvolňován na počátku obranných reakcí po interakci buňky s patogenem. Elicitor musí být identifikován hostitelskou rostlinou. Elicitory mohou být exogenní, ty jsou vylučovány patogeny (např. polysacharidy, specifické enzymy, peptidy). Elicitory endogenní jsou tvořeny z narušených buněčných stěn patogena i hostitelské rostliny (např. oligomery chitinu, oligoglukany, glykoproteiny). (11) Nyní se termín elicitor pouţívá pro látky různého původu, které svými účinky ovlivňují produkci sekundárních metabolitů. Elicitory lze rozdělit na abiotické a biotické. K syntéze sekundárních metabolitů nestačí pouhá přítomnost elicitorů. Některé rostlinné druhy reagují na různé druhy elicitoru odlišně. Záleţí i na koncentraci elicitoru a době jeho působení na rostlinu. Uvádí se, ţe nejlepší dobou pro přidání elicitoru je exponenciální fáze růstu, protoţe enzymový systém rostliny je schopen dosáhnout nejvyšší produkce sekundárních látek. Bylo zjištěno, ţe i přítomnost růstových regulátorů v ţivném médiu ovlivňuje produkci sekundárních metabolitů. Příkladem mohou být buněčné kultury Daucus carota. Pokud v ţivném médiu nebyly obsaţeny auxiny, tak buňky na elicitaci vůbec nereagovaly. (4) Elicitory abiotické Abiotické elicitory nepochází ze ţivého organismu, dělí se na fyzikální a chemické. Mezi fyzikální elicitory patří: mechanické účinky větru, nadměrné záření (UV i viditelné), extrémní teploty (horko, chlad, mráz). Chemické elicitory jsou: nedostatek vody, nedostatek kyslíku, nedostatek ţivin v půdě, nadbytek iontů solí a vodíku v půdě, toxické kovy a organické látky v půdě, toxické plyny ve vzduchu. (11) Elicitory biotické Biotické elicitory pochází svým původem ze ţivého organismu. Stresorem mohou být herbivorní ţivočichové, kteří rostlinu spasou nebo svým pohybem poškodí, dalšími stresory jsou patogenní mikroorganismy (viry, mikrobi, houby), dále také vzájemné ovlivňování rostlin (alelopatie, parazitismus). (11) 15

16 3.4 Ionty kovů jako elicitory Těţké kovy mají v přírodě na rostliny inhibiční aţ toxický vliv. Do prostředí se dostávají především činností člověka a to např. ze spalování fosilních paliv, pouţíváním detergentů, v zemědělství pak ve formě umělých hnojiv a pesticidů. (11) Kovy jako arsen, rtuť a kadmium nemají v rostlině ţádné uplatnění, jejich přítomnost je pro rostlinu potencionálně toxická. Některé těţké kovy však mají nezastupitelné postavení ve fyziologických procesech rostlin. Mezi tyto mikroelementy patří zinek, rtuť a měď. Jejich mnoţství v organismu však nesmí být překročeno, protoţe pak dochází k toxickým účinkům, jako je inhibice transpirace a fotosyntézy, narušení metabolismu sacharidů, vyvolání oxidačního stresu. Všechny tyto změny vedou k ovlivnění vývoje a růstu rostlin. (13) Pokud těţké kovy vstoupí do rostlinné buňky, dochází k inaktivaci některých enzymů a redoxních systémů. Těţké kovy se nejčastěji kumulují v kořenové části rostlin. Dochází ke zpomalení růstu primárního kořene z důvodu inhibice dělení a dlouţivého růstu buněk. (11) Jako reakce na přítomnost toxických kovů se syntetizují stresové proteiny zejména odolnější izoenzymy, proteázy a ubikvitin. Ubikvitin je specifická molekula, která označuje poškozené proteiny. Takto označené proteiny jsou dále rozkládány proteázami na aminokyseliny, které se vyuţívají k syntéze nových proteinů. (11) Rostliny reagují na stres vyvolaný těţkými kovy tvorbou specifických sloučenin, polypeptidů s malou molekulovou hmotností, tzv. fytochelatinů. Fytochelatiny jsou svou strukturou příbuzné glutationu. Fytochelatiny jsou schopny navázat těţké kovy do chelátových komplexů, a tím hrají zásadní roli při inaktivaci těţkých kovů. Takto navázané komplexy putují do vakuoly, kde jsou inaktivovány vysokou koncentrací organických kyselin. Syntéza fytochelatinů probíhá vlastní biochemickou cestou, která je zahájena aţ po vstupu těţkých kovů do cytosolu. (11) Další reakcí na elicitaci těţkými kovy je zvýšení tvorby fenolických látek ve tkáních, ve kterých jsou obvykle přítomny pouze v malém mnoţství. (14) Při zkoumání vlivu hliníku na ultrastrukturu a antioxidační aktivitu v listech Camelia sinensis (L.) bylo zjištěno, ţe při nízkých koncentracích hliníku je listový antioxidační systém schopen vychytávat reaktivní kyslíkové radikály a dostatečně tak chránit rostlinu před poškozením. Při vyšších koncentracích hliníku (0,53 mm) 16

