COMBINATION OF ISCO AND BIOREMEDIATION FOR CONTAMINATED SOIL TREATEMENT KOMBINACE ISCO A BIOREMEDIACE KONTAMINOVANÝCH ZEMIN

Transkript

1 COMBINATION OF ISCO AND BIOREMEDIATION FOR CONTAMINATED SOIL TREATEMENT KOMBINACE ISCO A BIOREMEDIACE KONTAMINOVANÝCH ZEMIN Petr Beneš 1), Jiří Mikeš 2), Kateřina Vítková 1), Klára Menšíková 1), Kristina Turnvaldová 1,2), Llorenç Gavilà Terrades 1) 1) Institute of Chemical Technology Prague, Department of Environmental Chemistry, Technicka 5, Prague 6, Czech Republic 2) EPS, s.r.o. V Pastouškách 205, Kunovice, Czech Republic, eps@epsro.cz Abstract: Chlorinated solvents are frequently encountered as subsurface contaminants. They are highly toxic and can be potentially carcinogenic. Their presence in the environment therefore possesses significant health and environmental risks which have required its acute removal from the subsurface in the past. In situ chemical oxidation (ISCO) is a soil decontamination technique mainly used for removal of organic pollutants from the environment in situ. It has been previously described that some microbial species are able to degrade chlorinated ethylenes in the subsurface as part of their normal metabolic pathways. The main aim of this study was to alleviate the drastic conditions of ISCO application and to try combining this technique with bioremediation. Based on this initial idea, the growth of the selected microbial species in the presence of manganese oxide and/or humic acid (main subproducts of ISCO with permanganate) was investigated. Bioremediation of trichloroethylene under these conditions was then studied. Based on the experiments performed, it has been proven that manganese oxides and/or humic acids of concentrations between 1 mg/l and 10 mg/l can stimulate the growth of certain microbial species. Conditions required for such stimulation have been described in this study. Moreover, after the 15-day adaptation period, trichloroethylene was gradually added into the experimental system and it has been proven that the microorganisms present were able to partially degrade the contaminant. Based on the results obtained, reduction of the general ISCO application costs as well as reduction of the environmental impact on treated soil microflora might be possible in the future. Additionally, the final biological stage of remediation after ISCO application might enable us to reach lower contaminant concentration levels and avoid the rebound effect. Key words: ISCO, bioremediation, chlorinated pollutants, manganese oxides, humic acids Abstrakt: Chlorované uhlovodíky jsou často se vyskytující kontaminanty půdního prostředí. Jsou vysoce toxické a některé z nich jsou potenciální karcinogeny. Jejich přítomnost v životním prostředí proto představuje závažný problém pro zdraví i životní prostředí a vyžádala si mnohdy akutní potřebu jejich odstranění. In situ chemická oxidace (ISCO) je remediační technika užívaná především pro odstraňování organických polutantů z půdního prostředí in situ. Dále je známo, že existují druhy mikroorganismů, které jsou schopny v rámci svých metabolických procesů odstraňovat chlorované ethyleny přímo v půdním prostředí. Hlavním cílem této práce je zmírnit drastické podmínky při aplikaci ISCO a zkombinovat tuto technologii s bioremediací. Na základě této myšlenky byl studován růst mikrobiálních kmenů za přítomnosti oxidů manganu a/nebo huminových kyselin (jakožto hlavních produktů ISCO). Dále byly za takto nastavených podmínek studovány možnosti biodegradace trichloroethylenu. Pomocí provedených experimentů bylo prokázáno, že huminové kyseliny a/nebo oxidy manganu jsou v koncentračním rozmezí od 1 g/l do 10 g/l schopny podpořit růst určitých druhů mikroorganismů. V rámci práce byly popsány podmínky takovéto stimulace. Dále byl po 15 dnech adaptace do experimentálního systému dávkován trichloroethylen a bylo prokázáno, že přítomné mikroorganismy jsou schopny tento kontaminant částečně rozkládat. Na základě implementace získaných výsledků v praxi by bylo možné redukovat nejen náklady ale především environmentální dopad ISCO na půdní mikroflóru. V neposlední řadě dočištění lokality pomocí bioremediace po ISCO umožní dosažení nižších cílových koncentrací kontaminantů a předejde rebound efektu.

