Cvičení č. 2: Pasážování buněk. 1) Teoretický základ

Transkript

1 Cvičení č. 2: Pasážování buněk 1) Teoretický základ Kultivace buněk in vitro (ve zkumavce) - Snaha o napodobení podmínek v organismu - Používání jednorázového spotřebního materiálu a speciálních chemikálií pro kultivaci buněčných kultur - Vyškolený personál (čistota a přesnost práce) Primární kultura: laboratorní zvíře, člověk (první kultura izolovaných buněk) - Množení buněk - Naředění a přenesení do nových kultivačních nádob = pasážování sekundární kultura/subkultura Primární kultura o normální tkáň omezená životnost (stárnutí kultury) o nádorová tkáň snazší kultivace (rychlá a neomezená proliferace) Kultivační podmínky povrch kultivační nádoby složení kultivačního média teplota: 37 C složení atmosféry: 5% CO2 (odpovídá poměrům v extracelulární tekutině, podílí se na udržení ph médií s bikarbonátovým pufrem) + relativní vlhkost atmosféry 90% (zamezení odpařování vody z kultivačního média) - adherentní buněčné kultury: rostou na vhodném kultivačním povrchu (polystyrenová nádoba s hydrofilním povrchem, popř. potažená adhezními faktory polypeptidy, kolagen, fibronektin, laminin) - buněčné kultury pěstované v suspenzi (např. krevní buňky) promíchávání kultury Inkubátory pro kultivaci buněčných kultur - regulace teploty, koncentrace CO2 - snadné čištění, dezinfekce, sterilizace povrchů Kultivační média - tvoří tenkou vrstvu kapaliny nad adherovanými buňkami dostatečně rychlá difúze O2 a CO2 - výměna média 2x-3x týdně - obsahují anorganické soli, pufry, glukózu, esenciální aminokyseliny, vitaminy, bílkoviny, růstové faktory, mastné kyseliny, lipidy, stopové prvky - přídavek séra pro doplnění významných organických látek (růstové faktory, bílkoviny, vitaminy, stopové prvky) nejčastěji bovinní sérum (fetální telecí=fbs)

2 - fetální sérum - obsahuje více růstových faktorů - sterilizace sér filtrací, tepelnou inaktivací zabrání přenosu virové infekce - ph 7,4 - acidobazický indikátor fenolová červeň (jasně červený při ph 7,4; kyselé ph žlutý; zásadité ph fialový) - rostoucí buňky vylučují do média kyselé metabolity (zežloutnutí nutnost výměny média) - přídavek antibiotik/antimykotik - zábrana kontaminace Růst buněčné kultury A) statická fáze (lag fáze): příprava na buněčné dělení B) exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin C) stacionární fáze (plató): počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů D) fáze odumírání T (osa x)=čas L (osa y)=počet buněk v kultuře - při kultivaci snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk) - kontaktní inhibice zastavení dělení - před dosažením plató fáze se kultura naředí a nasadí do nových kultivačních nádob v takové hustotě, aby rostla opět exponenciálně - konfluence = stav, kdy je vytvořena souvislá vrstva buněk (monolayer), které se vzájemně dotýkají Pasážování buněk - uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem - disociace buněk: odstranění dvojmocných iontů (EDTA chelatačně vážně Ca 2+, Mg 2+ ) a působení proteáz (trypsin)

3 MTT test Tato metoda je založena na redukci žlutého solubilního 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- difenyl tetrazolium bromidu (MTT) na nerozpustný formazan (fialové krystalky). Reakce probíhá na mitochondriální membráně živých buněk. Formazan se rozpustí přidáním okyseleného isopropanolu a zabarvení se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 570 nm (referenční vlnová délka 650 nm). Hodnota absorbance roztoku odpovídá množství živých buněk (čím tmavší barva a tedy vyšší absorbance, tím vyšší procento živých buněk). Princip konverze byl popsán v roce 1954 Blackem a Speerem a metoda byla zavedena do laboratorní praxe Mosmanem v roce 1983 (tzv. kolorimetrický test stanovení životnosti buněk).

