PAKOMÁŘI JAKO MODEL HODNOCENÍ TOXICITY

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA VÝZKUMNÉ CENTRUM PRO CHEMII ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ A EKOTOXIKOLOGII PAKOMÁŘI JAKO MODEL HODNOCENÍ TOXICITY SEDIMENTŮ Zuzana Rábová Bakalářská práce Brno, Česká republika, 2008

2 vedoucí práce: Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D. konzultant: Bc. Zuzana Ruferová...za velkou pomoc bych chtěla poděkovat vedoucí práce Mgr. Kláře Hilscherové, Ph.D. a konzultantce Bc. Zuzaně Ruferové, která mi trpělivě demonstrovala laboratorní úkony v rámci chovu a testů s pakomáry, obohatila mě o mnoho praktických dovedností a poskytla mi cenné studijní materiály. V Brně, 11. května

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod odborným vedením Mgr. Kláry Hilscherové, Ph.D. a Bc. Zuzany Ruferové. Práce vychází z informací ve vědeckých článcích a odborné literatuře. V Brně, Zuzana Rábová 3

4 Obsah Anotace 5 Abstract 5 1. Úvod Využití pakomárovitých (Chironomidae) jako modelových organismů v ekotoxikologii 7 3. Charakteristika vývojového cyklu a jednotlivých vývojových stupňů pakomárovitých (Chironomidae) Charakteristika jednotlivých vývojových stádií Vajíčko Larva Kukla Imago 3.2 Ekologie. 4. Laboratorní chov pakomárů (Chironomidae) Návod k laboratornímu chovu pakomárů dle OECD a US EPA 5. Provedení testů na základě standardizovaných i nestandardizovaných mezinárodních metodik Standardní 48h/96h test akutní toxicity na larvách 5.2 Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev Standardní 28-d test líhnutí a vývoje Standardní 65-d celoživotní studie 5.5 Dosud nestandardizované metodiky testování toxicity sedimentu s užitím pakomárovitých Chironomidae. 6. Využití modelového sedimentu nebo různě zatížených přírodních sedimentů. 6.1 Kontaminace sedimentu a vody nad sedimentem.. 7. Testování jednotlivých modelových látek a jejich směsí Kovy Pesticidy organofosfáty, pyrethroidy Azaareny (NPAHs) Léčiva Radioaktivní látky Přehled využití pakomárů (Chironomidae) jako indikátorů zatížení v reálném prostředí Bioindikace znečištění vyššími alifáty (HMWHs) 8.2 Hodnocení vlivu herbicidu Magnacide R H pomocí bioindikace na makroskopických vodních bezobratlých Praktické aspekty metodik akutních, semichronických a chronických testů s pakomáry (Chironomidae) Praktické seznámení s chovem a testy s pakomáry (Chironomidae) Závěr Použitá literatura Databáze chemických látek Přílohy

5 Anotace Bakalářská práce se zabývá problematikou využití pakomárů jako modelových organismů v ekotoxikologii. Práce shrnuje informace týkající se laboratorního chovu pakomárů čeledi Chironomidae a ekotoxikologického testování s využitím těchto organismů. Text také uvádí příklady využití pakomárů v biotestech či bioindikačních studiích při stanovování toxicity modelových látek v přírodním nebo artificiálním sedimentu. Použité informace pocházejí z odborných článků a standardních metodik k provedení biotestů vydávaných organizacemi jako OECD a US-EPA. Součástí práce je také praktické seznámení s laboratorním chovem a testováním na pakomárech v podobě jednoduchého protokolu o provedení 18ti denního testu, jehož cílem bylo posoudit vliv krmného režimu v průběhu testu na procento přežití. Abstract The Bachelor Thesis deals with the possible use of chironomids (non-biting midges) in ecotoxicology. It comprises data on laboratory culturing and testing with chironomids as model organisms. The text provides important examples of bioassays and bioindication studies using chironomids as a menas of ecotoxicological assessment of model substances in natural or artificial sediment. The Bachelor Thesis was written on the basis of numerous scholarly articles and guidelines for standardized tests issued by OECD and US-EPA. The work includes a section on the practical aspects of culturing and using chironomids in bioasays and presents a minor protocol of an 18-d test designed to compare the effects of two different feeding regimes on survival. 5

6 1. Úvod Pakomárovití (Chironomidae) jsou jako zástupci bentických bezobratlých významným modelovým organismem v ekotoxikologii. Pakomárovití jsou velmi důležitou skupinou v rámci přírodních akvatických ekosystémů, protože zde bývají dominantním článkem na úrovni konzumentů prvního řádu (Lindegaard 1997). Zásadní roli v ekotoxikologických biotestech hrají především druhy Chironomus riparius a Chironomus tentans, kteří jsou dnes již běžně užíváni ve specializovaných laboratořích k posuzování toxicity sedimentu. Chov pakomárů v laboratoři je poměrně snadný, jejich životní cyklus je krátký a přiměřená senzitivita ke znečištění umožňuje využití těchto organismů při sledování subletálních parametrů v testech (Janssens de Bisthoven 1998). Testy s pakomáry se nejčastěji provádí dle metodik standardizačních organizací jako OECD, ISO, US-EPA, ASTM a dalších, které přesně stanovují veškeré podmínky, za účelem minimalizace variability výsledků. Při provádění testu je možné se odkázat na velké množství odborné literatury, která uvádí důležité informace získané v již provedených testech, čímž se zjednodušuje práce např. při hledání rozsahu testovaných koncentrací, navíc je tak možné ušetřit zbytečnou práci a náklady. Pakomáry lze také využít v bioindikačních studiích, protože zastoupení určitých druhů odpovídá míře znečištění a svou citlivostí jsou pakomáři mnohdy výhodnějším modelem než zástupci producentů (Albarino et al. 2006). Laboratorní práce s pakomáry vyžaduje zkušenost a existuje mnoho praktických aspektů, které je třeba mít při provádění testů a péči o chov neustále na vědomí. Bakalářská práce si klade za cíl přehledně zpracovat informace týkající se všeobecného využití pakomárů v ekotoxikologii, jejich životního cyklu, laboratorního chovu a standardizovaných testů na tomto modelu. Dalším bodem je náhled do problematiky testování toxicity jednotlivých modelových látek na příkladech akutních či chronických testů z odborné literatury. Práce má přinést stručný příklad bioindikačního potenciálu pakomárovitých, dále výpis praktických aspektů spojených s chovem a testováním na pakomárech a v závěrečné části také praktické seznámení s chovem a testy v laboratoři v podobě cvičného biotestu. 6

