TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1

2 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně se vyskytujících druhů pomocí modifikace jejich DNA je žhavým tématem současnosti. Můžeme takto vnášet do genomu úseky DNA kódující produkt, který našemu transformantovi zajistí požadovanou vlastnost (např. rezistenci vůči patogenům, zvýšenou odolnost proti vlivům prostředí apod.). Můžeme ale také vypínat geny, které nejsou pro náš účel žádoucí (např. produkce chuťově odporných látek apod.). Kontrola GMO se zakládá na testování přítomnosti cizorodé DNA v genomu testované rostliny. Často se používá metoda PCR (polymerase chain reaction). Jde o amplifikaci úseku DNA omezeného dvěma malými komplementárními úseky (tzv. primery). Primery jsou voleny vzhledem k povaze amplifikovaného úseku. Nejčastěji testované jsou geny pro rezistence, které se používají při konstrukci GMO (např. neomycin-fosfotransferáza, která zprostředkovává rezistenci vůči kanamycinu), nebo promotorové oblasti, které řídí expresi vnesených genů (např. 35S promotor odvozený z viru tabákové mozaiky). Pro naše účely budeme testovat přítomnost genu zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), vneseného pomocí T-DNA, v genomu testovaných rostlin. T-DNA je tzv. transferová DNA, vnášená půdní bakterií Agrobacterium tumefaciens víceméně náhodně do genomu hostitelské rostliny. T-DNA je pečlivě navržená a často obsahuje další geny, třeba geny kódující rezistenci k herbicidu. GFP je protein, který zeleně fluoreskuje, pokud je vystaven ultrafialovému a modrému záření. Jeho původ lze vysledovat k medúze Aequorea victoria a dnes se již můžeme setkat i s jeho variantami, které mají odlišné spektrální charakteristiky (např. YFP (žlutá fluorescence), CFP (fialová fluorescence) aj.). V translační fúzi se zkoumaným proteinem umožňuje vizualizaci jeho lokalizace v buňce. V roce 2008 byla za objev GFP udělena Nobelova cena za chemii (M. Chalfie, O. Shinomura, R.Y. Tsien). 2

3 Zadání praktických úloh k tématu: TESTOVÁNÍ GMO Přehled úloh k vypracování: Úkol 1: Otestujte genom předložených rostlin Arabidopsis thaliana na přítomnost cizorodého genu 1a) Ověřte přítomnost genu pro GFP u rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR 3

4 Praktické úlohy: TESTOVÁNÍ GMO Úkol č. 1: Otestujte genom předložených rostlin Arabidopsis thaliana na přítomnost cizorodého genu Cíl: Seznámit se s technikou genotypování rostlinného materiálu, odlišit přítomnost cizorodého genu a následně ověřit, zda stanovený genotyp odpovídá fenotypu Hypotéza, kterou v průběhu práce ověříme: Vedle možnosti odlišit transgenní rostliny na základě fenotypového projevu (což je někdy nemožné), lze prokázat přítomnost vneseného genu pomocí metody PCR. Dílčí úlohy: 1a) Ověřte přítomnost genu pro GFP u rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR Princip: V případě, že testovaná rostlina nese gen pro GFP, bude po amplifikaci pomocí PCR a následném rozdělení na agarózovém gelu možné pozorovat proužek o velikosti cca 500 párů bazí, vzniklý právě amplifikací z GFP. Tento proužek by měl být jistě pozorován v případě positivní kontroly (tj. rostlin, které jistě nesou gen pro GFP) a měl by chybět u negativní kontroly (rostliny divokého typu (angl. wild type WT)). Výhodou GFP je, že výsledek testování je možné ihned ověřit pozorováním na fluorescenčním mikroskopu. Laboratorní postup: Potřeby: 3 rostliny Arabidopsis thaliana dvě kontrolní (positivní a negativní) a jednu určenou k otestování mikrozkumavky pinzeta a nůžky mikropipety extrakční pufr (200mM Tris-HCl ph 7,5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0,5%SDS) homogenizační tyčinky chloroform centrifuga vortex 4