17 však byla narušena rovnováha mezi tvorbou a odbouráváním volných radikálů a v důsledku toho došlo k poškození struktury listu. (15) Další studie se zabývala oxidačním stresem vyvolaným kadmiem v rostlině ryza sativa L. Výsledky prokázaly, ţe zvýšená tvorba reaktivních kyslíkových radikálů můţe být regulována po přidání nitroprussidu sodného, který je zdrojem oxidu dusnatého. (16) Také Balaţová A. a kolektiv zkoumala vliv kadmia na produkci sanguinarinu. Pokus byl prováděn na buněčných kulturách Papaver somniferum L. bsah sanguinarinu se zvyšoval lineárně a při odběru po 72 hodinách byl jeho obsah 2,3-krát vyšší neţ v neelicitovaných kulturách. (17) V jiné studii byl porovnáván vliv mědi v různých koncentracích na variety Daucus carota L. (18) Pozitivní efekt na zvýšení produkce flavonoidů byl pozorován při elicitaci síranem měďnatým v buněčné kultuře Digitalis lanata. Maximální obsah flavonoidů (téměř 10-krát vyšší neţ u kontrolních vzorků) byl dosaţen působením roztoku o koncentraci 40 µm při odběru po 24 hodinách. (19) Vliv zinečnatých iontů byl zkoumán na různé kultivary rajčat (Blizzard, Calypso, Liberto). U uvedených kultivarů byl pozorován maximální růst a výnos při působení koncentrací 0,5 mg/l. (14) Výsledky další studie dokazují, ţe největší akumulace diterpenoidu tanshinonu v buněčných kulturách Salvia miltiorrhiza byla zaznamenána po elicitaci ionty kovů stříbra a kadmia při koncentraci 25 µm. bsah celkového tanshinonu se 10-krát znásobil, obsah cryptotanshinonu byl zvýšen 30-krát v porovnání s kontrolními vzorky. Zároveň byla zkoumána i elicitace kobaltem. Kobalt však nezvyšoval produkci sekundárních metabolitů. (20) V suspenzní kultuře Gymnena sylvestre se zvýšila produkce saponinů po elicitaci solemi kovů Cd, Cu, Ag, Hg, Co, Ca. Nejvyššího obsahu bylo dosaţeno pouţitím chloridu kademnatého (koncentrace 0,2 mm) při odběru po 12 hodinách. Zatímco nejniţší obsah saponinů byl po elicitaci dusičnanem stříbrným (koncentrace 0,1 mm) při odběru po 48 hodinách. (21) Stříbrné ionty Stříbro se řadí mezi ušlechtilé kovy, je odolné vůči korozi a dříve bylo vyuţíváno k mincovním účelům. V přírodě se vyskytuje ve formě minerálů jako argentit Ag 2 S a chlorargyrit AgCl, kdy má oxidační číslo +I. (22) 17

18 Stříbro se jeví jako výhodný elicitor pro ovlivnění produkce sekundárních látek. (20) V následující odborné práci byl zkoumán vliv elicitace stříbrnými ionty na produkci flavonolignanů v suspenzní kultuře Silybum marianum L. (Gaertn). Koncentrace roztoků stříbra byly následující 0,2; 0,4; 0,8; 1; 2 mm. Nejvyšší obsah silymarinu byl zaznamenán po elicitaci roztokem o koncentraci 0,8 mm při odběru po 24 hodinách. bsah silymarinu se zvýšil 30-krát v porovnání s kontrolními vzorky. V nízkých koncentracích měla elicitace stříbrnými ionty positivní vliv i na růst buněk. (23) Khalili M. a kolektiv také pozorovali zvýšení produkce silymarinu v kořenové kultuře Silybum marianum L. (Gaertn.) působením stříbrných iontů. Tato studie zároveň srovnávala obsah sušiny elicitované a neelicitované kultury a zkoumala změny lipooxygenasové aktivity po elicitaci stříbrnými ionty. (24) Další studie se zabývala biosyntézou kyseliny lithospermové B a rosmarinové kyseliny kořenové kultuře Salvia miltiorrhiza. Elicitace stříbrnými ionty o koncentraci 15 µm značně zvýšila akumulaci kyseliny lithospermové B. bsah kyseliny rosmarinové nebyl zvýšen. Tato studie jako první informuje o tom, ţe kyselina rosmarinová je prekurzorem vedoucím k syntéze kyseliny lithospermové. (25) Na kořenové kultuře Salvia miltiorrhiza byl zkoumán synergický efekt biotických (kvasinky) a abiotických elicitorů (ionty stříbra, ionty kobaltu, α-aminoisobutyrová kyselina) na produkci tanshinonů. Nejvyšší produkce tanshinonu I byla zaznamenána při současné elicitaci ionty stříbra (300 µmol.l -1 ) a extraktem z kvasinek. bsah tanshinonu I byl zvýšen 14-krát v porovnání s kontrolními vzorky. Kombinace abiotického a biotického elicitoru má pozitivní vliv na zvýšení produkce sekundárních metabolitů. (26) Yan Q. a kolektiv zkoumali také vliv různých biotických a abiotických elicitorů v kořenové kultuře Salvia miltiorrhiza. Vliv abiotických elicitorů (ionty stříbra, kobaltu a izobutyrová kyselina) na produkci tanshinonů byl však niţší neţ u biotických. (27) Další studie se zabývala zvýšením obsahu tropanových alkaloidů v kořenové kultuře Anisodus acutangulus za pouţití tří elicitorů: ethanol, methyljasmonát a stříbrné ionty. Elicitací stříbrnými ionty byla zároveň zvýšena exprese putrescin N-methyltransferasy I. (28) V kořenové kultuře Catharantus roseus var. Nirmal byl sledován obsah indolových alkaloidů po elicitaci ionty mědi, stříbra, kadmia, hliníku a biotických 18