7 2. Využití pakomárovitých (Chironomidae) jako modelových organismů v ekotoxikologii Pakomárovití (Chironomidae) se stali modelovými organismy již před více než sto lety a dnes bývají zástupci této čeledi rutinně užíváni v laboratorních testech (bioassays) k posouzení toxicity sedimentů (Grosell et al. 2006). Důvodů, proč jsou právě pakomáři, a to především zástupci rodu Chironomus, vhodným modelovým organismem pro laboratorní testování, je hned několik: Prvním může být fakt, že populace pakomárů hrají v přírodě zcela zásadní roli, protože často bývají dominantními konzumenty 1. řádu v rámci sladkovodních akvatických ekosystémů. Díky značné abundanci jsou tedy významným článkem potravního řetězce, neboť představují zdroj potravy pro dravé bezobratlé a ryby. Toto nám umožňuje pozorovat důsledky kontaminace na úrovni populací, potravních řetězců až celého ekosystému. Druhým z důvodů je relativně krátký životní cyklus pakomárů chovaných v laboratorních podmínkách, přičemž jednotlivá životní stádia lze snadno rozlišit a pozorovat. Dalším důležitým důvodem k častému využití pakomárů v ekotoxikologii je skutečnost, že larvy pakomárů vykazují citlivost vůči znečištění (Lopes 2005). Zároveň je výhodou, že zástupci rodu Chironomus dokážou do jisté míry stres způsobený chemickou kontaminací překonávat, proto můžeme provádět řadu subletálních testů a sledovat různé parametry jako například: délku a váhu těla larev, suchou váhu a energetický obsah, podíl vylíhnutých dospělců, četnost deformací, eluční píky proteinů vážících kovy apod. (Janssens de Bisthoven 1998). Velikost pakomárů nám dovoluje snadno měřit biomarkery, dostupná je i epiteliální buněčná linie s lokalizovaným ekdysteroidním receptorem (Lammerding-Koppel et al. 1998; Grebe et al. 2000). Dalším faktem, který hovoří pro použití pakomárů, je znalost struktury G chromozomu, čehož se vyžívá pro stanovení vlivu kontaminace na úrovni genů (Ruferová 2005). Navíc jsou dostupné modely populačního růstu pakomárovitých (Lopes 2005; Péry et al. 2006), což výrazně přispívá k efektivní analýze dat z celoživotních testů a hodnocení vlivů na úrovni populací. V neposlední řadě je třeba také zmínit to, že užití pakomárů v testech toxicity má dnes již určitou tradici, na tomto modelovém organismu bylo zpracováno mnoho studií, máme tedy možnost porovnávat výsledky v celosvětovém měřítku (OECD 2006), případně moderními metodami meta-analýzy prohlubovat výpovědní hodnotu již získaných dat (Hose et al. 2006). Laboratorní testy založené na pakomárech mají i určité nevýhody, ty však nejsou v převaze, proto můžeme bezpochyby tvrdit, že se jedná o výhodný nástroj k posouzení toxicity sedimentu. 7

8 3. Charakteristika vývojového cyklu a jednotlivých vývojových stupňů pakomárovitých (Chironomidae) Pakomáři zastupují v ekotoxikologických testech skupinu makroskopických bezobratlých žijících na rozhraní sedimentu a volného vodního prostředí. Konkrétně jsou pakomárovití (Chironomidae) čeledí z řádu dvoukřídlého hmyzu (Diptera) a to v rámci jednoho z fylogeneticky původnějších podřádů (Nematocera) (Epler 2001), jde tedy o zástupce hmyzu s proměnou dokonalou (kohorta Holometabola) s 4 morfologicky i funkčně oddělenými vývojovými stadii vajíčko, larva, kukla, imago (viz obr. 1) (Sedlák 2006). Obrázek 1: Životní cyklus pakomára 3.1 Charakteristika vývojových stádií: Vajíčko Vajíčka pakomárovitých jsou podlouhlá, měří v rozsahu od 0,15 do 0,6 mm. Barva chorionu se v průběhu vývoje vajíčka pozoruhodně mění (Lindegaard 1997). Uspořádání vajíček je u různých taxonů různé, časté však bývá seskupení vajíček do řad ve dvou vrstvách. Samičky kladou shluky vajíček na hladinu, vajíčka v těchto shlucích jsou spojena želatinózní hmotou a mohou čítat až 600 kusů (Lopes 2005) Larva V larválním stadiu vývoje prochází jedinec 4 instary, přičemž první instar bývá převážně planktonický, kdežto larvy v následujících instarech žijí zavrtané v sedimentu (Lopes 8

9 2005). Larvální stadium trvá od 2 týdnů až po několik let (arktické druhy), délka trvání tedy závisí na teplotě (Mandaville 1999). Tělo larev je rozlišené na hlavu, hruď a zadeček a jeho délka se pohybuje v rozmezí od 2 do 30 mm. Barva těla může být od bílé, přes žlutou, zelenou, červenou, fialovou a růžovou až po hnědou, zatímco lidově bývají larvy pakomárů označovány jako krvaví červi (Mandaville 1999). Hlava larev nese 3 oční jamky umístěné po stranách, dále tykadla složená ze 4-8 článků, čelisti s několika zoubky a dobře vyvinuté mentum se sklerotizovanými zoubky (viz obr. 2). Hruď se skládá ze 3 článků, první z nich nese pár panožek. Zadeček je tvořen 9 články, poslední nese pár panožek a 4 nebo 6 análních tubulů. U některých rodů např. Chironomus nalézáme ještě 2 páry ventrálních tubulů na 8. zadečkovém článku a pár postranních tubulů na 7. zadečkovém článku. Larvy mohou být volné nebo žijí trvale ve schránkách (eutrofní vody), které si vytvářejí z detritu, řas a částic sedimentu (Lopes 2005). Odtud prohledávají okolí za účelem získávání potravy nebo filtrují vodu přímo ve schránce samotné (Lindegaard 1997). Larvy pakomárů mají uzavřený tracheální systém, a tudíž jejich dýchání závisí na příjmu kyslíku z okolního prostředí přes povrch těla do hemolymfy. Většina pakomárovitých má v hemolymfě obsažen hemoglobin, což jim zajišťuje příjem stále stejného množství kyslíku do těla, i když jeho koncentrace v okolním prostředí klesá. Tato vlastnost umožňuje některým pakomárovitým především rodu Chironomus přežívat v podmínkách se sníženým obsahem rozpuštěného kyslíku, jako jsou organicky znečištěné toky nebo profundál eutrofních jezer (Lindegaard 1997). Schopnosti rodu Chironomus přežívat značné znečištění a nepodléhat stresu z nedostatku kyslíku využíváme v laboratorních testech. Obrázek 2: Larva pakomára, vpravo detail larvy Kukla Vývoj v kukle trvá zpravidla jen několik dnů. Délka kukly je v rozsahu 1,5 25 mm. Stejně jako u larvy i zde můžeme rozlišit hlavu, hruď a zadeček (viz obr. 3). V hrudní části jsou uschovány nohy, křídla a haltery (kyvadélka). V zadní části hrudi se nachází pár tzv. hrudních trubiček, které mohou být větvené jde o respiratorní orgán (Lindegaard 1997). Kukly aktivně 9

