KULTURY LÉČIVÝCH ROSTLIN IN VITRO VIII

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE KULTURY LÉČIVÝCH ROSTLIN IN VITRO VIII (diplomová práce) Datum zadání: Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jaroslav Dušek, CSc. Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc. Počet stran: 78 Oponent diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, PhD. Hradec Králové, 2010 Veronika Špandelová

2 Tento výstup vznikl v rámci projektu specifického vysokoškolského výzkumu PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně a veškeré zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 2

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji členům katedry farmakognosie za ochotu a poskytnutí materiálů a přístrojů pro tuto práci. Děkuji Doc. PharmDr. Lence Tůmové, CSc. za odborné vedení, cenné rady, připomínky a pomoc při sepisování této práce. 3

4 Obsah 1 Úvod Cíl práce Teoretická část Kultury in vitro Základní vlastnosti explantátových kultur Rozdělení kultur rostlinných explantátů Kalusová kultura Suspenzní kultura Složení kultivačního média Kultivace explantátových kultur Využití explantátových kultur Růstové regulátory Auxiny Cytokininy Gibereliny Kyselina abscisová Ethylen Fyziologie stresu Stresová reakce a stresové faktory Společné mechanismy stresových reakcí Biotické stresy Abiotické stresy Elicitace Pyraziny Substituované amidy pyrazin-2-karboxylové kyseliny Flavonoidy

5 3.6.1 Flavonolignany Silybum marianum Matečná rostlina Droga Obsahové látky Sklizeň, sušení Mechanismus účinku Použití a farmakologické účinky Experimentální část Biologický materiál Přístroje a vybavení Chemikálie a pomocné látky Složení a příprava živného média Pasážování a kultivace kultur Příprava roztoků elicitoru Elicitace kultur in vitro Stanovení obsahu flavonolignanů Statistické zpracování výsledků Výsledky Diskuze Závěr Seznam použitých zkratek Literatura Abstrakt Abstract

6 1 ÚVOD Sekundární metabolity rostlin jsou unikátním zdrojem látek pro farmacii, potravinářský a chemický průmysl (1). Obsah sekundárních metabolitů v rostlinách je většinou velmi nízký a díky složitosti těchto struktur je chemická syntéza často velmi obtížná (2). Řada rostlinných látek je pro člověka nenahraditelná jako farmaka a požadavky na tyto látky rychle stoupají. Proto kromě zemědělské produkce jsou středem zájmu jiné alternativní zdroje (3). Rostlinné tkáňové kultury představují nadějný zdroj látek přírodního původu (2). Rostliny musíme stále ještě považovat za dosud málo prozkoumanou zásobárnu farmaceutických látek. Rychlý rozvoj technik explantátových kultur dosáhl takové úrovně, že je možno seriozně, hodnotit jejich biotechlonogické aplikace pro výrobu farmaceuticky důležitých rostlinných produktů (3). 6

7 2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce bylo seznámit se s metodikou kultivace rostlinných kultur in vitro. Dále zjistit vliv nově syntetizovaných látek ze skupiny antituberkulotik na produkci flavonolignanů kalusovou a suspenzní kulturou Silybum marianum. Na základě stanovení obsahu flavonolignanů HPLC metodou zjistit, zda deriváty N- phenylpyrazin-2-carboxamidu v různých koncentracích jsou schopny ovlivnit produkci těchto obsahových látek. 7

8 3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Kultury in vitro Explantátové kultury rostlin znamenají aseptickou kultivaci izolovaných částí rostlin za umělých podmínek (4). Jako explantáty se označují různé typy in vitro kultivovaných orgánů vyňatých z rostlin, jejich částí, meristematických pletiv, buněk, protoplastů a kalusů. Explantátové kultury se využívají jak při šlechtění rostlin, tak při produkci rostlinných metabolitů (3). Rostlinné buňky kultivované in vitro se vyznačují na rozdíl od buněk živočišných totipotencí tj. schopnost obnovit v průběhu diferenciačních procesů specializované funkce a postupně regenerovat ve fertilní rostlinu. Totipotence umožňuje realizaci genetických změn vyvolaných v jednotlivých buňkách na úrovni celého organismu. I vysoce diferencované a specializované buňky si však uchovávají schopnost za určitých podmínek opět diferencovat a nabýt charakter meristematického pletiva s vysokou dělivostí (5). V rostlinném organismu je tedy totipotentní nejen zygota a meristematická buňka, ale i kterákoli jiná rostlinná buňka. Teoreticky je jakékoliv pletivo obsahující buňky s funkčním jádrem vhodné pro odvození explantátové kultury (4). Odvozovat tkáňové kultury lze několika způsoby. Jednak z povrchově sterilizovaných semen nebo z částí rostlin pěstovaných v nesterilních podmínkách (5). Explantátová kultura se získá z kterékoli části rostliny, nadzemní nebo podzemní, explantací parenchymatické tkáně, jejím přenesením na tuhou živnou půdu a inkubací v teplotním rozmezí 23 až 28 o C. Po nárůstu dostatečného množství buněk ve formě kalusu je možné je opakovaně přenášet na čerstvé živné půdy a udržovat tak získanou kulturu v aktivním stavu. Obsah růstových látek a vitamínů v živné půdě má rozhodující význam nejen pro růst kalusové kultury, ale i pro převádění kalusu do suspenzní kultury. Zejména rozpadavý kalus po přenesení do tekuté živné půdy zajišťuje homogenitu suspenzní kultury, která je pro další vývoj postupu nezbytná. Homogenní kultura v tomto případě znamená, že obsahuje kromě jednotlivých buněk i shluky dvou až několika buněk (3). 8

9 Obr. č. 1. Odvození explantátové kultury z rostliny (3) Základní vlastnosti explantátových kultur (5) Za základní vlastnosti kultur rostlinných explantátů lze obecně považovat tyto znaky: a) kultury, zejména tkáňové a suspenzní lze odvodit, až na nečetné výjimky, z kterékoliv rostlinné části b) explantáty eliminují korelační vztahy, existující ve výše organizovaném celku c) při odvozování kultur (ne vždy v orgánové kultuře) dochází v primárním explantátu k dediferenciaci d) základní prvky totipotence jsou zachovány e) realizované kultury jsou heterotrofní, i když byla pozorována určitá fotosyntetická aktivita Rozdělení kultur rostlinných explantátů (5) Podle morfologických kritérií lze rostlinné explantáty rozdělit na kultury orgánové, tkáňové (pletivové), suspenzní a buněčné: a) Orgánové kultury jsou složeny z orgánových systémů, jednotlivých orgánů nebo jejich částí. Buňky jsou diferencované, stavba a funkce orgánu jsou zachovány. b) Tkáňové kultury jsou morfologicky dezorganizované mnohobuněčné částečně soudržné shluky buněk tkáně. Rozmnožují se většinou na polotuhých nebo tuhých živných půdách. 9

10 c) Suspenzní kultury obsahují volné buňky i drobné buněčné shluky suspendované v tekuté živné půdě, jsou provzdušňovány a promíchávány. d) Buněčné kultury jsou jednotlivé volné buňky kultivované v tekuté nebo polotekuté půdě, v některých případech na nosiči nasyceném živnou půdou. e) Kultury buněčných protoplastů obsahují pouze nahé rostlinné protoplasty. Získávají se enzymatickým štěpením buněčných stěn v hypertonickém prostředí Kalusová kultura (4) Kalus představuje soubor nediferencovaných buněk. U většiny dvouděložných bylin je možné odvodit kalus z různých explantátů jako např. ze segmentu listů, stonků, kořenů, kousků zásobních orgánů, vzrostných vrcholů, embryí atd. U jednoděložných je výběr pletiv vhodných k odvození kalusů menší. Růst kalusu je ve většině případů indukován umístěním explantátu na médium s relativně vysokou koncentrací auxinu (1-10 mg/l) v přítomnosti nižší koncentrace cytokininu. Kalus může být použit k odvození suspenzní kultury v tekutém médiu po jeho umístění na třepačku Suspenzní kultura (4) Suspenzní kultury rostlin představují relativně homogenní populaci buněk nebo malých buněčných agregátů, které jsou kultivovány v pohybujícím se tekutém živném médiu. Buňky suspenze jsou v přímém kontaktu s živným médiem, takže jeho jednotlivé složky jsou jim rychle přístupné. Snadný přístup živin s dobrá výměna dýchacích plynů v pohybujícím se médiu umožňuje velmi rychlý růst buněčné suspenze. Tyto kultury se hojně využívají jako modelový systém při studiu procesů sekundárního metabolismu, indukci enzymů, genové exprese a jako výchozí materiál pro přípravu enzymů. Ideální buněčná suspenze je morfologicky a biochemicky homogenní. Při dlouhodobé kultivaci se však buněčná suspenze stává značně heterogenní. Heterogenita je způsobena genetickými změnami, které jsou v suspenzních kulturách poměrně časté. Ve staré buněčné suspenzi je možné např. kromě tvorby buněčných agregátů pozorovat i tvorbu protáhlých vakuolizovaných buněk, které se nedělí. 10

11 Ke kultivaci buněčných suspenzi se používají různé kultivační systémy. Pro všechny kultivační systémy je společné používání tekutých živných médií, která se pohybují. Pohybem média se dosahuje jeho aerace, zajišťuje se lepší přístup živin k jednotlivým buňkám a napomáhá se rozpadu buněčných shluků, které vznikají při dělení buněk. Pohyb média je zajišťován umístěním kultivačních nádob na roller nebo na třepačku. Růst buněčné suspenze je v porovnání s růstem kalusu na pevném médiu mnohem rychlejší Složení kultivačního média (4) Jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících růst a morfogenezi v tkáňových kulturách rostlin je složení kultivačního média. Média používaná jak pro kultivaci buněk, tak rostlinných pletiv či orgánů obsahují obvykle následující složky: mikroelementy, mikroelementy, vitamíny, aminokyseliny nebo další zdroj organického dusíku, sacharidy, další nedefinované organické složky, zpevňující látku a růstové regulátory. Chemické složení a fyzikální vlastnosti média musí odpovídat požadavkům rostliny v různých fázích rozmnožovacího cyklu. Existuje celá řada médií používaných pro různé druhy rostlin a pro různé účely kultivace. Mezi nejčastěji používaná média patří média, která popsali White (1963), Murashige a Skoog (1962), Gamborg a kol. (1968), Gautheret (1942), Shenk a Hildebrant (1968), Nitsch a Nitsch (1969) a Lloyd a McCown (1981). Makroelementy Makroelementy dodávané do kultivačních médií zahrnují šest nejdůležitějších prvků: dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík a síru. Optimální koncentrace každého prvku pro dosažení maximální růstové rychlosti je značně závislá na rostlinném druhu. Kultivační médium by mělo obsahovat přinejmenším mm anorganického dusíku. Dusík se do kultivačního média nejčastěji dodává ve formě dusičnanu draselného a dusičnanu amonného. 11

