DETEKCE PHYTOPHTHORA CACTORUM A P. CAMBIVORA V PLETIVECH JABLONÍ KLASICKÝMI A IMUNOCHEMICKÝMI METODAMI.

Transkript

1 JIŘINA KRÁTKÁ, IVA KŘÍŽKOVÁ A DAVID NOVOTNÝ DETEKCE PHYTOPHTHORA CACTORUM A P. CAMBIVORA V PLETIVECH JABLONÍ KLASICKÝMI A IMUNOCHEMICKÝMI METODAMI. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

2 Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. Mze NAZV QF4074. Metodika je určena pro státní správu. O uplatnění metodiky byla se Státní rostlinolékařskou správu uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN:

3 JIŘINA KRÁTKÁ, IVA KŘÍŽKOVÁ A DAVID NOVOTNÝ DETEKCE PHYTOPHTHORA CACTORUM A P. CAMBIVORA V PLETIVECH JABLONÍ KLASICKÝMI A IMUNOCHEMICKÝMI METODAMI. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

4 Abstrakt: Detekce Phytophthora cactorum a P. cambivora v pletivech jabloní klasickými a imunochemickými metodami. Metodika konkretizuje a optimalizuje postupy, testy a metody, které umožňují přesnou a rychlou detekci P. cactorum a P. cambivora ve větvích a kmenech jabloních. Jedná se o výběr a optimalizaci vhodných postupů při odběru vzorků, izolaci patogenů, mikrobiologických a mykologických testů a imunochemických metod tak, aby bylo možné stanovit přítomnost/absenci jmenovaných druhů hub v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní jak to žádá certifikační schéma pro matečné rostliny jabloní, hrušní a kdouloní vydané Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO). Abstract: Detection of Phytophthora cactorum and P. cambivora in apple tissue by classically and imunochemical methods This methodology concretizes and optimises procedures, tests and methods, which allows precise and quick detection of P. cactorum and P. cambivora in apple branches and stems. The methodology includes choice and optimize of the suitable procedures to sampling, pathogens isolation, microbiological and mycological tests and immunochemical methods. It gives way to determine absence or occurrence of the species in the samples. The methodology is based on requirement of the certification schemes for nuclear stock of Malus, Pyrus and Cydonia issued by European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Oponenti: Doc. RNDr. Michal Tomšovský, PhD. a Ing. Eva Zapletalová Metodika je pro útvary státní správy a mohou ji využívat jakékoliv další pracoviště, které jsou vybaveny pro mikrobiologický rozbor vzorků. Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR.