10 putují k hladině, kde následuje ekdyze a líhnutí dospělců, kteří jsou hned vzápětí schopni letu (Lopes 2005). Obrázek 3: Kukla pakomára Imago Dospělci pakomárů dosahují velikosti 25 mm, podobají se komárům, ale na rozdíl od nich nesají krev, mají zakrnělé ústní ústrojí (vůbec nepřijímají potravu) a tykadla hustě ochmýřená, a to především u samců (viz obr. 4). Jsou velmi krátkověcí imago přežívá jen několik dnů. Na hlavě jsou po stranách výrazné oči, hruď nese nohy, křídla a haltery. Křídla jsou obvykle pokryta chloupky tzv. makrotrichiemi. Pohlavní orgány pakomárů nazýváme hypopygium jde o modifikovaný 9. zadečkový článek s přívěsky = gonocoxit a gonostylus (Lindegaard 1997). Dospělci se často líhnou synchronizovaně ve velkých množstvích a tvoří hejna nad vodní hladinou. U pakomárů často pozorujeme proterandrii samečci se líhnou o 4-7 dnů dříve než samičky (US-EPA 2000), tento jev zvyšuje reprodukční úspěch a hraje roli při páření nepříbuzných jedinců - outbreedingu (Servia et al. 2005). V hejnech dochází k páření, samičky následně nesou oplodněná vajíčka v rosolovitém shluku na konci zadečku a kladou jej nahodile do vody. Obrázek 4: Vlevo kopulující dospělci, uprostřed a vpravo dospělý sameček 10

11 Ekologie Pakomárovití jsou kosmopolitně rozšířeni, nepochybně je můžeme považovat za nejúspěšnější skupinu vodního hmyzu, která obývá všechny typy sladkovodních habitatů a úspěšně se rozšiřuje i v brakických a pobřežních mořských vodách (Lindegaard 1997). Pakomárovití jsou nejčetnější skupinou makroskopických vodních bezobratlých a to jak v počtu druhů, tak v četnosti jedinců (Epler 2001). Četnost larev v sladkovodním sedimentu běžně dosahuje až jedinců na m 2, což činí v průměru 60 % veškeré bentické produkce. Pakomáři jsou oportunisté, rychlost růstu závisí na teplotě a dostupnosti potravy, proto se v laboratorních podmínkách jedinci obvykle vyvíjí rychleji a životní cyklus se tak zkracuje. V přírodě mírného pásma je většina druhů uni- nebo bivoltinních, tzn. že za jednu vegetační sezónu vytvoří 1-2 generace (Lindegaard 1997). Trofické vztahy pakomárovitých jsou velmi rozmanité většina larev je všežravá spásají řasy, živí se rozsivkami, detritem apod. (Mandaville 1999). Dospělci zpravidla potravu již nepřijímají. Dle Lindegaarda můžeme pakomárovité rozdělit na základě ekologických předpokladů na lotické (tekoucí voda) a lentické (stojatá voda). Zastoupení jednotlivých druhů nebo celých podčeledí má pak důležitou vypovídací hodnotu o charakteru prostředí, případně o kvalitě vody (Williams 1992). 4. Laboratorní chov pakomárů (Chironomidae) Chov pakomárů v ekotoxikologické laboratoři je výhodné udržovat v případě, že se taková laboratoř opakovaně (nejednorázově) zabývá testy na hodnocení toxicity sedimentu užitím těchto organismů, protože laboratorní chovy jsou stálým a homogenním zdrojem pokusných zvířat. V případě jednorázového testování je možné zakoupit organismy přímo ve specializovaných laboratořích 1. Chov pakomárů v laboratoři je poměrně jednoduchý, ale i přesto vyžaduje pravidelný dohled, obsluhu a stabilní podmínky teplota, osvětlení, provzdušňování apod. Pokyny pro nastavení těchto podmínek a všeobecný postup při chovu a testování poskytují různé organizace, zdarma je lze získat na webových stránkách americké Agentury pro ochranu životního prostředí (US-EPA) a Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD). 1. Kontakt na specializované laboratoře, které se zabývají chovem pakomárů a poskytují tyto organismy, jak pro zakládání nových kultur, tak k jednorázovému použití, lze získat buď na serveru Chironomid Home Page: < nebo v metodických pokynech pro stanovování toxicity sedimentu pomocí vodních bezobratlých vydaných americkou agenturou na ochranu životního prostředí US EPA: < 11

12 Neexistuje žádná zcela jednotná metodika a postup pro laboratorní chov pakomárů, ale známe všeobecné principy, které by měly být dodržovány ve všech chovatelských laboratořích. Organismy v laboratorním chovu musí být jasně taxonomicky definované a zdokumentované. V laboratorních chovech se využívají především dva druhy pakomárů: Chironomus tentans a Chironomus riparius. 4.1 Návod k laboratornímu chovu pakomárů dle OECD a US EPA (US-EPA 2000; OECD 2004) Pro založení nové kultury umísťujeme vajíčka pakomárů do nádoby - zpravidla skleněného akvária (velikost závisí na velikosti chovu, běžně 19 l / 6-8 l vody) s 8-10 mm silnou vrstvou křemenného písku nebo křemeliny a několika centimetrovou vrstvou měkké vody. Nad hladinou musí být zachováno dostatečné místo pro líhnoucí se pakomáry, přičemž strop akvária je přikryt síťovinou (viz obr. 5). Pakomáry chováme při teplotě 23±1 C, fotoperiodě 16:8 (16 hodin světlo, 8 hodin tma), osvětlení 1000 lux a relativní vzdušné vlhkosti vyšší než 60%. Voda může být buď studniční, vodovodní (nechlorovaná) nebo uměle připravená dle metodických pokynů z deionizované vody a iontů (makroelementů a stopových prvků). Při chovu je třeba pravidelně měřit jednotlivé parametry, které popisují chovné vodní prostředí: teplota (denně nebo kontinuálně), rozpuštěný kyslík (týdně), tvrdost vody, bazicita, amoniak a ph by se měly měřit aspoň jednou za čtvrt roku. Chovné nádoby mohou být buď průtokové nebo statické. Technické řešení průtokových systémů bývá složitější a uspořádání může být různé, vždy však platí, že voda v chovných nádobách je kontinuálně obměňována, čímž se přirozeně snižují ztráty na kultuře způsobené poklesem kyslíku nebo hromaděním metabolitů. Průtokové nebo cirkulující systémy šetří obsluhu a jsou důležitým krokem k postupné automatizaci celého procesu. Statické uspořádání je technicky jednodušší, avšak vyžaduje častější a náročnější obsluhu. Podmínky v chovných nádobách se u statických systému mohou značně měnit mezi dvěma výměnami vody, proto je třeba obzvlášť pozorně sledovat všechny výše uvedené parametry především hladinu rozpuštěného kyslíku, která nikdy nesmí klesnout pod 2,5 mg/l. V případě, že kyslík klesne pod kritickou hodnotu, chov je třeba provzdušňovat (cca 1 bublina/s). Pravidelně musíme také pozorovat celkový stav organizmů důležitá je například barva larev, která by měla být sytě červená jeví-li se totiž organismy nezdravě a ve stresu, nemohou být použity pro ekotoxikologické testování. Vodu při statickém uspořádání měníme jednou za měsíc nebo jednou za dva měsíce. Při výměně vody jak ve statickém tak v průtokovém systému dbáme na to, aby proud vody zbytečně nerozrušoval sediment a schránky pakomářích larev. 12