12 Draslík se do médií dodává ve formě dusičnanu nebo chloridu v koncentraci mm. Optimální koncentrace fosforu, hořčíku, síry a vápníku se pohybuje v rozsahu 1-3 mm. Mikroelementy Mezi mikroelementy nezbytné pro růst tkáňových kultur rostlin patří železo, mangan, zinek, bór, měď a molybden. Železo a zinek se obvykle do médií dodávají v chelátové formě. Do médií se také někdy dodává kobalt, jód, sodík a chlór, ale nemusí být pro růst explantátové kultury nezbytné. Měď a kobalt se obvykle dodávají do médií v koncentraci 0,1 µm, železo a molybden v koncentraci 1µM, jód 5µM, zinek 5-30µM, mangan µm a bór µM. Zdroj uhlíku a energie Jako nejčastější zdroj uhlíku a energie je používána sacharóza. V některých případech je možné sacharózu nahradit glukózou či fruktózou. Obvykle používaná koncentrace sacharózy v kultivačním médiu je 2-3%. Vitamíny Normální rostlina sama syntetizuje vitamíny nezbytné k jejímu růstu a vývoji. Vitamíny jsou pro rostlinu nezbytné jako katalyzátory řady metabolických procesů. Pro rostlinné buňky a pletiva kultivovaná in vitro mohou být některé vitamíny limitujícím faktorem jejich růstu. Mezi vitamíny nejčastěji používané v živných médiích patří thiamin, kyseliny nikotinová, pyridoxin a myo-inositol. Thiamin se používá obvykle v koncentraci 0,1-10,0 mg/l a je pro růst tkáňových kultur nepostradatelný. Kyselina nikotinová se používá v koncentraci 0,1-5,0 mg/l, pyridoxin v koncentraci 0,1-10,0 mg/l. Myo-inositol je sacharid, který nemusí být pro růst explantátů nezbytný, ale může tento růst stimulovat. V kultivačních médiích se používá v koncentraci mg/l. 12

13 V kultivačních médiích se někdy používají další vitamíny jako biotin, kyseliny listová, kyselina askorbová, kyselina pantotenová, riboflavin atd. Jejich přítomnost v médiích není většinou nezbytná. Aminokyseliny a další zdroje organického dusíku Přestože jsou kultivované rostlinné buňky schopny syntetizovat všechny nezbytné aminokyseliny, může přítomnost některých aminokyselin v živném médiu stimulovat růst explantátů. Aminokyseliny slouží buňkám jako bezprostřední zdroj dusíku, který je v organické formě využíván rychleji než ve formě anorganické. Dusík se v organické formě dodává do živných médií nejčastěji ve směsi aminokyselin (např. kasein hydrolyzát). Velmi často se používá také L-glutamin, L- asparagin, glycin a adenin. Kasein hydrolyzát se používá obvykle v koncentraci 0,05-0,1 %. Aminokyseliny mohou při vyšší koncentraci také inhibovat růst. Koncentrace aminokyseliny stimulující růst závisí na druhu aminokyseliny. Nejčastěji se používá koncentrace v rozsahu mg/l. Nedefinované organické složky médií Růst explantátové kultury je možné často stimulovat přidáním celé řady organických extraktů jako např. protein hydrolyzátu, kokosového mléka, kvasničného extraktu, sladového extraktu, extraktu z banánů, pomerančové či rajčatové šťávy. Nejčastěji se používá protein (kasein) hydrolyzát a kokosové mléko. Protein hydrolyzát v koncentraci 0,05-0,1% a kokosové mléko v koncentraci 5-20%. Do médií se také někdy přidává aktivní uhlí, které může mít jak stimulační, tak inhibiční efekt na růst explantátů. Používá se v koncentraci 0,5-3,0%. Látky používané pro zpevnění média Pro přípravu tuhých médií se nejčastěji používá agar. Agarové gely jsou stabilní při teplotách používaných ke kultivaci. Agar nereaguje s ostatními složkami média a není rozkládán rostlinnými enzymy. Obvykle se používá v koncentraci 0,8-1,0%. Vedle agaru je možné používat ke zpevnění média také agarózu, Phytagel a Gerlite, které představují syntetické látky. Phytagel a Gerlite se používají v koncentraci 13

14 1,25-2,5 g/l, rychle tuhnou a výsledný gel je velmi čistý a usnadňuje detekci případných kontaminací média. V případě, že není použito pevné médium, je možné explantáty fixovat na můstcích z filtračního papíru, polyuretanové pěně, čedičové vatě (rockwool), perforovaném celofánu atd. Růstové regulátory Viz. Kapitola Kultivace explantátových kultur (3) Volba vhodného kultivačního zařízení má pro přípravu explantátových kultur rostlinných buněk značný význam, neboť při kultivacích ve větších objemech se rostlinné buňky liší od mikrobních buněk zejména vysokou zdánlivou viskozitou buněčných suspenzí spojenou s citlivostí ke střižným silám v důsledku značného buněčného objemu. Při šetrném, avšak nedostatečném způsobu promíchavání explantátové kultury mohou být metabolické procesy limitovány kyslíkem a kromě toho vzniká trvalý třífázový systém v důsledku nadměrné sedimentace nebo flotace buněk. Vhodným zařízením jsou pomaloběžné rollery nebo plastikové vaky umístěné na pomaloběžném reciprokém třepacím stroji. Buněčný cyklus u explantátových kultur se pohybuje od 15 h výše. 14

15 3.1.7 Využití explantátových kultur Explantátové rostlinné kultury se uplatňují zejména jako (3): a) Alternativní příprava produktů získávaných dosud z rostlin v polní kultuře. Předností je možnost vést proces za řízených podmínek, bez závislosti na ročním období, na klimatických podmínkách a půdních poměrech. Výsledné produkty jsou po kvalitativní stránce homogenní, prosté kontaminujících zárodků, hmyzu a chemikálií používaných k ochraně kultur. b) Získávání produktů obsažených v nesnadno pěstovatelích rostlinách. c) Získávání nových látek v důsledku změn metabolismu explantátových rostlinných buněk. Z explantátových kultur byly izolovány látky, které nebyly zjištěny v mateřských rostlinách, z nichž byly kultury odvozeny. d) Produkty biotransformací, kdy z poměrně levných a dostupných substrátů lze získat farmaceuticky významné látky, protože příslušné enzymy se u mikroorganismů nevyskytují. Tkáňové kultury jsou využívány např. pro produkci kardioglykosidů (digoxin, lanatosid) používaných při léčbě srdečních onemocnění, alkaloidů-vinblastinu a vinkristinu při léčbě leukemie. Problémem zůstává však většinou nízký obsah produkovaných látek kombinovaný často s vyskytující se nestabilností produkce. Do stádia průmyslové výroby byly dotaženy zatím některé kultury-např. výroba shikoninu z kultury Lithospermum erythrorhizon, kde se získává 5x vyšší výtěžek oproti původní rostlině, nebo se využívá průmyslová fermentace buněk tabáku k získání ubichinonu a nikotinu (5). 15

16 3.2 Růstové regulátory Základní informace pro řízení růstu, diferenciace a morfogeneze je sice kódována v DNA každé rostlinné buňky, ale při koordinaci růstových procesů na úrovni rostliny je třeba sladit činnost jednotlivých souborů buněk, pletiv umístěných třeba na vzdálených částech rostliny. Tuto koordinaci zajišťují především jednoduché chemické látky, zvané rostlinné hormony fytohormony (5). Fytohormony jsou organické sloučeniny, syntetizované v určitých pletivech (částech) rostliny. Z místa vzniku jsou pak transportovány vodivými pletivy do jiných částí rostliny, kde ovlivňují různé fyziologické procesy. Neřadíme k nim tedy anorganické ionty přijímané z vnějšího prostředí ani organické metabolity ovlivňující růst např. sacharidy, aminokyseliny (5). Každá rostlina vytváří jak látky stimulující (promotory), tak i látky inhibující růst (nativní inhibitory) svých orgánů (6). Všechny tyto látky působí ve velmi malých tzv. fyziologických koncentracích. Pokud se ale stimulátory vyskytují ve vyšších koncentracích, mohou růst brzdit a naopak inhibitory ve velmi nízkých koncentracích mohou růst povzbuzovat. Růstové regulátory, které si rostlina sama syntetizuje, označujeme jako nativní (endogenní). Kromě toho se podařilo uměle vyrobit tzv. syntetické regulátory, které po exogenní aplikaci značně ovlivňují růst rostlin. Mohou působit opět stimulačně, nebo retardačně (brzdící účinek na růst) (5). Účinek fytohormonů je závislý na mnoha faktorech, např. vývojovém stavu příslušného orgánu, na interakcích s ostatními hormony a na dalších vnitřních a vnějších faktorech. Mechanismus účinku hormonů na cílovou buňku u rostlin bude zřejmě obdobný jako u živočichů, kde je tato problematika daleko více prozkoumána. I u rostlin se předpokládají dvě hlavní cesty působení fytohormonů: a) první cesta spočívá v proniknutí hormonu přes cytoplazmatickou membránu až do jádra, kde stimuluje transkripci a úpravy mrna. Ta se pak váže na ribozomy, dochází k syntéze bílkoviny-enzymu, katalyzujícího určitou reakci. Nelze ale vyloučit ani hormonální ovlivnění posttranslační modifikace enzymů mimo jádro. b) druhá cesta spočívá v navázání fytohormonu na specifický receptor (protein) přítomný v plazmatické membráně cílové buňky. Od tohoto 16