5 ÚVOD Rod Phytophthora patří mezi škodlivé organismy uvedené v certifikačním schématu pro matečné rostliny Malus, Pyrus a Cydonia, ze kterých je získáván množitelský materiál těchto ovocných dřevin. Seznam byl schválen jako samostatný standard Radou EPPO v r Ve schématu jsou uvedeny konkrétní testy pro detekci virů, fytoplasem a viroidů, pro detekci bakterií a hub nejsou metody detekce konkretizovány (Anonymus 1999). Předkládaná metodika se zabývá detekcí dvou patogenních druhů r. Phytophthora na jabloni a to P. cactorum (Leb. et Cohn) Schröt 1886 (Bayerův kód PHYTCC) a P. cambivora (Petri) Buisma 1924 (Bayerův kód - není). Cíl. Předkládaná metodika konkretizuje a optimalizuje postupy, testy a metody, které umožňují přesnou a rychlou detekci P. cactorum a P. cambivora v pletivech jabloní. Jedná se o výběr a optimalizaci vhodných postupů při odběru vzorků, izolaci patogenů, mikrobiologických a mykologických testů a imunochemických metod. Vlastní metodika. 1. Vizuální zjištění příznaků onemocnění Napadení jabloní houbami rodu Phytophthora se projevuje nespecifickými příznaky. Je to celkové zpomalování růstu rostlin, žloutnutí a usychání listů, abnormálně světle zelená barva listů. Dochází ke zpomalení terminálního růstu mladých stromků a tvorba malých plodů. Tyto příznaky se po infekci jabloní r. Phytophthora nemusí projevit nebo mohou být odpovědí na přítomnost jiných škodlivých organismů. Primárně patogen Phytophthora cactorum vyvolává hnilobu plodů, na kmenech stromů krčkovou a límcovou hnilobu (crown and collar rot). Tyto symptomy onemocnění nejsou často viditelné, protože napadená pletiva jsou ukryta pod kůrou. Patogen prorůstá floémem do kambia, pletiva jsou nekrotická, zbarvená do oranžova až červenohnědě, příp. tmavohnědě. Houba vyvolává rovněž hnilobu kořenů, která je také typická červenohnědým nebo červenooranžovým zbarvením kambia a vnitřní strany kůry. Phytophthora cambivora vyvolává límcovou hnilobu kmenů (viz P. cactorum), hnilobu kořenů a nádorovitost kmenů. Podobné nespecifické primární i sekundární symptomy způsobují další druhy rodu Phytophthora, např. P. cinnamomi, P. syringae, P. megasperma. 2. Odběr vzorků Odběr vzorků pro laboratorní analýzy provádíme při prohlídce porostu nebo jednotlivých stromů jabloní v rámci fytosanitární kontroly zaměřené na kontrolu a průzkum výskytu škodlivých organismů. Z kontrolovaných stromů odebíráme vzorky pro mikrobiologické, mykologické a imunochemické stanovení. Odebrané vzorky kořenů a dřeva z báze kmene se symptomy napadení uložíme do mikrotenového sáčku, který pečlivě uzavřeme, aby nedošlo k vyschnutí a kontaminaci vzorků. Sáčky označíme a připojíme: jméno vzorkovatele, jméno a adresu pěstitele, lokalitu, druh a odrůdu dřeviny, datum sběru. Vzorky co nejdříve dopravíme do diagnostické laboratoře. Vzorky

6 odebíráme i ze stromů, kde nebyly zjištěny symptomy napadení na kořenech nebo na bázi kmenů, ale bylo pozorováno usychání listů a zakrnění plodů. Odebrané vzorky ukládáme v laboratoři do lednice. Jejich zpracování je nutné provést do 24 hodin, maximálně do 48 hodin. 3. Izolace a kultivace patogenů Patogeny se izolují po povrchové dezinfekci (5 % vodný roztok chlornanu sodného 3 minuty a následně 3 krát opláchnout sterilní destilovanou vodou) z odebraného vzorku. Po povrchové dezinfekci se odebrané pletivo sterilně přenese na agarové živné medium v Petriho miskách pomocí vysterilizovaných skalpelů a pinzet. Vhodná média jsou: Czapek-Dox agarové médium, Hohlovo agarové medium nebo bramborový agar (viz Příloha). Takto zpracované vzorky se umístí do kultivačního boxu při teplotě ºC. Po 4-5 dnech je nutné kultury prohlédnout, mycelium narostlých hub vyizolovat na nově připravené agarové medium v Petriho miskách. Tento postup je potřeba několikrát opakovat. Zároveň je nutné připravit z rostoucího mycelia jednotlivých hub mikroskopické preparáty pro identifikaci a prohlédnout pod mikroskopem při použití objektivů zvětšujících krát. Při izolaci a první fázi čištění kultur je vhodné použít Czapek Dox agarové médium, v další fázi kultivace Hohlovo agarové médium nebo bramborový agar. V případě, že nelze jednoznačně stanovit přítomnost P. cactorum nebo P. cambivora na základě morfologických znaků, především při absenci tvorby sporangií na Hohlově mediu, příp. i oospor v pěstované kultuře, je nutno použít selektivní média, Doporučujeme použít mrkvové, které se rychle a snadno připravuje a je cenově nejpřijatelnější. V případě, že není dosaženo cíle, tzn. netvoří se sporangia příp. oospory, je nutné použít další selektivní média v pořadí, jak jsou dále vyjmenovaná: ovesné, glukozo-asparaginové, V8 Juice (viz Příloha). Uvedená média se používají buď s agarem (agarové plotny) nebo tekutá (bez agaru) a kultivace je stacionární. 4. Mikroskopická identifikace patogenů, morfologie sledovaných patogenů Identifikace hub je prováděna na základě vyhodnocení morfologických znaků. V případě sledovaných patogenů jsou vyhodnocovány především tvar a velikost sporangií, přítomnost papily u sporangií, tvar a velikost oogonií, antheridií, přisedání antheridia k oogoniu a velikost a tvar oospor. Phytophthora cactorum Sporangia mají výraznou, terminálně položenou papilu, jejíž tvar může být zcela elipsoidní, ale také oválný až kulovitý. Sporangia mají přechodně krátké stopky (kratší než 4 µm). Sporangia mají rozměry 31,4 ± 4,8 x 26,4 ±4,0 µm. Chlamydospory se tvoří někdy, nebo jen u některých izolátů, často je jejich tvorba ovlivněna takovými podmínkami, jako je izolace z určitého hostitele použití specifického média, nebo teploty při kultivaci (např. se netvoří na bramborovém nebo hrachovém médiu). Jejich velikost je velmi variabilní (25 39,5 µm) a proto při identifikaci houby se nepoužívají. Houba je monothalická. Oogonia mají hladkou stěnu, tloušťka 2 µm, jsou hyalinní, kulovité, velikost µm. Oospory vyplňují celé oogonium (obr. č. 1). Minimální teplota pro růst je 2 ºC, optimum 25 ºC a maximum 31 ºC. Kolonie pěstované houby při 25 ºC na ovesném agaru jsou bílé, nevýrazné, radiální, kompaktní bez jednoznačného ohraničení, načechrané, ale ne husté s krátkými vzdušnými hyfami. Na ovesném agaru nebo na mrkvovém agaru se tvoří oospory nejvíce. Při stacionární kultivaci v Rouxových

