KONZERVAČNÍ PŘÍSADY V KOSMETICE. Andrea Bednaříková

Transkript

1 KONZERVAČNÍ PŘÍSADY V KOSMETICE Andrea Bednaříková Bakalářská práce 2013

2

3

4

5

6 ABSTRAKT Práce se zabývá problematikou konzervace kosmetických přípravků. Nejprve jsou charakterizovány druhy mikroorganizmů kontaminující kosmetické prostředky, dále příčiny mikrobiální kontaminace a také moţnosti konzervace kosmetických přípravků. Cílem práce bylo prověřit účinnost komerčních konzervačních přísad Versatil, tedy jejich schopnost zajistit bezpečnost a stabilitu při kontaminaci grampozitivními bakteriemi Bacillus subtillis a Staphylococcus aureus. Klíčová slova: mikrobiální kontaminace, konzervační látky, účinnost konzervantů ABSTRACT The bachelor thesis deals with preservation of cosmetic products. At first, microbial species contaminating cosmetic products are characterised, then the sources of microbial contamination and the possibilities of cosmetic products preservation are reviewed. The aim of the thesis was to evaluate the efficiency of commercial preservatives Versatil by examining their ability to provide sufficient safety and stability of cosmetic products inoculated with Gram-positive bacteria Bacillus subtillis and Staphylococcus aureus. Keywords: microbial contamination, cosmetic preservatives, preservative efficiency

7

8 OBSAH ÚVOD I TEORETICKÁ ČÁST MIKROORGANIZMY V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH BAKTERIE Bakteriální buňka Rozdělení bakterií na základě Gramova barvení Grampozitivní bakterie Rod Staphylococcus Rod Bacillus PLÍSNĚ A KVASINKY KONTAMINACE KOSMETICKÝCH PROSTŘEDKŮ KONZERVACE KOSMETICKÝCH PROSTŘEDKŮ KONZERVANTY V KOSMETICE Syntetické konzervanty Přírodní konzervanty Antioxidanty CHARAKTERISTIKA KONZERVAČNÍCH LÁTEK ORGANICKÉ KYSELINY, JEJICH SOLI A ESTERY Kyselina sorbová Sorbát draselný Kyselina benzoová Parabeny ALDEHYDOVÉ A FORMALDEHYDOVÉ KONZERVANTY ALKOHOLOVÉ DERIVÁTY Fenoxyetanol OSTATNÍ KONZERVAČNÍ LÁTKY FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ VÝBĚR VHODNÉHO KONZERVAČNÍHO SYSTÉMU METODY HODNOCENÍ ANTIMIKROBIÁLNÍ OCHRANY KOSMETICKÝCH PŘÍPRAVKŮ II PRAKTICKÁ ČÁST MATERIÁL A METODY ZÁTĚŢOVÝ TEST ÚČINNOSTI KONZERVAČNÍCH LÁTEK POUŢITÉ CHEMIKÁLIE PŘÍSTROJE A POMŮCKY POSTUP PRÁCE Příprava pleťové vody Příprava neutralizačního roztoku Příprava ředícího roztoku Příprava kultivačního média TSA agar (Soyabean Casein Digest Agar) Příprava inokula Provedení odběru vzorku... 33

9 5 VÝSLEDKY A DISKUZE VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL SL PROTI BAKTERII BACILLUS SUBTILLIS SUBSP. SPIZIZENII CCM VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL SL PROTI BAKTERII STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS CCM VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL PC PROTI BAKTERII BACILLUS SUBTILLIS SUBSP. SPIZIZENII CCM VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL PC PROTI BAKTERII STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS CCM VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL BP PROTI BAKTERII BACILLUS SUBTILLIS SUBSP. SPIZIZENII CCM VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ÚČINNOSTI KONZERVANTU VERSATIL BP PROTI BAKTERII STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBSP. AUREUS CCM ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ... 51

10 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 10 ÚVOD Práce se zabývá problematikou konzervace kosmetických prostředků, která je důleţitá z hlediska ochrany zdraví spotřebitele a zajištění stability prostředků. Konzervační látky jsou přidávány do kosmetických prostředků, aby bránily jejich znehodnocení a mikrobiální kontaminaci. Mezi běţně pouţívané konzervační přísady patří estery kyseliny parahydroxybenzoové (parabeny), alkoholy, chlorované deriváty, deriváty močoviny a mnohé další látky. Cílem konzervace kosmetického prostředku je zabránit kontaminaci a degradaci výrobku nejen během výroby, ale i po dobu uţívání. Mikrobiální kontaminace můţe způsobit rozklad prostředku (zánik emulze), změnu barvy, zápach a další neţádoucí projevy. Při styku s kůţí můţe dojít k podráţdění a jiným problémům způsobených kontaminací patogenními mikroorganizmy. Konzervace kosmetických prostředků je velmi důleţitá pro stabilitu prostředků a ochranu spotřebitele před mikroorganizmy. Bez konzervace by většina prostředků, s výjimkou prostředků s vyšším obsahem alkoholu, byla kontaminována. Konzervační látky většinou nebývají přidávány samostatně, ale ve směsích, kvůli pokrytí širšího spektra mikroorganizmů. Musí být schopny zastavit mnoţení a růst většiny zejména patogenních mikroorganizmů. Není povoleno prodávat výrobky kontaminované nebo ohroţené kontaminací. Výroba musí být v souladu s hygienickými předpisy, jinak dochází ke zhoršení kvality výrobku a ohroţení spotřebitele. Kaţdá země má své vlastní předpisy pro výrobu kosmetiky a uvedení na trh zahrnující povolené mnoţství nepatogenních mikroorganizmů ve finálním produktu. Konzervační látky jsou jedny z nejkontroverznějších kosmetických přísad. Jsou zodpovědné za většinu neţádoucích projevů na kůţi. Jejich mnoţství v kosmetickém prostředku nesmí překročit povolenou koncentraci a jsou nejčastější příčinou vzniku kontaktní dermatitidy. Praktická část této práce se zabývá testováním účinku konzervačních látek proti grampozitivním bakteriím Staphylococcus aureus a Bacillus subtilis v připravených vzorcích pleťových vod. Testovány byly tři druhy komerčních konzervačních látek ve třech různých koncentracích.

11 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 11 I. TEORETICKÁ ČÁST

12 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 12 1 MIKROORGANIZMY V KOSMETICKÝCH PROSTŘEDCÍCH 1.1 Bakterie Bakterie hrají významnou roli v ekosystému. Jsou velmi důleţité jak pro biochemické cykly, tak pro zachování homeostázy prostředí. Bakterie jsou téměř všudypřítomné, proto nepřekvapí, ţe se vyskytují i v celé řadě kosmetických výrobních závodů. Mnohé bakterie vykazují značnou odolnost k podmínkám prostředí, tedy i například k působení dezinfekčních látek. Dobrá ochrana výrobku a čistota výrobního prostředí pomáhá zabránit kontaminaci, nicméně je nezbytné mikrobiologickou kvalitu výrobků kontrolovat. [1, 24] Obr. 1 : Buňka bakterie [2] Bakteriální buňka Bakterie patří mezi prokaryotické organizmy, které na rozdíl od eukaryot postrádají membránové organely. Přestoţe jsou bakterie jednoduché organizmy, jejich buňky se mohou vyskytovat v několika tvarech; nejčastější je kulovitý tvar (koky), dále mohou mít tvar tyčinkovitý, spirálovitý nebo vláknitý. Bakteriální buňka je řádově menší neţ buňka eukaryotických mikroorganizmů. Rozměr buněk bakterií se pohybuje v rozmezí desítek aţ stovek nanometrů. Struktura bakteriální buňky je znázorněna na obrázku 1.

