Základy laboratorní techniky

Transkript

1 Předmět: Biologie ŠVP: prokaryotní organismy, genetika Doporučený věk žáků: let Doba trvání: 2 x 45 min. Specifické cíle: naučit studenty pracovat s laboratorními pomůckami a přístroji Seznam pomůcek: automatické mikropipety různých objemů, Eppendorfky, PCR mikrozkumavky, centrifuga, elektroforéza, příslušenství na elektroforézu, agaróza, pufr, potravinová barviva, glycerol nebo nasycený roztok cukru Stručná anotace V tomto laboratorním cvičení jde především o to, naučit studenty pracovat s pomůckami a přístroji, které jsou běžnou součástí každé mikrobiologické nebo genetické laboratoře. Na základě nacvičených postupů pak budou provádět praktická cvičení s bakteriemi a vzorky DNA. 1

2 Přípravy pro učitele Motivace Naučit studenty základní metody a způsoby práce používané v mikrobiologické či genetické laboratoři. Teorie 1. Měření objemů pomocí mikropipet Mikropipety jsou přístroje určené k pipetování malého objemu roztoků. Na spodním konci mají odnímatelnou špičku a na horním konci dvoupolohový ovladač (určený k nasávání a vypouštění roztoků) a držák usnadňující manipulaci. Jsou založeny na podobném principu jako injekční stříkačka pro velmi malé objemy. Pro snadnější manipulaci je objem nastavován pomocí mikrometrického šroubu a celá stříkačka je uzavřena do plastového pouzdra o velikosti vhodné k ruční manipulaci (obr. č. 1, obr. č. 2). Obr. č. 1 Obr. č. 2 Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, 2

3 2. Centrifugace Odstřeďování (centrifugace) je jednoduchá základní laboratorní metoda sloužící zejména k oddělování pevných částic z roztoku. Přirozená sedimentace pevných částic způsobená gravitací je urychlena použitím centrifugy, ve které se zkumavky pohybují v tzv. rotoru po kruhové dráze (obr. č. 3). Působí tak na ně odstředivá síla, která je tím větší, čím větší rychlostí a po delší dráze se zkumavky pohybují. Tato síla tedy závisí na poloměru rotoru a na rychlosti, se kterou se rotor otáčí. Odstředivá síla se vyjadřuje v jednotkách g, které vyjadřují, kolikrát se při odstřeďování znásobí hmotnost částic. Vzhledem k velkým silám, které nastávají, je třeba, aby rotor centrifugy byl vždy vyvážen!! obr. č. 3 Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, 3. Elektroforéza nukleových kyselin Úseky DNA, produkty PCR reakce nebo štěpy DNA lze dělit pomocí elektroforézy. Provádí se zpravidla v gelu, a to buď agarózovém, nebo polyakrylamidovém. V obou případech se molekuly, které v zásaditém prostředí nesou záporný náboj, pohybují v elektrickém poli od katody k anodě. Gely tvoří poměrně hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly mluví se proto o technice molekulového síta. Elektroforetická aparatura je zařízení na dělení DNA fragmentů, které se skládá ze zdroje napětí, elektroforetické vany, nosítek na gel a hřebene (obr. č. 4). 3

4 obr. č. 4 Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, Elektroforetická vana je nádoba s vyvýšeným středem pro uložení gelu a dvěma komorami pro elektroforetický pufr po stranách. V nejvzdálenějším místě každé komory je vždy podélně uložená elektroda v podobě tenkého platinového drátku. Ten je propojen s vnějšími konektory, kterými lze elektrody propojit se zdrojem napětí (obr. č. 5). Obr. č. 5 Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, Elektroforéza v agarózovém gelu Agaróza je polysacharid tvořený D-galaktózou a anhydro-l-galaktózou, který produkují některé mořské řasy a pod názvem agar se používá k výrobě gelů v potravinářství, mikrobiologii, imunologii či biochemii. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarózy. Čím je obsah polysacharidu vyšší, tím je lepší rozlišovací schopnost gelu, ale tím je také průběh elektroforézy pomalejší. 4