2 Klíčová slova: ISCO, bioremediace, chlorované kontaminanty, oxidy manganu, huminové kyseliny Úvod, výchozí skutečnosti Schopnost mikroorganismů zapojovat se do širokého spektra procesů, v nichž figurují mimo jiné kontaminanty jako předmět konkrétních transformací, je v mnoha ohledech naprosto unikátní a ojedinělá. Skutečností, proč tomu tak může být, je mnoho. Zjednodušeně však může být řečeno, že základním prostředkem je obrovská flexibilita mikrobiálního metabolismu ve všech čtyřech klíčových oblastech reprezentovaných vhodnými zdroji, kde se jedná o zdroje uhlíku, zdroje redukčního ekvivalentu (elektronů), zdroje energie a v neposlední řadě zdroje terminálních akceptorů elektronů. Jakýkoli metabolismus představuje unikátní systém nejenom redoxních, ale i acidobazických, srážecích a komplexotvorných reakcí. Smysluplné poznávání souvislostí nejenom v rovině principů, ale především ve své komplexnosti, nabízí nové a mnohdy velmi efektivní základy pro nové technologické koncepty. ISCO jako řešení aplikace oxidačního činidla na kontaminovaný systém je známým typem sanačních zákroků. Zdánlivě poznané řešení však neustále překvapuje nabídkou možností pro inovace a zejména optimalizace za účelem efektivního využití v reálné praxi. Velkou základnou pro další a soustavné poznávání je prostá skutečnost, že v důsledku oxidace nastane velká škála změn. Jednu z nejvýznamnějších změn z pohledu bioremediačních řešení reprezentuje i pouhá parciální destrukce molekuly kontaminantu, díky níž se tyto reakční produkty mohou zásadně změnit z hlediska své uplatnitelnosti v systému metabolismu biodegradujících mikroorganismů. Jinými slovy, aplikace ISCO má zásadní dopad na faktor tzv. biologické dostupnosti. Bylo by však chybné se domnívat, že případný pozitivní efekt pramení pouze z této skutečnosti. Rovněž faktor biologické dosažitelnosti může nabývat zcela jiných rozměrů v zamýšleném bioremediačním systému. Vedlejší profit může vycházet z posunů koncentračních rovnovah v prostředí, které různě významně ovlivňují termodynamiku kombinovaných systémů (Sutton et al., 2011). Zásadním efektem tohoto uchopení však s velkou pravděpodobností bude souhra alternativních faktorů v prostředí, jíž může být v prvé řadě vznik nových zdrojů redukčních ekvivalentů a terminálních akceptorů elektronů. Jejich původ vychází z rozpadu tzv. soil organic matter (SOM) na směs rozmanitých fragmentů s nezanedbatelnou biologickou aktivitou. A právě biomimetické uchopení poznatků (napodobení za účelem intenzifikace řešení) vede k velkému důrazu na rodinu látek spojovaných klíčovým termínem huminové látky. Současný stav poznání není jednoznačný v kategorizaci jejich role v bioremediačních procesech. Lze se setkat jak s jejich prokázaným efektem v roli zdroje redukčního ekvivalentu (Trump et al., 2011), tak na pozici terminálních akceptorů (Cervantes et al., 2011). Analogicky figuruje v komplexnosti tohoto tématu uměle uskutečněná dodávka slibně se chovajícího terminálního akceptoru elektronů v podobě oxidu manganičitého. Právě zásadní konverze prostředí do podoby atraktivního kultivačního systému pro specifickou skupinu bakterií označovaných jako mangan redukující bakterie je obrovskou výzvou pro jakoukoliv smysluplnou formu výzkumu a především transferu poznatků do praxe. Tím více posiluje toto tvrzení zjištění, že existuje reálná substituce bakteriemi redukujícími železo, neboť jejich enzymové vybavení vykazuje značně nízkou substrátovou specifitu v alternaci mangan železo na pozici TEA (Nealson et al., 1994). Experiment Materiály a metody Substrát: Vzorek sedimentu odebraný v severních Čechách 50 33'46.520"N, 13 31'21.425"E. Jedná se o sediment pocházející ze dna řeky cca 1,5m pod hladinou. Řeka protéká regionem těžby hnědého uhlí s intenzivní průmyslovou činností a prokázanou rozmanitou kontaminací. Dále se v tomto sedimentu nachází významné množství přirozeného železa. V tomto sedimentu byla předpokládána přítomnost mikroorganismů adaptovaných na kontaminované prostředí s vyšším výskytem železa, případně manganu.

