Univerzita Karlova v Praze

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Klinická a toxikologická analýza Bc. Tereza Kadlecová Kapilární elektroforéza s duální optickou a bezkontaktní vodivostní detekcí Capillary electrophoresis with dual optical and contactless conductivity detection Diplomová práce Vedoucí diplomové práce/školitel: Prof. RNDr. František Opekar, CSc. Praha, 2013

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Podpis 2

3 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat vedoucímu mé diplomové práce Prof. RNDr. Františku Opekarovi, CSc. za cenné rady, připomínky, metodické vedení práce a také trpělivost a ochotu. Dále bych také chtěla poděkovat mojí rodině a příteli za jejich podporu. Práce na tomto projektu byla finančně podporována Výzkumným záměrem Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky, projekt MSM a grantem GAČR P206/10/

4 Abstrakt Tato práce se zabývá duální detekcí organických a anorganických analytů po separaci kapilární zónovou elektroforézou. V první části se testují dva typy dávkování vzorku. Standardní hydrodynamické dávkování, používané v laboratorních elektroforetických aparaturách nejčastěji, spočívající ve zvednutí nádobky se vzorkem v níž je ponořen dávkovací konec kapiláry, a nový způsob hydrodynamického dávkování pomocí zvýšeného tlaku na hladinu vzorku bez pohybu kapiláry. Toto dávkování minimalizuje činnost experimentátora, protože je ovládáno softwarově. Experimentátor pouze vyměňuje nádobku se vzorkem při dávkování za nádobku se separačním elektrolytem při separaci. Hledá se nejlepší dávkovací čas a tlak pro separaci tak, aby bylo dosaženo co nejvyšší účinnosti a dostatečné citlivosti detekce. V druhé části diplomové práce je vyvinutá metoda testována při separaci aminokyselin v biologickém vzorku (moči). Klíčová slova Kapilární elektroforéza, duální detekce, hydrodynamické dávkování, tlakové dávkování. Abstract This work deals with dual detection of organic and inorganic analytes after separation by capillary zone electrophoresis. In the first part, two types of hydrodynamic sampling are tested. Standard hydrodynamic sampling most often used in laboratory-made electrophoretic apparatus, based on lifting the vessel with the sample, in which the sampling end of the capillary is immersed, and a new method based on increasing the pressure in the sampling vessel without moving the capillary. This sampling procedure minimizes experimenter activity because it is controlled by software. Experimenter only changes vessel containing the sample solution for one with separation electrolyte. The experimental parameters, the sampling time and pressure, are optimized to achieve maximum separation efficiency and adequate detection sensitivity. In the second part of the work, the developed method is tested for the separation of amino-acids in a biological sample (urine). Keywords Capillary electrophoresis, dual detection, hydrodynamic sampling, pressure-controlled sampling. 4

5 Obsah 1 Teoretický úvod Kapilární zónová elektroforéza Praktické využití kapilární elektroforézy Shrnutí výhod a nevýhod kapilární elektroforézy Varianty elektromigračních metod v kapiláře Metody detekce používané pro kapilární zónovou elektroforézu Spektrofotometrická detekce Nepřímá fotometrická detekce Fluorescenční detekce Bezkontaktní vodivostní detekce Duální detekce Způsoby dávkování v CZE Standardní dávkování hydrodynamické Elektrokinetické dávkování Nový způsob dávkování Využití kapilární elektroforézy moči Cíl práce Experimentální část Popis dávkovacího zařízení Použité chemikálie a roztoky Pracovní postup Výsledky a diskuze Určení optimálních dávkovacích parametrů Dávkovací tlak 1x10 5 Pa (1000 mbar) generovaný membránovou pumpou Porovnání standardního a testovaného dávkování Dávkovací tlak 5x10 3 Pa (50 mbar) generovaný membránovou pumpou Porovnání standardního a testovaného dávkování Elektroforéza moči Závěr