5 Volba koncentrace agarózového gelu pro elektroforézu DNA Obsah agarózy v gelu Délka fragmentů DNA 0,5 % 1 30 kpb 0,7 % 0,8 12 kpb 1,0 % 0,5 10 kpb 1,2 % 0,4 7 kpb 1,5 % 0,2 3 kpb 2,0 % 50 bp 2 kpb 3 4 % 10 bp 1 kpb Tab. č. 1 Příprava gelu je poměrně jednoduchá. Spočívá v rozpuštění a následném roztavení agarózy v pufru a nalití do elektroforetických nosítek s umístěným hřebenem pro nanášení vzorků. Ten je po utuhnutí gelu vyjmut a do jamek jsou naneseny vzorky (obr. č. 6). Gel je umístěn v elektroforetické vaně a zcela ponořen v pufru. Do jamek se vždy nanáší vzorek s tzv. nanášecím pufrem. Ten obsahuje glycerol, aby vzorek sedl ke dnu jamky a barvu, která působí jako marker, tzn. putuje stejně rychle jako nejmenší fragmenty DNA. Tak je možno včas rozpoznat konec elektroforézy. Společně se vzorky je do gelu nanášen i velikostní standard, který je tvořen směsí fragmentů DNA o přesně definovaných délkách. Obr. č. 6 Zdroj: Gymnázium Nad Alejí, 5

6 Pomůcky a vybavení Automatické mikropipety s objemem 2-20 mikrolitrů, mikrolitrů, mikrolitrů, špičky na příslušnou velikost mikropipet, PCR mikrozkumavky, Eppendorfky o objemu 2mililitry, centrifuga, elektroforéza, agaróza, pufr, voda obarvená potravinovým barvivem, glycerol nebo nasycený roztok cukru Bezpečnost Centrifuga i elektroforéza musí být obsluhována pod přímým dozorem vyučujícího! Především při neopatrné manipulaci s elektroforézou by mohlo dojít ke zranění elektrickým proudem. Při vaření agarózového gelu je nutné používat plášť, rukavice a ochranné brýle. 6

7 Pracovní list pro studenty V mikrobiologické či genetické laboratoři se pracuje většinou s nepatrným množstvím vzorků. Proto jsou nezbytnou součástí laboratoře automatické mikropipety o různých objemech, které zaručí, že laborant nabere přesně požadované množství daného vzorku či dalších chemikálií, které se ke vzorku přidávají. Centrifugace pak slouží zejména k oddělování pevných částic z roztoku. Upravené vzorky (DNA, proteinu) se oddělují pomocí elektroforézy na agarózové nebo polyakrylamidovém gelu. Gely tvoří hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly, tím dochází k jejich oddělení. V následujících úkolech si osvojíme práci s těmito pomůckami, které jsou dnes nezbytnou součástí každé laboratoře. Pomůcky Automatické mikropipety s objemem 2-20 mikrolitrů, mikrolitrů, mikrolitrů, špičky na příslušnou velikost mikropipet, PCR mikrozkumavky, Eppendorfky o objemu 2mililitry, centrifuga, elektroforéza, agaróza, pufr, voda obarvená potravinovým barvivem, glycerol nebo nasycený roztok cukru Úkol 1 Osvojení si práce s automatickou mikropipetou. Postup/návod 1. Do pěti kádinek s vodou rozpustíme přiměřené množství potravinového barviva různých barev a smícháme s roztokem glycerolu nebo nasyceného roztoku cukru. 2. Na mikropipetu nasadíme odnímatelnou špičku. 3. Mikropipetu uchopíme tak, abychom si o ukazováček podepřeli držák a palcem jsme mohli pracovat s dvoupolohovým ovladačem. 7