3 Anaerobní kultivace: Všechny vzorky byly po nasazení sledovány po dobu 30 dní, každých 5 dní byla prováděna kultivační stanovení. U některých vzorků byl navíc 10. den po nasazení dávkován trichlorethylen (TCE) a dále byl sledován jeho úbytek. Veškerá kultivační stanovení i manipulace se vzorky byly prováděny tak, aby bylo zabráněno přístupu kyslíku. Počáteční složení vzorků je popsáno v tab. 1. Tab. 1: Složení vzorků huminová kys. (HA M ) [g/l] oxyhumolit (OH M ) [g/l] oxid manganu [g/l] sediment [ml/l] kontaminant TCE [mg/l] A x X 1 B x X 10 C x X 1 37,4 10 D x X 10 E x X X K6 1 X K7 0,1 X K8 x 1 x K9 x 0,1 K5K x X X 40 K6K 1 X K7K 0,1 X 20 K8K x 1 K9K x 0,1 M1 1 x 0,1 M2 0,1 x 0,1 M3 x 1 0,1 x M4 x 0,1 0,1 M5 x x X 40 M6 1 x 1 M7 0,1 x 1 20 M8 x 1 1 M9 x 0,1 1 Kultivační stanovení: Pro účely stanovení celkového počtu heterotrofních anaerobních bakterií byly vzorky ředěny fyziologickým roztokem v poměru 1:10, maximálně však do poměru 1: Při vyšších koncentracích než CFU/ml ve vzorcích dochází k silnému vzájemnému ovlivnění kultury jejich metabolity. Z příslušných ředění, zvolených podle očekávaných koncentrací CFU, byla za anaerobních podmínek dávkována 1 kapka (cca 50 µl) na neselektivní živný agar. Přítomnost živé kultury je identifikována redoxním indikátorem 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloridem (TTC). Projev červeného zbarvení po dvou dnech indikuje přítomnost prosperující mikrobiální kultury. Výsledky jsou detekovány v rozmezí jednoho řádu. Kultivační stanovení byla opakována vždy cca po pěti dnech, takto byl sledován vývoj mikrobiálních kultur během 30 až 50 dní v různých podmínkách vzorků. Do vybraných vzorků byl navíc dávkován kontaminant TCE v množství mg/l. Jeho úbytek byl průběžně určován plynovou chromatografií, analýzou vzorku extrahovaného do hexanu.

4 Příprava oxidu manganu Reakcí vodných roztoků KMnO 4 a Na 2 SO 4, vznikl oxid manganu podle rovnice: 2KMnO 4 + 3Na 2 SO 4 + 4H 2 O 2MnO 2 + 3NaHSO 4 + 2KOH + 3NaOH Z výsledků rentgenové fluorescenční analýzy ukázaných na obr. 1 je patrné, že výsledný produkt je birnessit, jeho spektrum je totožné se spektrem MnO 2, odebraného z vrtu na lokalitě, kde taktéž převládá strukturní modifikace birnessit. Counts Z-MnO Position [ 2Theta] Obr. 1: XRF spektrum MnO 2, odebraného z vrtu na lokalitě Příprava oxidovaných huminových kyselin a oxyhumolitu Vycházíme z experimentálně stanovené spotřeby oxidantu KMnO 4 pro vstupní organický uhlík obsažený v a HA 5,6 g/g (Beneš, 2011). Reakce manganistanu s huminovou kyselinu a oxyhumolitem probíhá zvlášť, ve dvou reakčních nádobách. Nasycený vodný roztok KMnO 4 reaguje s organickými látkami (huminovou kys., oxyhumolitem) po dobu 4 h. Následným okyselením HCl dojde k odstranění oxidů manganu, ty přejdou do roztoku v podobě manganatých kationtů. Pevný podíl oxidačních produktů reakce získaný vakuovou filtrací v následujícím textu označujeme HA M (oxidovaná huminová kyselina), OH M (oxidovaný oxyhumolit). Ty jsou dále promývány vodou až do hodnoty neutrálního ph, aby nedošlo k ovlivnění mikroorganismů změnou ph ve vzorcích. Analýza kontaminantu Jako kontaminant byl použit TCE, do vzorků byl zaváděn Hamiltonovou stříkačkou v množství 10 mg/l až 20 mg/l. Aby byla dokázána schopnost bakteriálních kmenů degradovat TCE, byl sledován jeho úbytek. V průběhu 15 dní, počínaje 13. dnem po nasazení vzorků, byla koncentrace TCE určována plynovou chromatografií na přístroji Hewlett Packard HP 5890 s ECD detektorem. Spolu se vzorky byl také analyzován blank (destilovaná voda a TCE ve stejné koncentraci jako ve vzorcích). Podařilo se tak kvantifikovat jak úniky TCE ze vzorkovnic, tak úbytek TCE, který lze přisoudit čistě mikrobiální degradaci.