7 láhvích P. cactorum na Hohlově mediu vytváří bílé až krémově-bílé kolonie. Optimální podmínky pro kultivaci je teplota 25 C a bez osvětlení. Obrázek č. 1. Phytophthora cactorum: Sporangium s papilou, klíčící oospora produkující sporangia, mycelium, oogonium s oosporou a antheridiem (kresba dle A. Vizari) Phytophthora cambivora Sporangia nemají papilu, tvar sporangií je variabilní od oválného až po elipsoidní, naspodu dobře zakulacené, rozměry jsou variabilní, ovlivněné použitým médiem a případně i hostitelem, ze kterého byla houba vyizolována: délka µm, šířka µm. Sporangiofory jsou jednoduché, nevětvené. Houba je heterothalická. Oogonia jsou kulovitá, velikost µm, stěna je na povrchu bradavičnatá (puchýřnatá), tloušťka 2 µm. Oospory vyplňují zcela, nebo částečně oogonium, velikost µm (obr. č. 2). Minimální teplota pro růst je 2 ºC, optimum ºC a maximum 32 ºC. Kolonie jsou při teplotě 25 ºC na ovesném agaru bílé, nevýrazné, nízké, mycelium je koraloidní, u staršího mycelia lze najít septa, kolonie se rozrůstají na pevném médiu hvězdicovitě až rovnoměrně, mycelium má většinou vzdušné hyfy. Na ovesném agaru nebo na mrkvovém agaru se tvoří oospory nejvíce. Při stacionární kultivaci v Rouxových lahvích P. cambivora na Hohlově mediu vytváří bílé až krémově-bílé kolonie. Optimální podmínky pro kultivaci jsou při teplotě 25 C a bez osvětlení.