13 Nezbytnou součástí chovu pakomárů je krmení. Larvy pakomárů krmíme vločkovým krmením pro akvarijní ryby (Tetrafin R ), do chovné nádoby přidáváme 0,25 0,5 mg rozemletých vloček na larvu a den. Potravu aplikujeme v podobě suspenze (1,25 g sušených vloček na 100ml vody). Krmivo by také mělo obsahovat přídavek vápenného prášku, čímž zabráníme poklesu ph. Dodáváme-li krmiva příliš mnoho, mohou se v nádobě rozvinout bakteriální a plísňové nárosty, což vede k poklesu rozpuštěného kyslíku. Přidáváme-li nedostatečné množství krmiva, larvy mají tendenci opouštět sediment a vznášet se ve vodním sloupci. Jako krmivo mohou být také přidávány buňky zelených řas (Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus). Líhnutí dospělců nastává při chovu ve 23 C asi po třech týdnech od vykulení z vajíčka. Dospělci vylétají nad hladinu a usedají na stěny síťové klícky, odkud je musíme opatrně odsát a přemístit do snubní komůrky (= reprodukční nádoba). Snubní komůrka (viz obr. 5 a 7) může mít nejrůznější podoby, lze ji například jednoduše vyrobit z Erlenmayerovy baňky, kam na svislo umístíme pevnou síťku ta slouží samičkám jako podklad pro kladení vajíček. Do baňky nalijeme ml vody a hrdlo uzavřeme síťovinou jako u chovné nádoby pro larvy. U dospělců si všímáme poměru zastoupení pohlaví, ideálem pro efektivní oplodnění je poměr 3:1 ve prospěch samiček. Samičky kladou shluky vajíček na připravenou síťku, dospělci pak brzy umírají. Shluky vajíček poslouží k založení nové kultury nebo k testování kontaminovaných sedimentů. Pro založení nové laboratorní kultury postačí 5 shluků vajíček, které vysadíme do chovné nádoby. Potravu nepřidáváme, dokud se z vajíček nevylíhne první larvální instar, což obvykle trvá 2-4 dny. Životní cyklus druhu Chironomus riparus (21-28 dnů) je v laboratorních podmínkách zpravidla o několik dnů kratší než u druhu Chironomus tentans (25-30 dnů). 13

14 Obrázek 5: Realizace chovu pakomárů v laboratořích Recetox; vlevo nahoře chovné nádoby v záchytné klícce, vlevo dole snubní akvárium, vpravo detail chovné nádoby vzdušnění Pasteurovou pipetou 5. Provedení testů na základě standardizovaných i nestandardizovaných mezinárodních metodik (US-EPA 2000; OECD 2004) Testy na stanovování toxicity sedimentu s užitím pakomárů jsou dnes již velmi rozšířené, a proto byly standardizovány několika světovými organizacemi za účelem možnosti srovnání a lepší interpretace výsledků testů prováděných v různých laboratořích. U standardizovaných testů jsou přesně definovány veškeré podmínky, kroky postupu i způsob vyhodnocování, aby se u sledovaných parametrů minimalizoval nebo aspoň sjednotil vliv pozadí a statistického zpracování na výsledky. Jednotlivé organizace poskytují tyto velmi detailně vypracované postupy buď zdarma anebo za úplatu2. Bezplatným zdrojem směrnic k testům je americká Agentura pro ochranu životního prostředí (US-EPA) a Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD). 2. Organizace poskytující standardní postupy k provádění testů s užitím pakomárů zdarma: Organizace Web < OECD nw=1/rpsv/ij/oecdjournals/ x/v1n2/s18/p1> < US EPA Environment Canada 14

15 Tabulka 1: Přehled doporučených metodik k testům s pakomáry Vydávající organizace Identifikační číslo Rok Název dokumentu Délka testu OECD OECD Guidelines for testing of chemicals, Sediment-Water 10 - d 28 - d Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment OECD OECD Guidelines for testing of chemicals, Sediment-Water 10 - d 28 - d Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water US-EPA 600/R-99/ Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sedimentassociated Contaminants with Freshwater Invertebrates. - Test Method 100.2: Chironomus tentans 10-d Survival and Growth Test for Sediments 10 - d - Test Method 100.5: Life-cycle celoživotní Test for Measuring the Effects of Sediment-associated Contaminants on Chironomus tentans BBA U Long-term toxicity test with Chironomus riparius: development and validation of a new test system 28 -d Environment Canada EPS 1/RM/ Biological Test Method: Test for Growth and Survival in Sediment Using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius) ASTM E Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates 10 - d 10 - d Existují 4 základní typy testů: 1. Standardní 48 hod / 96 hod test akutní toxicity na larvách 2. Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev 3. Standardní 28-d test líhnutí a vývoje 4. Standardní 65-d celoživotní studie Postupy a podmínky pro provedení jednotlivých testů jsou velmi podobné, testy se liší dobou expozice a především sledovanými parametry, na základě kterých testy vyhodnocujeme. Všeobecně platí, že při testování musíme průběžně sledovat všechny zadané veličiny a důsledně dbát na dodržení podmínek obzvlášť na množství rozpuštěného kyslíku. Při přemisťování 15

16 dospělců nebo vajíček je třeba postupovat co nejopatrněji, abychom je nezranili. Při stanovování váhy organismů určujeme vždy váhu sušiny prosté popelovin (AFDW- ash free dry weight), neboť se ukázalo, že vnitřní obsah střev larev často vykazuje značné množství nestravitelných částic sedimentu toto množství je však variabilní a při započtení váhy těchto zrníček sedimentu do váhy organismu bychom se dopouštěli chyby (US-EPA 2000). Praktickou alternativou k náročnému stanovování AFDW je měření délky těla larev, neboť bylo prokázáno, že AFDW a délka těla spolu těsně korelují (US-EPA 2000) (viz Graf 1). Graf 1: Závislost AFDW na délce těla larev (US-EPA 2000) Počet opakování, rozsah a faktor ředění mezi testovanými koncentracemi závisí na cíli experimentu. US-EPA doporučuje 8 opakování/koncentraci v 10-d testu a 12 opakování/ koncentraci v celoživotním testu, kdežto OECD v celoživotním testu doporučuje testování 5 různých koncentrací aspoň po 3 opakováních/koncentraci (f<2) při stanovování EC x a po 4 opakováních/ koncentraci při stanovování LOEC a NOEC. Test můžeme považovat za validní v případě, že v kontrole přežívá více než 70 % jedinců (u 10-d testu) nebo se vylíhne více než 50% jedinců (celoživotní test). Splněny musí být i další parametry uvedené v tabulkách 1 a 3 v příloze. Při stanovování procenta přežití za mrtvé považujeme larvy, které se nepohybují ani nereagují na podráždění, a zároveň larvy které se nepodaří v sedimentu při přesívání objevit (rozdíl počtu celkově vysazených a na konci objevených larev). Při zpracování výsledků se užívá statistických metod (viz tab. 2) uvedených ve směrnicích OECD a US-EPA (US-EPA 2000; OECD 2004). 16