17 receptoru je signál uvnitř buňky přenášen určitými látkami zvanými mediátory (druhý posel, second messenger), které stimulují různé intracelulární děje (5). Nejdůležitější fytohormony, čili nativní růstové regulátory, se dělí v současné době do pěti skupin: auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselinu abscisová a etylen (5) Auxiny Auxin vzniká v primárních meristémech, hlavně ve vzrostném vrcholu stonku, v mladých listech, ale i v sekundárních meristémech, především v kambiu, které každoročně vytvoří nový přírůst dřeva (=letokruh) i lýka a obsahuje jej i felogen, produkující zelený feloderm a navenek druhotné krycí pletivo korek. Působení auxinu může být těsně vázáno především na fenolické látky a flavonoidy. Převládá u něj bazipetální pohyb (od vrcholu rostliny k bázi) a mnohokráte převyšuje pohyb akropetální (od kořene k vrcholu). Jeho transport specificky brzdí TIBA (6). Po dlouhá léta byl znám pouze jeden auxin - kyselina β-indolyloctová (Indole-3- acetic Acid - IAA). Je hlavní a nejdůležitější složkou růstových látek vzrostného vrcholu (dá se z nich izolovat). V rostlinách se syntetizuje z tryptofanu, přes kyselinu β- indolylpyrohroznovou, nebo přes tryptamin. Postupně byly objeveny i další nativní organické kyseliny s podobným účinkem, např. kyselina β-indolylmáselná a z neidolových auxinů, např. kyselina fenyloctová. Vedle toho je v rostlinách přítomna řada prekurzorů auxinů i produktů jejich rozpadu (5). O N H Obr. č. 2. Kyselina β-indolyloctová (6). HO Vedle nativních auxinů známe i několik uměle syntetizovaných kátek s podobným účinkem na rostliny jako auxiny. Mezi nejznámější patří kyseliny β- indolylmáselná (IBA), α -naftyloctová (NAA), 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) (5). 17

18 Pro růstové a morfogenetické pochody v rostlinách je důležitá určitá koncentrace auxinů (stimulační účinek mají koncentrace mol). Tato koncentrace závisí nejen na jejich syntéze, ale i na jejich degradaci. Při degradaci dochází obvykle ke ztrátě karboxylové skupiny, především enzymatickou oxidací IAA-peroxidázou (IAAoxidázou). Mimoto rostlina může koncentraci IAA kontrolovat i její inaktivací, tj. vazbou na některé organické látky, zejména cukry a aminokyseliny (např. glukózu, aspartát, glutamát). Z těchto vazeb se uvolňuje pomocí hydrolytických enzymů. Vázaná IAA se může skladovat v určitých částech rostliny, např. semenech a při klíčení dochází k rychlé aktivaci. Auxiny mění kyselost buněčné stěny zřejmě přes protonové pumpy, a tím je ph prostředí vhodné pro aktivitu enzymů potřebných pro její růst. Stimuluje (podněcuje) vznik adventivních kořenů i rašení pupenů. Vzniká i v oplozeném vajíčku a podněcuje vznik plodu (plod, který bazipetálně produkuje nejvíce auxinů, roste nejvíce). Na vzrostném vrcholu, kde auxin dosahuje vyšší koncentrace, plní vlastně funkci nativního inhibitoru tím, že brzdí růst postranních pupenů (6). Auxiny stimulují dlouživý růst buněk, zesilují mitotickou aktivitu pletiv, což se uplatňuje i při poranění pletiva, kdy stimulují tvorbu ochranné vrstvy zkorkovatělých buněk zacelujících ránu. Tento účinek se ale projevuje pouze za spolupůsobení cytokininů (5). V kultivačním médiu jsou používány především za účelem stimulace růstu kalusu a buněk, v některých případech k indukci tvorby prýtů a zejména kořenů, k indukci somatické embryogeneze a stimulaci růstu apikálních meristémů (4) Cytokininy Cytokininy indukují v přítomnosti auxinů buněčné dělení čili cytokinezi. Se stimulací dělení buněk je spjato urychlení tvorby DNA. Obecně lze říci, že cytokininy stimulují metabolismus rostlin, zvláště pak RNA a proteosyntézu. Proto zpomalují stárnutí buněk a zvyšují jejich odolnost proti nepříznivým činitelův prostředí (6). Cytokininy v nízkých dávkách urychlují klíčení dřevin, ruší dormanci pupenů a semen, zpomalují stárnutí listů, stimulují diferenciaci chloroplastů a syntézu chlorofylu, porušují apikální dominanci stonku (antagonista auxinu). V kořenech cytokininy působí rovněž opačně než auxin - potlačují zakládání adventivních a postranních kořenů. 18

19 Podporují tedy apikální dominanci hlavního kořenu. V kombinaci s IAA podporují zakořeňování a růst stonkových řízků (5). V současné době je známo asi 50 nativních cytokininů. Jako první byl objeven zeatin, který dostal název podle kukuřice, z jejichž nedozrálých obilek byl poprvé izolován. Dalšími nativními cytokininy jsou dihydrozeatin a izopentylaminopurin. Z chemického hlediska jsou všechny nativní cytokininy podobné. Jejich základní kostru tvoří adenin, na který jsou připojeny různé substituenty. Kromě toho se na každý z cytokininů může připojovat ribóza za vzniku nukleosidu a fosfát za vzniku nukleotidu. Ty jsou pak nejčastěji transportovanou formou cytokininů. Největší regulační účinky však mívají jen základní formy, označované jako volné báze. Z uměle připravovaných cytokininů jsou nejpoužívanější kinetin a benzylaminopurin (5). Někdy se mezi cytokininy řadí i tzv. biózy, které jsou důležité pro normální růst buněk rostlin. Řadíme mezi ně biotin (vitamín H), thiamin (vitamín B 1 ), kyselinu nikotinovou (vitamín PP) a kyselinu pantotenovou (vitamín B 5 ). Tyto látky jsou obsaženy v dělohách, pupenech a listech (5). Cytokininy se používají v kultivačních médiích za účelem stimulace buněčného dělení, k indukci tvorby prýtů a inhibici tvorby kořenů (4) Gibereliny Gibereliny jsou terpenoidní sloučeniny s charakteristickým giberelinovým skeletem (6). Nejznámější je kyselina giberelová (GA 3 ). V rostlině se nachází zpravidla více druhů giberelinů. Navzájem se liší počtem hydroxylů a dvojných vazeb (5). Obr. č. 3. Giberelinový skelet (7). 19

20 Gibereliny stimulují dělení buněk (zkrácením G 1 a S-fáze ) a hlavně jejich prodlužovací růst zvýšením roztažitelnosti buněčné stěny. Na rozdíl od auxinů tento účinek není spoje s okyselováním buněčné stěny, ale gibereliny brání reakcím, které ztužují buněčnou stěnu. Gibereliny mají rovněž důležitou roli při klíčení semen. Na počátku klíčení se uvolňují ze zásobních forem (konjugáty s glukózou), později jsou produkovány embryem. Stimulují tvorbu a vylučování hydrolytických enzymů a tím i rychlost uvolňování lehce rozložitelných cukrů (sacharózy) potřebných pro růst klíční rostlinky (5). Kyselina giberelová se přidává do média za účelem stimulace růstu buněčných kultur při nízké hustotě suspenze, ke stimulaci růstu kalusu a ke stimulaci růstu zakrslých rostlin (4) Kyselina abscisová Kyselina abscisová patří k terpenoidním inhibitorům. Vyskytuje se ve formě několika izomerů a fyziologicky aktivní je její S-izomer (6): H 3 C CH 3 CH 3 O OH CH 3 HO O Obr. č. 4. Kyselina abscisová (5). Nejvíce je ABA syntetizována v dospělých listech, uložena je v chloroplastech. Dále je syntetizována v plodech a vysokou aktivitu má i v kořenovém apexu (5). Mechanismus jejího působení lze rozdělit do tří hlavních oblastí (5): a) inhibice činnosti protonových pump v plazmalemě, dochází tak k poklesu gradientu H +, což je spojeno s pasivním výstupem K + z buněk, dochází k poklesu jejich turgoru. To vede i k zastavení dlouživého růstu buněk v meristémech. Účinek ABA je tak opačný než u auxinů. 20

21 b) celková inhibice syntézy proteinů, tudíž i enzymů (např. hydroláz v semenech). Tento mechanismus se uplatňuje zejména při navozování dormance. V tomto směru působí ABA antagonisticky s gibereliny. Inhibicí syntézy proteinů jsou urychlovány i procesy stárnutí buněk. c) aktivace a inaktivace některých genů, a to na úrovni transkripce. To umožňuje za stresových podmínek nahradit část stávajících proteinů novými, s výhodnějšími vlastnostmi - tzv. stresové proteiny. Kyselina abscisová brzdí prodlužovací růst rostlin, urychluje vstup rostliny do odpočinku. Důležitou úlohu hraje při dozrávání semen - brzdí předčasný růst embrya v nevyzrálých semenech a řídí tvorbu a ukládání některých látek. Nepřímo spolupůsobí na tvorbě oddělovací vrstvy mezi řapíkem a stonkem při opadu listů, květů, plodů. Podle současných poznatků má na tento mechanizmus vliv především IAA a etylen. Dále ABA inhibuje klíčení a kvetení dlouhodenních rostlin, a podporuje tvorbu hlíz u brambor (5). Kyselina abscisová se dodává do média za účelem stimulace i inhibice růstu kalusu v závislosti na rostlinném druhu, stimulaci proliferace prýtů a k inhibici pozdějších fází embryogeneze (4) Ethylen Po chemické stránce je ethylen nejjednodušším růstovým regulátorem (CH 2 =CH 2 ). U vyšších rostlin vzniká z methioninu. Je to plyn, snadno reaguje, oxiduje se (až na formaldehyd), reaguje s CO 2 a s některými těžkými kovy. Rozpouští se v cytoplazmě, kde byla zjištěna specifická vazebná místa pro ethylen. Antagonisticky na něj působí ionty Ag +. Působí ve velmi nízkých koncentracích a inhibuje dlouživý růst, zatímco stimuluje růst radiální (ve vazbě na reorganizaci mikrotubulů a mikrofibril celulózy ve směru longitudálního do radiálního). Inhibuje i růst kořenů. Uvolněn do prostředí, může ovlivnit rostliny ve svém okolí (6). Urychluje zrání plodů v důsledku zvýšení aktivity enzymů hydrolyzujících polysacharidy (celuláza, pektinázy). Ethylen může ale aktivovat tyto enzymy i v jiných orgánech, což vede k závažným důsledkům: degradace různých struktur, opad květů, plodů, listů atd. Působí na degradaci chlorofylu, stimuluje biosyntézu karotenoidů a biosyntézu kalózy ve floému (5). 21

22 Z uměle připravených etylenotvorných látek je nejznámější 2- chlorethylfosfonová kyselina (CEPA), která dovede uvolňovat ethylen do prostředí. Brzdí vegetativní růst a indikuje tvorbu květů a plodů. V pletivech rostlin brzdí transport auxinů (5). 22