8 Obrázek č. 2. Phytophthora cambivora: sporangium bez papily, produkce nového sporangia, bradavičnaté (puchýřnaté) oogonium s dvoubuněčným antheridiem. (Kresba dle A. Vaziri) 5.Příprava a zpracování odebraného vzorku pro detekci pomocí imunochemických testů Skalpelem oloupeme kůru, lýko a povrchovou vrstvu dřeva a vzorek zvážíme. Poté kousky pletiva rozdělíme na menší a vložíme do selektivního média pro předinkubaci (viz Příloha) k nasáknutí (cca na 1 hodinu). Pak slijeme (filtrujeme) a dáme do vlhké komůrky (sterilní Petriho miska se suchým filtračním papírem). Pokud odkapané selektivní médium z kousků pletiva nezvlhčí filtrační papír dostatečně, přidáme 0,5 1 ml selektivního média. Inkubujeme 3 dny při teplotě C. Poté kousky pletiva zvážíme, rozstříháme nůžkami na drobnější a drtíme ve třecí misce s pomocí tekutého dusíku nebo mořského písku. Vzorek extrahujeme v PBS (3 ml/g pletiva, ale zohledníme množství vody, které se do kůry nasáklo ze selektivního média) po 24 hod. při 4 ºC. Centrifugací (4020 g, 10 min, 0 C) oddělíme supernatant od peletu, supernatant buď ihned testujeme, anebo zamrazíme (nejlépe při -45 C nebo nižší teplotě). 6. Detekce patogenů P. cactorum a P. cambivora pomocí ELISA Nepřímá PTA-ELISA na mikrotitrační destičce 1. Aplikován antigen nebo extrakt ze vzorku - ředění: bikarbonátový pufr ph 9,6, nebo PBS, objem: 100 µl / jamku, inkubace: 25 C, 3 h nebo přes noc v lednici.

9 2. Promytí - promývací roztok (PBS s Tweenem), celkem promývání 3-krát po 5 minutách, na závěr z desky vyklepat zbylou tekutinu. 3. Blokace - blokační pufr, množství 200 µl / jamku, inkubace 30 minut při 25 C 4. Promytí - ad Primární protilátka anti-p.cactorum ředění v blokačním pufru: ředíme IgG na koncentraci 0,75 µg/ml, množství: 100 µl/jamku, inkubace: 25 C, 3 hodiny nebo přes noc v lednici. 6. Promytí - ad Konjugát - značený alkalickou fosfatázou (anti-rabbit IgG-AP), ředění v promývacím pufru, koncentrace 250 mu, množství: 100 µl / jamku, inkubace: 25 C, 3 h nebo přes noc v lednici. 8. Promytí - ad Substrát - p-nitrofenylfosfát 1 mg/1 ml substrátového pufru (smíchat těsně před použitím), množství: 100 µl / jamku, inkubace minut. 10. Zastavení reakce: 50 µl / jamku 3 mol / ln NaOH (120 g/1000 ml) tento krok není nutný. 11. Změřit absorbanci při 405 nm na ELISA-readeru. Dot-blot Všechny kroky metody provádíme v jedné vaničce za pokojové teploty a mírného třepání. Nitrocelulózová membrána musí být ve všech používaných roztocích ponořena, po každém kroku postupu se použitý roztok vylije. Ilustrační fotka nitrocelulózové membrány po provedeném testu (obr. č. 3). 1) Kapku extraktu (2 l) opatrně kápneme na membránu podle dopředu stanoveného schématu (dot-blot). 2) Do 15 ml blokačního pufru (2 % BSA v PBS), třepání 1 hod. 3) Slít, dát primární protilátku anti-p.cactorum ředěnou v blokačním pufru (IgG ředíme na koncentraci 0,75 µg/ml), třepání 1 hod. 4) 3 krát promýt v PBS (3 x 3 min.). 5) Nalít 0,01 M Tris-NaCl, ph 8,1 a 3 min. na třepačce, vylít. 6) 0,01 M Tris NaCl, ph 8,1 + konjugát anti-rabbit IgG AP (dle doporučení výrobce, 500 U/ml nebo 2000 x ředěno), třepat ½ hodiny na třepačce, vylít. 7) 3 x promýt 0,01 M Tris-NaCl, ph 8,1 (3 x 3 min. na třepačce). 8) 2 x promýt 0,1 M Tris-NaCl, ph 8,1 + MgCl2 (0,102 g MgCl2.6 H2O na 100 ml Tris = 0,5 mm ), vylít. 9) Nalít substrát, 10 ml/desku (200 l NBC/BCIP Stock Solution do 10 ml Tris+MgCl2), sledovat vývoj zabarvení (na třepačce), vylít. 10) Zastavit v H2O (několikrát promýt).