13 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 13 Buněčná stěna a plazmatická membrána obklopují buňku, některým buňkám chybí buněčná stěna, avšak všechny mají cytoplazmatickou membránu. Genetický materiál je uloţen v jádru, které není obklopeno jadernou membránou jako u eukaryotických organizmů. Ribozomy jsou rozptýleny volně v cytoplazmě. Jedinou organelou vystupující z povrchu buňky je bičík, který je přítomen pouze u některých bakterií. Buněčnou stěnu obklopují kapsule, pili nebo fimbrie, které umoţňují bakteriím přichycení k povrchu. [1, 25, 26] Rozdělení bakterií na základě Gramova barvení Grampozitivní a gramnegativní buněčné stěny jsou definovány podle zbarvení buňky a fyziologické struktury. Technika Gramova barvení je zaloţena na rozdílném zbarvení buněk bakterií; některé buňky se zbarví růţově, ostatní nachově. [1, 27] Při provedení Gramova barvení se nejprve nanese suspenze bakterií na sklíčko a zafixuje plamenem, poté se přidá roztok krystalové violeti, který se ponechá na sklíčku přibliţně minutu a opláchne se vodou. Bakterie absorbují barvivo a zbarví se nachově. Dále se na sklíčko přidá jod, který působí jako mořidlo. Následně se směs opláchne acetonem nebo etanolem, aby došlo k odstranění barviva. Nakonec se provede dobarvení safraninem, při němţ dojde ke zbarvení do růţova. Pokud krystalová violeť není odstraněna acetonem, pak zbarvení safraninem není viditelné. Pokud je krystalová violeť vymyta, jsou bakterie bezbarvé, dokud není přidán safranin. Nachově zbarvené bakterie se nazývají grampozitivní, zatímco růţově zbarvené jsou gramnegativní bakterie. [1, 30, 31] Buněčná stěna grampozitivních a gramnegativních bakterií vykazuje značné rozdíly. Základem buněčné stěny bakterií je peptitoglykan. Peptidoglykan (murein) je polymer sloţený ze dvou aminosacharidů a několika peptidových řetězců (tetrapeptidů). Peptidoglykan zajišťuje tuhost, pevnost a ochranu proti tlaku a působení vnějších vlivů. V grampozitivních buňkách spojuje D-alanin a L-lysin v tetrapeptidu most tvořený pentaglycinem, lysin a alanin gramnegativních buněk je spojen přímo. Vrstva peptidoglykanu grampozitivních bakterií je tlustší neţ u gramnegativních bakterií. Gramnegativní bakterie mají však buněčnou stěnu sloţitější, protoţe kromě tenké vrstvy peptidoglykanu je její součástí i vnější membrána. Tato membrána je tvořena z dvojvrstvy fosfolipidů podobně jako membrána cytoplazmatická a je příčinou vyšší odolnosti gramnegativních bakterií k některým vnějším vlivům. [1, 27]

14 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Grampozitivní bakterie Rod Staphylococcus Tyto grampozitivní bakterie jsou fakultativně anaerobní nepohyblivé mikroorganizmy. [1, 60] Kolonie jsou obvykle neprůhledné, mohou být bílé nebo krémové, ţluté aţ ţlutooranţové. Optimální teplota růstu je C. Bakterie rodu Staphylococcus patří mezi všudypřítomné, buňky se vyskytují jednotlivě nebo v nepravidelných shlucích. Můţeme je najít na kůţi, koţních ţlázách a sliznicích teplokrevných obratlovců. Dále jsou často izolovány z různých potravin ţivočišného původu a z nejrůznějších zdrojů v prostředí, jako je půda, voda, písek a prach. Některé druhy jsou oportunně patogenní aţ patogenní pro člověka i zvířata, nebo produkují extracelulární toxiny, případně jsou patogenní jen pro zvířata. Koaguláza pozitivní stafylokoky mohou být patogenní pro člověka nebo zvířata. Koaguláza negativní stafylokoky byly povaţovány za nepatogenní, ale v současnosti jsou povaţovány za podmíněné patogeny, které mohou vyvolat onemocnění u oslabeného jedince. [3, 241] Staphylococcus aureus je jedním z nejnebezpečnějších druhů bakterií, protoţe můţe způsobovat řadu váţných a těţce léčitelných onemocnění. [4, 24] Produkuje toxiny, které způsobují hemolýzu červených krvinek. Dále také produkují různé enzymy, jako například proteázy, lipázy, koagulázy. [1, 60] Infekce ostatními druhy rodu Staphylococcus jsou typické spíše pro ţivočichy, ne pro člověka. Jméno aureus, coţ je latinský výraz pro zlato, charakterizuje růst bakterie ve velkých ţlutých koloniích. Staphylococcus aureus ţije na kůţi a sliznicích teplokrevných ţivočichů. Lidé jsou jedním z primárních nositelů. Zejména nosní membrány poskytují ideální prostředí pro kolonizaci stafylokoky, protoţe jsou teplé a vlhké. Nalézají se také na mnoha dalších lokalitách, také v přítomnosti vody a na téměř kaţdém povrchu. S. aureus je extrémně odolný, roste v širokém teplotním rozsahu. Pokud podmínky pro růst nejsou příznivé, můţe být několik let ve stavu dormance. Jedním z důvodů odolnosti je tloušťka buněčné stěny, která je v porovnání s ostatními bakteriemi velmi silná. Tloušťka a vlastnosti buněčné stěny jsou příčinou ztíţeného prostupu antimikrobiálních látek do buněk S. aureus, coţ je jeden z mnoha důvodů obtíţné léčby onemocnění, které tento mikroorganizmus způsobuje. Většina zdravých jedinců, jejichţ kůţe je kolonizována bakterií Staphylococcus aureus, není infikována díky koţní bariéře, která tvoří přirozenou ochranu proti prostupu mikroor-