23 3.3 Fyziologie stresu Stresová reakce a stresové faktory (7) Rostliny jsou během svého života vystaveny velmi proměnlivým podmínkám vnějšího prostředí. Ty mohou nejen zpomalovat jejich životní funkce, ale také poškozovat jednotlivé orgány a v krajním případě vést i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí závažně ohrožující rostlinu označujeme jako stresové faktory, čili stresory. Nejdůležitější stresové faktory, se kterými se rostliny setkávají v přírodě, můžeme rozdělit na: 1) Abiotické o fyzikální mechanické účinky větru nadměrné záření (UV, viditelné) extrémní teploty (horko, chlad, mráz) o chemické nedostatek vody (sucho) nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie) nedostatek živin v půdě nadbytek iontů solí a vodíku v půdě toxické kovy a organické látky v půdě toxické plyny ve vzduchu 2) Biotické o herbivorní živočichové (spásání, poranění) o patogenní mikroorganismy (viry, mikrobi, houby) o vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitismus) Stresové faktory, ať už abiotické či biotické, mohou pronikat do vnitřního prostředí rostlin různých druhů nestejně snadno, a to především v důsledku různě 23

24 vyvinutých ochranných struktur. Tento způsob ochrany má převážně pasivní a dlouhodobý charakter (např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn). Jde vlastně o schopnost vyhnout se stresu, ke které přispívají také vhodně načasované životní cykly. Z fyziologického hlediska jsou mnohem zajímavější mechanismy aktivní odolnosti omezující negativní dopad stresorů až po jejich proniknutí k plazmatické membráně buněk a do symplastu. V takovém případě dochází ke spuštění tzv. stresové reakce. Klasické schéma průběhu stresové reakce: 1. poplachová fáze - bezprostředně po začátku působení stresového faktoru dochází k narušení buněčných struktur a funkcí 2. restituční fáze - intenzita působení stresoru nepřekračuje letální úroveň, záhy dochází k mobilizaci kompenzačních mechanismů 3. fáze rezistence - kompenzační mechanismy směřují ke zvýšení odolnosti rostliny vůči působícím faktorům 4. fáze vyčerpání - zvýšení odolnosti nemá trvalý charakter. Při dlouhodobém a intenzivním působení stresového faktoru může být vystřídáno dalším poklesem Obr. č. 5. Idealizovaný průběh stresové reakce (7) 24

25 Základní schéma průběhu stresové reakce však nevypovídá vůbec nic o rozmanitosti vlastního působení stresorů ani o koordinaci složitého komplexu reakcí, kterými je podložena odpověď rostliny na jejich působení. Průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi, souhrnně nazývané jako adaptační schopnosti. Přechodné zvýšení odolnosti získané pod vlivem stresoru (aklimatizace), může být založeno jak na změnách pomíjivých (tvorba specifických metabolitů) tak i na změnách trvalejších (změny v tvorbě nových orgánů a v jejích nové struktuře). Studium stresu u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách je většinou komplikováno tím, že často více stresových faktorů působí současně (např. silné záření, vysoká teplota a nedostatek vody). Interakce mezi nimi mohou podstatně měnit charakter stresové reakce ve srovnání s působením každého faktoru odděleně. Působení stresorů bývá také často omezeno pouze na část rostliny (listy či kořeny), ve které dochází k lokální stresové reakci, ale ta může druhotně způsobovat stres i v ostatních orgánech Společné mechanismy stresových reakcí (7) K nejčastějším společným změnám, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresovým faktorům současně, patří: a) tvorba stresových proteinů b) tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku c) tvorba stresových fytohormonů (kyseliny abscisové, etylenu, kyseliny jasmonové, metyljasmonátu a polyamimů) d) tvorba osmoregulačních sloučenin (cukrů, polyalkoholů a jednoduchých dusíkatch látek) Tvorba stresových proteinů Pod vlivem kteréhokoliv ze stresových faktorů se začínají v buňce syntetizovat stresové proteiny, které se za normálních okolností vůbec nedají v buňce zjistit. Jen 25

26 některé proteiny se vyskytují pravidelně i u jiných typů stresů, většina je ale specificky vázaná na určitý stresový faktor. Proteiny, jejichž tvorba je indukována nespecificky, tedy různými typy stresorů, můžeme rozdělit do tří funkčních skupin: a) molekulární chaperony b) proteasy c) ubikvitin Jedná se vesměs o konstitutivní proteiny, patřící k pravidelné výbavě buněk všech genotypů, ale za stresu se jejich množství mnohonásobně zvyšuje. Jejich intenzivní tvorba souvisí se vzrůstem počtu poškozených proteinů v různých buněčných strukturách. Chaperony slouží nejen k řízení změn konformace proteinů při transportech přes membrány, ale jsou schopny upravit jejich konformaci i při mírném poškození. Pokud ale dojde k velkým, nenapravitelným změnám, je takový protein označen malou molekulou ubikvitonu a rozložen pomocí proteas na aminokyseliny. Ty jsou pak využity k syntéze nových proteinů. Nejdůležitější skupiny stresových hormonů jsou: d) proteiny indukované zvýšenou teplotou e) proteiny indukované chladem f) proteiny indukované dehydratací g) proteiny indukované sníženou koncentrací kyslíku h) proteiny indukované patogeny 26

27 Tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku (7) Aktivní formy kyslíku ROS reactive oxygen species. Běžný molekulární kyslík v naší atmosféře je poměrně málo reaktivní, ovšem některými procesy v rostlinách může být přeměněn na mnohem aktivnější formy (singletový kyslík a superoxidový anion), či silně oxidační sloučeniny (hydroxylový radikál, peroxid vodíku). Úloha těchto látek ve stresovaných rostlinách je rozmanitá a do jisté míry také rozporná. Jednak vznikají jako nebezpečné produkty při působení řady stresových faktorů a rostliny musí mít účinné systémy na jejich deaktivaci, jednak mohou mít kladnou úlohu jako signály či ochranné látky při některých typech stresů. Proto je žádoucí jejich koncentraci udržovat na jisté úrovni. Tvorba aktivních forem kyslíku probíhá především v chloroplastech, kde se soustřeďuje velké množství energie při absorpci záření asimilačními pigmenty a současně je v nich zvýšená koncentrace kyslíku z rozkládající se vody ve fotosystému II. K fotoredukci kyslíku může docházet především ve fotosystému I (Mehlerova reakce), produktem při Mehlerově reakci je superoxid, z něhož se mohou dále tvořit nebezpečnější hydroxylové radikály a peroxid vodíku. Zvýšení tvorby aktivních forem kyslíku je v chloroplastu dáno snížením rychlosti sekundárních procesů fotosyntézy vlivem nejrůznějších stresových faktorů. V mitochondriích může docházet k tvorbě superoxidu a následně i peroxidu vodíku autooxidací ubichinonu, zejména je-li transport elektronů zpomalen. Tvorba superoxidu byla dokázaná také na dalších membránách (peroxizomů, glyoxyzomů, mikrozomů, na plazmatické membráně a tonoplastu). Negativní působení aktivních forem kyslíku spočívá především v peroxidaci lipidů. Nejvíce náchylné jsou membránové lipidy s vysokým obsahem nenasycených mastných kyselin. Poškozeny mohou být i některé aminokyseliny, proteiny a nukleové kyseliny. K oxidaci je zejména citlivý histidin, methionin, tryptofan a guanin. Mechanismy ochrany před oxidačním poškozením: a) systémy přímé deaktivace: karotenoidy, α-tokoferol b) specializované enzymy a enzymatické systémy: superoxiddismutasa, askorbát a glutation 27

28 Protistresová úloha aktivních forem kyslíku je důležitá při napadení rostliny patogenem, regulovaná tvorba má i přímý antimikrobiální účinek. Přispívá ke zpevnění buněčné stěny, a tím má rostlina větší odolnost vůči stresorům. Tvorba stresových fytohormonů Působením stresových faktorů se mohou vytvářet některé fytohormony - kyselina abscisová, ethylen, kyselina jasmonová, methhyljasmonát a polyaminy) (7). Kyselina abscisová je přirozeným inhibitorem všeobecně rozšířeným u krytosemenných rostlin. Působení ABA se projevuje: o tvorbou oddělovací vrstvy mezi řapíkem a stonkem, což vede k opadávání listů a řapíků o inhibicí klíčení; vzrostný vrchol se mění na zimní pupeny o urychlením stárnutí buněk o inhibicí kvetení dlouhodenních rostlin o podporou tvorby hlíz brambor o brzděním dělení a růstu buněk a anabolických procesů (8) Její působení ve stresových situacích je spojeno s indukcí tvorby specifických proteinů, které chrání buňku před působením stresových podmínek (7). Ethylen je přírodní regulátor zrání plodů (8). Brzdí syntézu auxinu. Inhibuje prodlužovací růst a stimuluje růst radiální. Zvýšení tvorby etylenu je jednou z prvních reakcí rostlin na působení stresoru (7). Kyselina jasmonová a methyljasmonát urychlují stárnutí listových segmentů a důležitou úlohou je jejich funkce jako signál při reakci na dotyk, na patogeny, na poranění. Stoupá tím jejich obsah v buňce, který nese informaci o působení vnějšího faktoru (7). Polyaminy stimulují růst v systémech in vitro, ve kterých probíhá nintenzivní buněčné dělení. Také stimulují somatickou embryogenezi a iniciují kvetení. Hrají významnou roli v obraně proti stresům, a to díky jejich ochrannému působení na membrány a na DNA (mohou ovlivnit její konformaci i expresi genů) (7). 28