10 Obrázek č. 3. Test dot-blot provedený na nitrocelulózové membráně (jako kalibrační křivka použit immunogen). Detekce patogenů r. Phytophthora provedena v přirozeně infikovaných stromcích z komerčního sadu (vzorky s označením s byly předinkubovány v selektivním médiu). Hodnocení testů Výsledky imunotestů jsou porovnány s pozitivní kontrolou, kterou může být buď kalibrační křivka koncentrací antigenu, nebo pletivo hostitelské rostliny, které bylo úspěšně inokulováno a prokazatelně infikováno patogenem. Do každého testu je třeba zařadit negativní kontrolu (pletivo z několika prokazatelně nenapadených rostlin), která stanoví prahové hodnoty při prováděném testování. Na základě absorbance dostatečného počtu negativních kontrol (cca 10 měření) stanovíme detekční limit testu (detekční limit = průměr negativních vzorků + 3* jejich směrodatná odchylka). Hodnota detekčního limitu je nejnižší hodnota absorbance, od které je vzorek hodnocen jako pozitivní. Upozornění Připravená polyklonální protilátka pro detekci P. cactorum a P. cambivora je uložena ve Sbírce mikroorganismů a protilátek oddělení mykologie, Odbor rostlinolékařství, VÚRV, a jsou k dispozici pro referenční a diagnostické laboratoře SRS. Použitá kultivační média a pufry viz Příloha Srovnání novosti postupů oproti původní metodice, případně jejich zdůvodnění, pokud se bude jednat o novou neznámou metodiku ( 2, odst. 1, písm. a, bod 2 zákona č. 130/2002 Sb.). Předkládaná metodika obsahuje postupy vhodné pro využití klasických a imunochemických testů a metod, které umožňují detekci r. Phytophthora v hostitelských rostlinách jabloně a které jsou popisovány často jen jednotlivě v různých publikacích, knihách nebo příručkách. Použití imunochemických testů a klasických metod zvyšuje spolehlivost určení přítomných patogenů v hostiteli. V ČR nebyla doposud vypracována metodika pro detekci r. Phytophthora v ovocných dřevinách.

11 Metodika, která koresponduje s předkládanou metodikou byla vydána v r Krátká J., a kol.: Phythophthora fragariae a Colletotrichum acutatum - karanténní houbové patogeny jahodníku (identifikace a diagnostika). UZPI, Praha, zemědělské informace 9/2001, 15 p. Závěr Kombinace imunochemických a klasických metod zvyšuje spolehlivost určení přítomných patogenů r. Phytophthora v hostiteli. Pro detekci P. cactorum nebo P. cambivora je použití klasického postupu, (tzn. izolace z pletiva hostitele, kultivace na médiu a hodnocení pod mikroskopem) spolehlivé, ale časově a technicky náročné. Při izolaci v první fázi kultivace je nejlepší Czapek Dox agarové medium, pro další čištění a kultivaci Hohlovo nebo bramborové agarové médium. Hohlovo médium stimuluje u obou druhů r. Phytophthora především tvorbu sporangií, mrkvové médium tvorbu oogonií, antheridií a oospor. Pokud ke sporulaci na jmenovaných médiích nedochází, použijí se další uvedená agarová média (ovesné, glukozo-asparaginové, V8 Juice) a to agarová i tekutá. Pokud vyizolované kultury nesporulují, nelze jednoznačně detekovat přítomnost r. Phytophthora v pletivu hostitele. Je proto potřeba použít imunotesty. Nejvhodnější je ELISA a to jak na mikrotitračních destičkách tak dot blot. Použití imunochemické metody pro detekci r. Phytophthora v pletivu hostitele je rychlé a jednoznačné, ale ve srovnání s klasickým postupem je finančně náročné. Používané protilátky jsou rodově specifické, nelze rozlišit druh P.cactorum od P. cambivora. Popis uplatnění metodiky, pro koho je určena, jakým způsobem bude uplatněna. Předkládaná metodika je určena pracovníkům Státní rostlinolékařské zprávy, kteří se zabývají diagnostikou houbových patogenů v zemědělských komoditách, pracovníkům, kteří se zabývají certifikací ovocných stromů a pracovníkům vysokých škol, kteří se zabývají obdobnou problematikou. Seznam použité související literatury ANONYMUS (1999): Normes OEPP. EPPO Standards. Certification schemes. Pathogentested material of Malus, Pyrus and Cydonia. EPPO Bulletin 29(3): ERWIN D.C., RIBEIRO O. K. (1996): Phytophthora Diseases Worldwide. APS Press, St. Paul, Minnesota, 562 p. GALLEGLY M. E., Hong Ch. (2008): Phytophthora: identifying species by morphology and DNA fingerprints. - APS Press, St. Paul, 158 pp. JONES A. L., ALDWINCKLE H. S. (1990): Compendium of Apple and Pear Diseases. APS Press, St. Paul, 125 pp. HARLOW E., LANE D. (1999): Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY, 495 pp. Seznam publikací, které předcházely metodice a byly publikovány (pokud existují), případně výstupy z určité znalosti, jestliže se jedná o originální práci.