15 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 15 ganizmů do těla jedince. Porušení kůţe v důsledku zranění však poskytuje moţnost vstupu těchto bakterií do organizmu. [4, 26, 28] Rod Bacillus Zástupci rodu Bacillus jsou aerobní nebo fakultativně anaerobní, kataláza pozitivní bakterie tyčinkovitého tvaru uspořádané ve dvojicích nebo v řetízcích s optimální teplotou růstu C. Někteří zástupci produkují pigmenty nebo tvoří pouzdra. Několik druhů je patogenních pro obratlovce nebo bezobratlé, mohou způsobit potravinové otravy. [3, 234] Do tohoto rodu patří různorodé a komerčně uţitečné skupiny mikroorganizmů. Metabolická diverzita spolu s nízkou patogenitou, vede k jejich pouţití v celé řadě průmyslových procesů. Jsou široce rozšířené v půdě, ve vzduchu a vodě, kde se účastní mnoha chemických přeměn. [5, 1] Metabolizmus se adaptuje na nedostatek ţivin mnoha různými způsoby, nejčastěji vylučováním hydrolytických enzymů a produkcí endospor odolných proti teplu a záření, které mohou přeţívat ve stavu dormance mnoho let, ne-li dokonce století. Sporulace a další metabolické změny na konci exponenciálního růstu, jsou velmi důleţité v produktivitě buněk. [5, 3] Rod Bacillus tvoří oválné nebo kulaté spory, které jsou přítomny v půdě, ve vodě a na rostlinách. Sporami mohou být kontaminovány i kosmetické přípravky a tato kontaminace můţe mít váţné zdravotní následky. Některé druhy patří mezi běţné producenty antibiotik. Řada druhů rodu Bacillus je patogenní, například B. anthracis je původcem antraxu, spory mohou způsobit koţní choroby, které vstupují do kůţe řeznými ranami a odřeninami. [1, 60, 61] Bacillus subtillis Jedná se o pohyblivé bakterie tyčinkovitého tvaru. [6, 7] Jsou to všudypřítomné půdní bakterie, které mohou být z půdy snadno izolovány. Buňky B. subtillis jsou unikátní pro svou schopnost zvolit jeden ze tří odlišných genetických programů, pokud mají v prostředí nedostatek ţivin, nebo pokud buněčná hustota poklesne pod kritickou hodnotu. Pro přeţití v těchto nepříznivých podmínkách mohou buňky vstoupit do stacionární fáze růstu, pro kterou je typická tvorba jednotlivých pohyblivých buněk (buňky v exponenciální fázi růstu jsou zpravidla nepohyblivé a tvoří řetízky). Druhou moţností je vznik metabolicky inaktivních endospor. [8, preface] Bacillus subtillis je schopný tvořit endospory, které jsou schopny růstu v příznivých podmínkách prostředí. [7, 57] Třetí strategií pro adaptaci na nepříznivé podmínky prostředí je navození stavu kompetence. Kompetence je stav, při

16 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 16 kterém můţe dojít k přijetí cizorodé DNA z prostředí, která můţe být vyuţita jako zdroj nových genů. [8, preface] 1.2 Plísně a kvasinky Jedná se o eukaryotické organizmy, které jsou řazeny mezi houby (Fungi). Obsahují organely obklopené membránou, zejména jádro, které obsahuje chromozomy. Ostatní membránové organely zahrnují mitochondrie, Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum a lyzozomy. Termín organela vyjadřuje podobnost orgánů ţivočichů s těmito vnitřními buněčnými strukturami, které zajišťují specifické funkce. [1, 62] Nejdůleţitější komplexní struktura buněk je cytoplazma, která tvoří prostředí pro buněčné organely a místo pro biochemické procesy. [1, 63] Fungi jsou typické kontaminanty kosmetických prostředků s vyšším obsahem vody a niţšími hodnotami ph, jako jsou například roztoky a krémy. [1, 62] Kosmetické prostředky skladované ve vlhké koupelně mohou být tedy ohroţeny kontaminací těmito mikroorganizmy. Z tohoto důvodu jsou pro bezpečnost kosmetických prostředků velmi důleţité právě fungicidní vlastnosti konzervačních látek. [1, 68,69] 1.3 Kontaminace kosmetických prostředků K primární kontaminaci dochází při výrobě produktu. Často bývá způsobena gramnegativními bakteriemi. K zabránění primární kontaminace během výroby a plnění je nutné poskytnout čisté pracovní prostředí. Výrobu v celkově čistých podmínkách lze zajistit sterilizací vody a surovin, mytím výrobního zařízení, školením pracovníků o čistotě práce a instalací zařízení jako jsou prachové filtry ve ventilaci a odvlhčovače. Dále je nutné dodrţování správné výrobní praxe. Nehygienická výroba vede ke kontaminaci patogenními i nepatogenními mikroorganizmy, ke zhoršení kvality produktu a následně k iritaci kůţe spotřebitele. Určité mnoţství nepatogenních mikroorganizmů ve výrobku je povoleno, povolené mnoţství závisí na legislativě jednotlivých zemí. Koaguláza pozitivní Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa jsou příklady patogenních bakterií, které se nesmí vyskytovat v kosmetických prostředcích.

17 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 17 Sekundární kontaminace vzniká během pouţívání přípravku spotřebitelem. Bývá výsledkem kontaminace grampozitivními bakteriemi přítomnými na rukou a v prostředí. Spotřebitelé mohou ohrozit kvalitu výrobků skladováním v nepřijatelných podmínkách, například v mokré sprše nebo vlhké koupelně. [9, 200] Mezi tyto výrobky patří řasenky, oční stíny, šampony, pleťové vody a pudry. Pouţíváním kosmetických přípravků můţe také dojít ke styku výrobku se slinami, vodou, nebo špinavýma rukama, coţ vede k mikrobiální kontaminaci. [1, 164] Kontaminace můţe být zřejmá na první pohled povlakem plísně na povrchu produktu, nebo změnou barvy, zápachem, popřípadě rozkladem emulzního systému. [10] Zakalení čiré kapaliny představuje viditelnou degradaci výrobku, ale rizikem jsou neprůhledné výrobky typu emulzí. Mikrobiální kontaminace také můţe měnit vzhled produktu obsahem pigmentů. Důleţitým kvalitativním parametrem jsou vonné látky, z nichţ mohou vznikat účinkem mikrobů těkavé organické sloučeniny jako je skatol, indol nebo sirovodík. [1, 165] Mikrobiální kontaminace způsobuje nejen organoleptické změny, jako zápach, změny viskozity a barvy, ale můţe také ohrozit spotřebitele. [11, 212] Lze říci, ţe kaţení kosmetických prostředků můţe vést k mikrobiální infekci spotřebitele. Protoţe mnohé konzervační látky způsobují alergickou kontaktní dermatitidu, výrobci pouţívají konzervanty v nejniţších moţných koncentracích, bez ztráty antimikrobiálního účinku. Doporučení pro koncentrace konzervantů se liší v závislosti na legislativě jednotlivých zemí. Navíc je v zákonech obecný nedostatek informací o tom, zda konzervační látky pouţívat samostatně, nebo v kombinaci s jinými konzervanty. Kombinace různých konzervačních látek můţe mít potenciálně synergické nebo doplňkové účinky proti mikroorganizmům, a to má několik výhod. Za prvé, se koncentrace potřebné pro dostatečné zabezpečení a uchování vlastností kosmetických přípravků mohou sníţit. Vývoj alergické kontaktní dermatitidy je závislý na dávce konzervantů, proto můţe sníţení koncentrace potenciálně vést ke sníţení počtu alergických reakcí. Za druhé, vhodně zvolené kombinace konzervačních látek jsou účinné proti širšímu spektru mikroorganizmů. [12] Koncentrace konzervantů hraje důleţitou roli a je limitována dvěma hodnotami: MIC (minimální inhibiční koncentrace), která je nejniţší koncentrací antimikrobní látky, při které nedochází k růstu daného mikroorganizmu a MBC (minimální baktericidní koncentrace), která je nejniţší koncentrací zajišťující usmrcení buněk konkrétního mikroorganizmu.