6 5 Použité zdroje

7 Použité zkratky AMK AMP CE COND CZE C 4 D ECL EOF HEC HIS HPLC LIF MES MS RSD SDS UV aminokyselina amperometrická detekce kapilární elektroforéza konduktometrická detekce kapilární zónová elektroforéza bezkontaktní vodivostní detekce elektrochemiluminiscenční detekce elektroosmotický tok hydroxyethylcelulóza histidin vysokoúčinná kapalinová chromatografie laserem indukovaná fluorescence 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina hmotnostně spektrometrická detekce relativní směrodatná odchylka dodecylsulfát sodný ultrafialové záření Použité symboly A c d E ε η g h K n l L absorbance, plocha píku koncentrace vnitřní průměr kapiláry intenzita elektrického pole permitivita roztoku, molární absorpční koeficient viskozita gravitační zrychlení rozdíl výšek hladin, výška píku konstanta délka zóny délka optické dráhy 7

8 L c L 1,2 m M i N Q i r r i R ρ t t migr U celková délka kapiláry interval spolehlivosti nadávkované množství molekulová hmotnost i-tého iontu separační účinnost náboj i-tého iontu vnitřní poloměr kapiláry poloměr i-tého iontu elektrický odpor, rozpětí hustota doba dávkování migrační čas napětí µ ef,i elektroforetická pohyblivost i-tého iontu µ eof elektroosmotická mobilita V nadávkovaný objem v nadávkovaný objem v ef v eof w 1/2 X x~ medián elektroforetická rychlost elektroosmotický tok šířka píku v polovině jeho výšky kapacitance Z P impedance elektrokinetický (zeta) potenciál tlak na vstupu kapiláry 8

9 Seznam obrázků Obr. 1. Elektroosmotický tok v separační kapiláře. Obr. 2. Proudění kapaliny kapilárou hnanou tlakem (A) a elektroosmoticky (B). Obr. 3. Schéma pro kapilární elektroforézu. Obr. 4. Elektroforeogram směsi kationtů, aniontů a nenabitých látek. Obr. 5. Schéma standardního hydrodynamického dávkování do laboratorní elektroforetické aparatury. Obr. 6. Schéma elektrokinetického dávkování. Obr. 7. Principiální znázornění nového způsobu hydrodynamického dávkování. Obr. 8. Schéma dávkovací a promývací části laboratorní elektroforetické aparatury. Obr. 9. Detailní pohled na dávkovací část aparatury. Obr. 10. Celková laboratorní elektroforetická sestava. Obr. 11. Závislost plochy píku K + iontu na době dávkování tlakem 1x10 5 Pa. Obr. 12. Závislost separační účinnosti K + iontu na době dávkování tlakem 1x10 5 Pa. Obr. 13. Elektroforeogramy 0,05 mm testovacího roztoku (1) K +, (2) Na + a (3) tyraminu. Obr. 14. Elektroforeogramy 0,5 mm testovacího roztoku (1) K +, (2) Na + a (3) tyraminu. Obr. 15. Elektroforeogram 0,05 mm směsi kationtů (1) K +, (2) Ba 2+, (3) Ca 2+, (4) Na +, (5) Mg 2+, (6) Li +. Obr. 16. Závislost plochy píku K + iontu na době dávkování tlakem 5x10 3 Pa. Obr. 17. Závislost separační účinnosti píku K + iontu na době dávkování tlakem 5x10 3 Pa. Obr. 18. Elektroforeogramy 0,05 mm testovacího roztoku (1) K +, (2) Na + a (3) tyraminu. Obr. 19. Elektroforeogramy 0,5 mm testovacího roztoku (1) K +, (2) Na + a (3) tyraminu. Obr. 20. Elektroforeogramy 0,05 mm směsi kationtů (1) K +, (2) Ba 2+, (3) Ca 2+, (4) Na +, (5) Mg 2+, (6) Li +. Obr. 21. Elektroforeogram modelové směsi 20 µm K + (1), Na + (2), Ca 2+ (3) a 100 µm 3- methylhistidinu (4), histidinu (5) a 1-methylhistidinu (6). Obr. 22. Elektroferogramy moči ředěné vodou 1:9 (B) a moči ředěné vodou s přídavkem 100 m histidinu (C). Obr. 23. Detailní část elektroforeogramu s píkem histidinu v moči zředěné 1:9 deionizovanou vodou. Obr. 24. Detailní část elektroforeogramu s píky (1) 3-methylhistidinu, (2) histidinu a (3) 1- methylhistidinu v moči s přídavkem 100 M jednotlivých histidinů. 9