5 Anaerobní kultivace s přídavkem oxidu manganu Vzorky A, B, C, D byly nasazeny současně, po dobu 22 dní byla prováděna kultivační stanovení počtu mikroorganismů postupem popsaným v kapitole Materiály a metody. 11. den po nasazení byl do všech vzorků současně dávkován TCE, v průběhu experimentu však docházelo k jeho únikům přes septa vzorkovnic. Výsledky kultivačních stanovení zatíženy chybou, protože se nepodařilo odhadnout správné rozmezí koncentrací, které byly dávkovány na živný agar. Stejné uspořádání experimentu s totožným značením i složením vzorků bylo znovu zopakováno, v tomto druhém běhu už nedocházelo k významným únikům TCE v blanku. V kapitole Výsledky anaerobní kultivace s přídavkem oxidu manganu jsou proto použity výsledky stanovení TCE z druhého běhu, zatímco stanovení růstu vychází z výsledků kultivačních stanovení v prvním běhu. Anaerobní kultivace s přídavkem oxidovaných organických látek (huminové kyseliny a oxyhumolitu) Vzorky K6, K7, K8, K9 jsou svým složením, dle tab. 1, bez zavádění TCE, do vzorků K6K, K7K, K8K, K9K byl zaveden TCE 13. den po nasazení. Stanovení růstu i stanovení úbytku TCE proběhla současně. Anaerobní kultivace s přídavkem směsi oxidu manganu a oxidovaných organických látek Kultivace vzorků M1-M9 proběhla ve stejném uspořádání za přítomnosti syntetizovaného oxidu manganu ve dvou opakováních. Výsledné růstové křivky jsou sestaveny podle výsledků prvního běhu, stanovení úbytku TCE z druhého běhu. Výsledky a diskuse Výsledky anaerobní kultivace s přídavkem oxidu manganu Složení vzorků je uvedeno v tab. 1. Výsledky kultivačních stanovení jsou shrnuty na obr. 2, stanovení úbytku TCE z druhého běhu na obr. 3. Obr. 2: Stanovení růstu ve vzorcích s přídavkem Mn x O y Získané výsledky neprokázaly výraznou podporu růstu mikroorganismů působením přídavku oxidu manganu. Vzorky A, C jsou totožné, jejich odpovědi se však neshodují. Vzorek C nicméně vykazuje podobný trend jako vzorky B, D, rovněž vzájemně totožné svým složením. Kontrolní vzorek E, bez přídavku oxidu manganu nicméně také vykazuje růst sledovaných mikroorganismů. Bylo prokázáno, že takto nastavené anaerobní experimentální podmínky vyhovují sledovaným mikrobiálním kmenům a jejich kultivace je úspěšná. Proto mohly následovat testy s přídavky sledovaného kontaminantu. Po přídavku TCE o koncentraci 10 mg/l v 11. dni po startu experimentu

6 anaerobní kolonie [CFU/mL] ctce[mg/l] vykazují všechny vzorky pokračující nárůst počtu CFU/ml. Tento nárůst může být vysvětlen přítomností bakteriálních kmenů schopných TCE degradovat, případně v jeho přítomnosti prospívat. 