17 Tabulka 2: Statistika pro zpracování dat (OECD 2004) ECx NOEC, LOEC Závislost citlivosti na pohlaví Procento vylíhnutých jedinců Regresní analýza ANOVA Chi-square test Cochran-Armitage test, Fisher s exact test, Mantel- Haentzal test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin transformace) Jako referenční chemikálie lze použít např. lindan, trifluralin, pentachlorfenol, chlorid kademnatý a chlorid draselný (OECD 2004). Výstupem testu je tzv. testová zpráva (viz tabulka 7 v příloze) hod / 96 hod test akutní toxicity na larvách V akutních testech vystavujeme organismy vyšším koncentracím testovaných látek a sledovaným cílovým parametrem je mortalita. Tento test je normován pouze pro provedení ve vodě, nikoli v sedimentu (OECD 2006). 5.2 Standardní desetidenní (10-d) test přežití a růstu larev (US-EPA 2000) Tato testová metoda je používána ke stanovování toxicity sedimentu od konce 70.let 20. století a byla ověřena mnoha mezilaboratorními studiemi i v testech se skutečnou přírodní bentickou populací. Test se začíná s 10 dní starými larvami (třetí instar) a expozice kontaminaci v sedimentu trvá 10 dnů. Je velmi důležité, aby testované organismy byly ve věku uniformní, protože jednotlivé fáze larválního vývoje (instary) jsou ke kontaminantům různě citlivé - třetí a čtvrtý instar je obdobím nejnižší citlivosti. Sledovanými parametry na konci pokusu jsou procento přežití a AFDW jako parametr růstu. Imobilní jedince izolované ze sedimentu považujeme za mrtvé a do stanovování AFDW je nezahrnujeme. Navíc můžeme měřit také délku larev v tomto případě je potřeba larvy zakonzervovat v 8% cukerném roztoku formalínu. Vliv ostatních organismů, žijících přirozeně v sedimentu, nebyl na výsledcích testu prokázán. Při interpretaci výsledků je však třeba brát v úvahu toxicitu způsobenou amoniakem. Všeobecné podmínky a časový harmonogram 10-d testu dle US-EPA jsou uvedeny v příloze v tabulkách 1 a 2. Uspořádání testu znázorňuje obr

18 Obrázek 6: Uspořádání 10-d testu, vlevo detail testových kádinek s přívodem vzdušnění 5.3 Standardní 28-d test líhnutí a vývoje (OECD 2004) 28-d test s pakomáry se provádí za stejných podmínek jako 10-d varianta, do testu se však nasazují 1-4 dny staré larvy a celý test trvá, jak vyplývá z názvu, 28 dní toto platí pro druh C. riparius, u druhu C. tentans může trvat až 65 dnů. Dle OECD se kádinky se sedimentem a testovou vodou (viz tabulka 8, 9, a 10 v příloze) nasazují po 20 jedincích. Testové kádinky jsou svrchu opatřeny síťkou k záchytu vylíhlých dospělců. Sledovanými parametry 28-d testu jsou: procento líhnutí dospělců, střední čas vývoje a střední rychlost vývoje postup výpočtu naznačuje tabulka 6 v příloze. Postup při nasazení a pozorování líhnutí je podrobněji popsán u následujícího testu (viz 5.4); detailní popis podmínek i jednotlivých kroků testu udává tabulka 5 v příloze. 5.4 Standardní 65-d celoživotní studie (US-EPA 2000) Test se začíná s nově vylíhlými larvami v testových nádobách s důkladně homogenizovaným sedimentem zalitým testovou vodou. Larvičky získáváme ze shluků vajíček sesbíraných na Petriho misku ze snubní komůrky, kde dochází k páření. Larvy se obvykle líhnou po 48 hodinách a po dalších 24 hodin zpravidla zůstávají v želatinózním shluku, který slouží jako zdroj potravy, poté larvy shluk opouštějí. Proto přemísťujeme celý shluk po 24 hodinách od propuknutí líhnutí do testové kádinky s čistou vodou, čímž zajistíme homogenní stáří larev, neboť larvy které by opustily shluk a tím i zdroj potravy dříve by musely být považovány za starší. Následně jsou larvy nasávány Pasteurovou pipetou a vypouštěny do vody v testových kádinkách (viz obr. 8). Poté larvy denně krmíme, doplňujeme odpařené médium destilovanou vodou a sledujeme důležité parametry testového prostředí především ph a rozpuštěný kyslík. Asi po 23 dnech se dospělci začínají líhnout a létat. Samce a samice z jednotlivých kádinek pak 18

19 odchytáváme a přemísťujeme do snubních komůrek (Erlenmayerova baňka, viz obr. 7), kde dochází k rozmnožování. Oplodněné samice kladou shluky vajíček, které odebíráme a umísťujeme do Petriho misek. Samičky mohou naklást i více než jeden shluk vajíček pro výsledky testu jsou však směrodatná pouze vajíčka z prvního nakladeného shluku. Abychom zajistili dostatečný počet samečků na páření, který kvůli jejich dřívějšímu líhnutí (proterandrii) o 4-7 dnů nemusí být vždy zaručen, chováme pomocnou testovou kulturu s časovým posunem 7 dnů. V den 20 stanovujeme růst (AFDW), což odpovídá cílovému parametru 10-d testu. Pro toto měření použijeme 4 z celkových 12 doporučených opakování, 8 opakování nám tedy zůstává pro hodnocení reprodukčních parametrů a růstu na konci pokusu. Ode dne 23 denně monitorujeme líhnutí a reprodukci. Test se končí tehdy, pokud se v dané kádince už 7 dnů nevylíhl žádný dospělec. Soubor sledovaných parametrů udává tabulka 3. Obrázek 7: Snubní komůrka: A víčko ze síťoviny, B pevná oporná síťka, C voda (US-EPA 2000) Tabulka 3: Sledované parametry u celoživotního testu (US-EPA 2000) Letální Subletální Přežití: Růst: Líhnutí: Reprodukce: Larvy (20-d) Larvy Celkem/procentuálně Poměr pohlaví Larvy na konci Kumulativní četnost Čas do kladení vajíček vylíhnutých jedinců Kukly Čas do prvního líhnutí Střední počet vajíček na samici Dospělci Čas do smrti Počet shluků vajíček na kádinku Poměr vajíček vylíhlých ku nevylíhlým Parametry spojené s reprodukcí bývají variabilnější, proto v některých případech musíme volit větší počet opakování. Při hodnocení líhnutí je třeba rozlišovat tzv. úplné a částečné líhnutí. Při úplném líhnutí jedinec zcela odhodí exuvii stadia kukly a překonává 19

20 povrchové napětí vody. Při částečném líhnutí si jedinec nechává část exuvie připojenou k tělu a do 24 hodin hyne, stejně tak jako vylíhlý jedinec, kterému se nepodaří překonat povrchové napětí hladiny. Nakladené shluky vajíček přemísťujeme do Petriho misky a zaznamenáváme líhnutí. Odhad počtu vajíček ve shlucích které tvarem připomínají písmeno C provádíme tzv. prstencovou metodou: shluk rozdělíme podélně na 5 prstenců stejné délky, počet vajíček ve shluku pak odpovídá počtu vajíček v 1 prstenci vynásobený 5ti. Vznikne-li v sedimentu velký gradient kontaminace, je velmi pravděpodobné, že líhnutí v jednotlivých koncentracích bude značně asynchronní. Všeobecné podmínky a časový harmonogram celoživotního testu dle US EPA jsou uvedeny v příloze v tabulkách 3 a 4. Obrázek 8: Testová nádoba k provedení celoživotního testu (A - nylonová síťka, B - plastový kryt, C - kádinka bez zobáčku, D - otvory na výměnu vody, E sediment) (US-EPA 2000) 5.5 Dosud nestandardizované metodiky testování toxicity sedimentu s užitím pakomárovitých Chironomidae Vedle standardizovaných testů existuje mnoho dalších alternativ, lišících se buď v celém experimentálním navržení nebo jen v samotných cílových parametrech. V poslední době se jako cílového parametru často využívá stanovování subletálních biomarkerů jako jsou aktivita acetylcholinesterázy (Moreira-Santos et al. 2005), hladina sacharidů a lipidů (Servia et al. 2005), vitellogeneze (OECD 2006) a aktivita glutathion-s-transferázy (Printes et al. 2007). Některé studie využívající pakomáry jsou prováděny in-situ a přinášejí tedy relevantnější informace o reálném ekosystému oproti laboratorním testům (Moreira-Santos et al. 2005). Pakomárovité je možno využít i pro monitoring, protože zastoupení jednotlivých druhů často koreluje se znečištěním (Albarino et al. 2006). 20