18 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 18 Koncentrace konzervační látky a také četnost pouţití této látky v kosmetických přípravcích je velmi důleţitá. Alergické reakce se totiţ mohou objevit jak po první aplikaci, tak i po letech pouţívání kosmetiky obsahující konkrétní konzervační látku. [11, 212] Zdravotní riziko pro spotřebitele představuje především kosmetika s vysokým obsahem vody, která je náchylnější k mikrobiální kontaminaci, respektive poskytuje kontaminujícím mikroorganizmům vhodnější podmínky pro růst a mnoţení. [13] Ačkoli je kosmetika občas kontaminována mikroorganizmy způsobujícími kaţení výrobku, největší hrozbou kontaminace je pochopitelně přítomnost patogenů, které mohou ohrozit zdraví spotřebitele. Nelze opomenout ani oportunně patogenní mikroorganizmy, které mohou být příčinou onemocnění, pokud nastanou určité podmínky, například u osob s oslabenou imunitou, poraněnou či popálenou kůţí a podobně. [1, 112]

19 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 19 2 KONZERVACE KOSMETICKÝCH PROSTŘEDKŮ Konzervační látky jsou přidávány do kosmetických prostředků ze dvou důvodů: prvním je ochrana proti mikrobiálnímu kaţení a tedy prodlouţení doby trvanlivosti přípravků, druhým důvodem je ochrana zdraví spotřebitele před potenciální infekcí. [14] Konzervační látky jsou součástí kosmetických přípravků, které mají jako základ vodu nebo vodu v zevní fázi (emulzní systémy typu olej/voda, tzn. nemastné krémy). [15] Kosmetika nemusí být sterilní, ale musí být přiměřeně chráněna před mikrobiální kontaminací a znehodnocením. [1, 112] Některé kosmetické přípravky obsahují větší mnoţství konzervačních látek neţ je potřebné k udrţení stability výrobku. [12] Pro úspěšnou konzervaci musí být brány v úvahu všechny aspekty vývoje kosmetického prostředku, od návrhu přes výrobu, aţ po spotřebitelské vyuţití a likvidaci. Výrobky obsahují širokou škálu kosmetických přísad, obsahují čisté přísady jako chemikálie a přísady, u nichţ není známo přesné sloţení, například rostlinné extrakty. U všech přísad však musí být zajištěna dostatečná mikrobiologická kvalita. [1, 164] Na obalu kosmetického prostředku musí být mimo jiné vyznačeno datum minimální trvanlivosti. Buď je vyznačen měsíc a rok, nebo den, měsíc a rok. Pokud je to nutné, měly by tyto informace být podle potřeby doplněny údajem o podmínkách, které musí být splněny pro zajištění uvedené trvanlivosti. [11, 214] EU zavedla označení spotřebujte nejlépe do data a doba po otevření. Výrobky s trvanlivostí do 30 měsíců musí být označeny nejlépe datem a výrobky s trvanlivostí delší neţ 30 měsíců jsou označovány symbolem otevřeného kelímku s počtem měsíců, po které je výrobek bezpečný. [11, 8] Lidem trpícím alergiemi se doporučuje vyhnout se přípravkům obsahujícím alergenní přísady. Kaţdý výrobek musí obsahovat seznam všech sloţek na etiketě nebo přiloţeném letáku. [13] 2.1 Konzervanty v kosmetice Pouţití konzervačních látek závisí na předpisech v jednotlivých zemích. Zejména je důleţitá bezpečnost, konzervanty nesmí ohrozit zdraví spotřebitele, podráţdit pokoţku, nebo jinak nepříznivě ovlivňovat místo aplikace. Dále je nezbytná kontrola rozpustnosti, závislosti účinku na ph, barvy a zápachu a jejich snášenlivost s ostatními surovinami v kosmetickém prostředku. Pouţití některých konzervantů je omezeno pouze pro mýdla, šampony a jiné produkty, které jsou po pouţití opláchnuty, tzv. rinse off prostředky.

20 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 20 Ne všechny antimikrobiální látky mohou být pouţity v kosmetických prostředcích vzhledem k tomu, ţe některé mají neţádoucí vlastnosti. Obecně lze říci, ţe antimikrobiální látky mohou být pouţity buď jako látky konzervační, nebo jako látky dezinfekční. Konzervanty by měly splňovat řadu poţadavků. Především se jedná o: Účinnost proti mnoha druhům mikroorganizmů Rozpustnost ve vodě nebo jednoduché rozpouštění v běţně pouţívaných kosmetických ingrediencích Vysoká bezpečnost, neiritabilita Neutrální, neměnící ph výrobku Nesmí sniţovat účinek ostatních přísad Nesmí mít nepříznivý efekt na vzhled produktu Stabilita při vysoké teplotě a změně ph Snadná dostupnost Nízká cena a ekonomické vyuţití [9, 202] Ţádná konzervační látka nesplňuje všechny uvedené poţadavky, především poţadavek na širokospektrý účinek. Z tohoto důvodu nejsou do výrobku obvykle přidávány jednotlivé konzervační látky, ale jejich směsi. Vzhledem k neustálému nárůstu různých surovin pouţívaných v kosmetice a nedostatku komplexních předpisů pro pouţití konzervačních látek v kosmetice, je často nutné spoléhat na farmaceutické a potravinářské předpisy a lékopisy. Ale zatímco pro potraviny a farmaceutické látky jsou definována mnohá omezení, kosmetické produkty podléhají pouze kosmetické vyhlášce EU. [11, 213] Kromě pozitivních ochranných účinků konzervačních látek v kosmetice, jsou předmětem zájmu také jejich neţádoucí účinky, protoţe některé z těchto látek mohou mít škodlivé účinky na lidské zdraví. Aby byla zajištěna vysoká úroveň ochrany lidského zdraví, jsou kosmetické přípravky regulovány a kontrolovány po celém světě. Konzervační látky povolené v rámci ČR a EU jsou uvedeny v příloze č. 6 Vyhlášky 448/2009 Sb. o stanovení hygienických poţadavků na kosmetické prostředky, kde jsou uvedeny omezení, poţadavky, štítek varování a maximální přípustná koncentrace. [16]

21 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 21 V poslední době se značně zvyšuje zájem spotřebitelů o kosmetické přípravky bez konzervačních látek nebo s konzervačními látkami přírodního původu. Ochrany kosmetického prostředku lze docílit i vhodnou formulací přísad. Některé kosmetické přísady mají samy o sobě antimikrobní účinek, dále lze upravit vlastnosti prostředku tak, aby bránily mnoţení mikroorganizmů (úprava ph, úprava vodní aktivity kosmetického prostředku a podobně). [14] Konzervační látky nemusí být přidány do výrobků obsahujících vysoké koncentrace etanolu (20 % a vyšší). [17, 698] Syntetické konzervanty Potenciální konzervační látky jsou shrnuty v rozsáhlých seznamech, které nerozlišují míru účinnosti daných sloučenin. Jen málo konzervačních látek nabízí uspokojivou účinnost pro běţné pouţití. [1, 169] Většina konzervantů je účinná pouze pro určitou skupinu mikroorganizmů, buď pro bakterie, plísně, nebo kvasinky. Účinnost lze rozšířit kombinací jednotlivých látek, směsi konzervantů pak vykazují širokospektrý účinek potřebný k zachování bezpečnosti produktu. Mnohé z těchto konzervačních látek lze označit jako syntetické konzervanty vyrobené chemickou syntézou Přírodní konzervanty Konzervanty mohou být i přírodní povahy, ale tyto látky mají obecně niţší aktivitu a uţší spektrum působení ve srovnání s konzervanty syntetickými. Často jsou tyto přírodní konzervanty zaloţeny na antioxidační aktivitě chránící oleje a tuky před ţluknutím. [10] Jejich pouţití je omezené z důvodu ztráty aktivity začleněním do kompozice produktu a vlivem ph. Přírodní materiály, spíše známé jako účinné sloţky, je obtíţné začlenit do kompozice kvůli jejich konzistenci. Některé takzvaně přírodní nebo přírodně upravené konzervanty se staly komerčními. [1, 172] Přírodní konzervační látky zahrnují rostlinné extrakty, esenciální oleje a vitaminy. Některé vonné látky pouţívané v kosmetice mají antimikrobiální aktivitu, ale jsou často pouţívány v tak nízkých koncentracích, ţe je účinek nepatrný. Mnoho olejových extraktů má také antimikrobiální účinky, ale opět je nutné pouţít vysoké koncentrace k zajištění efektivní konzervace. Esenciální oleje a vonné přísady se skládají z mnoha různých chemických komponent, z nichţ některé jsou vysoce alergenní. [13] V předcházejícím textu bylo uvedeno, ţe mnohé přírodní konzervační látky fungují na principu zamezení oxidace tuků a olejů. Látkám s antioxidačním účinkem je tedy věnována následující podkapitola.