10 Blanc A B C D E Čas [dny] Obr. 3: Stanovení úbytku TCE ve vzorcích obohacených Mn x O y Ze stanovení úbytku TCE ve slepém vzorku na obr. 3 je patrné, že dochází jen k mírným únikům TCE. Veškeré stanovené koncentrace ve vzorcích oživených mikrobiálními kmeny jsou pod hodnotou koncentrace slepého vzorku a vykazují kontinuální pokles korelující s pokračujícím růstem počtu CFU/ml. Detekovaný pokles koncentrace TCE je tedy prokazatelně způsobený mikrobiální metabolickou degradací. V případě vzorku D je touto cestou degradováno přes 49 % (hm) přítomného kontaminantu Výsledky anaerobní kultivace s přídavkem oxidovaných organických látek (huminové kyseliny a oxyhumolitu) V tab. 1 je uvedeno složení vzorků, výsledky kultivačních stanovení v průběhu 26 dní jsou shrnuty na obr. 4. Kontaminant TCE v množství 20 mg/l byl dávkován 13. den. Vývoj průběhu koncentrace dávkovaného kontaminantu TCE je ukázán na obr. 5. 1,E+09 1,E+08 1,E+07 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 1,E+01 K6 K7 K8 K9 K6K K7K K8K K9K Obr. 4: Stanovení růstu ve vzorcích s přídavkem organických látek 1,E čas [dny]

7 ctce [mg/l] Všechny vzorky bez kontaminantu TCE (tj. K6 až K9) vykazují po 15. dni kultivace pokles koncentrací mikroorganismů, vyjádřených jako CFU/ml. Naopak všechny vzorky, do kterých byl 13. den dávkován TCE (tj. K6K až K9K), vykazují v následujících dnech nárůst počtu kolonií. Lze tedy usuzovat, že přítomnost v dávkovaném množství nejen že přítomným kmenům nevadí, ale naopak stimuluje jejich růst. Lze ale předpokládat, že tento efekt je vázán právě na přítomnost stimulujících oxidovaných organických látek, které představují velmi dobře dostupný zdroj uhlíku pro příslušné metabolické cykly, kdy v rámci kometabolismu může být zpracováván i přítomný kontaminant. 20 Blanc K6K K7K K8K K9K Čas [dny] Obr. 5: Stanovení úbytku TCE ve vzorcích obohacených organickými látkami (HA M, OH M ) Během prvních 20 dní je patrný výraznější pokles koncentrací nejen ve vzorcích s kultivovanými mikroorganismy, ale i ve slepém vzorku. V době následující již k úbytku ze slepého vzorku nedochází a lze předpokládat, že úbytek TCE ve vzorcích s kultivovanými mikroorganismy je způsoben právě jejich metabolickou činností. V případě vzorků K6K a K8K je touto cestou degradováno přes 45 % (hm) přítomného kontaminantu. Výsledky anaerobní kultivace s přídavkem směsi oxidu manganu a oxidovaných organických látek V tab. 1 je uvedeno složení vzorků, výsledky kultivačních stanovení v průběhu 50 dní jsou shrnuty na obr. 6. Kontaminant TCE v množství 20 mg/l byl do vzorkovnic dávkován 15. den. Vývoj průběhu koncentrace dávkovaného kontaminantu TCE je ukázán na obr. 7. V prvních 15 dnech pozorujeme ve vzorkovnicích velmi intenzivní nárůst počtu mikroorganismů (až o 7 řádů) s výjimkou vozku M5, kde nedošlo k přídavku ani oxidů manganu ani oxidovaných organických látek HA M a OH M. Lze tedy usoudit, že přídavek kombinace oxidů manganu a metabolicky přístupného uhlíku v oxidovaných organických látkách představuje velmi účinný stimulant růstu sledovaných mikroorganismů. V tomto případě byl zaznamenán nejrychlejší úbytek koncentrace kontaminantu TCE. Je patrné, že ve vzorcích s kultivovanými mikroorganismy došlo během 15 dní k úbytku koncentrace TCE z 20 mg až na hodnoty kolem 2 mg/l z čehož (po odečtení úbytku způsobeného úniky - slepý vzorek) více než polovina (přes 52 % hm) byla odstraněna metabolickými cykly přítomných mikroorganismů.