21 OECD se v současné době snaží vyvinout a standardizovat metodiky testů, které by poskytovaly data o vlivu endokrinních disruptorů, a pomocí nichž by bylo možné hodnotit potenciální poškození populace. Takové testy by měly být dlouhodobější a zahrnovat aspoň dvě generace, aby se mohly projevit mnohdy latentní vlivy endokrinních disruptorů například na fertilitu, páření, embryonální vývoj atp. Pakomárovití jsou jako zástupci hmyzu dobrými kandidáty na toto testování, protože právě hmyz je skupinou bezobratlých, u níž jsou růst, vývoj a reprodukce řízeny hormonálně a jejíž endokrinní systém je nejlépe prostudován, hlavně díky hedvábnictví a vývoji pesticidů třetí generace. Například Watts et al. (2001) provedli dvougenerační studie posuzující vliv 17-ethinylestradiolu a bisfenolu A na životní cyklus pakomárů Chironomus riparius. Došlo k opoždění líhnutí a změně poměru pohlaví v druhé generaci u opakování s nejvyššími koncentracemi látek (1 mg/l), ty jsou však naštěstí absolutně environmentálně nerelevantní. Testování některých látek přineslo velmi překvapivé a mnohdy i protichůdné výsledky, což je zatím společně s nedostatečnou odpovědí na xenoestrogeny slabým místem tohoto typu testování (OECD 2006). 6. Využití modelového sedimentu nebo různě zatížených přírodních sedimentů V testech s pakomáry můžeme jako substrát využít buď přírodní a nebo uměle připravený sediment. Ve standardizovaných testech se doporučuje užívat artificiálního sedimentu, protože jeho fyzikálně-chemické vlastnosti jsou mnohem lépe definovatelné než v případě přírodního sedimentu. Další výhodou artificiálního sedimentu je, že nepodléhá sezónním variacím, neobsahuje žádnou další faunu a nemusí se tedy dále předpřipravovat. Všechny tyto aspekty snižují náklady testování. Navíc je možné porovnávat výsledky jednotlivých studií. Přesné složení artificiálního sedimentu udává tabulka 4. (OECD 2004) Tabulka 4: Složení artificiálního sedimentu pro testování toxicity chemických látek Složka Vlastnosti Procentuální obsah suché váhy sedimentu Rašelina Rašelina mechu Sphagnum (rašeliník) o ph 5, s nezřetelnými rostlinnými zbytky, jemně namletá (velikost zrn<1mm), vysušená Křemenný písek Velikost zrn: více než 50% zrn by mělo být v rozsahu velikostí µm Kaolin Obsah kaolinitu > 30 % 20 Organický uhlík Upraveno přidáním písku a rašeliny 2 ± 0,5 Uhličitan vápenatý Rozemletý, chemicky čistý 0,05-0,1 Voda Vodivost < 10 µs/cm

22 Užíváme-li v testu přírodní sediment, je potřeba charakterizovat jeho ph, obsah organického uhlíku, poměr C/N a zrnitost (OECD 2004). Bylo však prokázáno, že v případě 10-d testů obsah organické hmoty jak v přírodním tak artificiálním sedimentu nemá vliv na přežití organismů, avšak hraje důležitou roli pro růst (US-EPA 2000). 6.1 Kontaminace sedimentu a vody nad sedimentem Existují 2 hlavní přístupy v přípravě koncentračních řad kontaminace v testových nádobách: prvním přístupem je kontaminace sedimentu a následné zalití čistým médiem. Druhá varianta pracuje s čistým sedimentem a naopak kontaminovanou vodou nad sedimentem. V obou případech je nutné dodržet potřebnou dobu na dosažení rozdělovací rovnováhy (48 hodin až několik dnů). Na začátku a konci testu by měla být provedena analýza sedimentu, vody nad sedimentem a pórové vody aspoň v nádobách s 2 nejvyššími koncentracemi. Kontaminace sedimentu se provádí tak, že ve fázi přípravy sedimentu přidáváme patřičné množství zásobního roztoku kontaminantu ředěného v deionizované vodě. Směs se musí důkladně promíchat. Je-li testovaná látka špatně rozpustná ve vodě, můžeme ji rozpustit v co nejmenším možném množství organického rozpouštědla (hexanu, acetonu, chloroformu). Poté doplníme 10 g jemného křemenného písku (množství odpovídající jedné testové nádobě), promícháme, veškeré rozpouštědlo necháme několik minut odpařit (použitá rozpouštědla musí být volatilní a tudíž se odpařovat okamžitě), poté smícháme se zbývajícími složkami sedimentu (OECD 2004). Kontaminace vody se provádí přímým ředěním zásobního roztoku kontaminantu médiem. Koncentrace je uvažovaná pouze na objem vody nad sedimentem objem samotného sedimentu se při výpočtu koncentrace k objemu vody nepřičítá. Použijeme-li organické rozpouštědlo nebo dispergovadlo, je potom nutné založit další kontrolu s ekvivalentním přídavkem tohoto rozpouštědla, abychom byli schopni identifikovat jeho případný vliv na testové organismy. 7. Testování jednotlivých modelových látek a jejich směsí V ekotoxikologické praxi byla provedena už řada biotestů na pakomárech za účelem stanovení toxicity modelových látek v sedimentu. V popředí zájmu ekotoxikologických výzkumů stojí bezesporu těžké kovy, syntetické organické látky a pesticidy, a to především kvůli jejich množství, distribuci a škodlivým či necílovým účinkům v životním prostředí. V této oblasti je možné získat množství informací z odborných článků, které uvádějí účinné koncentrace látek, citlivost organismů vůči nim či jiná 22