10 Obr. 25. Elektroforeogram modelové směsi 20 µm (1) K +, (2) Na +, (3) Ca 2+ a 100 µm (4) 3-methylhistidinu, (5) histidinu a (6) 1-methylhistidinu v separačním pufru 20 mm MES + 5 mm LiOH, ph 5,9, s přídavkem 0,1 % HEC. Obr. 26. Elektroforeogram moči zředěné 1:9 s deionizovanou vodou v separačním pufru 20 mm MES + 5 mm LiOH, ph 5,9, s přídavkem 0,1 % HEC. Obr. 27. Elektroforeogram moči s přídavkem 100 M jednotlivých histidinů zředěné 1:9 s deionizovanou vodou v separačním pufru 20 mm MES + 5 mm LiOH, ph 5,9, s přídavkem 0,1 % HEC. 10

11 1 Teoretický úvod 1.1 Kapilární zónová elektroforéza Kapilární zónová elektroforéza (CZE) často označovaná pouze jako kapilární elektroforéza (CE), je separační metoda patřící do skupiny kapilárních elektromigračních metod, kde k separaci nabitých látek dochází vlivem elektrického pole. Kapilární zónová elektroforéza je z těchto metod nejpoužívanější. Je vhodná pro separaci látek s velkou i malou molekulovou hmostností. Jedná se o jednu z nejvíce používaných separačních metod, díky mnoha výhodám, které poskytuje. K separaci stačí velmi malé množství vzorku, také spotřeba separačního pufru je minimální, analýza je rychlá, snadná a zároveň poskytuje vysokou separační účinnost jenž dosahuje stovek tisíc až milionů teoretických pater. Díky tomu se stává metodou konkurující metodám kapalinové chromatografie. Dalším významným pozitivem použití kapilární zónové elektroforézy je možnost přídavku malého množství selektoru jenž účinně ovlivní separaci. A také možnost ovlivnění sledu elektrolytů jenž slouží nejen k separaci, ale i ke zkoncentrování analytů. Nevýhodou může být nižší reprodukovatelnost a citlivost oproti technikám chromatografickým v důsledku časté nestability elektroosmotického toku. Kapilární zónovou elektroforézou lze separovat organické a anorganické látky, které mají náboj, ať už kladný či záporný. Můžou být tedy separovány anorganické ionty, aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, nukleové kyseliny, sacharidy, organické a anorganické kyseliny. Separovány mohou být i nabité biočástice jako jsou viry či buněčné organely [1, 2, 3]. Proteinogenní aminokyseliny, separované v této práci, mohou být elektroforeticky separovány díky dvěma disociovatelným skupinám na hlavním řetězci, skupině karboxylové, ze které může být oddisociován vodík za vzniku karboxylového aniontu a aminoskupině, která naopak může nést kladný náboj. Některé aminokyseliny mají disociovatelnou skupinu i v postranním řetězci, například imidazolová skupina histidinu. To jaký náboj bude aminokyselina mít závisí na ph separačního elektrolytu. V kyselém pufru aminokyselina nese kladný náboj, je potlačena disociace karboxylové skupiny a aminokyselina se tedy vyskytuje ve formě kationtu či divalentního kationtu u histidinu. Se stoupajícím ph do zásadité oblasti přechází přes neutrální formu (zwiteriont) až k aniontu, dochází k deprotonizaci kvarterní aminoskupiny. U aminokyselin, které mají disociovatelnou skupinu i v postranním řetězci je nutné uvažovat i její disociaci [4, 5]. Separace probíhá v křemenné kapiláře s vnitřním průměrem od 10 do 100 µm potažené vrstvou polyimidu, nejčastěji jsou používány kapiláry o vnitřním průměru 50 nebo 75 µm. Díky polyimidu lze s kapilárou dobře manipulovat a ohýbat ji, nepotažená kapilára je velice křehká a náchylná ke zlomení. Díky malému průměru separační kapiláry je snížen rozsah difúze analytu během separace. Dále je použití kapiláry výhodné v tom, že může být snadno odváděno teplo vznikající při separaci průchodem elektrického proudu tzv. Jouleovo teplo. Díky tomu je možné k separaci použít vysoké hodnoty napětí. V této práci 11