19 elicitorů. Nejvyšší produkce indolových alkaloidů byla zaznamenána po přidání iontů mědi a stříbra po 21 dnech od přidání elicitoru. (29) Vliv stříbrných iontů a putrescinu ve dvoufázové elicitaci zkoumal Chen W. H. a kolektiv. Zjistili, ţe přídavek stříbra do suspenzní kultury Cistanche deserticola zvyšuje obsah H 2 2 a aktivitu fenylalanin amonium-lyasy, coţ vede k větší produkci echinacosidů a acteosidů. (30) Také produkce flavonoidů v kalusové kultuře nonis arvensis L. byla zvýšena po elicitaci roztokem dusičnanu stříbrného. Nejvyššího obsahu flavonoidů bylo dosaţeno při pouţití koncentrace 0,5 mg/l. (31) Další studie se zabývala zvýšením obsahu sakuranetinu, který chrání rýţová pole před houbovým onemocněním způsobeným Pyricularia oryzae Cav. Nejvyšší obsah sakuranetinu byl zaznamenán po elicitaci 1% roztokem dusičnanu stříbrného po šesti týdnech elicitace. (32) V následující studii byla zkoumána elicitace dusičnanem stříbrným a glutationem suspenzní kultury Saussurea medusa. Bylo zjištěno, ţe produkce jaceosidinu a hispidulinu se zvýšila pouţitím těchto elicitorů. Vyššího obsahu však bylo dosaţeno, pokud byly oba dva elicitory pouţity zároveň. (33) Parsons J. a kolektiv zkoumali vliv různých elicitorů (také stříbrných iontů) na produkci solasodinu v kořenové kultuře Solanum eleagnifolium Cav. Ţádný z elicitorů však produkci solasodinu nezvyšoval. (34) 3.5 stropestřec mariánský (Silybum marianum L. (Gaertn.)) Popis: stropestřec mariánský je zástupcem čeledi hvězdnicovité (Asteraceae). Jedná se o jedno aţ dvouletou, statnou, bodlákovitou rostlinu. Silná, větvená lodyha můţe být vysoká i přes 1 metr. Listy jsou střídavé, objímavé, chobotnatě vykrajované, ostře zubaté, tuhé, lesklé, na ţilnatině bíle mramorované, ostnaté. Nachové květy vyrůstají na konci lodyhy a jejich větví. Báze květů je vejčitá, ostnatě zubatá. Plodem jsou lesklé, hnědě skvrnité naţky, které mají chmýří sloţené z chloupků, po stranách brvitých. Doba květu je od července do září. (2, 35) Výskyt: stropestřec pochází ze Středomoří. U nás se pěstuje jako léčivá rostlina, někdy však zplaňuje a poté se vyskytuje na návsích, rumištích, kamenitých stráních. (2, 35) 19

20 Droga: Drogou je chmýru zbavený zralý plod (Silybi mariani fructus). Plod je bez ţluklého zápachu a má hořkou chuť. Chmýřité hlavice se však sbírají těsně před dozráním, suší ve větraných prostorách a teprve aţ poté se vymlátí plody a zbaví chmýru. (2, 36) bsahové látky: Hlavní obsahovou látkou, která se v ostopestřeci nachází, jsou flavonolignany, tzv. silymarinový komplex. Poţadovaný obsah je nejméně 1,5 % silymarinu, vyjádřeno jako silybinin, počítáno na vysušenou drogu. Silymarin zahrnuje tyto sloţky silybin A, silybin B, silydianin, silychristin, isosilybin A, isosilybin B. Další látky, které rostlina obsahuje: flavonoid taxifolin a kvercetin, dále biogenní aminy tyramin a histamin, oleje s vyšším podílem nenasycených mastných kyselin, silice a hořčiny. (35, 36, 37) Pouţití: Droga má protektivní účinky na jaterní parenchym. Silymarin se vstřebává z gastrointestinálního traktu a rychle se vylučuje do ţluči. Tradiční je pouţití jako choleretikum, cholagogum a mírné spasmolytikum. (37) Hodí se i k zevnímu podání, a to při hemoroidech, křečových ţilách a bércových vředech. (2) 3.6 Flavonolignany a terapeutické vyuţití Jedná se o adiční sloučeniny flavanonolů s koniferylalkoholem. V ostropestřeci se nachází tzv. silymarinový komplex. (37) Následující studie se zabývala hodnocením účinku a bezpečnosti silymarinu u 55 osob, které se nakazily virem hepatitidy C. Pacientům bylo denně podáváno 630 mg silymarinu po dobu 24 týdnů. Výsledkem bylo zlepšení hladiny aminotransferas v séru, rovněţ došlo ke statisticky významnému zlepšení hodnot markerů jaterní fibrózy. Zároveň se u pacientů zlepšila kvalita ţivota. (38) Bylo provedeno několik studií na modelech in vitro i in vivo, podle kterých by silymarin mohl mít pozitivní účinek při léčbě rakoviny. (39) Das S. a kolektiv ve své studii zkoumali schopnost silymarinu chránit játra před akutní toxicitou paracetamolu při předávkování. Zjistili, ţe účinek samotného 20