23 zajímavá fakta týkající se testového uspořádání. Toxicita významných těžkých kovů, organických látek a pesticidů je dnes již dle standardních metodik dobře charakterizována a výsledky hodnocení toxicity ve standardizovaných testech s pakomáry jsou pro řadu látek shrnuty v mezinárodních ekotoxikologických databázích (např. IRIS, ITER TERA a další, viz 12.1). Není možné se v rámci bakalářské práce zabývat všemi těmito daty, proto byly do dalšího textu vybrány jen příklady podrobnějších studií, které kromě standardních výstupů hodnotí i další specifické parametry. Studie ekotoxicity s užitím pakomárů je možné dohledat například v databázi SETAC (Společnost pro environmentální toxikologii a chemii) nebo pomocí vyhledávačů BioOne a ScienceDirect. Na pakomárech byly testovány i další modelové látky jako například azaareny, radioaktivní látky nebo léčiva. Existuje jen omezené množství studií zabývajících se takovými toxikanty a do budoucna tedy představují prostor pro další výzkum. V následujícím textu jsou zmíněny příklady prací popisujících toxicitu těchto tří skupin skupin. 7.1 Těžké kovy Těžké kovy jsou perzistentními polutanty, které se dostávají ve zvýšené míře do prostředí díky lidské činnosti. Těžké kovy mají k sedimentu obzvláště vysokou afinitu, a protože většina kovů je pro biotu neesenciální a v určitém množství toxická, je potřeba v legislativě zakotvit vhodné limity pro jejich obsah (Dias et al. 2005; Grosell et al. 2006). Při hledání této hodnoty můžeme využít mimo jiné biotesty s pakomáry. Studií, které se zabývají toxicitou kovů pro pakomáry, existuje celá řada (Fargašová 2001). Na tomto místě však není možné zmínit všechny tyto experimenty, proto jsou níže uvedeny 3 zajímavé příklady konkrétních testů. Jako první příklad poslouží studie provedená vědci z univerzity v Miami (USA) (Grosell et al. 2006), kteří testovali chronickou toxicitu olova paralelně na třech zástupcích sladkovodních bezobratlých Brachionus calyciflorus (vířníci - Rotifera), Chironomus tentans (hmyz Insecta) a Lymnea stagnalis (měkkýši Mollusca) a porovnali citlivost jednotlivých druhů. V případě pakomárů zvolili celoživotní test, avšak oproti standardnímu postupu byl test započat s 8-d larvami. Substrátem byl plážový písek (15 ml) zalitý testovou vodou (130 ml) z jedné třetiny tvořenou běžnou vodovodní vodou z oblasti Florida Key a ze dvou třetin deionizovanou vodou obohacenou vápenatými ionty. Takto upravená voda umožňuje udržet vysoké koncentrace rozpuštěného olova, tím že koncentrace uhličitanových a hydrogenuhličitanových iontů jsou nízké, a zároveň slouží jako vhodné medium pro vývoj larev. Testované koncentrace olova byly v rozsahu µg/l (5 členů řady, vždy 3 opakování po 5 jedincích, v průtočném systému 20 ml/min). Sledováno bylo procento přežití, líhnutí a čas do 23

24 líhnutí. Procento přežití bylo výrazně nižší ve dvou nejvyšších koncentracích. Čas do líhnutí se v žádném případě významně nelišil od kontroly, a všechny larvy, co přežily se také vylíhly. Hodnoty NOEC a LOEC byly stanoveny na NOEC = 109 µg/l a LOEC = 497 µg/l. Ukázalo se, že Chironomus riparius je ze tří výše uvedených druhů nejtolerantnější vůči olovu. Dobrou zprávou je, že dle zjištěných hodnot NOEC a LOEC by olovo pro přírodní populace pakomárů nemělo představovat žádné reálné riziko, neboť běžné koncentrace olova v prostředí se pohybují v rozsahu 0,6 120 µg/l. Potenciální nebezpečí pro pakomáry představují olovem zamořené vody s nízkým obsahem Ca 2+, neboť mezi larválním příjmem iontů vápníku a olova existuje antagonistický vztah (Grosell et al. 2006). Dále je třeba mít na paměti, že citlivost je dána nejen druhem (viz graf 2), ale také životní fází, ve které se organismus nachází. Je známo, že u pakomárů je nejcitlivějším obdobím první larvální instar, kdy jedinci mohou být vůči působení kovů až 1000krát citlivější oproti čtvrtému instaru (Bleeker et al. 1998). Graf 2: Rozložení druhové citlivosti k Pb podle hodnoty NOEC u různých sladkovodních organismů. Běžné koncentrace Pb ve vodách se pohybují v rozsahu 0,6-120µg/l (Grosell et al. 2006) Dalším zajímavým příkladem využití pakomárů při studiu ekotoxicity kovů může být studie provedená společně vědci z Francie a Španělska (Servia et al. 2005), zabývající se vlivem mědi na energetický metabolismus a vývoj larev. Cílovými parametry této studie byly tedy 1) vývojové biomarkery: vývoj imaginárních disků a mokrá váha těla larev; 2) energetické biomarkery: hladina sacharidů a lipidů v hemolymfě a těle zbaveném obsahu střeva. Aby bylo 24

25 možné získat dostatek biologického materiálu pro biochemická měření, musely být provedeny 2 nezávislé experimenty. Test se začínal se 4-d larvami - po 20 jedincích ve 3 opakování každé koncentrace - a trval 7 (experiment 1) a 9 dnů (experiment 2). Doba testu byla vybrána tak, aby zachycovala období larválního somatického růstu, který za daných podmínek trvá asi 10 dnů. Poté totiž následuje období, kdy larvy začínají investovat energii do produkce gamet zvyšuje se jejich hmotnost a akumulace rezerv, ale tělo se neprodlužuje (Dias et al. 2005). Expozice tedy byla ukončena po 7 a 9 dnech rozdílné hodnoty byly zvoleny z důvodu rozdílné vývojové rychlosti samců a samic. Nominální koncentrace mědi v experimentu sahaly od 0 do 50 mg/kg suché váhy sedimentu. Ukázalo se, že v 7-d testu má statisticky významný vliv na rychlost vývoje pouze pohlaví. Naopak u 9-d testu už to byla i koncentrace mědi 25 a 50 mg/kg. Některé larvy utrpěly značné zpomalení vývoje a zaostaly ve fázi třetího instaru. Hladiny sacharidů (konkrétně glukózy, trehalózy a glykogenu) se mezi jednotlivými koncentracemi významně nelišily, kdežto hladiny lipidů (konkrétně glycerolu a trigliceridu) byly variabilnější vysoké hladiny glycerolu byly zaznamenány především u larev v koncentraci 50 mg/kg. Se zvyšující se koncentrací mědi se snižovala hladina triglyceridu u samic, což koresponduje se sníženou fekunditou (počet vajíček ve shluku) zjištěnou v dřívějších studiích popisujících ekotoxicitu mědi. Výsledky studie je možné interpretovat tak, že k výraznému snížení hladiny cirkulujících sacharidů nedošlo, neboť ta je variabilní podle intenzity stresu. Dalším důležitým faktem je to, že larvy mohly zvýšený energetický výdej kompenzovat příjmem potravy, protože byly krmeny dostatečně. Celkově se samice projevily jako citlivější v uvedených sledovaných parametrech než samci (Servia et al. 2005). Za zmínku jistě stojí také studie provedená pod záštitou Environment Canada (Hruska and Dubé 2004), jejímž cílem bylo porovnat výsledky biotestu prováděného standardně (beaker bioassay BB) a v artificiálním toku (artificial stream bioassay ASB). 11-d larvy byly v obou případech vystaveny 45% odpadní vodě po úpravě v ČOV (Copper Cliff Wastewater Treatment Plant v Sudbury, ON, Canada) a pozorovány až do skončení jejich životního cyklu. Testová voda byla oproti referenční vodě významně zatížena zvýšeným obsahem 13 různých kovů (As, B, Cd, Co, Cu, Fe, Li, Mn, Ni, Rb, Sr, Se, Tl) pocházejících z přilehlých dolů, ale pouze u 4 kovů (Cu, Cd, Ni a Se) byly překročeny koncentrační limity dané kanadskou legislativou. Umělý tok (ASB) byl vytvořen v 10-ti litrové válcové nádobě, umístěné v 85-ti litrovém zásobním bazénu, odkud voda proudila do válcových nádob (celkem 6) rychlostí 2 l za minutu, což simuluje přirozené říční podmínky. Do každého umělého toku bylo umístěno 250 larev, kdežto do každé standardní kádinky 12 larev (celkem 8 opakování). Oba systémy byly udržovány v laboratoři za stejných podmínek a byly u nich stejným způsobem hodnoceny stejné cílové parametry: procento přežití 25