12 KRÁTKÁ J., KYNĚROVÁ B., SÝKOROVÁ S., PODANÁ M. (1996): The diagnosis of Phytophthora sp. by polyclonal antibodies - observation of antibodies specificity. Ochrana Rostlin, 32: PEKÁROVÁ B., KRÁTKÁ J., SLOVÁČEK J. (2001): Utilization of immunochemical methods to detect Phytophthora fragariae in strawberry plants. Plant. Prot. Sci., 37: KŘÍŽKOVÁ-KUDLÍKOVÁ I., KRÁTKÁ J., PEKÁROVÁ B. (2003): Utilization of immunochemical methods for detection of Phytophthora spp. in apple trees, In: Abstracts of Offered Papers from 8th International Congress of Plant Pathology, Christchurch, New Zealand, 2-7 February 2003 Finančně hrazeno projektem NAZV QF 4074.

13 Příloha Kultivační média a pufry. Bramborový agar V 1 litru destilované vody vaříme 20 minut 250 g. oloupaných na kostičky nakrájených brambor. Uvařené brambory přefiltrujeme přes gázu a filtrát doplníme destilovanou vodou na 1000 ml, přidáme 10 g glukózy a 20 g agaru, upravíme ph na 4,5-5,2 (10 % Na2CO3, resp. 1M HCl). Sterilizujeme 30 min. při 105 0C a po 24 hod. sterilizaci opakujeme. Ještě teplou půdu rozlijeme do Petriho misek nebo zkumavek, po zatuhnutí uchováváme v lednici. Před použitím vytemperujeme na laboratorní teplotu. Abychom zabránili zbakterizování půdy v prvních fázích izolace houby ze vzorku, přidáváme těsně před rozlitím na misky do půdy antibiotika ( U.I. jednotek penicilinu nebo 200 mg streptomycinu /1000 ml média, nebo před poslední sterilizací média přidáme bengálskou červeň (10 ml / 1000 ml média). Příprava roztoku bengálské červeně: 0,5 g. práškové bengálské červeně rozpustit v malém množství lihu a nalít do 150 ml destilované vody. Czapek Dox agar destilovaná voda 1000 ml sacharóza 30 g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0,5 g FeSO4. 7H2O 0,01 g KCl 0,5 g NaNO3. 2,0 g ph upravíme na 6,0-6,2 (1M HCl resp 1M NaOH) agar 20 g Sterilizujeme 2 krát a to pokaždé 20 minut při 105 0C Hohlovo médium V 1000 ml destilované vody postupně rozpustíme Na2CO3 3,0 g K2HPO4 1,0 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g CaCl2.H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,01 g FeCl3.6H2O 0,0016 g ZnCl2 0,001 g EDTA 0,001 g thiamine HCl 0,0003 g guanin 0,05 g asparagin.h2o 0,13 g histidin HCl 0,19 g serin 0,05 g leucin 0,065 g cystein 0,065 g sacharosa 30 g