5 nádobka s ledem izopropanol roztok 2mM TRIS ph 8,5 PCR cycler sada oligonukleotidů (primerů) pro identifikaci kontrolní a mutantní alely 10x pufr pro PCR reakci (dodáván spolu s polymerázou) 10mM dntp Dream Taq polymeráza agaróza 1x roztok TBE (TRIS, kyselina boritá, EDTA) Roztok GelRed Barvička pro nanášení na gel (loading dye) Elektroforéza se zdrojem napětí, hřeben gelový dokumentační systém (GEN-DOC), případně UV komora pro vizualizaci. Provedení úkolu: Izolace DNA. 1. Připravte si potřeby pro extrakci (nůžky pinzetu, kelímek s vodou, mikrozkumavky, mikropipety se špičkami, extrakční pufr, homogenizační tyčinky, chloroform). 2. Opatrně odstřihněte z každé rostlinky 1-2 malé lístky a přeneste je do označené mikrozkumavky. Zbytek rostlinky zachovejte pro pozdější pozorování! Mezi odběry omyjte nástroje v připravené vodě, abyste snížili riziko křížové kontaminace. 3. Do mikrozkumavky přidejte 400µl extrakčního pufru a pomocí homogenizační tyčinky se pokuste materiál co nejpečlivěji rozmělnit. 4. K extrakční směsi přidejte 400 µl chloroformu a umístěte na vortex. Třepejte 1 min. 5. Centrifugujte 3 min při plném výkonu. Mezitím si připravte nové zkumavky o shodném značení. 6. Zkumavky opatrně vyjměte, aby nedošlo k promísení fází, a umístěte do stojánku. Do nové zkumavky přeneste cca 300 µl horní fáze. Pracujte opatrně, nesmí dojít k promísení se spodní fází, což by narušilo další postup izolace. 7. K extraktu přidejte 300 µl izopropanolu a dobře promíchejte. 8. Centrifugujte 5 min při maximálních otáčkách. Následně odstraňte všechnu tekutinu odsátím pipetou, ve zkumavce by měl být patrný opaleskující bezbarvý sediment viditelný při pohledu proti světlu. Sediment často není vidět vůbec! (není to důvod k opakování extrakce). Izolovanou DNA sušte při pokojové teplotě cca 10 min v otevřené zkumavce. Pozor! Je třeba, aby nedošlo k přesušení! (vzorek by se pak špatně rozpouštěl) 9. Sediment rozpusťte ve 100 µl 2mM TRIS ph 8,5. DNA se uvolní do roztoku poklepáváním na zkumavku. 5

6 Amplifikace DNA Celou přípravu PCR reakcí provádějte na ledu! DNA polymerázu skladujte ve vymrazovacím bločku! 1. Připravte si označené mikrozkumavky pro PCR reakce. 2. Z připravené směsi (vody, pufru, deoxynukleozidtrifosfátů dntp, primerů ohraničujících amplifikovanou sekvenci, DreamTaq polymerázy) odpipetujte do zkumavek 19 µl. Pipetujte přesně, v opačném případě by nemuselo stačit pro kolegy! 3. Do každé zkumavky přidejte 1 µl DNA templátu. Pozor, na každou zkumavku použijte novou špičku, aby se zabránilo případným kontaminacím. Nepomíchejte kontroly. 4. Připravené PCR reakce krátce centrifugujte, umístěte zpět na led a vyčkejte, až budou ostatní skupiny hotové. 5. Umístěte společně do PCR cycleru, uzavřete a spusťte nastavený program. Vizualizace DNA fragmentů pomocí gelové elektroforézy, porovnání s fenotypem 1. Do zkumavek s PCR reakcemi přidejte 4 µl nanášecí barvičky (loading dye). 2. Na připravený elektroforetický gel (1 % agaróza rozpuštěná v 1x TBE pufru s přidaným interkalačním barvivem GelRed (1:10000)) s otvory pro nanášení vzorků naneste v obou řadách úplně vlevo standard molekulových hmotností (směs fragmentů DNA o známé velikosti, která slouží jako měřítko testovaných fragmentů). Do každého otvoru naneste 10 µl směsi v pořadí positivní kontrola, negativní kontrola a testovaný vzorek. Vynechávejte jednu pozici mezi vzorky jednotlivých skupin. Pracujte rychle, aby se minimalizoval vliv difúze vzorků v gelu! 3. Elektroforézu zakryjte víčkem a připojte ke zdroji napětí. Pozor, je nutno pamatovat na to, že vzorek se pohybuje od katody k anodě!! Nastavte napětí 110 V a spusťte. 4. Po cca ½ - ¾ h elektroforézu vypněte, vyjměte gel, přeneste do komory gelového dokumentačního systému a zhotovte fotografii. 5. Na základě (ne)přítomnosti proužků na gelu učiňte závěr, zda se ve vašem případě jedná o rostlinu nesoucí gen pro GFP. Vytvořte mikroskopický preparát z kořínků vaší testované rostliny a ověřte správnost vašeho závěru mikroskopickým pozorováním. Otázky: Jak se shodovala vaše analýza s mikroskopickým pozorováním? Co by se stalo, kdyby v důsledku málo pečlivé práce došlo ke kontaminaci DNA polymerázy positivním vzorkem DNA? K jakému pólu se pohybuje DNA v elektroforéze a proč? 6