21 silymarinu je nedostačující. Na modelech zvířat pak byly zkoušeny silymarinové nanočástice, které uţ chránily játra při intoxikaci dostatečně. Dokonce nedošlo ani k úhynu zvířete ani při koncentraci paracetamolu vyvolávající jaterní nekrózu. (40) V randomizované, dvojitě zaslepené studii byl zkoumán vliv extraktu ze semen Silybum marianum na jaterní a lipidové parametry. Biochemickou analýzou bylo prokázáno, ţe ve skupině muţů, kterým bylo po dobu 60 dnů podáváno 531 mg silymarinu, došlo ke sníţení hladiny cholesterolu v séru a zvýšení hladiny HDLcholesterolu v porovnání se skupinou uţívajících placebo. Proto se jeví extrakt silymarinu jako vhodný potravní doplněk při hypercholesterolémii. (41) Dále byla provedena studie, při které se prokázalo, ţe silymarin má místní fotoprotektivní účinky, proto by mohl být v budoucnu uţíván jako součást opalovacích krémů. (42) V následující studii byl zjišťován vliv silibininu (směs diastereoisomerů silybinu A a silybinu B) na metabolické dráhy, které jsou zodpovědné za udrţování glykémie, glykogenolýzu a glukoneogenezi. Při pokusech prováděných na krysích játrech se potvrdil antihyperglykemický účinek silibininu. (43) Účinky silymarinu jsou vyuţívány i v zemědělské produkci, kdy podání plodu ostropestřece v kombinaci s fosfatidylcholinem sniţuje projevy trávicích potíţí, které jsou způsobeny onemocněním jater. Toto je podáváno kuřicím pro zlepšení jejich růstu nebo pro sníţení stresových faktorů při ţivočišné produkci vepřového masa. (44) brázek č. 1: Chemická struktura taxifolinu a flavonolignanů obsaţených v Silybum marianum L. (Gaertn.) (45) H H H H H H H taxifolin 21

22 H H H H H H CH 3 H H H silybin A H H H H H H CH 3 H H H silybin B H H H H H H H CH 3 H H isosilybin A H H H H H H H CH 3 H H isosilybin B 22

23 H H H H 3 C H H H H H silychristin H H H CH 3 H H H H H isosilychristin H H 3 C H H H H H H H H H silydianin 23

24 3.7 Kručinka barvířská (Genista tinctoria L.) Popis: Kručinka barvířská patří do čeledi Bobovité (Fabaceae). Jedná se o půl metru vysoký polokeř, větve jsou krátké, husté, bez trnů. Listy jsou jednoduché, přisedlé, eliptické aţ kopinaté, na líci tmavozelené, na rubu světlejší barvy s brvami. Květy kručinky jsou zlatoţluté, vyrůstají ve vrcholových nebo latovitých hroznech. Plodem je úzce podlouhlý lusk, který obsahuje 6-10 semen. (2, 46) Výskyt: Kručinka barvířská je poměrně častá rostlina, roste na území Evropy i Asie. Typická stanoviště jsou světlé lesy, suché písečné louky, meze, křoviny a pastviny. (2, 47) Droga: Drogou je kvetoucí nať (Herba genistae tinctoriae), která se sbírá v době od května do srpna. Nať se odřeţe v polovině osy a poté se suší ve stínu. Pokud se suší za umělého tepla, nesmí být překročena teplota 35 C. V České republice se vyskytuje v šesti poddruzích, které se při sběru nerozlišují. (2, 46) bsahové látky: Hlavní účinné látky, které kručinka barvířská obsahuje, jsou isoflavonoidy a chinolizidinové alkaloidy. Pomocí HPLC byly nalezeny tyto flavonoidy a isoflavonoidy: genistein 7--diglukosid, puerarin, 2 hydroxygenistein 7--glukosid, daidzin, apigenin 7--glukosid, luteolin 7--glukosid, genistin, genistein 7--(6 malonyl)-glukosid, ononin, 4,7-dihydroxyisoflavan, daidzein, sissotrin, genistein, luteolin. Isoflavonoidy biochanin A a formononetin se metabolizují v trávicím traktu savců na genistein, resp. daidzein. Zástupci chinolizidinových alkaloidů, které se podařilo prokázat, jsou: cytisin, retamin, L-isospartein. V kalusové kultuře byl prokázán pouze retamin a spartein, v jiných zdrojích se uvádí i obsah anagyrinu a lupaninu. V nati se dále objevují silice, třísloviny a barviva. (2, 47) Pouţití: Droga má diuretický účinek díky obsahu flavonů a silic. Podává se ve formě nálevu. Doporučuje se při onemocněních močových cest a ledvin, také při otocích, srdeční nedostatečnosti či k podpoře látkové výměny. Dříve slouţila zároveň jako barvířská rostlina. (2, 47) 24