12 postačilo přirozené ochlazování okolním vzduchem. Díky těmto faktorům je rozmytí látek malé a je možné separovat látky s vysokými difúzními koeficienty. Křemenná kapilára se využívá nejčastěji díky její cenové dostupnosti a obsahu silanolových skupin na vnitřním povrchu, které urychlují dobu analýzy vyvoláním elektroosmotického toku. Na kapiláru je vloženo vysoké napětí. Nabité ionty jsou separovány díky jejich rozdílné elektroforetické pohyblivosti a elektroosmotickému toku separačního pufru, kterým je naplněna separační kapilára [6, 7]. Jak již bylo zmíněno výše, ionty jsou separovány díky elektroforetické migraci. Jedná se o pohyb iontů v elektrickém poli, které bylo vytvořeno vložením vysokého napětí na kapiláru. Ionty migrují díky elektrostatickému přitahování jejich náboje s opačným nábojem elektrody. To znamená, že kationty jsou přitahovány k záporně nabité katodě a anionty ke kladně nabité anodě. Nabité látky se pohybují k opačně nabité elektrodě konstantní elektroforetickou rychlosti v ef [ms -1 ]. Ta je definována vztahem: v E (1 1) ef ef, i kde E [V m -1 ] je intenzita elektrického pole a µ ef,i [m 2 V -1 s -1 ] je elektroforetická pohyblivost separovaného iontu. Ze vztahu je jasné, že konstantní elektroforetická rychlost je závislá na intenzitě elektrického pole E a na elektroforetické pohyblivosti separovaného iontu µ ef,i, jejich závislost je přímo úměrná. Intenzita elektrického pole E je přímo úměrná napětí U [V] vloženému na kapiláru a nepřímo úměrná celkové délce kapiláry L c [cm]: U E (1-2) L c To jakou elektroforetickou pohyblivostí µ ef,i se budou ionty pohybovat v elektrickém poli závisí na poloměru separovaného iontu r i [m], na celkovém náboji daného iontu Q i [C] a také na viskozitě separačního pufru η [kg m -1 s -1 ]: µ ef,i Qi (1-3) 6 r i Ze vztahu (1-3) je patrné, že elektroforetická pohyblivost separovaného iontu je přímo úměrná celkovému náboji daného iontu Q i a nepřímo úměrná poloměru iontu r i a viskozitě roztoku v separační kapiláře η. Druhý transportní jev, který se podílí spolu s elektroforetickou migrací na pohybu iontů v kapiláře je elektroosmotický tok (EOF) separačního pufru kapilárou. Na vnitřní stěně křemenné kapiláry jsou siloxanové skupiny hydrolyzovány na silanolové skupiny, které dále disociují za vzniku záporně nabitých křemičitanových skupin. Záporně nabité křemičitanové skupiny jsou na vnitřním povrchu křemenné kapiláry. Na záporně nabitý povrch kapiláry se váží kationty z roztoku. K povrchu kapiláry je tedy přilehlá pozitivně nabitá vrstva roztoku. Na základě působení stejnosměrného pole se začínají pohybovat kationty u povrchu kapiláry směrem ke katodě a strhávají spolu sebou i celý roztok 12