22 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Antioxidanty Antioxidanty jsou látky schopné inhibovat oxidační reakce, čímţ se zabrání oxidačnímu ţluknutí tuků, olejů, vosků, surfaktantů, parfémů a jiných sloţek kosmetických prostředků. Jsou obvykle reprezentovány redukčními činidly nebo volnými radikály. Jako antioxidanty v kosmetických prostředcích se uplatňují kyselina citronová, galová a její estery. Také vitaminy mohou působit jako antioxidanty, například retinol a jeho prekurzory, tokoferol a askorbová kyselina, nebo vitaminové deriváty jako retinyl acetát, retinyl palmitát, askorbyl palmitát, askorbyl fosfát hořečnatý a tokoferol acetát. Konzervační schopnost přírodních antioxidantů je obvykle niţší neţ u syntetických konzervantů, naopak jejich výhodou je nepřítomnost vedlejších toxických účinků. [11, 217]

23 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 23 3 CHARAKTERISTIKA KONZERVAČNÍCH LÁTEK Velké mnoţství konzervačních látek můţe být rozděleno do několika skupin podle funkční skupiny jejich molekulární struktury. [11, 214] Mezi nejčastěji pouţívané konzervační přísady patří následující skupiny látek. 3.1 Organické kyseliny, jejich soli a estery Mezi organické kyseliny pouţívané jako konzervační látky patří například kyselina sorbová, salicylová, propionová, jejich soli a také kyselina benzoová, její soli a estery. [3, 215] Kyselina sorbová Kyselina sorbová se vyskytuje v přírodě jako součást rostlin, je obsaţena v brusinkách, jahodách a rybízu, lze ji připravit i synteticky kondenzací krotonaldehydu s kyselinou malonovou. Jedná se o bílý krystalický prášek, prakticky bez zápachu se slabě kyselou chutí. [18, 282] Kyselina sorbová je účinná v rozsahu ph 4 5,5 a slabě účinná do ph 9. Vykazuje silné fungicidní a slabé baktericidní účinky. Pouţívá se nejen v kosmetických přípravcích, ale také v potravinářském, farmaceutickém a technickém průmyslu. [19] V kosmetických přípravcích bývá zastoupena v 0,2 % koncentraci, zejména v přípravcích obsahující mastné kyseliny a polyoxyethylenové estery. [18, 283] Bývá také často pouţívána v kombinaci s kyselinou benzoovou v různých typech produktů. Kyselina sorbová je více pouţívaná neţ jiné organické kyseliny díky své fyziologické neškodnosti a organoleptické neutralitě. [20, 37] Sorbát draselný Draselná sůl kyseliny sorbové má niţší účinek neţ kyselina sorbová. Podobně jako sorbová kyselina je sorbát pouţíván jako inhibitor růstu plísní a kvasinek, zejména kdyţ je ţádoucí pouţití konzervační látky s dobrou rozpustností ve vodě. Účinek sorbátu draselného je závislý na ph. [18, 283, 284] Pouţívá se častěji neţ kyselina sorbová, díky vyšší stabilitě a rozpustnosti. Inhibiční aktivita je stejná jako v případě kyseliny sorbové, ale obvykle je do výrobků přidáváno o 25 % více sorbátu k dosaţení stejného efektu. [20, 38]

24 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Kyselina benzoová Kyselina benzoová je stabilní při nízkém ph, optimální ph účinnosti je 2 5. Účinnost ztrácí v přítomnosti proteinů a glycerolu. Kyselina benzoová pokrývá široké spektrum mikroorganizmů, grampozitivní a gramnegativní bakterie, kvasinky i plísně. V kosmetických přípravcích se pouţívá v koncentracích do 0,1%. Pouţívá se také ke konzervaci potravin, zejména jako inhibitor růstu kvasinek a plísní v kyselých potravinách. [20] Stejně jako kyselina sorbová je kyselina benzoová nejčastěji přidávána do výrobků v podobě ve vodě rozpustných sodných a draselných solí. [21, 185] Antimikrobiální účinek benzoové kyseliny je zaloţen na inhibici enzymatických reakcí mikrobiálních buněk. Kromě inaktivace enzymů také působí v buněčné stěně. [22, 177] Parabeny Parabeny jsou alkylestery p-hydroxybenzoové kyseliny, mezi které lze zahrnout metylparaben, etylparaben, propylparaben, butylparaben, a benzylparaben. Estery kyseliny p- hydroxybenzoové a její soli jsou široce pouţívány jako konzervační přísady v kosmetických přípravcích, hygienických potřebách, potravinách a léčivech. [23] Nejpouţívanější je metylparaben a propylparaben. Metylparaben je více rozpustný ve vodě, ale méně účinný proti plísním neţ propylparaben. Rovnováhy v účinnosti se docílí vytvořením směsi. Z chemického hlediska se jedná o bílé prášky se slabým zápachem, dobře rozpustné ve vodě při pokojové teplotě. [24, 151] Parabeny jsou běţně pouţívané díky své nízké toxicitě a efektivní konzervační aktivitě, zvláště proti kvasinkám a plísním. [11, 215] Jejich antimikrobiální aktivita je obecně selektivní, takţe jejich směsi, nebo směsi s jinými typy konzervačních látek zajišťují antimikrobiální aktivitu proti širokému spektru mikroorganizmů. [25] Antimikrobiální aktivita parabenů roste s počtem uhlíků alkylového řetězce, zatímco jejich rozpustnost ve vodě s rostoucím řetězcem klesá. Konzervační účinnost lze zvýšit také přídavkem propylen glykolu ve 2-5 % koncentraci, nebo pouţitím parabenů v kombinaci s jinými antimikrobiálními látkami. Naopak je aktivita parabenů sníţena v přítomnosti neionických tenzidů. [26, 749] Aktivita parabenů je na ph nezávislá, jsou účinné při podstatně niţších koncentracích, neţ jsou potřebné pro účinnost slabých kyselin. [27, 72]