25 3.8 Isoflavonoidy a terapeutické vyuţití Základem chemické struktury isoflavonoidů je isoflavan jedná se o chroman substituovaný v poloze 3. (37) Podmínkou biologické aktivity isoflavonoidů je vazba fenylu na třetí uhlík. Při průchodu gastrointestinálním traktem dochází k metabolizaci střevními bakteriemi a biochanin A a formononetin se mění na genistein a daidzein. Daidzein se můţe dále přeměnit aţ na equol. (47) Různou mírou schopnosti metabolizace isoflavonoidů se zabývala následující studie. Porovnávala produkci S-equolu u ţen, které uţívaly potravinové doplňky s obsahem fytoestrogenů, a ţen, které uţívaly hormonální substituční terapii. Po vyhodnocení výsledků studie prokázala, ţe účinnost uţívání fytoestrogenů je jen o třetinu niţší neţ klasická hormonální terapie. (48) Mezi účinky isoflavonoidů patří účinek antivirotický, antimykotický, protizánětlivý, analgetický, ulceroprotektivní. (47) Dalším účinkem isoflavonoidů je jejich antioxidační aktivita. Ve studii, která porovnávala antioxidační aktivitu flavonoidu (apigenin) a isoflavonoidu (genistein) se prokázalo, ţe lepším antioxidantem je genistein. (49) Další studie se zabývala účinkem flavonoidů a isoflavonoidů při prevenci rakoviny u člověka i u zvířat. Jedná se především o nádory, které jsou hormonálně závislé, a to prsu, dělohy a prostaty. Získané výsledky však vyţadují další výzkum. (50, 51) Isoflavonoidy jsou strukturně i funkčně podobné endogenním estrogenům, proto působí agonisticky/antagonisticky na estrogenních receptorech. Estrogenní aktivita pozitivně působí u ţen při vyrovnávání se se symptomy menopauzy a působí preventivně při osteoporóze. (51) brázek č. 2: Chemická struktura isoflavonoidů obsaţených v Genista tinctoria L. (47) H H daidzein 25

26 H H H genistein CH 3 H formononetin H CH 3 H biochanin A H H H H H H genistin 26

27 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Pomůcky a přístroje Autokláv PS 20 A, Chirana, ČR Box s laminárním prouděním Fatran L-F, Výrobné druţstvo Pokrok, SR Germicidní lampa UVR-Mi, Biosan LtD, Lotyšsko Horkovzdušný sterilizátor SVS 9/1, Chirana, ČR Laboratorní analytické váhy PRLT A13, Sartorius, Německo Laboratorní třepačka Heidolph Promax 2020, Heidolph Instruments, Německo Mikrofiltry (0,45 μm), Tessek, ČR Mikrofiltry (0,20 μm), Corning NY 14831, Německo Kapalinový chromatograf: Autosampler Jasco AS-2055, Japonsko Diodový detektor Jasco MD-2015, Japonsko Čerpadlo Jasco PU-2089 Plus, Japonsko Fluorescentní detektor Jasco FP 2020 Plus, Japonsko Kolona LiChrospher RP-18, 250x4 (5µm), Merck, Německo Předkolona, Merck Darmstadt, Německo Termostat kolony Jetstream 2 Plus, Japonsko Těsnění na vialky, Labicom s.r.o. lomouc, ČR Vialky, Labicom s.r.o. lomouc, ČR 27