13 v kapiláře, včetně všech přítomných látek v roztoku viz. schéma na obr. 1. I nenabité látky se tedy v kapiláře pohybují a to rychlostí elektroosmotického toku. Látky nabité se pohybují rychleji a to podle svojí elektroforetické mobility a putují různým směrem podle náboje, ale kationty i anionty jsou elektroosmotickým tokem strhávány ke katodě. Kladně nabité látky dojdou ke katodě dříve než záporně nabité látky, protože kromě elektroosmotického toku je směrem ke katodě pohání i elektroforetická migrace. Kationty jsou tedy elektroosmotickým tokem urychlovány a anionty naopak zpomalovány. Rychlost elektroosmotického toku eof [m s -1 ] je definována vztahem: E (1-4) eof eof Kde eof [m 2 V -1 s -1 ] je elektroosmotická mobilita. Velikost elektroosmotické mobility a tedy i elektroosmotického toku je závislá na několika faktorech. Z rovnice (1-5) eof (1-5) r vyplývá, že eof je přímo úměrná permitivitě elektrolytu ε [F m -1 ] a zeta potenciálu ζ [V] vzniklého v důsledku náboje na povrchu kapiláry a nepřímo úměrná viskozitě roztoku η a poloměru kapiláry r. Elektroosmotický tok je možné měnit, například změnou ph separačního elektrolytu. Elektroroosmotický tok je závislý na ph elektrolytu díky závislosti zeta potenciálu na stupni ionizace silanolových skupin. Se zvyšujícím se ph elektrolytu se zvětší záporný náboj na vnitřní stěně kapiláry a dojde tedy k urychlení elektroosmotického toku. Přibližně do ph 4 je ionizace nízká, ale všechny skupiny jsou ionizované při hodnotě ph 9. Rychlost separace látek také závisí na koncentraci separačního elektrolytu, teplotě, separačním napětí a také na míře sorpce látek na stěnu kapiláry [2, 8, 9, 10, 11, 12]. Elektroosmotický tok také kolísá v důsledku chemicko-fyzikální nestability vnitřního povrchu křemenné kapiláry, který je měněn separovaným roztokem a to má dopad na reprodukovatelnost metody. EOF lze stabilizovat či modifikovat buď úpravou vnitřního povrchu kapiláry nebo činidly přidávanými do separačního elektrolytu. EOF umožňuje v CE nejen větší rychlost separace, ale také zmenšuje rozmytí zón analytů, jelikož způsobuje plochý profil proudění kapaliny kapilárou. Zatímco v kapalinové chromatografii, kde je k proudění kapaliny využíván tlak, jehož zdrojem je tlaková pumpa, je profil toku kapaliny parabolický. Látky se tedy nepohybují stejně rychle v jednom místě kapiláry, tak jako v CE s elektroosmotickým tokem. Plochý a parabolický profil pohybu kapaliny je znázorněn na obr. 2 [2, 6]. 13

14 Obr. 1 Elektroosmotický tok v separační kapiláře. Záporně nabité křemičitanové skupiny na vnitřní straně kapiláry na sebe váží kationty z roztoku a ty pak putují směrem ke katodě spolu s roztokem v kapiláře. Převzato z [11]. Obr. 2. Proudění kapaliny kapilárou hnanou tlakem (A) a elektroosmoticky (B). (A) Parabolický profil proudící kapaliny u kapiláry hnané tlakem. (B) Rovný profil proudící kapaliny u kapaliny poháněné elektroosmotickým tokem. Převzato z [2]. Obecné schéma aparatury pro kapilární elektroforézu je na obr. 3. Separační kapilára potažená vrstvou polyimidu je svým vstupním koncem ponořena do nádobky s elektrolytem, která je při dávkování vyměněna za nádobku se vzorkem a výstupní konec kapiláry je také ponořen do nádobky s elektrolytem. V nádobkách jsou rovněž ponořeny elektrody, na které je při zahájení separace, případně při elektrokinetickém dávkování, vloženo vysoké napětí. Detektor je umístěn v tom místě kapiláry, kde je při optické detekci vytvořené detekční okénko odleptáním polyimidu a signál z detektoru je vyhodnocován a převeden na elektroforeogram ve vyhodnocovacím zařízení. Elektroforeogramem rozumíme záznam závislosti signálu z detektoru na čase. Na obr. 4 je znázorněn elektroforeogram pro separaci směsi kationtů, aniontů a neutrálních látek. Kationty a 14

15 anionty migrují opačným směrem, pokud je elektroosmotický tok rychlejší než migrační rychlost aniontů, putují oba ionty stejným směrem a anionty lze detegovat až po pozitivně nabitých iontech a po neutrálních analytech, které putují rychlostí EOF. Obr. 3: Schéma pro kapilární elektroforézu. Převzato z [13]. Obr. 4. Elektroforeogram směsi kationtů, aniontů a nenabitých látek. Převzato z [2]. 15