14 k připravenému roztoku se následně přidá lecitin a sterol rozpuštěné v horkém Tween 20 (asi ve 2 ml) lecitin 0,2 g sterol (β-sistosterol) 0,05 g ph se upraví na cca ph 6,5 agar 20 g 0 Sterilizace 2 krát při 100 C 45 minut. Ovesný agar ovesné vločky agar destilovaná voda 30 g 20 g 1000 ml Vločky vaříme 20 min., přefiltrujeme, doplníme do 1000 ml, autoklávujeme při 121 C 15 min. Mrkvový agar V 500 ml destilované vody se vaří 40 minut 200 g nastrouhané mrkve, poté se přefiltruje přes gázu (několik vrstev) a v případě, že nebyly odstraněny zbytky vařené mrkve, se ještě odstředí při 4000 rpm. Získaná šťáva se doplní do 1000 ml destilovanou vodou, přidá se 20 g agaru a sterilizuje se při 121 0C 20 min 2 krát po 24 hodinách. Glukozo-asparaginový agar glukosa 5g asparagin 0,1 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,0005 g Fe(NO3)3..9H2O 0,0001 g ZnNO3.7H2O 0,0002 g CaCl2.2H2O 0,01 g CuSO4.5H2O 0,00002 g MnSO4.H2O 0,00005 g thiamin HCl 0,001 g destilovaná voda 1000 ml β-sistosterol (rozpustit v etheru a přidat k roztoku) 10 g. ph upravit na ph 6,0 (1N KOH resp. 1M H2SO4) před přidáním agaru (20 g). sterilizace 2-krát při 111 0C 25 minut. V8 Juice agar V8 Juice (354 ml) pufrovat pomocí 5 g CaCO3,míchat několik minut na míchačce, odstředit při 4000 rpm a supernatant smíchat v poměru 1:4 s destilovanou vodou. Přidat β-sistosterol (rozpuštěný v etheru) 0,2 g/ 1000 ml vody, upravit ph na 7,0 (1 N KOH), přidat agar - 20 g/ 1000 ml vody. Sterilizace 2 x při 121 0C, 20 minut Selektivní médium pro předinkubaci vzorků podezřelých z napadení r. Phytophthora:

15 benomyl 100 mg/l lecitin 0,2 g/l β-sitosterol 50 mg/l thiamin HCl 3 mg/l sacharoza 10 g/l ampicillin 100 mg/l V destilované vodě rozpustíme benomyl, thiamin HCl a sacharózu. Steroly (lecitin a βsistosterol) rozpustíme v horkém Tweenu 20 (ne více než 2 ml na litr média). Tween se přivede k varu a pak se přidají steroly a rozmíchají. Doplníme objem do jednoho litru. Ampicillin přidáváme až po autoklávování (20 min, 120 C) a těsně před použitím (po rozpuštění po více než 24 hod. výrazně klesá účinnost). Pokud chceme pevné médium (např. pro reizolace), přidáváme 40 g agaru/l (takto tuhý agar by měl eliminovat růst kolonií bakterií). PBS pufrovaný fyziologický roztok NaCl 8,0 g KH2PO4 0,2 g Na2HPO4.12H2O 2,9 g KCl 0,2 g Doplnit do 1 litru destilovanou vodou, adjustovat na ph 7,2-7,4 Blokační pufr 1 % BSA (bovine serum albumin )v PBS Bikarbonátový pufr Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g NaN3 0,2 g Doplnit do 1000 ml destilovanou vodou, upravit ph = 9,6 Promývací pufr PBS s přídavkem Tween 20, 0,5 ml v 1000 ml Substrátový pufr diethanolaminu (C4H11NO2) 97 ml MgCl2 x 6 H2O 100 mg NaN3 0,2 g destilovaná voda 800 ml ph nastavíme pomocí HCl 36-37% na ph 9,8 a doplníme do 1000 ml destilovanou vodou nebo použít hotový pufr od Loewe Biochemica, katalog. č. D-82054

16 Autoři: RNDr. Jiřina Krátká DrSc., Mgr. Iva Křížková Ph.D, RNDr. David Novotný Ph.D. Název: Detekce Phytophthora cactorum a P. cambivora v pletivech jabloní klasickými a imunochemickými metodami. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně Sazba a tisk: Výzkumný ústav zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně Náklad: 20 ks Metodika je veřejně přístupná na adrese Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: novotny@vurv.cz Autor titulní fotografie: RNDr. David Novotný Ph.D. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., 2008