28 4.2 Chemikálie Ajatin plus roztok 10%, Profarma produkt s.r.o., ČR Destilovaná voda, Katedra analytické chemie, FaF UK v HK, ČR Dihydrogenfosforečnan amonný p.a., Lachema, ČR Dihydrogenfosforečnan draselný p.a., Lachema, ČR Dusičnan amonný p.a., Penta, ČR Dusičnan draselný p.a., Lachema, ČR Dusičnan stříbrný p.a., Lachema, ČR Edetan sodno - ţeleznatý p.a., Sigma Aldrich, USA Ethanol 96%, Penta, ČR Glycin p.a., Penta, ČR Hydrolyzát kaseinu, Imuna, SR Chelaton III p.a., Lachema, ČR Chlorid kobaltnatý hexahydrát, Fluka, Švýcarsko Chlorid vápenatý p.a., Penta, ČR Chlorid vápenatý hexahydrát p.a., Penta, ČR Jodid draselný p.a., Penta, ČR Kinetin, Serva, Německo Kyselina boritá p.a., Lachema, ČR Kyselina nikotinová, Sigma Aldrich, USA Molybdenan sodný dihydrát p.a., Penta, ČR Methanol 80%, Penta, ČR Myo inositol, Sigma Aldrich, USA Pyridoxin, Sigma Aldrich, USA Růstový stimulátor α NA, Sigma Aldrich, USA Sacharosa p.a., Lachema, ČR Síran hořečnatý p.a., Penta, ČR Síran hořečnatý p.a., Penta, ČR Síran manganatý monohydrát p.a., Lachema, ČR Síran měďnatý pentahydrát p.a., Lachema, ČR Síran zinečnatý heptahydrát p.a., Penta, ČR Síran ţeleznatý heptahydrát p.a., Lachema, ČR Standardy Biochanin-A p.a., Sigma Aldrich, USA 28

29 Daidzein p.a., Fluka, Švýcarsko Formononetin p.a., Fluka, Švýcarsko Genistein p.a., Sigma Aldrich, USA Genistin p.a., Fluka, Švýcarsko Silymarin p.a., Sigma Aldrich, USA Taxifolin p.a., Sigma Aldrich, USA Thiamin, Sigma Aldrich, USA Utračistá voda, Katedra analytické chemie, FaF UK v HK, ČR 2,4 D, Sigma Aldrich, USA 4.3 Rostlinný materiál Ve své diplomové práci jsem k pokusu pouţila suspenzní kultury Silybum marianum L. (Gaertn.) v pasáţi a suspenzní kultury Genista tinctoria L. v pasáţi Ţivná média Ke kultivaci suspenzní kultury Silybum marianum L. (Gaertn.) bylo pouţito ţivné médium podle Murashigeho a Skooga. Suspenzní kultury Genista tinctoria L. byly kultivovány na ţivném médiu Schenk Hildebrandta Ţivné médium dle Murashigeho a Skooga Suspenzní kultury Silybum marianum L. (Gaertn.) byly kultivovány na ţivném médiu dle Murashigeho a Skooga. Sloţení ţivného média dle Murashigeho a Skooga v mg/l: makroelementy: CaCl 2 332,50 KN ,00 MgS 4.7H 2 370,00 NH 4 N ,00 KH 2 P 4 170,00 mikroelementy: MnS 4.H 2 16,90 ZnS 4.7H 2 11,50 H 3 B 3 6,20 KI 0,83 CuS 4.5H 2 0,025 29

30 Na 2 Mo 4.2H 2 0,25 CoCl 2.6H 2 0,025 ţeleznatý komplex: FeS 4.7H 2 27,84 Na 2 EDTA 37,34 vitamíny: kyselina nikotinová 0,50 pyridoxin 0,50 thiamin 0,10 glycin 2,00 sacharosa 30000,00 myo-inositol 100,00 hydrolyzát kaseinu 1000,00 Jednotlivé substance byly odváţeny na analytických vahách a převedeny do odměrné baňky. Velmi malá mnoţství byla odebírána ze zásobních roztoků odpipetováním. Vše se rozpustilo v odměrné baňce na 1000,0 ml a doplnilo destilovanou vodou po rysku. Pro suspenzní kultury Silybum marianum L. (Gaertn.) se pouţilo 1 ml růstového regulátoru α-na (kyselina α-naftyloctová) o koncentraci 1g/100ml v ethanolu. Hotové ţivné médium se po promíchání rozlévalo po 30 ml do vysterilizovaných Erlenmayerových baněk. Kaţdá Erlenmayerova baňka s médiem byla překryta hliníkovou fólií a vysterilizována v autoklávu 20 minut (121 C, 100 kpa) Ţivné médium dle Schenka a Hildebrandta Suspenzní kultury Genista tinctoria L. byly kultivovány na ţivném médiu Schenka a Hildebrandta. Sloţení ţivného média dle Schenka a Hildebrandta v mg/l: makroelementy: CaCl 2 151,00 KN ,00 MgS 4 195,05 (NH 4 )H 2 P 4 300,00 mikroelementy: CaCl 2.6H 2 0,10 CuS 4.5H 2 0,20 FeNaEDTA 19,80 H 3 B 3 5,00 KI 1,00 MnS 4.H 2 10,00 30