25 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 25 Výhodou parabenů je jejich účinnost při vyšších hodnotách ph, v rozmezí od 3 do 8, stabilita při změně teploty, dokonce i při sterilizaci vodní parou. [24, 151] 3.2 Aldehydové a formaldehydové konzervanty Nejběţněji pouţívané jsou aldehydy a formaldehydy jako oxymetylen nebo formalin. Jsou to levné konzervační látky s vyšší rozpustností ve vodě neţ v olejích a tucích, pouţívané ve vodných formulacích (šampony, kondicionéry, sprchové gely, tekutá mýdla a koupelové pěny). Nicméně formaldehyd, který je bezbarvý, štiplavě páchnoucí, iritující plyn, můţe způsobit slzení očí, pálení v očích a krku, nevolnost, dýchací obtíţe, alergie a při vysokých koncentracích můţe vyvolat bolest hlavy a astmatický záchvat. Kosmetika a toaletní potřeby obsahující formaldehyd jako konzervant, jsou prodávány v EU s následujícími omezeními: prostředky ústní hygieny nesmí obsahovat více neţ 0,1 %, zatímco kosmetika a toaletní potřeby, které se neuţívají vnitřně, nesmí obsahovat více neţ 0,2 %, s výjimkou aerosolových sprejů, kde jsou zakázány. Tato omezení platí, kdyţ je formaldehyd pouţit jako konzervant, ale pokud jsou pouţity jako nehtová tuţidla, můţe dosahovat koncentrace 5 %. [11, 215] Ačkoli formaldehyd, pouţívaný především v šamponech a koupelových pěnách, patří mezi oblíbené konzervační látky, jeho uţívání klesá. [28] Omezení platí také pro konzervanty, které ve vodných roztocích uvolňují formaldehyd (donory formaldehydu), jako je imidazolidinyl urea, diazolidinyl urea, hydroxymethylglycinát sodný a benzylhemiformal. Všechny tyto látky jsou regulovány na základě mnoţství uvolněného formaldehydu, vyjadřující maximum povolené koncentrace, shodné s koncentrací uvolněného formaldehydu. [11, 215] 3.3 Alkoholové deriváty Do této skupiny patří fenoxyetanol, fenoxyisopropanol, dichlorobenzyl alkohol, benzyl alkohol, chlorobutanol a další látky. [11, 216] Fenoxyetanol Je jednou ze sloţek konzervantů Versatil PC a Versatil BP pouţitých v praktické části bakalářské práce. Je účinný zejména proti bakteriím a plísním. Pouţívá se v rozsahu koncentrací 0,5 1,5 % při ph [1, 182, 263] Některé konzervační látky mohou mít v kombinaci s fenoxyetanolem sníţený účinek. [12]

26 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Ostatní konzervační látky Mezi další skupiny látek s antimikrobiálním účinkem se řadí aminy, amidy, pyridiny a benzalkoniové soli, imidazolové deriváty a další látky. [11, 216] 3.5 Faktory ovlivňující výběr vhodného konzervačního systému Efektivní konzervace kosmetiky není jednoduchý proces, při kterém se přidá jedna nebo více konzervačních přísad do výrobku. Aby byla konzervace úspěšná, je nutné zváţit celou řadu faktorů, které mají vliv na účinnost a stabilitu zahrnující celkové chemické a fyzikální vlastnosti, specifické přísady, konzervační účinnost a stabilitu, balení výrobku, výrobní procesy a materiály, předpokládané uţívání zákazníkem. [1, 167] Kaţdý jednotlivý kosmetický výrobek vyţaduje individuální přístup při výběru vhodného konzervačního systému. Mezi důleţité faktory ovlivňující výběr a dávkování konzervační látky patří, kromě typu produktu a základu, také snášenlivost s ostatními přísadami a doba trvanlivosti. Ţádný typ konzervační látky není vhodný pro všechny typy produktů. Tyto faktory lze vyuţít k usnadnění konzervace, ale na druhou stranu mohou být příčinou sníţení účinnosti konzervační látky (konzervačního systému). Chemické a fyzikální vlastnosti kosmetických prostředků přímo souvisí s účinností konzervačních látek a stabilitou výrobku. Jednou ze zásadních vlastností je ph produktu; přestoţe vysoce kyselé nebo zásadité prostředí zabraňuje mikrobiální kontaminaci, relativně malé změny v rozsahu ph, způsobí mikrobiální růst a tím ovlivní účinek konzervantů a stabilitu produktu. [1, 168] Odolnost kosmetického prostředku vůči mikrobiální kontaminaci, závisí kromě účinku přidaných konzervačních látek, na mnoha faktorech, jako je dávkování, vodní aktivita, nebo přítomnost chelatačních látek, které zvyšují účinek některých konzervantů. Vodní aktivita, je definována jako obsah dostupné vody, tedy vody, kterou je mikroorganizmus schopen vyuţít pro růst, mnoţení a biochemické pochody v buňce. Výrobky s nízkou vodní aktivitou jsou bezpečné i bez přídavku konzervačních látek, ale mnoho kosmetických přípravků, jako jsou krémy, pleťové vody, šampony, kondicionéry a tekutá mýdla, mají vysokou vodní aktivitu a proto je chemická ochrana nutná 13]. Chelatační činidla reagují s ionty kovů v buněčné stěně mikroorganizmů, čímţ zvyšují schopnost konzervantů pronikat přes buněčnou stěnu a usmrtit mikroorganizmus. Jedním

27 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 27 z nejčastěji pouţívaných chelatačních činidel je etylendiamintetraoctová kyselina (EDTA). [13] 3.6 Metody hodnocení antimikrobiální ochrany kosmetických přípravků Kromě maximálního počtu mikroorganizmů povoleného v konečném produktu, je také důleţité, aby byl konzervační systém dlouhodobě účinný proti mikrobiální kontaminaci. Tento účinek lze dokázat pomocí zátěţového testu, při kterém je výrobek cíleně kontaminován mikroorganizmy a sleduje se jeho schopnost bránit přítomným kontaminujícím mikroorganizmům v růstu. [13] Principem zátěţových (přeţívacích) testů je vnesení standardních kultur různých mikroorganizmů (bakterií, kvasinek, plísní) do zkoušeného kosmetického výrobku a sledování míry jejich inaktivace působením pouţitých druhů a koncentrací konzervačních látek při daném sloţení a fyzikálních vlastnostech výrobku 29]. Zátěţové testy jsou většinou dlouhodobé, nejčastěji 28-denní, po tuto dobu se v určených intervalech sleduje počet buněk v zaočkovaném vzorku. Má-li být zajištěna dostatečná ochrana výrobku, je nutné tento test provést. Zkušební test je velmi pracný a náročný, zejména pokud je testováno několik různých konzervantů v různých koncentracích [13]. Při provedení testu je třeba brát v úvahu řadu faktorů. Velmi důleţitá je příprava inokula bakterií, kterým je testovaný kosmetický prostředek zaočkován. Postup přípravy inokula určuje fyziologický stav buněk, který má přímý vliv na výsledky jakéhokoli testu účinnosti. Kosmetické přípravky jsou zaočkovány určitou mikrobiální kulturou. Tyto kultury je nutné udrţovat, tedy přeočkovávat na vhodných médiích, aby byla zajištěna jejich ţivotaschopnost, odolnost a stabilita vlastností. Standardní podmínky pro přípravu a skladování mikroorganizmů jsou nezbytné pro reprodukovatelné výsledky. Inokulum mikroorganizmu pro zátěţový test by mělo být standardizováno a je tedy nutné znát počet buněk v inokulu, respektive počet kolonie tvořících jednotek na 1 ml inokula (colony forming units, CFU/ml). [1, 113, 114] Kosmetické prostředky zpravidla obsahují značné mnoţství různých přísad, z nichţ kterákoli můţe teoreticky sniţovat či úplně blokovat účinnost konzervační látky. Kosmetické prostředky v závislosti na svém sloţení vykazují velkou nebo malou polaritu, různou hodnotu HLB a různý obsah neionických surfaktantů, polymerů a humektantů. Je sloţité před-