29 3.3.3 Biotické stresy (7) Alelopatie O alelopatii hovoříme tehdy, jestliže dojde k přenosu účinné látky z rostliny a dojde tak k ovlivnění sousední rostliny. Látky mohou na rostlinu působit inhibičně v některých, případech až toxicky. Účinné látky musí být z jedné (zdrojové) rostliny vyloučeny a přeneseny na jinou (cílovou) rostlinu v dostatečné koncentraci. Zdrojová rostlina musí být vůči účinné látce mnohem méně citlivá, než rostlina cílová. Jako příklad lze uvést juglon (5-hydroxy-α-naftochinon), který způsobuje silnou toxicitu rozkládajících se listů ořešáku na řadu druhů zahradních rostlin. Interakce s býložravými živočichy Rostliny jsou neustále vystaveny nebezpečí poškození svých orgánů mnoha druhy živočichů. Existuje celá řada morfologických a morfogenetických adaptací k omezení tohoto poškození (např. ostré trny či trichomy, vysoký obsah tuhých sklerenchymatických pletiv). Kromě toho se setkaváme i s adaptacemi biochemickými. Mnohé sekundární metabolity syntetizované v rostlinách působí odpudivě či toxicky na živočichy. Tyto látky lze z hlediska množství výskytu rozdělit na kvalitativně významné a kvantitativně významné. Látky kvalitativně významné se v rostlinách vyskytují v malých koncentracích, přesto jsou pro živočichy velmi toxické. Patří zde nejrůznější alkaloidy, glykosidy uvolňující kyanovodík, glukosinoláty a mnoho dalších. Mezi kvantitativně významné metabolity, které nejsou natolik toxické, ale vyskytují se ve větším množství (často tvoří více než 10% sušiny), patři lignin, taniny a fenolické látky. Tyto látky způsobují špatnou stravitelnost, nechutnost až toxicitu. Reakce na patogenní organizmy Rostliny mohou být napadány také patogenními mikroorganismy (viry, bakterie, houby). Především patogenní houby disponují celou řadou velmi účinných lytických exoenzymů. Na počátku všech obranných reakcí je podnět k jejich spuštění, kterým bývá specifický metabolit (elicitor) uvolňovaný při počáteční interakci buňky 29

30 s patogenem a identifikovaný vhodným receptorem hostitelské buňky. Jako elicitory mohou sloužit některé metabolity vylučované patogeny tzv. exogenní elicitory (např. některé polysacharidy, specifické enzymy a peptidy) a sloučeniny uvolňované z narušených buněčných stěn obou organizmů tzv. endogenní elicitory (např. oligomery chitinu, oligoglukany a glykoproteidy uvolňované hydrolýzou buněčné stěny patogenních hub). K obranným reakcím rostlin na patogeny můžeme zařadit tvorbu fytoalexinů, specifických nízkomolekulárních látek, které se za normálních podmínek v buňkách nevyskytují, ale začínají se vytvářet až po napadení patogenem. Většina těchto sloučenin je lipofilní povahy, což jim usnadňuje pronikání přes plazmatickou membránu patogenů a mohou tak poškodit membránové funkce. Působí toxicky hlavně na patogenní houby, méně na bakterie. Další obrannou reakcí je tzv. hypersenzitivní reakce. Při této reakci dochází k rozpadu membránového systému hlavně náhlým zvýšením koncentrace vysoce reaktivních volných radikálů a peroxidu vodíku. Dochází tak k rychlé zkáze vlastní buňky i houbové hyfy. Postupně odumírají i buňky v blízkosti místa infekce. Jiným typem obranné reakce je zvýšená tvorba polysacharidu kalózy. Kalóza vyplňuje buňky v okolí infikovaného místa a je velmi odolná vůči houbovým hydrolýzám. Navzdory těmto mechanismům existují silně virulentní kmeny hub, které snadno překonají ochranná opatření a to díky tvorbě specifických látek tzv. supresorů, které potlačují vznik ochranných metabolitů Abiotické stresy (7) Reakce na přehřátí Při zvýšení teploty zhruba nad 40 o C dochází u většiny druhů rostlin k zásadním změnám ve fyzikálně-chemických vlastnostech buněčných membrán i proteinů. Stresové účinky nízkých teplot Citlivost na chlad (nízké teploty nad bodem mrazu) vykazují zejména některé užitkové rostliny původem z teplejších oblastí. Velmi citlivé na chlad jsou také květní orgány v raném stádiu vývoje a v průběhu gametogeneze. Vlivem nízkých teplot dochází ke změnám fyzikálně-chemických vlastností membrán. 30

31 Vodní stres Ze všech abiotických faktorů, které omezují růst a produktivitu rostlin, stojí na prvním místě nedostatek vody. Voda má velmi rychlý koloběh v ekosystémech a její zásoba v rostlinách i v půdě stačí jen na poměrně krátkou dobu. Nejvíce postiženým orgánem jsou vždy listy. Nedostatek kyslíku v půdě K tomuto nedostatku dochází, pokud je málo vzdušných pórů v půdě a navíc jsou úzké, jak tomu bývá u těžkých jílových půd nebo v důsledku zvýšeného obsahu vody v půdě. Zasolené a kyselé půdy Zasolené půdy působí na rostliny toxicky vlivem vysoké koncentrace některých iontů (zejména Na +, Cl -, SO 2-4, Mg 2+ ), dále se zde vyskytuje velmi nízký vodní potenciál a zhoršené fyzikální vlastnosti půdy. V kyselých půdách dochází k poklesu ph vstupem vodíkových iontů do půdy z kyselých srážek, nevhodným způsobem obhospodařování nebo nepřímým působením vysokých koncentrací vodíkových iontů. Dohází ke zvýšení rozpustnosti některých sloučenin v půdě, zejména uvolňování vysoce toxických iontů hliníků, železnatých a manganatých iontů, které v nadbytku působí velice toxicky. Toxické látky v prostředí Oxid siřičitý a toxické kovy jako zinek, olovo a kadmium ovlivňují proces fotosyntézy. Při vyšších koncentracích ozónu dochází k poškození buněčných součástí (plazmalema, organely včetně chloroplastu). 31

32 3.4 Elicitace Za jednu z možností, jak získávat sekundární metabolity rostlin je považována produkce pomocí in vitro kultur. V těchto kulturách však bývá biosyntéza sekundárních látek často nedostatečná, nebo je potlačena úplně. Ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů se používá řada metod, jako jsou například optimalizace kultivačního média, elicitace, genetická manipulace a také přidávání prekurzorů do média (9). Elicitace je založená na poznatku, že akumulace mnoha sekundárních látek v rostlinách a rostlinných tkáňových kulturách je součástí jejich obranné reakce vůči působení patogenů nebo stresorů. Faktory vyvolávající obranné reakce se obecně nazývají jako elicitory (2). Proteinové nebo uhlovodíkové molekuly elicitoru jsou rozpoznávány specifickými receptory v plazmatické membráně. G-proteiny se mohou navázat na receptory a zprostředkovat elicitorem vyvolanou aktivaci iontových kanálků. Přesun iontů, zvláště Ca 2+, aktivuje proteinkinasy, peroxidasy, NADPH oxidasy a fosfolipasy, které dále vytvářejí jiné signální molekuly, jako reaktivní formy kyslíku, DAG, IP 3, camp, JA, ethylen, NO, cadp ribózu a SA. Všechny tyto signální molekuly vytvářejí jednotlivé nebo zkřížené metabolické dráhy, které vedou k regulaci transkripčních faktorů, které aktivují genovou expresi. Většina genů kódujících sekundární metabolity se vyznačují pozdní odpovědí (1). Elicitory dělíme na biotické (houby, bakterie, viry, fytohormony) a abiotické (těžké kovy, UV záření, chlad) (10). Využití chemických sloučenin jako abiotických elicitorů poskytuje ve srovnání s biotickými elicitory některé výhody jako například snadnou dostupnost, relativně nižší cenu, definované složení (2). 32

33 3.5 Pyraziny (11) Pyrazin, 1,4-diazin, představuje vysoce symetrickou molekulu. Jde o slabě aromatickou sloučeninu, která se v přírodních zdrojích vyskytuje v relativně malých množstvích. Pyraziny jsou často těkavé a nestálé molekuly. Přírodní pyraziny se vyskytují v rostlinách a hmyzu, kde plní úlohu atraktantů, feromonů či signálních látek. Alkylované, vinylované, alkoxylované pyraziny se běžně vyskytují v naší potravě, kde ovlivňují organoleptické vlastnosti. Jsou obsaženy v kávových a sojových bobech, ve vařeném hovězím masu, smažených burských oříšcích, vínu a pivu. Tyto látky jsou také obsaženy v čínské rostlině Ligusticum wallichii, používané v tradiční čínské medicíně při léčbě srdečního a mozkového infarktu. Rovněž mořští živočichové a rostliny produkují deriváty pyrazinu s potenciálním protinádorovým účinkem. Pyraziny vytvářejí také plísně, např. baktericidně účinné antibiotikum kyselina aspergillová, která se pro svou vysokou toxicitu terapeuticky nepoužívá, či flutimid s výraznou protivirovou aktivitou, jehož syntetické analogy jsou intenzivně studovány jako potenciální léčiva. Mechanismus tvorby pyrazinového jádra v přírodních zdrojích spočívá v autokondenzaci α-aminokarbonylových sloučenin, příp. kondenzaci α,βdikarbonylových a α,β-diaminosloučenin, vznikajících při fermentaci sacharidů a bílkovin. Velmi toxické diaziny vznikají zahřiváním směsi sacharidů, aminokyselin a kreatininu. Jako identická vonidla či chutidla pro výrobu umělých pokrmových tuků, instantní kávy nebo při výrobě cukrovinek jsou v potravinářství používány synteticky připravené deriváty pyrazinu. Tyto sloučeniny se využívají rovněž ve voňavkářském nebo tabákovém průmyslu. Synteticky připravené pyraziny vykazují také farmakologické účinky, např. chemoterapeutikum sulfapyrazin, antituberkulotikum pyrazinamid, kalium šetřící diuretikum amilorid, používající se při léčbě hypertenze, antidiabetikum glipizid nebo hypnotikum zopiklon. Význam pyrazinového kruhu pro biologický účinek lze u výše představených sloučenin primárně hodnotit podle velikosti zkoumané molekuly. U relativně malých 33

34 sloučenin je přítomnost pyrazinu podmínkou účinku. U rozsáhlejších molekul přináší připojení pyrazinového jádra celé sloučenině specificky bazické, resp. Slabě aromatické vlastnosti. 34

35 3.5.1 Substituované amidy pyrazin-2-karboxylové kyseliny Objevení aktivity pyrazinamidu, amidu pyrazin-2-karboxylové kyseliny, je produktem úsilí vyvinutého při hledání antimetabolitu nikotinamidu. Rovněž modifikace této malé molekuly se ubíraly vesměs neúspěšnými cestami. Neosvědčila se náhrada pyrazinového jádra jiným heteroaromatickým kruhem, na druhé straně pozitivní výsledky přinesly substituce pyrazinového jádra (alkylace či halogenace) (12). Mechanismus účinku pyrazinamidu spočívá v inhibici nikotinamidasy, jedná se o prekurzor vznikající uvnitř tuberkulotické buňky. Aktivním metabolitem je pyrazin-2- karboxylová kyselina (12). Pyrazinamid je vhodný především k iniciální fázi terapie tuberkulózy nebo při postižení CNS, a to v kombinaci a isoniazidem a rifampicinem. Jeho indikací je terapie plicní a mimoplicní tuberkulózy (v kombinaci s dalšími antituberkulotiky) (12). Ve své diplomové práci jsem pro elicitaci kalusových a suspenzních kultur Sylibum marianum (L.) Gaertn. použila jako abiotický elicitor látku ze skupiny substituovaných amidů pyrazin-2-karboxylové kyseliny: N-(3-jod-4-methylfenyl)amid 5-terc-butyl-6-chlorpyrazin-2-karboxylové kyseliny Cl N N O N I Obr. č. 6. Vzorec elicitoru Rozpustnost: horká voda, ethanol, DMSO Molekulová hmotnost: 429,7 Teplota tání: 122,9-123,5 o C 35