8 4. Nasátí provedeme takto: ovladač stlačíme do polohy 1 (špička je ve vzduchu), ponoříme do roztoku a pomalu pustíme. Po vyjmutí z roztoku špičku otřeme, abychom odstranili kapky, které ulpěly na vnější straně špičky. 5. Potom mikropipetu ponoříme do roztoku, kam chceme pipetovanou látku přidat. Vypustíme roztok stlačením ovladače do polohy 1 (několikrát stlačíme do polohy 1 a pomalu pustíme, přičemž špička je stále ponořená. Tím se důkladně promyje špička). Vypuštění dokončíme stlačením do polohy 2 a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze 2 ). 6. Pokud opakovaně pipetujeme tentýž roztok, ponecháme na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. V přestávkách mezi pipetováním mikropipetu věšíme na speciální stojan nebo pokládáme vodorovně. Špička se nesmí ničeho dotýkat (nebezpečí znečištění špičky, pracovních roztoků, stolu, oblečení, ). Pokud pipetujeme roztok jiný, odhazujeme použitou špičku do odpadu a nasazujeme špičku novou. Úkol 2 Měření objemů pomocí automatických mikropipet. Postup/návod 1. Napipetujte 1000 mikrolitrů roztoku (s červeným potravinovým barvivem) do 1,5 ml Eppendorfky a označte výšku hladiny fixem. 2. Do 5 připravených PCR mikrozkumavek příslušnými pipetami napipetujte zadané objemy: a) 5 mikrolitrů b) 10 mikrolitrů c) 125 mikrolitrů d) 200 mikrolitrů e) 660 mikrolitrů 3. Nepipetované objemy z pěti PCR mikrozkumavek obdobným způsobem vraťte do původní Eppendorfky. 4. Sloučené objemy tekutin by měly opět sahat k rysce. 8

9 Úkol 3 Oddělování jednotlivých složek směsi. Postup/návod 1. Napipetujte 1000 mikrolitrů barevné směsi do třech Eppendorfek a promícháním obsahu mikropipetou vytvořte homogenní směs. 2. Následně oddělte jednotlivé složky směsi. Použijte centrifugu. 3. Tuhá i tekutá složka směsi se od sebe oddělí, ne dně Eppendorfky se usadí prášek pelleta. Úkol 4: Příprava agarózového gelu na elektroforézu DNA. Postup/návod Příprava 1% agarózového gelu 1 g agarózového prášku na každých 100 ml pufru TAE (Tris-Acetát-EDTA) v koncentraci 1x. Na přípravu nikdy nepoužívejte vodu! Na 1 gel je potřeba cca ml 1% agarózy. 1. Do 250 ml Erlenmeyerovy baňky nasypte požadované množství agarózového prášku a přidejte adekvátní objem pufru TAE 1x (konečný objem v 250 ml baňce by neměl přesáhnout 100 ml). 2. Popisovačem naznačte výšku hladiny pufru v baňce. Roztok zahřívejte v mikrovlnné troubě po dobu cca 3 min. Každých 30 s zahřívání přerušte a krouživými pohyby zamíchejte obsah baňky. Pozor na utajený var! 3. Opakujte, dokud není agaróza zcela rozpuštěná. Ztracený objem vzorku doplňte pufrem TAE 1x (až po vyznačenou rysku). 4. Před nalitím roztok 1% agarózy zchlaďte na C (vytemperovaná vodní lázeň, tekoucí voda). 5. Vždy používejte ochranné rukavice, brýle a laboratorní plášť! 9

10 Nalévání agarózového gelu 1. Připravte si nosítka na gel. Uzavřete oba konce nosítek pomocí lepící pásky a ujistěte se, že páska dobře přiléhá k okrajům. Nosítka umístěte na vodorovnou plochu. 2. Do nosítek umístěte příslušný elektroforetický hřeben. Je nutné, aby každý gel obsahoval alespoň 7 jamek. Podle potřeby můžete použít dva hřebeny (jeden bude na kraji nosítek, druhý uprostřed). 3. Připravte si potřebné množství 1% agarózy (viz výše) a před nalitím ji ochlaďte na C. 4. Do nosítek nalijte 1% agarózu (zuby hřebene musí být ponořené) a až do utuhnutí gelu s nosítky nepohybujte, ani je nepřemisťujte! 5. Gel nechte tuhnout při pokojové teplotě cca min (stane se neprůhledným). 6. Z utuhlého gelu vyjměte hřeben a odstraňte lepicí pásky. Ztuhlý gel umístěný v neprodyšném obalu lze před použitím uchovávat při pokojové teplotě (1 den) nebo v lednici (maximálně 1 týden). 10

11 Domácí úkol 1. Nakresli a popiš obrázek elektroforetické soupravy. 2. Na jakém principu je elektroforéza založená? 3. Jaké faktory ovlivňují rychlost elektroforézy? 4. Jak se nazývá kladná elektroda? 5. Kde po vizualizaci nacházíme nejdelší fragmenty DNA? 11