26 (10-d a na konci) růst (délka, 10-d a na konci), čas do líhnutí dospělců, procento líhnutí dospělců, poměr pohlaví, počet shluků vajíček na samici, počet vajíček ve shluku, procento líhnutí vajíček. Pouze růst (délka) byl stanovována rozdílně v ASB variantě byla délka změřena celkem 3krát po začátku expozice, což se později projevilo jako velmi efektivní řešení, které přináší relativně důležité informace pro statistické hodnocení. V závěru se ukázalo, že odpověď organismů se u dvou různě uspořádaných biotestů shoduje pouze ve dvou sledovaných cílových parametrech. U obou uspořádání se čas do líhnutí dospělců celkově zvýšil (jak pro samce tak pro samice), a procento líhnutí vajíček se snížilo. Ve variantě s užitím umělého vodního toku (ASB) došlo také k významným negativním změnám v dalších 4 parametrech (% přežití, % líhnutí dospělců, počet shluků vajíček/samici a délka), kdežto v případě standardní kádinkové metody (BB) se změny v těchto parametrech neprojevily jako statisticky významné. Nejednotnost výsledků má příčinu především v zásadně rozdílné velikosti vzorků v jednotlivých uspořádáních (250 v ASB a 12 v BB), ačkoli hustota larev byla v ASB i BB obdobná (0,36 jedince/cm 2 ). Protože z varianty ASB bylo k určení střední hodnoty parametru/opakování vybráno více subvzorků, variabilita výsledků z ASB byla nižší a proto bylo možné prokázat statisticky významné rozdíly, které se v BB nemohly kvůli malému počtu jedinců na opakování projevit. Výstupem z této studie bohužel nemůže být informace o tom, do jaké míry se která složka podílí na celkové toxicitě odpadní vody. Práce Fargašové (2001) uvádí, že směsi kovů, jakou je například právě odpadní voda ze zmíněné ČOV, vykazují zpravidla vyšší toxicitu než jaká byla zjištěna u jednotlivých prvků. Míra synergismu ovšem závisí na koncentraci přítomných kovů ve směsi (Fargašová 2001). Zajímavým zjištěním studie s užitím ASB je bezpochyby to, že citlivost standardních kádinkových biotestů může být oproti jiným variantám značně omezená a snadno tedy můžeme podcenit toxicitu kovů testovanou v tomto uspořádání. Avšak velkou výhodou standardního testu zůstává relativně nízká cena oproti složitým technickým a logistickým řešením v případě ASB (Hruska and Dubé 2004). Důležitým aspektem, který je třeba zmínit v souvislosti s pakomáry a posuzováním toxicity sedimentů znečištěných kovy, je ochranná povaha schránky, kterou si larvy kolem sebe budují z částeček substrátu. Bylo totiž prokázáno, že u larev vystavených kontaminaci sulfidem měďnatým, schránka sehrála důležitou roli v omezení průniku kontaminantů do tkání. U larev bez schránek se vliv kontaminantu projevil zvýšenou propustností membrán mnohem více než u larev žijících v ochranných schránkách (Halpern et al. 2002). 26

27 7.2 Pesticidy organofosfáty, pyrethroidy Pesticidy aplikované na zemědělsky využívané plochy se běžně s nevelkým zpožděním a ve velkých dávkách dostávají do vodního prostředí, kde mohou ohrožovat necílové druhy. Pesticidy jsou centrem zájmu ekotoxikologického testování, a proto bylo provedeno mnoho experimentů i s pakomáry. Dnes již víme spoustu základních údajů o jednotlivých látkách, posoudit skutečná rizika pesticidů v reálném prostředí je však stále velmi obtížné: důležitou roli hraje aplikační režim, fyzikálně-chemické vlastnosti (hlavně hydrofobicita a degradabilita), vzájemné spolupůsobení (Forbes and Cold. 2005; Belden and Lydy 2006) nebo také specifický charakter zasaženého prostředí. Těmto problémům se věnují následující vybrané příklady pokročilejších ekotoxikologických studií: Dosavadních prací, které by braly v úvahu například expoziční scénář není mnoho. Jedním takovým příkladem může být experiment, využívající pakomáry Chironomus riparius, provedený na dánské univerzitě v Roskilde (Forbes and Cold. 2005). V tomto pokusu šlo o pozorování vlivu pyrethroidu esfenvaleratu na přežití, vývoj a reprodukci ve 3 různých uspořádáních. V prvním experimentu byl posuzován vliv environmentálně realistické koncentrace pesticidu (0,2 µg/l) na týdenní larvy v kontaminovaném vodním sloupci po dobu 1 hodiny (simulace jednorázové aplikace pesticidu). Test probíhal v 0,5 l nádobách s 30 jedinci po 4 opakováních; vedle kontroly zde byly 2 varianty s kontaminovaným vodním sloupcem, z první byli po 1 hodině jedinci přemístěni do čisté vody a sedimentu; z druhé byli jedinci přemístěni do čisté vody avšak kontaminovaného sedimentu, který prošel stejnou expozicí. V druhém experimentu byl sediment vystaven 24-h expozici stejné koncentrace esfenvaleratu (0,2 µg/l), poté zalit čistou vodou a nasazen testovými organismy. Cílem třetího experimentu bylo zjistit, jakou roli v otázce toxicity esfenvaleratu hraje hustota populace: týdenní larvy byly den po nasazení vystaveny 1-h expozici pesticidu ve vodné fázi a přemístěny do sedimentu při dvou různých populačních hustotách 0,2 a 0,4 larvy/cm 2 (při stejném množství potravy na larvu 0,25 mg/d). Výsledky jednotlivých experimentů lze v krátkosti interpretovat tak, že i velmi krátké expozice užitými realistickými koncentracemi esfenvaleratu působí měřitelné efekty na vývoj a přežití mladých larev, které jsou nejcitlivější. Největší vliv byl zaznamenán ve variantě s kontaminovaným vodním sloupcem. Avšak ti jedinci, co přežili pak již nejevili známky postižení esfenvaleratem v ostatních znacích. U varianty s 24-h kontaminovaným sedimentem nedošlo k významným změnám oproti kontrole. Vyšší populační hustota snížila rychlost růstu populace (PGR), přičemž vliv esfenvaleratu tento efekt zmírňoval byl tedy menší než aditivní, což je v souladu s výsledky Hoopera et al. (2005). Hustota populace i pesticid měly tendenci prohlubovat rozdíl mezi dobou do líhnutí samců a samic. Studie tedy dospěla k podobným 27