36 Deriváty pyrazin-2-karboxylových kyselin byly již v předchozích letech testovány jako potenciální abiotické elicitory u několika kultur in vitro. Např. byl zkoumán vliv látky (3-jod-4-methylfenyl)amid 5-methylpyrazin-2- karboxylové kyseliny ve třech koncentracích na produkci sekundárních metabolitů v kalusové a suspenzní kultuře Silybum marianum (L.) Gaert. Maximální zvýšení produkce silymarinového komplexu (0,03%) nastalo v kalusové kultuře po 24 hodinovém působení elicitoru o koncentraci c 1 = 2,83 x 10-3 mol/l. Maximální zvýšení produkce silymarinového komplexu (0,04%) v suspenzní kultuře bylo zjištěno po 48 hodinovém působení elicitoru o koncentraci c 3 = 2,83 x 10-5 mol/l. (13). V další práci byl sledován vliv sloučeniny ze skupiny substituovaných amidů pyrazin-2-karboxylových kyselin, a to N-(3-jodo-4-methylfenyl)amid pyrazin-2- karboxylové kyseliny, ve třech různých koncentracích, na produkci sekundárních metabolitů v kalusové kultuře Silybum marianum (L.) Gaert. Maximální zvýšení produkce flavonolignanů a taxifolinu bylo dosaženo při koncentraci c 2 = 2,95 x 10-4 mol/l po 6 hodinách elicitace a při koncentraci c 3 = 2,95 x 10-5 mol/l po 24 a 72 hodinovém působení roztoku elicitoru. Nejvyšší nárůst silychristinu byl dosažen pouze po 6-ti hodinovém působení elicitoru o koncentraci c 2 = 2,95 x 10-4 mol/l. Obsah této složky silymarinového komplexu byl 2-krát vyšší ve srovnání s kontrolním vzorkem (14). Další ze substituovaných amidů pyrazin-2-karboxylové kyseliny aplikovaných na kalusové kultuře Silybum marianum (L.) Gaertn., byla látka N-(3-jodo-4- methylfenyl)amid 5-terc-butylpyrazin-2-karboxylové kyseliny ve třech koncentracích. Nejvyšší obsah flavonolignanů a taxifolinu byl zjištěn po 72 hodinách působení elicitoru o konecntraci c 1 = 2,53 x 10-3 mol/l a po 6-ti hodinách u koncentrací c 2 = 2,53 x 10-4 mol/l a c 3 = 2,53 x 10-5 mol/l. Nejvyšší obsah silychristinu byl zjištěn pouze po 72 hodinách elicitace při koncentraci c 1 = 2,53 x 10-3 mol/l, což bylo 12-krát více v porovnání s kontrolou (15). Efekt substituovaných amidů pyrazin-2-karboxylové kyseliny byl zkoumán i na jiných kulturách. Např. na kalusovou kulturu Genista tinctoria byla aplikována látka N- (3-jodo-4-methylfenyl)amid pyrazin-2-karboxylové kyseliny, opět ve třech koncentracích. Bylo zjištěno významné navýšení tvorby isoflavonoidů. Nevyšší množství genistinu bylo detekováno po 6-ti hodinách působení u koncentrace c 2 = 2,95 x 36

37 10-4 mol/l což bylo navýšení o 3200% v porovnání s kontrolou. U koncentrace c 3 = 2,95 x 10-5 mol/l došlo k nejlepší stimulaci daidzeinu a formononetinu (16). Pro zvýšení množství obsahových látek v kalusové kultuře Genista tinctoria byla také použita látka N-(3-jod-4-methylfenyl)amid 5-terc-butyl-6-chlorpyrazin-2- karboxylové kyseliny (ve třech koncentracích). Obsah genistinu byl zvýšen po 12 hodinách o 5640% a po 24 hodinách o 1340% ve srovnání s kontrolou u koncentrace c 1 = 2,33 x 10-3 mol/l. U ostatních koncentracích bylo navýšení produkce genistinu relativně nízké nebo žádné. Po aplikaci roztoku elicitoru o koncentraci c 2 = 2,33 x 10-4 mol/l bylo zjištěno zvýšení produkce formononetinu a koncentrace c 3 = 2,33 x 10-5 mol/l obecně produkci isoflavonoidů snižovala (16). 37

38 3.6 Flavonoidy Flavonoidy jsou deriváty fenylchromanu. V rostlinách se vyskytují jako aglykony i jako glykosidy (-O nebo -C) (17). Základem je chroman armovaný v poloze 2 (flavany), 3 (isoflavany) nebo 4 (neoflavany) (18). Obr. č. 7.Vzorec flavanu, isoflavanu, neoflavanu Vyskytují se jen v rostlinné říši, a to nejčastěji flavany, řidčeji isoflavany. Neoflavany se vyskytují vzácně a nemají terapeutický význam. Flavany jsou v přírodě hojně rozšířeny, v cévnatých rostlinách. Zvlášť významné jsou flavonoidy (deriváty 4- oxoflavanu) - flavony, flavonoly a flavanony, a katechinové třísloviny - deriváty flavanu. Jednotlivé flavonoidy se navzájem liší počtem a polohou hydroxylových skupin na obou aromatických kruzích a napojením cukrů nebo organických kyselin (18). Flavonoidy, pro všestranné působení na organismus často nazývané bioflavonoidy, se v rostlinách vyskytují většinou glykosidně vázané, rozpuštěné v buněčné šťávě vakuoly. Methoxylované deriváty jsou lipofilní a vyskytují se v silicích. V živém rostlinném organismu se flavonoidy patrně účastní oxidačně redukčních pochodů (18). Terapeutické využití flavonoidů je založeno na jejich schopnosti normalizovat permeabilitu kapilár, odstraňovat jejich lomivost, působit antihemorhagicky a antiedematosně (P-vitaminový účinek). Jsou inhibitory hyaluronidasy, brání šíření mikrobiálních toxinů tkáněmi, jsou proto podpůrnými prostředky při léčení infekčních nemocí. Některé působí diureticky, rozšiřují cévy, snižují krevní tlak. S ionty Ca 2+ tvoří komplexní soli a brání tak srážení krve a zadržují vápník v těle. Potencují účinek vitamínu C. Mají též vlastnosti choleretické, cholagogní a spasmolytické (18). 38

39 Flavonoidy jsou často označovány jako protizánětlivě účinné látky a také vychytávají volné radikály (20). V poslední době je diskutována otázka zamezení oxidace LDL flavonoidy. Oxidace LDL hraje s velkou pravděpodobností důležitou roli při vzniku atheromatózních lézí. Monocyty vychytávají molekuly modifikovaného LDL, ke kterému mají desetkrát větší afinitu než k nativnímu LDL. Tyto monocyty penetrují do subendotheliálního prostoru a způsobují první stádium atherogeneze. Některé flavonoidy jako kvercetin, krysin, myricetin nebo rutin vykázaly in vitro inhibici oxidace LDL. S tím souvisí jev označovaný jako tzv. francouzský paradox. Ukázalo se, že ve Francii navzdory skladbě stravy (silné zastoupení tuků) nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění. Tento jev je vysvětlován příjmem červeného vína, ve kterém je obsaženo vysoké množství antioxidantů, zejména flavonoidů. Někteří autoři uvádějí, že se díky příjmu vína snižuje riziko vzniku koronárních onemocnění až o 40% (20). Aglykony flavonoidních glykosidů jsou produkty vznikající hlavními cestami vedoucími k syntéze aromatických látek v biologických systémech. Jeden 6-ti uhlíkový fragment těchto sloučenin se odvozuje z acetátového metabolismu a zbývající 9-ti uhlíková část z kyseliny šikimové (fenylpropanoid). Jednotka C6 - C3, patrně ve formě kyseliny skořicové, se spojuje se 3 molekulami acetátu za vytvoření meziproduktu z 15- ti atomů uhlíků, chalkonu, z něhož vzniká potom flavanon. Flavanony mají vztah k dalším skupinám flavonoidů, a to k flavonům, chudším o dva atomy vodíku. Deriváty se tvoří zavedením nebo odstraněním hydroxylových skupin. Flavanonoly vznikají zavedením hydroxylové skupiny do polohy 3, dehydrogenace poloh 2 a 3 vede ke vzniku flavonolů. Glykosylace nastává v pozdním stadiu tvorby flavonoidu (18). 39

40 3.6.1 Flavonolignany Flavonolignany jsou adiční sloučeniny flavanonolů s koniferylalkoholem. Hlavními obsahovými látkami Silybum marianum je skupina flavonolignanů komplexně nazývána silymarin (21). OH HO OH O O OH OH + H 3 C O HO OH O OH HO O O O CH 3 OH OH OH O Obr. č. 8. Schéma biosyntézy flavonolignanů. Taxifolin + Koniferylalkohol Silybin (22) 40

41 3.7 Silybum marianum Matečná rostlina Silybum marianum, Asteraceae, Asterales Silybum marianum (L.) Gaertn. Je původně středomořská dvouletá bylina, nápadná peřenolaločnatými, bíle skvrnitými listy. Spodní listy jsou v přízemní růžici. Květy tvoří purpurově zbarvené vejcovité úbory. Listy a listeny zákrovu mají špičaté žluté bodliny (23). Plody (nažky) nesou bílý pappus, snadno odpadající (18) Droga Silybi mariani fructus Drogou je usušený plod, zbavený chmýru (18). Plod uzavírá velké světlé semeno bez endospermu, jehož tenké osemení je srostlé s oplodím. Droga je bez pachu, oplodí má nahořklou a semena olejovitou chuť (21). Droga slouží jako surovina k izolaci komplexu nazvaného silymarin (24). Droga je vedena v Českém lékopise 2009 pod článkem Silybi mariani fructus. Český lékopis 2009 obsahuje také článek: Silybi mariani extractum siccum raffinatum et normatum Jedná se o suchý, čištěný a standardizovaný extrakt vyrobený z drogy Silybi mariani fructus. Obsahuje % silymarinu, vyjádřeného jako silibinin. Ve vysušeném extraktu je obsah silymarinu 30-65%. Je to žlutohnědý amorfní prášek. Vyrábí se z rostlinné drogy vhodným postupem za použití jednoho nebo více uvedených rozpouštědel (ethyl-acetát, aceton nebo směs acetonu s vodou, ethanol nebo směs ethanolu s vodou, methanol nebo s měs methanolu s vodou) (25) Obsahové látky Účinnou látkou této drogy jsou flavolignany tzv. silymarinový komplex. Jde o adiční sloučeniny flavanonolů s koniferylalkoholem. Silymarinový komplex (1,5-3%) obsahuje 3 hlavní a nejméně 5 vedlejších látek. Hlavní složky jsou silybin, silydianin a silychristin. Výtažky z drogy obsahují často různé polymerní produkty silybinu (18). Další flavonolignany identifikované v Silybum marianum jsou 2,3-dehydrosilybin; 2,3-41