31 Na 2 Mo 4.2H 2 0,10 ZnS 4.2H 2 1,00 vitamíny: kyselina nikotinová 5,00 pyridoxin 0,50 thiamin 5,00 sacharosa 30000,00 myo-inositol 1000,00 Jednotlivé substance byly odváţeny na analytických vahách a převedeny do odměrné baňky. Velmi malá mnoţství byla odebírána ze zásobních roztoků odpipetováním. Vše se rozpustilo v odměrné baňce na 1000,0 ml a doplnilo destilovanou vodou po rysku. Pro suspenzní kultury Genista tinctoria L. se pouţilo 0,5 ml růstového regulátoru 2,4-D (2,4 - dichlorfenoxyoctová kyselina) o koncentraci 0,025g/25ml v etanolu a 100 µl kinetinu o koncentraci 0,025g/25ml v etanolu. Hotové ţivné médium se po promíchání rozlévalo po 30 ml do vysterilizovaných Erlenmayerových baněk. Kaţdá Erlenmayerova baňka s médiem byla překryta hliníkovou fólií a vysterilizována v autoklávu 20 minut (121 C, 100 kpa). 4.5 Příprava elicitoru K elicitaci suspenzních kultur Silybum marianum L. (Gaertn.) a Genista tinctoria L. byl pouţit roztok dusičnanu stříbrného (AgN 3 ) ve třech koncentracích: 100mg/100ml, 10mg/100ml, 1mg/100ml. Roztok o koncentrace c 1 (100mg/100ml) byl připraven naváţením 100,0 mg dusičnanu stříbrného na analytických vahách a poté kvantitativním převedením do odměrné baňky na 100,0 ml a doplněním ultračistou vodou po rysku. Roztok dusičnanu stříbrného byl vysterilizován v autoklávu 20 minut (121 C, 100 kpa). Roztok o koncentraci c 2 (10mg/100ml) byl získán odpipetováním 10,0 ml roztoku c 1 do odměrné baňky na 100,0 ml a doplněním ultračistou vodou po rysku. dpipetováním 10,0 ml roztoku c 2 a doplněním ultračistou vodou po rysku ve 100,0 ml odměrné baňce byl připraven roztok o koncentraci c 3 (1mg/100ml). c 1 = 100 mg/100ml = 5, mol/l c 2 = 10 mg/100ml = 5, mol/l c 3 = 1mg/100ml = 5, mol/l Celá příprava roztoků dusičnanu stříbrného probíhala za podmínek aseptické práce v boxu s laminárním prouděním předem vysvíceného germicidní UV lampou. 31

32 Při přípravě elicitoru bylo pouţito sklo i nástroje vysterilizované v horkovzdušném sterilizátoru. 4.6 Kultivace suspenzních kultur Suspenzní kultura byla připravena z kalusové kultury mechanickým rozmělněním. Suspenzní kultura byla kultivována v Erlenmayerových baňkách se ţivným médiem překrytých hliníkovou fólií tři týdny na třepačce (120 otáček/ min.). Kultivace probíhala v kultivační místnosti při stálé teplotě 25 C a při střídání světelného reţimu (16 hodin světlo/ 8 hodin tma). 4.7 Elicitace suspenzních kultur Pokus byl prováděn se 30 baňkami se suspenzní kulturou. Baňky překryté hliníkovou fólií byly před přidáním elicitoru otřeny roztokem Ajatinu. Do kaţdé Erlenmayerovy baňky se suspenzní kulturou byl napipetován 1 ml roztoku elicitoru poţadované koncentrace. Přidávání elicitoru probíhalo v boxu s laminárním prouděním za pouţití vysterilizovaného skla. Po přidání roztoku elicitoru byly baňky umístěny na třepačku do kultivační místnosti. Po uplynutí stanoveného časového intervalu - 6, 12, 24, 48, 72, 168 hodin bylo odebráno 5 baněk, které byly zfiltrovány. Filtrační papír se zfiltrovanými shluky buněk byl vysušen za laboratorní teploty a uchován pro stanovení obsahu kapalinovou chromatografií. Zároveň byl v kaţdém časovém intervalu odebrán vzorek ţivného média. Celý postup byl opakován pro všechny tři koncentrace elicitoru (c 1, c 2, c 3 ). Dále byla provedena kontrola v čase 0 a 168 hodin. Ke kaţdému odběru kontrolních kultur bylo pouţito 5 baněk. Kontrolní vzorky byly kultivovány bez přídavku elicitoru. Místo elicitoru byl do suspenzních kultur napipetován 1 ml ultračisté vody. Další postup byl stejný jako u baněk s elicitovanou kulturou. 32

