Makrofágy a parazitární infekce

Transkript

1 Makrofágy a parazitární infekce

2 Funkce makrofágů Profesionální fagocyty Antigen-prezentující buňky (asociace s MHC II glykoproteiny) Producenti cytokinů (IL-12, TNF-α, IL-1 ) Osteoklasty (kosti), mikrogliální buňky (CNS), histiocyty (pojivová tkáň), Kupfferovy buňky (játra)

3 Diferenciace makrofágů

4 Makrofágy a parazitární infekce LEISHMANIÓZA

5 CaMF IFNg, TNFa, IL-12 bakteriální LPS exprese inos produkce NO pro-zánětlivá aktivita podporuje Th1 odpověď mikrobicidní aktivita AaMF IL-4, IL-13, IL-10, TGF komplexy Ag-Ab apoptotické buňky glukokortikoidy prostaglandiny exprese arginázy 1 produkce L-ornithinu a močoviny proti-zánětlivá aktivita inhibuje T-buněčnou odpověď podporuje hojení ran (kolagen)

6 Myš rezistentní k Leishmania major - CaMF C57BL/6 inos

7 Myš vnímavá k Leishmania major - AaMF BALB/c argináza

8 Kupková & Beneš, Chemické listy 98, 2004

9 Griessova metoda; stanovení NO

10 Stanovení arginázové aktivity

11 ÚLOHA Podle poměru mezi arginázovou aktivitou a produkcí NO zjisti, zda makrofágy pocházely z myši rezistentní nebo vnímavé na leishmaniózu. C57BL/6 rezistentní DBA/2 semi-rezistentní BALB/c vnímavá

12 2) stimulace makrofágů 1 zkontrolovat buňky pod mikroskopem a odebrat supernatant stimulace buněk inkubace 72 hodin v celkovém objemu 200 ul, 37 o C, 5% CO 2 zkontrolovat buňky pod mikroskopem odebrat supernatant pro stanovení NO, cytokinů lyze buněk pro stanovení arginázové aktivity na společné kultivační destičce si vyber 2 vzorky (= 2 jamky) přenes 100 ul vybraného vzorku na svojí destičku vyučující přenese zbylých 100 ul vybraného vzorku na společnou destičku (vzorek dej do stejné jamky jako je na kultivační destičce stejné souřadnice) poznamenej si kód vzorku (A1-A10, B1-B10) a podepiš si destičku

13 4) stanovení arginázové aktivity 2 lyze buněk přidej 100 ul 0,1% TritonX, 4 o C, s proteázovými inhibitory inkubuj 20 min na třepačce, v pokojové teplotě na společné kultivační destičce přidej ke svým vzorkům 100 ul 0,1% TritonX

14 3) stanovení NO ul vzorku smíchat s 50 ul roztoku A inkubovat 5 min ve tmě, pokojová teplota ke vzorkům přidat 50 ul roztoku B inkubovat 5 min ve tmě, pokojová teplota kalibrační křivka: NaNO um 0,781 um měřit optickou densitu při 550 nm pracuj na svojí ELISA destičce připrav kalibrační křivku: STD 1 = 100 ul z epinky STD 2 = 100 ul z epinky ul destilky STD 3 = 100 ul STD ul destilky STD 4 = 100 ul STD ul destilky...až do STD8 přidej postupně roztok A a B ke vzorkům a kalibrační křivce zakryj alobalem a nech na stole

15 přidej 100 ul 25mM Tris-HCl 4 aktivace enzymu odeber 100 ul lyzátu buněk do ependorfky přidej 10 ul 10mM MnCl 2, pořádně zavři víčko a krátce stoč inkubuj 10 min při 56 o C (HEATER) přidej 100 ul 0,5M argininu, krátce stoč inkubuj 45 min, 37 o C, 5% CO 2 přidej Tris-HCl ke svému vzorku, promíchej a odeber 100 ul do epinky postupuj dále dle návodu

16 1) výplach peritonea a získání makrofágů 5 myš uspaná 8d. anesteze, vykrvená a zabitá stržením vazu výplach peritonea 10 ml chlazeného média sterilně v boxu stočit 8 min, 1200 rpm, 4 o C sediment resuspendovat ve 3 ml média spočítat buňky - CountessTM Automated Cell Counter 10 ul buněk + 10 ul Trypan Blue, z toho 10 ul na sklíčko nastavení: cell size = 8-20, roundness = 80, sensitivity = 5 naředit buňky na koncentraci 2*10 5 bb/ml média à 100 ul na jamku (tzn. 2*10 4 bb/jamku 96-jamkové destičky) inkubace 2 hodiny nebo přes noc, 37 o C, 5% CO 2 demonstrace peritoneálního výplachu + izolace makrofágů z kostní dřeně 1-2 dobrovolníci si můžou metodu peritoneálního výplachu vyzkoušet

17

18 kalibrační křivka STD 1 = 300 mg/ml, dále dvojkovou řadou až k 19 mg/ml zastavení reakce odeber 100 ul vzorku do nové epinky přidej 200 ul kyselin a 10 ul ISPF, krátce stoč inkubuj 45 min při 100 o C (HEATER) OPATRNĚ vyndej vzorky inkubuj 10 min v pokojové teplotě VE TMĚ (pod alobalem) měření přenes 100 ul vzorku na ELISA destičku měř při 540 nm 6 kalibrační křivka je jen jedna společná dostanete už odebraných 100 ul vzorku, zpracujte dle návodu na měření přenes 100 ul vzorku na společnou ELISA destičku

19

20 urea NO myš A Balb/c A Balb/c A C57BL/6 A Balb/c A5 + + DBA A6 + + DBA A Balb/c A Balb/c A C57BL/6 A DBA A C57BL/6 A DBA B C57BL/6 B2 + + DBA B3 + + DBA B Balb/c B C57BL/6 B C57BL/6 B Balb/c B Balb/c B C57BL/6 B DBA B DBA B Balb/c C Balb/c C2 + + DBA C3 + + DBA C C57BL/6 C Balb/c C C57BL/6 C57BL/6 rezistentní DBA/2 semi-rezistentní BALB/c vnímavá