28 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 28 vídat účinek konzervantů s ohledem na sloţky výrobku, stejně tak odhadnout potřebné mnoţství konzervační látky. Kaţdý výrobek musí být tedy individuálně testován inokulací mikroorganizmů, aby byl ověřen konzervační účinek. V případě, ţe jednotlivé faktory, které ovlivňují účinnost konzervačních látek, jsou známy a kosmetika se skládá z ingrediencí, které nezpůsobují významnou inaktivaci konzervantu (např. oleje s nízkou polaritou a surfaktanty s nízkou HLB), je moţné redukovat mnoţství konzervačních látek v kosmetickém prostředku. Na druhou stranu, pokud se kosmetika skládá z přísad se silným inaktivačním účinkem (oleje s vysokou polaritou, vysoká HLB surfaktantů a polyetylen glykol), mnoţství konzervantů musí vzrůst. Další látky jako humektanty, například 1,3-butylenglykol, mají mikrobistatický účinek proti bakteriím. Pokud jsou pouţity v kombinaci s vhodnými konzervanty, dochází k synergickému účinku a výsledná koncentrace konzervační látky můţe být niţší. [9, 206]

29 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 29 II. PRAKTICKÁ ČÁST

30 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 30 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Zátěžový test účinnosti konzervačních látek Byl proveden 28 denní test ke zhodnocení účinku konzervačních látek přidaných do vzorku pleťové vody. K provedení testu účinnosti byly pouţity grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus a Bacillus subtillis. Nejdříve bylo připraveno inokulum kaţdého ze zvolených mikroorganizmů. Dále byly připravené zakonzervované vzorky pleťové vody kontaminovány grampozitivními bakteriemi B. subtillis a S. aureus. Během 28 dnů byla sledována schopnost konzervačních látek zabránit mnoţení těchto bakterií ve vzorku, případně sníţit jejich počet. Odběry vzorků byly provedeny po 7, 14 a 28 dnech, kdy bylo odebráno 500 μl vzorku a smícháno s připraveným neutralizačním roztokem. Dále bylo provedeno ředění v ředícím roztoku a odebraný vzorek byl kultivován na vhodné pevné půdě při optimální teplotě růstu pouţitých mikroorganizmů. Výsledky byly vyhodnoceny na základě počtu kolonií na miskách, pro kaţdý vzorek byla vypočítána hodnota CFU/ml (počet kolonie tvořících jednotek na 1 ml vzorku) a vypočtené hodnoty byly graficky znázorněny. 4.2 Použité chemikálie Flavol KDA, Enaspol a.s. Spolapon AES, Enaspol a.s. Novethix TM L-10 Polymer, Lubrizol Kyselina citronová Tween 40, Himedia TSA (Soyasean Casein Digest Agar), Himedia Casein Enzyme Hydrolyste, Himedia NaCl (LachNer) Versatil PC, Drstraetmans Sloţení: Fenoxyetanol, Kaprylyglykol Versatil SL, Drstraetmans Sloţení: Levulinát sodný, sorbát draselný, voda Versatil BP, Drstraetmans

31 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 31 Sloţení: Fenoxyetanol, Kyselina benzoová 4.3 Přístroje a pomůcky Autokláv Varioklav H+P, Německo Automatické mikropipety Biohit a Nichipet Biologický termostat BT 120, Česká republika Denzitometr Unimed, Česká republika Digitální váhy, OHAUS, Švýcarsko Laboratorní sklo (kádinky, tyčinky, sterilní misky, sterilní zkumavky, odměrná baňka) Laboratorní pomůcky (plastové zkumavky a hokejky, kličky, sterilní špičky na mikropipety) ph metr Plynový kahan Vortex Heidolph REAX top, Německo Vysokorychlostní mixer Heidolph RZR Postup práce Příprava pleťové vody K provedení testu účinnosti konzervačních látek byly připraveny vzorky pleťové vody podle následující receptury: Voda 80 % Tween 40 8,9 % SLES 8,9 % Cocamidopropyl betain 1,8 % Novethix 0,4 % Do kádinky bylo na 100 g vzorku naváţeno : Novethix 8,9 g Tween 40 12,71g

32 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 32 SLES 6,67g Cocamidopropyl betain 1,6g Voda 70,12 g Dále byly do vzorků přidány tři druhy konzervačních látek Versatil PC, Versatil SL a Versatil BP ve třech různých koncentracích v rozmezí doporučeném výrobcem. Versatil PC je vhodné pouţít v koncentracích 0,8 1%, Versatil SL 1 2 % a Versatil BP 0,5 1 %. Pro Versatil PC byly zvoleny koncentrace 0,8 %; 0,9 % a 1%. Pro konzervant Versatil SL byly zvoleny následující koncentrace: 1%; 1,5 %; 2 %. Konzervant Versatil BP byl pouţit v koncentracích 0,5 %; 0,75 % a 1%. Jednotlivé konzervační přísady byly přidávány do vzorků pleťových vod zvlášť, aby mohla být prověřena antimikrobiální účinnost kaţdého z pouţitých konzervantů. Následně byla směs homogenizována vysokorychlostním mixérem Heidolph RZR Problém tvořil špatně se rozpouštějící polymer Novethix, proto se nejdříve nechal nabobtnat a poté byl přidán do směsi. Na závěr bylo upraveno ph na hodnotu 5,5 pomocí 30% roztoku kyseliny citronové. ph bylo upraveno u všech vzorků, přestoţe Versatil PC je na ph nezávislý, Versatil SL je účinný při ph menším neţ 6 a Versatil BP je účinný v rozsahu ph 4 6. Na závěr byly vzorky převedeny do plastových zkumavek o objemu 10 ml a uchovány k dalšímu pouţití Příprava neutralizačního roztoku Neutralizační roztok byl připraven z následujících surovin: Eugonic LT 100 Brook Base (Himedia) Tween 80 (Himedia) Destilovaná voda Do láhve o objemu 400 ml bylo naváţeno 12,96 g přísady Eugonic Brook Base. Dále byla připravena směs vody a přísady Tween 80 ve vodní lázni, aby došlo k úplnému rozpuštění. Všechny přísady byly smíchány a následně byl roztok sterilizován v autoklávu při 132 C po dobu 20 minut Příprava ředícího roztoku Ředící roztok se skládal z: Casein Enzyme Hydrolyste (Himedia)