33 4.8 Stanovení obsahu Ke stanovení obsahu flavonolignanů a flavonoidu taxifolinu v suspenzní kultuře Silybum marianum L. (Gaertn.) byla pouţita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Rovněţ obsah isoflavonoidů v Genista tinctoria L. byl stanoven pomocí HPLC. Zároveň byl stanoven obsah sekundárních metabolitů v kontrolních vzorcích. Postup stanovení obsahu v kontrolních vzorcích byl analogický jako u vzorků elicitovaných. Metoda HPLC je velmi široce vyuţívaná separační metoda, protoţe umoţňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu jednotlivých sloţek směsi. (52) Principem HPLC je separace látek mezi stacionární fází, která je umístěna v koloně, a mobilní fází procházející kolonou. Dělení látek probíhá za vysokého tlaku. (53) Nutnou součástí kapalinového chromatografu jsou detektory, které určují citlivost a selektivitu analýzy. (52) Stanovení obsahu flavonolignanů Vzorky suspenzních kultur Silybum marianum L. (Gaertn.) byly po usušení rozmělněny v třecí misce, zváţeny a převedeny do varných baněk. Do baněk bylo přilito 10 ml methanolu 80% a následně probíhala extrakce pod zpětným chladičem po dobu 10 minut na vodní lázni. Celá extrakce byla znovu opakována a oba výluhy byly spojeny a doplněny v odměrné baňce na 20 ml methanolem 80%. Poté byl roztok zfiltrován přes mikrofiltr (0,45 µm) a 1,7 ml roztoku bylo převedeno do vialek a analyzováno metodou HPLC. Zároveň byla analyzována produkce sekundárních metabolitů do ţivného média. Náhodné vzorky média byly odpařeny na vodní lázni, rozpuštěny v 10 ml metanolu 80% a po filtraci převedeny do vialek. Stanovení obsahu probíhalo metodou HPLC. Stanovení obsahu flavonolignanů probíhalo na chromatografické sestavě Jasco, kterou tvořilo čerpadlo PU-2089, detektor MD-2015, autosampler AS-2055, předkolonový filtr a kolona LiChrospher RP x4 (5 µm) s ochrannou předklonkou. Průtoková rychlost byla 1,4 ml/min, teplota kolony 25 C, objem nástřiku 20 µl. K detekci byl pouţit DAD detektor v rozmezí vlnových délek nm. bsah píků byl vyhodnocen při vlnové délce 260 nm. 33

34 Eluce mobilní fáze probíhala nejprve gradientově, z 0% methanolu v čase t = 0 do 50% methanolu v čase t = 5 minut. Poté následovala isokratická eluce 50% methanolem do času t = 25 minut. Mobilní fáze obsahovala 0,15% kyseliny fosforečné. bsah byl zjištěn pomocí matematické metody normalizace a porovnáním s kalibrační křivkou vytvořenou metodou vnějšího standardu. Jako standard byl pouţit silymarin a taxifolin Stanovení obsahu isoflavonoidů Vzorky suspenzních kultur Genista tinctoria L. byly po usušení rozmělněny v třecí misce, zváţeny a převedeny do varných baněk. Ke kaţdému vzorku bylo přilito 10 ml methanolu 80% a následně probíhala extrakce pod zpětným chladičem po dobu 20 minut na vodní lázni. Poté se výluh zfiltroval přes chomáček vaty a extrakce probíhala ještě jednou stejným postupem. ba extrakty byly spojeny a doplněny methanolem 80% na 25 ml v odměrné baňce. Roztok byl zfiltrován přes mikrofiltr (0,20 µl) a 2 ml roztoku bylo převedeno do vialek a analyzováno metodou HPLC. Také byl stanoven obsah isoflavonoidů vylučovaných do ţivného média. Náhodné vzorky médií byly odpařeny na vodní lázni, rozpuštěny v methanolu 80%, zfitrovány a převedeny do vialek. Analyzovány byly pomocí HPLC. Stanovení obsahu isoflavonoidů probíhalo na stejné chromatografické sestavě Jasco jako u flavonolignanů. Průtoková rychlost byla 1,1 ml/min, teplota kolony 25 C, objem nástřiku 20 µl. K detekci byl pouţit DAD detektor v rozmezí vlnových délek nm. bsah píků byl vyhodnocen při vlnové délce 260 nm. Také byl pouţit fluorescenční detektor FP 2020 Plus. Vlnová délka excitačního záření byla 340 nm, vlnová délka emitovaného záření 470 nm. Eluce mobilní fáze probíhala nejprve gradientově, z 30% methanolu v čase t = 0 do 80% methanolu v čase t = 9 minut. Poté následovala isokratická eluce 80% methanolem do času t = 15 minut. Mobilní fáze obsahovala jako pufr 0,15% kyseliny fosforečné. Jako standard byl pouţit genistin, daidzein, genistein, formononetin, biochanin A Kalibrační křivky Kalibrační křivky jsou sestrojeny dle rovnice y = bx + a y plocha; x - koncentrace v mg/100ml; a = 0; b různé hodnoty pro sekundární metabolity 34

35 Kalibrační křivky flavonolignanů v Silybum marianum L. (Gaertn.) Kalibrační křivka taxifolin: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b = 3,264 Kalibrační křivka silychristin: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b = 3,270 Kalibrační křivka silydianin: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b = 3,282 35

36 Kalibrační křivka silybin A: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b= 3,266 Kalibrační křivka silybin B: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b = 3,270 Kalibrační křivka isosilybin A: regresní koeficient = 0,9999 a = 0 b = 3,277 36

37 Kalibrační křivka - isosilybin B: regresní koeficient = 0,9992 a = 0 b = 3,282 Kalibrační křivky isoflavonoidů pro Genista tinctoria L. Kalibrační křivka - genistin: regresní koeficient = 0,9998 a = 0 b = 6,089 37