42 dehydrosilychristin, dále obsahuje několik flavoniodů jako např. taxifolin, apigenin a jeho 7-O-glukosid (21). Dále droga obsahuje 20-30% mastného oleje (26), aminokyseliny se značným podílem zástupců obsahujících síru, cukry (glukóza, fruktóza a blíže neurčená pentóza), hořčiny a silice. Pro obsah biogenních aminů (tyramin, histamin) se droga kdysi doporučovala jako náhražka za námel (Secale cornutum), jeho účinnosti však nemohla dosáhnout (21). Účinné látky jsou bezprostředně pod osemením (tyramin, histamin, silybin), a proto se používá semeno i se slupkou (21). Silydianin Taxifolin 2,3-Dihydroquercetin Obr. č. 9.Struktury silybinu, silychristinu, silydianinu a taxifolinu (21). 42

43 3.7.4 Sklizeň, sušení Plody (nažky) se sklízejí v době, kdy jsou úplně zralé v úborech hlavních os, což je obvykle v průběhu srpna. Před sklizní se porost nejprve postříká herbicidním přípravkem, který porost desikuje. Vlastní sklizeň se provádí desátý den po desikačním postřiku sklízecími mlátičkami běžného typu. Posklizňová úprava je stejná jako u obilovin a provádí se na stejných zařízeních sušičkách při 40 až 60 o C a čističkách. Ostropestřec se pěstuje výlučně velkoprodukčně (24) Mechanismus účinku Mechanismus účinku silymarinu se zřejmě uskutečňuje čtyřmi různými cestami: a) jako antioxidanty, zhášeče a regulátory intracelulárního obsahu glutationu b) jako stabilizátor buněčné membrány a regulátor permeability, který zabraňuje hepatotoxickému agens vstupovat do hepatocytu. c) Jako promotor rrna syntézy, stimuluje jaterní regulaci d) Jako inhibitor přeměny hvězdicovitých hepatocytů na myofibroblasty-tj. proces odpovědný za depozici kolagenových vláken, což vede k cirhóze (21) Použití a farmakologické účinky Silymarin se používá jako hepatoprotektivum, choleretikum a slabé spasmolytikum (18). Tyto hepatoprotektivní látky jsou doporučovány např. u chronických forem žloutenky, při poškození jater alkoholem, či jako prevence účinku toxických látek na játra (26). V jedné klinické studii byl vyhodnocen dvojitě slepý, placebo kontrolovaný pokus účinnosti silymarinu na léčbu 36 chronických alkoholiků s fibrózní změnou jater nebo s mikronodulární cirhózou. Závěrečným měřením byl test funkčnosti jater, sérové hladiny peptidu-prokolagen III a jaterní histologie. Během pokusu byla redukována spotřeba alkoholu a zbytkový alkohol byl v obou skupinách srovnatelný. Léčba silymarinem (140 mg 2x denně p.o.) zlepšila jaterní histologii, zvýšila proliferaci lymfocytů a snížila peroxidaci lipidů. Během léčby se navrátily k mormálu: sérový bilirubin, aspartát aminotransferáza a alanin aminotransferáza, 43

44 snížily se hladiny γ-glutamyltransferázy a prokolagenu III na úroveň srovnatelnou s placebem. U další biopsie bylo pozorováno u léčené skupiny zlepšení jaterní histologie (21). V randomizované studii 60 pacientů se sekundárním inzulíndependentním diabetem způsobeným alkoholem vyvolanou cirhózou po 6 měsíčním užívání 600 mg/den silymarinu došlo ke snížení hladiny glukózy a malondialdehydu v krvi a ke snížení denní potřeby inzulínu. Stálá inzulinémie byla znatelně nižší u léčené skupiny ve srovnání s neléčenými pacienty (21). Další práce studovala silymarin z hlediska účinku na hladiny cholesterolu, plazmových lipoproteinů a na oxidaci LDL u potkanů s dietně vyvolanou hypercholesterolémií. Bylo prokázáno, že silymarin podávaný současně s vysokocholesterolovou dietou brání rozvoji hypercholesterolémie a příznivě ovlivňuje distribuci cholesterolu mezi plazmovými lipoproteiny; snížení VLDL a LDL, zvýšení HDL. Silymarin a jeho hlavní složka silybin snížily citlivost LDL na oxidaci, ale tento efekt byl limitován in vivo biologickou dostupností. Tyto výsledky naznačují možnost rozšíření indikace silymarinu jako hypocholesterolemika s LDL antioxidačním účinkem (21). Předpokládá se, že silybinin reguluje expresi genu MMP-9 vyvolanou TNF-α přes inhibici MEK/ERK metabolické cesty v buňkách rakoviny žaludku (27). Silybinin je též možné využívat k léčbě androgenně dependentní rakoviny prostaty. Byl zjištěn nižší výskyt tohoto typu rakoviny u Asiatů žijících v Asii oproti Asiatům žijících v USA. Asijští Asiaté mají totiž stravu s nižším obsahem biologicky aktivních androgenů. Další důkaz k potvrzení tohoto konceptu pochází ze zjištění, že více než 75% onemocnění rakovinou prostaty je v počáteční diagnóze androgenně dependentní. PSA (prostate specific antigen) je důležitý androgenem regulovaný gen zdravých a rakovinných buněk, který se jeví zvláště citlivým ukazatelem pro diagnózu a léčbu této nemoci. Tato studie objevila možnou roli antioxidantů silybininu jako potenciálu k ovlivnění progrese hormonálně dependentní rakoviny. Silybinin totiž snižuje intracelulární a dekretovaný PSA v séru a androgenem indukované podmínky zpomalující buněčný růst zastavením G 1 fáze růstového cyklu. Ošetření silybininem má za následek znatelnou diferenciaci neuroendokrinních buněk od rakovinných, ale ne apoptózu. Tedy silybinin má zřejmý účinek jen na rakovinné buňky. Snížení hladiny 44

45 PSA je tedy přisuzováno vlastnímu inhibičnímu účinku na PSA proteinovou expresi nebo přímo na inhibici androgenního receptoru zprostředkovávajícího PSA expresi (21). Silybin se také používá jako lék první volby při otravách muchomůrkou zelenou (Amanita phalloides) (28). Extrakt ze Silybum marianum je složkou několika hromadně vyráběných léčivých přípravků (Flavobion) a jako sušená droga je součástí čajových směsí, např. Jaterní čajová směs (Megafyt), Játra a žlučník (Teekanne), Na játra a žlučník-ungolen (Fytopharma). Reprodukční toxicita Studie ovlivnění fertility a prenatální, perinatální a postnatální toxicity provedené na potkanech a králicích, nezjistily žádné nepříznivé účinky na různá stádia reprodukce (maximální zkoušená dávka: 2,5 g/kg). Zejména nebyl zjištěn žádný teratogenní potenciál silymarinu (19). Mutagenita Studie provedené se silymarinem in vitro a in vivo byly negativní. Bezpečnost pro podání v těhotenství a při kojení u člověka nebyla ověřena (19). Nežádoucí účinky Velmi ojediněle průjem, dyspeptické potíže, kožní alergické projevy. Po vysazení nežádoucí účinky mizí (19). Farmakodynamické vlastnosti Silymarin chrání extra- a endoplazmatické membrány hepatocytů proti působení hepatotoxických látek a zlepšuje funkci jater. Za podstatu membránu stabilizujícího účinku silymarinu se považuje jeho antioxidační působení a inhibice lipoperoxidace přímou inhibicí lipooxygenázy. Silymarin jako zhášeč (scavanger) volných radikálů se může uplatnit i při radiačním poškození jater (19). 45

46 Farmakokinetické vlastnosti Po p.o. podání silymarinu se nalézají v krvi jen nízké koncentrace jeho hlavní komponenty silybininu, ve žluči se však nalézá asi 20-40% aplikované dávky. Jeho renální vylučování je nepatrné, za 24 hodin po aplikaci se objeví v moči jen asi 1-7% aplikované dávky. Silybinin se vylučuje převážnou měrou (více než 80% vstřebaného množství) žlučí, a to především v konjugované formě. Lze předpokládat, že se silybinin po dekonjugaci resorbuje a dochází tak k enterohepatálnímu oběhu. Poločas biliární eliminace je asi 3-4 hodiny. Silybinin se neakumuluje. Při opakovaném podání silymarinu 140 mg 3x denně se dosáhne ustáleného stavu biliární eliminace (19). Předklinické údaje Silymarin se vyznačuje obzvláště nízkou toxicitou, dlouhodobá aplikace terapeutických dávek je nezávadná. Akutní toxicita: LD 50 při jednorázovém p.o. podání u potkanů a myší je vyšší než 2 g/kg. Chronická toxicita: Po maximálně 12-ti měsíčním p.o. podání potkanům a psům v dávce 2,5 popř. 1,2 g/kg tělesné hmotnosti nebyly prokázány dle laboratorních údajů ani dle patologickoanatomických nálezů toxické účinky (19). 46