4 2) Praktické cvičení: a) Stanovení počtu živých buněk pomocí Bürkerovy komůrky 1. Buněčná suspenze se promíchá s trypanovou modří v poměru 1:1. 2. Vzniklou suspenzí se naplní obě poloviny Bürkerovy komůrky. Je třeba aplikovat takové množství vzorku, aby se komůrka právě naplnila, roztok nesmí přetékat do okolních žlábků. 3. Pod světelným mikroskopem se při nejmenším zvětšení počítají zvlášť živé (bezbarvé) a mrtvé (modré) buňky. Počítá se nejprve 5 čtverců (4 rohové a středový) 1 1 mm v jedné polovině komůrky. Je-li celkový počet buněk menší než 100, počítají se buňky i v dalších 5 čtvercích ve druhé polovině komůrky. Za hranici čtverce se považuje prostřední linka z trojité čáry. Z buněk, které leží na okraji čtverce, se počítají ty, které se i jen dotýkají levého nebo horního okraje, a naopak se nepočítají buňky, které se i jen dotýkají pravého nebo dolního okraje. 4. Počet buněk se vypočítá podle vzorce, kde: P je počet buněk na 1 ml suspenze N je celkový počet buněk D = 2 (ředění suspenze) H = 0,1 (hloubka komůrky v mm) S je počet čtverců 5. Vypočítá se podíl živých buněk v procentech a výsledek se porovná s údajem získaným na automatické počítačce buněk (Luna).

5 b) Praktické cvičení: Pasážování buněk Pasážování se provádí, pokud jsou buňky konfluentní ze 70-80% (pokrývají 70-80% povrchu kultivační nádoby). Zkontrolujte mikroskopicky nárůst buněk a uveďte stupeň konfluence do protokolu. K pasáži jedné 25 cm 2 kultivační lahvičky je potřeba: trypsin, pufr PBS, kompletní médium (DMEM + 10% FBS + 1% glutamin + 1% atb). Před vlastním pasážováním si do boxu připravit vše potřebné - vždy postříkat etanolem, otřít a vložit do boxu. Pasážování: 1. Z kultivační lahvičky odsát médium, přidat k buňkám cca 2 ml PBS pufru. Buňky opláchnout a pufr odsát. 2. Přidat 0,5 ml trypsinu a ihned odsát. Přidat znovu 0,5 ml trypsinu a kultivační lahvičku vložit na 5-10 minut do termostatu (mikroskopická kontrola- zakulacení buněk, plavání v médiu). 3. Po trypsinizaci buňky jemně mechanicky sklepat ze dna a přidat 1 ml připraveného kompletního média. Buňky šetrně resuspendovat v tomto médiu (rozbít shluky buněk). 4. Ponechat cca 200 µl buněčné suspenze v kultivační lahvičce a přidat čerstvé médium (celkový objem 5 ml). 5. Buňky zkontrolovat pod mikroskopem a vložit do termostatu. Ukončení práce: Jednorázový spotřební materiál vyhodit, zbytek umýt. V boxu vypnout laminární proudění, otevřít, vyndat všechny pomůcky, povrchy v boxu a pomůcky otřít dezinfekcí, vrátit do boxu, nechat vysvítit UV po dobu 20 min.

6 c) Nativní preparát buněk bukální sliznice Materiál a pomůcky: Podložní sklíčka, vatové tyčinky, stěr z bukální sliznice. Vlastní pokus: Před odebráním bukální sliznice si důkladně vodou vypláchněte ústa, aby se odstranily bakterie a zbytky jídla. Potom jedním koncem vatové tyčinky několikrát seškrábnete povrch bukální sliznice a získaný materiál rychle rozetřete v tenké vrstvě na čisté podložní sklo. Tento nativní preparát pozorujete v normálním světlém poli. Zakreslete buňky s pozorovanými detaily, uveďte zvětšení mikroskopu a odhad velikosti buňky. 1,8 mm 900 μm 450μm 100x 200x 400x d) Sestrojení kalibrační křivky MTT testu Materiál a pomůcky: 96jamková destička s nasazenými buňkami a roztokem MTT, okyselený isopropanol, spektrofotometr (570, 650 nm). Vlastní pokus: Po skončení inkubace MTT testu odsajte médium a přidejte 200 µl okyseleného isopropanolu (IPA 50 ml IPA + 20 µl koncentrované HCl). Nechte plně rozpustit fialové krystaly. Zabarvený roztok přepipetujte do čistých jamek a na spektrofotometru změřte absorbanci při 570 a 650 nm. Výslednou absorbanci vzorků pak získáte jako rozdíl absorbancí při 570 a 650 nm. Výsledky poté zprůměrujte a uveďte do grafu se směrodatnými odchylkami. Sestrojte kalibrační křivku závislosti počtu buněk na naměřené absorbanci.