33 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 33 NaCl (LachNer) Destilované vody Z těchto přísad bylo připraveno 200 ml roztoku, který byl sterilizován v autoklávu při 132 C po dobu 20 minut Příprava kultivačního média TSA agar (Soyabean Casein Digest Agar) Sloţení kultivačního média: TSA agar (HiMedia) Destilovaná voda Bylo naváţeno 16 g TSA agaru do skleněné lahve a rozpuštěno ve 400 ml destilované vody. Následně bylo připravené médium sterilizováno v autoklávu při teplotě 132 C po dobu 20 minut Příprava inokula K provedení testu byly zvoleny grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus subsp. aureus CCM 3953 a Bacillus subtillis subsp. spizizenii CCM Z připraveného kříţového roztěru byl odebrán vzorek mikroorganizmů a zaočkován do ředícího roztoku. Následně byla provedena potřebná ředění, kdy byl pomocí denzitometru upraven zákal suspenze na hodnotu 1. stupně McFarlandovy zákalové stupnice. Takto bylo připraveno inokulum pro Bacillus subtillis i Staphylococcus aureus. Dále byly inokulem zaočkovány vzorky pleťových vod připravených v plastových zkumavkách, do kaţdé zkumavky bylo přidáno 100 μl inokula Provedení odběru vzorku Odběry vzorků byly provedeny v čase 0 a dále po 7, 14 a 28 dnech. Odběr vzorku v čase 0 byl pouţit ke stanovení počtu buněk zaočkovaných do vzorku pleťové vody, tedy počtu buněk ve vzorku na začátku testu. Bylo odebráno 0,1 ml inokula a smícháno s 10 ml ředícího roztoku. Po důkladném promíchání na vortexu bylo odebráno 0,1 ml vzorku a přeneseno do 2. zkumavky s 10 ml ředícího roztoku. Takto byly provedeny čtyři ředění. Odběr vzorků po 7, 14 a 28 dnech byl proveden následujícím způsobem. Nejdříve byly provedeny tři ředění. 0,5 ml vzorku bylo smícháno se 4,5 ml neutralizačního roztoku a směs byla homogenizována na vortexu. Dále bylo z neutralizačního roztoku odebráno 0,5

34 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 34 ml vzorku a smícháno se 4,5 ml ředícího roztoku, stejným způsobem bylo provedeno i třetí ředění. Následně bylo mikropipetou odebráno 100 μl vzorku na misku s TSA agarem, kde byl vzorek rozetřen pomocí sterilní hokejky. Misky byly 48 hodin kultivovány v termostatu při optimální teplotě růstu pouţitých mikroorganizmů, tedy 30 C pro B. subtilis a 37 C pro S. aureus. Po 48 hodinách kultivace byly spočítány kolonie bakterií Staphylococcus aureus a Bacillus subtillis, poté byla vypočtena hodnota CFU/ml. Výsledky byly zpracovány graficky, na základě vypočtených hodnot byl vyhodnocen antimikrobiální účinek pouţitých konzervantů.

35 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 35 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Pro praktickou část bakalářské práce byly připraveny vzorky pleťových vod, do kterých byly přidávány komerční konzervační prostředky Versatil SL, Versatil PC a Versatil BP. Základem konzervantu Versatil SL je levulinát sodný a draselná sůl kyseliny sorbové (sorbát draselný). Antimikrobiální sloţkou Versatilu PC je fenoxyetanol a kaprylyglykol, fenoxyetanol je i sloţkou posledního testovaného konzervantu Versatil BP, který kromě této látky obsahuje i kyselinu benzoovou. Konzervační látky byly do pleťových vod přidávány ve třech různých koncentracích a vzorky pleťových vod byly následně zaočkovány grampozitivními bakteriemi Staphylococcus aureus subsp. aureus CCM 3953 a Bacillus subtilis subsp. spizizenii CCM Hodnocení účinnosti konzervačních látek bylo provedeno pomocí zátěţového testu konzervace, během kterého byl sledován počet ţivotaschopných buněk v jednotlivých vzorcích pleťových vod. Počet buněk ve vzorcích byl stanoven v čase 0 (mnoţství buněk zaočkovaných do vzorku na počátku testu) a dále po 7, 14 a 28 dnech skladování. V následujících kapitolách jsou hodnoceny výsledky tohoto testu pro jednotlivé konzervační látky a mikroorganizmy.

36 CFU/ml UTB ve Zlíně, Fakulta technologická Vyhodnocení výsledků účinnosti konzervantu Versatil SL proti bakterii Bacillus subtillis subsp. spizizenii CCM SL 1% SL 1,5% SL 2% Doba odběru vzorku [den] Obr. 2: Počet buněk Bacillus subtillis ve vzorcích pleťových vod obsahujících konzervant Versatil SL Výsledky zátěţového testu jsou graficky znázorněny na obrázku 2. Versatil SL byl testován v koncentracích 1 %, 1,5 % a 2 %. Do grafu byly vyneseny hodnoty CFU/ml získané po 7, 14 a 28 dnech skladování. Počet buněk ve vzorku odebraném v čase 0, tedy počet buněk vnesených do vzorku pleťových vod, byl stanoven výsevem základního inokula B. subtilis. Z počtu buněk v inokulu byl následně vypočítán počáteční počet buněk ve vzorku pleťových vod. V čase 0 byly hodnoty CFU/ml ve vzorcích 1, Po 7 dnech počet kolonií ve vzorku klesl u všech pouţitých koncentrací. V případě 1% koncentrace klesl počet buněk bakterií ve vzorku na hodnotu 50 CFU/ml, u 1,5% koncentrace došlo ke sníţení počtu buněk bakterií na hodnotu 200 CFU/ml a pro 2% koncentraci byl počet buněk stanoven na 3100 CFU/ml. Při dalších odběrech vzorků se počet kolonií postupně sniţoval aţ na nulovou hodnotu. Pouze u vzorku obsahující konzervant o 1% koncentraci se počet kolonií zvýšil při druhém odběru 14. den od zahájení testu na hodnotu 500 CFU/ml a dále zůstal stabilní. 1% koncentrace tedy není vhodná pro konzervaci pleťové vody o daném sloţení. Přesto je konzervant Versatil SL účinný proti bakterii Bacillus subtillis, protoţe došlo ke

37 UTB ve Zlíně, Fakulta technologická 37 sníţení počtu buněk ve vzorcích pleťových vod. Kritéria pro hodnocení účinnosti konzervačních látek jsou uvedeny v České technické normě ČSN EN ISO 11930: Hodnocení antimikrobiální ochrany kosmetického výrobku. Tato norma uvádí dvě kritéria pro hodnocení. Jestliţe kosmetický přípravek splňuje kritérium A, mikrobiologické riziko je povaţováno za tolerovatelné a výrobek splňuje poţadavky této normy bez dalšího odvodnění. Pokud přípravek splňuje kritérium B, analýza mikrobiologického rizika musí prokázat existenci kontrolních faktorů nesouvisejících se sloţením výrobku; na příklad ochranné balení (přítomnost pumpičky) poskytuje vyšší úroveň ochrany neţ nádobka s víčkem. To je povaţováno za ochranný prostředek pro sníţení rizika a přípravek pak splňuje normu na základě kritéria B a mikrobiologické riziko je tolerovatelné. Podle kritéria A musí dojít ke sníţení počtu bakterií nejméně o 3 logaritmické řády po 7, 14 a 28 dnech skladování kosmetického prostředku, zároveň nesmí dojít k ţádnému zvýšení počtu od předchozího stanovení. Podle kritéria B musí dojít ke sníţení počtu bakterií ve vzorku nejméně o 3 logaritmické řády po 14 a 28 dnech a opět není přípustné zvýšení počtu buněk od předchozího stanovení. V této normě je odchylka 0,5 log od stanovených kritérií povaţována přijatelnou 30]. Podle výše uvedených kritérií by výrobek konzervovaný Versatilem SL splňoval normu dle kritéria B, vzhledem k tomu, ţe při prvním odběru nebylo dosaţeno poţadovaného sníţení o 3 logaritmické řády, v následujících odběrech byla ale tato podmínka dodrţena při pouţití Versatilu SL v koncentraci 1,5 a 2 %.