47 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Biologický materiál Pro vypracování této diplomové práce byla použita tkáňová kultura odvozená z kořenové části klíční rostliny Silybum Marianum (L.) Gaertn. v 51. až 58. pasáži. 4.2 Přístroje a vybavení o Analytické váhy Sartorius PRLT A 1, Německo o Autokláv P S 20 A, Chirana, ČR o Autosampler Jasco AS-2055 Plus, Japonsko o Box s laminárním prouděním Fatran LF, Slovensko o Diodový detektor Jasco MD-2050, Japonsko o Horkovzdušný sterilizátor, Chirana SVS9/1, ČR o Kolona Li Chrospher RP , sorbent Li Chrospher 5µm o Mikrofiltry (0,45µm), Tessek, ČR o Předkolona Li ChroCART 4-4, sorbent Li Chrospher 5µm o Pumpa Jasco PU-2089 Plus, Japonsko o Sušárna HS 61A Chirana, ČR o Termostat kolony Jetstream 2 Plus, Japonsko o Těsnění na vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc, ČR o Třepačka UNIMAX 2010, Heidoplh Instruments, Německo o Vialky, LABICOM s.r.o. Olomouc, ČR o Vodní lázeň, typ 1042, GLF, Německo 47

48 4.3 Chemikálie a pomocné látky o Destilovaná voda, Katedra analytické chemie, Faf UK HK, ČR o Dihydrogenfosforečnan draselný p.a., Lachema, ČR o Dusičnan amonný p.a., Penta, ČR o Dusičnan draselný p.a., Lach-Ner, ČR o Ethanol 96%, Lachema, ČR o Glycin, Aldrich, USA o Hydrolyzát kaseinu, Imuna, Slovensko o Chlorid kobaltnatý p.a., Penta, ČR o Chlorid vápenatý p.a., Penta, ČR o Jodid draselný p.a., Lachema, ČR o Kyselina boritá p.a., Lachema, ČR o Kyselina fosforečná, Lachema, ČR o Kyselina nikotinová, Lachema, ČR o Methanol HPLC grade, Merk, Německo o Methanol p.a., Penta ČR o Molybdenan sodný, Lachema, ČR o Myo-inositol, Fluka, Švýcarsko o Pyridoxin purin., Koch-Light Laboratories, Velká Británie o Sacharóza čistá, Lachema, ČR o Síran hořečnatý p.a., Lachema, ČR o Síran manganatý p.a., Lachema, ČR o Síran měďnatý p.a., Lachema, ČR o Síran zinečnatý, Lachema, ČR o Síran železnatý, Lachema, ČR o Thiamin, Koch-Light Laboratories, Velká Británie 48

49 4.4 Složení a příprava živného média Pro kultivaci tkáňových kultur bylo použito živné médium připravené podle Murashigeho a Skooga v tomto složení (13): Makroelementy mg/l NH 4 NO ,000 KNO ,000 CaCl 2 x 2H 2 O 440,000 MgSO 4 x 7H 2 O 370,000 KH 2 PO 4 x H 2 O 170,000 Mikroelementy mg/l H 3 BO 3 6,200 MnSO 4 x 4H 2 O 22,300 ZnSO 4 x 7H 2 O 11,500 KI 0,830 Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0,025 CuSO 4 x 5H 2 O 0,025 CoCl 2 x 6H 2 O 0,025 Železnatý komplex mg/l Na 2 EDTA 37,300 FeSO 4 x 7H 2 O 27,800 Vitamíny mg/l Kyselina nikotinová 0,500 49

50 Pyridoxin 0,500 Thiamin 0,100 Ostatní složky živné půdy mg/l Glycin 2,000 Sacharóza 30000,000 Myo-inositol 100,000 Hydrolyzát kaseinu 1000,000 Množství složek živné půdy je vyjádřeno v miligramech na litr. Sacharóza, glycin a myo-inositol byly naváženy na analytických vahách, ostatní látky byly pipetovány ze zásobních roztoků. Všechny substance živné půdy byly rozpuštěny v destilované vodě v 1000 ml odměrné baňce a doplněny opět destilovanou vodou po rysku. Jako stimulátor růstu byl použit roztok kyseliny α-naftyloctové v hmotnostní koncentraci 10 mg/l živné půdy. 50

51 4.5 Pasážování a kultivace kultur Pro kultivaci kalusových kultur byly použity 100 ml Erlenmayerovy baňky, které byly před použitím vymyty horkou saponátovou vodou, opláchnuty pitnou a poté destilovanou vodou a nakonec vysušeny v horkovzdušném sterilizátoru při teplotě 200 o C. Do každé takto připravené baňky byl vložen pomocí pinzety můstek z filtračního papíru. Poté bylo do baňky odměřeno 30 ml živného média s růstovým regulátorem. Baňky byly uzavřeny hliníkovou folií a sterilizovány v autoklávu při 121 o C a 100 kpa po dobu 15-ti minut. K pasážování byl použit box s laminárním prouděním vzduchu, který se před použitím vytřel roztokem lihu 96% a vysvítil UV-lampou. Uzávěry baněk z hliníkové folie se potřely roztokem Ajatinu. V boxu se na můstek z filtračního papíru uloženého ve vysterilizovaných baňkách přenesla část kalusu z předchozí kultivace. Kultury byly kultivovány po dobu 3-4 týdnů v místnosti s teplotou 25 o C a světelnou periodou, která zahrnovala 16 hodin světlo a 8 hodin tmu. Suspenzní kultura byla odvozena z kultury kalusové pomocí pinzety mechanickým rozmělněním. Tato kultura byla kultivována po dobu 2-3 týdnů na třepačce (120 ot/min) za stejných podmínek jako kalusová kultura. 51

52 4.6 Příprava roztoků elicitoru Jako elicitor byla použita látka MD 420/II: (3-jod-4-methylfenyl)amid 5-tercbutyl-6-chlorpyrazin-2-karboxylové kyseliny, a to ve třech koncentracích: 100mg/100ml; 10mg/100ml; 1mg/100ml. Do 100 ml odměrné baňky bylo kvantitativně přeneseno 100 mg látky MD 420/II a doplněno ethanolem 96% po rysku. Takto vznikla koncentrace c 1. Odpipetováním 10 ml roztoku o koncentraci c 1 do 100 ml odměrné baňky a doplněním rozpouštědlem po rysku vznikla koncentrace c 2. Koncentrace c 3 byla dosažena převedením 10 ml roztoku c 2 do 100 ml odměrné baňky a doplněním ethanolem 96% po rysku. Všechny koncentrace elicitoru byly připraveny v boxu s laminárním prouděním vzduchu, který byl předem vysvícen UV-lampou. Bylo použito sterilní sklo a nástroje. Koncentrace připravených roztoků elicitoru: c 1 = 100 mg/100ml (2,33 x 10-3 mol/l) c 2 = 10 mg/100ml (2,33 x 10-4 mol/l) c 3 = 1 mg/100ml (2,33 x 10-5 mol/l) 52

53 4.7 Elicitace kultur in vitro K elicitaci byly použity kalusové kultury kultivované po dobu 3-4 týdnů a suspenzní kultury kultivované po dobu 2-3 týdnů. Elicitace probíhala v boxu s laminárním prouděním vzduchu, který byl před použitím vysvícen UV-lampou. Ke vnášení roztoku elicitoru byly použity sterilní pipety. Pro každou koncentraci elicitoru bylo použito 35 baněk s kalusovou nebo suspenzní kulturou. Po otření hliníkových uzávěrů Ajatinem byl přidán do každé z 30 baněk 1 ml roztoku elicitoru, 5 baněk sloužilo jako kontrola. Baňky byly rozděleny do sedmi skupin podle délky působení elicitoru: 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodin. Sedmou skupinu tvořily baňky bez obsahu elicitoru. Po uplynutí doby působení elicitoru byly kalusy pomocí pinzety vytaženy na filtrační papír a sušeny při laboratorní teplotě. Suspenzní kultury byly zfiltrovány přes Bűchnerovu nálevku a zachycené shluky na filtračním papíru byly sušeny za laboratorní teploty. Byly také odebírány vzorky média ze suspenzních kultur. 53

54 4.8 Stanovení obsahu flavonolignanů Ke stanovení obsahu flavonolignanů a flavoniodu taxifolinu byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Jedná se o separační metodu, která umožňuje kvalitativní i kvantitativní hodnocení separovaných složek směsi (29). Při HPLC nastává dělení látek mezi stacionární fází naplněnou v koloně a mobilní fází procházející kolonou za vysokého tlaku (30). Postup stanovení Usušené vzorky kalusových a suspenzních kultur byly rozmělněny v třecí misce, přeneseny do varných baněk a zality 10 ml methanolu R 80%. Baňky byly umístěny na vodní lázeň a po dobu 10 minut probíhala extrakce pod zpětným chladičem. Poté byl obsah baněk extrahován podruhé, opět s použitím 10 ml methanolu R 80%. Oba extrakty byly spojeny dohromady a doplněny methanolem R 80% na 20 ml. Pomocí mikrofiltru (0,45 µm) byl tento roztok zfiltrován a přibližně 1,7 ml bylo převedeno do vialek. Takto připravené vzorky byly analyzovány metodou HPLC. Vzorky média byly odpařeny na vodní lázni, rozpuštěny v 10 ml methanolu R 80%, zfiltrovány mikrofiltrem a přibližně 1,7 ml bylo převedeno do vialek. Takto připravené vzorky byly analyzovány metodou HPLC. HPLC analýza byla prováděna na chromatografické sestavě Jasco (čerpadlo PU- 2089, detektor MD-2015, autosampler AS-2055), vybavené předkolonovým filtrem, kolonou LiChrospher RP x4 (5µm) s ochrannou předkolonou. Detekce byla provedena pomocí DAD detektoru v rozmezí vlnových délek nm. Obsah sledovaných látek byl vypočten z píků při vlnové délce 288 nm. Objem nástřiku byl 20 µl. Eluce mobilní fáze probíhala nejdříve gradientově, z 0 % methanolu v čase t = 0 do 50 % methanolu v čase t = 5 min. Následovala isokratická eluce 50 % metanolem do času t = 25 min. Mobilní fáze obsahovala jako pufr vždy 0,15 % kyseliny fosforečné. Průtok byl 1,4 ml/min a jako standard byl použit silymarin. 54

55 Kalibrační křivky 1. Kalibrační křivka: Taxifolin x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y = bx + a b = 3, Kalibrační křivka: Silychristin x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a: 0 y: bx + a b: 3,

56 3. Kalibrační křivka: Silydianin x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y: bx + a b = 3, Kalibrační křivka: Silybin B x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y: bx + a b = 3,

57 5. Kalibrační křivka: Silybin A x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y: bx + a b = 3, Kalibrační křivka: Isosilybin A x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y: bx + a b = 3,

58 7. Kalibrační křivka: Isosilybin B x: koncentrace (mg/g) regresní koeficient: 0,9999 y: plocha a = 0 y: bx + a b = 3,28158 Obr. č. 10. Příklad HPLC chromatogramu standard silymarinu. 58