8 ctce[mg/l] anaerobní kolonie [CFU/ml] 1,E+10 1,E+09 1,E+08 1,E+07 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 1,E+01 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 1,E čas [dny] Obr. 6: Stanovení růstu ve vzorcích s přídavkem směsi oxidů manganu a oxidovaných organických látek (HA M, OH M ) 25 Blanc M8 M9 M6 M čas[dny] Obr. 7: Stanovení úbytku TCE ve vzorcích s přídavkem směsi oxidů manganu a oxidovaných organických látek (HA M, OH M ). Závěry V rámci této studie byly provedeny experimenty s cílem popsat možnosti kombinace osvědčené remediační techniky ISCO s manganistanem draselným s bioremediací. Byly zkoumány možnosti stimulace růstu anaerobních mikroorganismů pomocí primárních produktů ISCO (oxidy manganu a oxidované organické látky huminové kyseliny a oxyhumolitu). Dále byl testován potenciál takto stimulovaných mikrobiálních kultur pro degradaci běžných environmentálních polutantů byl zvolen trichlorethylen. Na základě výše publikovaných výsledků lze formulovat následující dílčí závěry: Bylo prokázáno, že při stimulaci oxidy manganu a oxidy manganu s oxidovanými organickými látkami dochází během prvních 15 dní k intenzivnímu růstu sledovaných mikroorganismů (až

9 Oxidy Organ. l. Směs o 7 řádů v případě kombinované stimulace). V případě stimulace pouze oxidovanými organickými látkami k tomuto prudkému nárůstu v prvních týdnech experimentu nedochází. Po přídavku kontaminantu (TCE 10 mg/l až 20 mg/l) nedochází k výraznému snížení počtu živých mikroorganismů v testovaných systémech. Lze konstatovat, že jejich množství buď zůstává na stejné úrovni - v případě stimulace oxidy manganu a oxidy manganu s oxidovanými organickými látkami, nebo dokonce narůstá (až o 3 řády) v případě stimulace pouze oxidovanými organickými látkami. Koncentrace sledovaného kontaminantu (TCE) v experimentálním systému klesá díky fyzikálním vlivům a také pomocí metabolické degradace mikroorganismy. Byly kvantifikovány úbytky, které lze přisoudit výhradně přítomným mikroorganismům. Hodnoty jsou shrnuty v tab. 2. Obecně lze konstatovat, že přítomné mikrobiální kmeny dokázaly degradovat až 50 % (hm) přítomného kontaminantu. Je patné, že v případě stimulace růstu pomocí směsi oxidů manganu a oxidovaných organických látek jsou metabolické procesy stran odstranění kontaminantu nejefektivnější a v testovaných vzorcích klesla koncentrace kontaminantu z 20 mg/l až na 2 mg/l, z čehož více než 50 % (hm) lze přisoudit právě činnosti přítomných mikroorganismů. Tab. 2: Množství kontaminantu TCE (% hm) odstraněné metabolickými cykly přítomných mikroorganismů vzorek % TCE odstraněných mikrobiální cestou vzorek % TCE odstraněných mikrobiální cestou vzorek % TCE odstraněných mikrobiální cestou A 30,2 K6K 45,5 M6 41,9 B 38,6 K7K 28,7 M7 52,2 C 15,1 K8K 45,2 M8 43,9 D 49,1 K9K 31,5 M9 52,4 V rámci studie byly potvrzeny možnosti stimulace určitých druhů mikroorganismů pomocí přímých produktů sanační techniky ISCO (oxidů manganu a oxidovaných organických látek). Dále bylo prokázáno, že za anaerobních podmínek a definované stimulace je možné zvýšit počet těchto mikroorganismů až o 7 řádů. Experimenty s kontaminantem prokázaly, že studované kmeny jsou v rámci svých metabolických cyklů schopny degradovat trichlorethylen, a to z koncentrací až 20 mg/l. Implementace získaných poznatků do běžné sanační praxe v ČR by mohla přinést nejen zmírnění drastičnosti standardní aplikace ISCO, ale také díky využití potenciálu bioremediačního stupně pro dočištění lokality menší zátěž životního prostředí a v neposlední řadě značné finanční úspory. Literatura: Beneš, P.; Studium in-situ chemické oxidace kontaminovaných, Disertační práce 2011, VŠCHT Praha. Francisco J. Cervantes, Ana Rosa Mancilla, E. Emilia Ríos-del Toro, Ángel G. Alpuche-Solís, Lilia Montoya-Lorenzana; Anaerobic degradation of benzene by enriched consortia with humic acids as terminal electron acceptors, J Hazard Mater, 2011, Nov 15; 195: Nealson K. H., Saffarini D.; Iron and Manganese in Anaerobic Respiration: Environmental Significance, Physiology, and Regulation, Annual Review of Microbiology, October 1994, Vol. 48: Nora B. Sutton, J. Tim C. Grotenhuis, Alette A. M. Langenhoff, Huub H. M. Rijnaarts; Efforts to improve coupled in situ chemical oxidation with bioremediation: a review of optimization strategies, Journal of Soils and Sediments, January 2011, Volume 11, Issue 1, pp J. Ian Van Trump, Kelly C. Wrighton, J. Cameron Thrash, Karrie A. Weber, Gary L. Andersen, John D. Coates; Humic Acid-Oxidizing, Nitrate-Reducing Bacteria in Agricultural Soils, mbio Jul- Aug; 2(4): e