16 1.1.1 Praktické využití kapilární elektroforézy Analýza chemicky a biologicky důležitých analytů v komplexních směsích (biologických tekutinách), tj. anorganických a organických iontů (např. analýza a sledování léků v moči a séru tzv. Terapeutické monitorování léků); Určení elektroforetických pohyblivostí, efektivních nábojů a jiných chemickofyzikálních vlastností analytů; Analýza hormonů, léčiv, chemikálií, kontrola čistoty životního prostředí (např. kontrola obsahu nesteroidních protizánětlivých látek - analgetik ve vodním ekosystému); Stanovení peptidových map pro analýzu struktury bílkovin, separace fragmentů po specifickém štěpení bílkoviny; Dále také CE slouží k analýze mikroorganismů, organel buňky a je též aplikována na metabolický výzkum [2, 3, 14, 15, 16] Shrnutí výhod a nevýhod kapilární elektroforézy Kapilární elektroforéza poskytuje několik výhod oproti jiným separačním technikám, které jsou stále používané častěji než CE, například vysokoúčinná kapalinová chromatografie, jenž je srovnatelnou technikou Kapilární elektroforéza je rychlejší, levnější a metodicky jednodušší; Instrumentace CE je mnohem jednodušší než instrumentace u metod chromatografických; Pro separaci v CE stačí velmi malá množství vzorku a pufru. To je výhodou zejména u drahých pufrů či obtížně dostupných vzorků; V CE jsou snadněji optimalizovány a vyvíjeny nové postupy; CE je šetrnější k životnímu prostředí, použití organických rozpouštědel je menší než u HPLC, je považována za zelenou techniku ; Pomocí CE lze separovat látky velké rozmanitosti: anorganické i organické látky, nabité i nenabité látky, látky chirální a achirální, nízkomolekulární i vysokomolekulární látky, bakterie a viry; Vyznačuje se vysokým rozlišením a vysokou separační účinností; Výhodou CE oproti ostatním elektroforetickým technikám je větší poměr povrchu kapiláry k objemu, vznikající Jouleovo teplo tak může být snadněji odváděno, například chlazením kapiláry; Také difúze, další zdroj rozmývání zón v elektroforetických technikách, je v kapilární elektroforéze minimalizován, právě díky malému průměru kapiláry; 16

17 Snadná a rychlá příprava vzorku, to je důležité zejména pro rutinní analýzy většího množství vzorků; Na druhou stranu má použití CE i několik nevýhod: Spolehlivost získaných dat, citlivost a rozsah detekce je u CE nižší než u chromatografických metod, nízkou koncentrační citlivost způsobuje dávkování velmi malých objemů vzorků a krátká optická dráha u spektrálních detektorů; Kolísavý elektroosmotický tok v separační kapiláře způsobuje nižší reprodukovatelnost migračních časů; A proto většina laboratoří stále upřednostňuje, i přes nesporné výhody CE, složitější a nákladnější metody chtomatografické [2, 6, 17, 18, 19]. 1.2 Varianty elektromigračních metod v kapiláře Izotachoforéza je metoda pro separaci iontů při které se používají dva elektrolyty a mezi elektrolyt vedoucí a koncový je dávkován vzorek. Vzorek pak tvoří rozhraní mezi těmito dvěma elektrolyty. Separovat lze pouze ionty se stejným nábojem. Oba elektrolyty obsahují ko-iont k separovaným iontům. Ve vedoucím elektrolytu je elektroforetická pohyblivost ko-iontu vyšší než u všech separovaných iontů a v koncovém nižší. Po spuštění napětí se během migrace ionty z analyzovaného vzorku řadí dle svých klesajících pohyblivostí za koiontem vedoucího elektrolytu. Došlo tak k vytvoření zón separovaných iontů mezi zónami vedoucího a koncového elektrolytu podle klesající elektroforetické pohyblivosti. Vyhodnocením této elektroforetické techniky je isotachoforeogram, který je schodovitý. Výška schodu odpovídá vodivosti zóny, délka koncentraci iontu v zóně. Isotachoforéza je využíváná též ke zkoncentrování analytů u zředěných vzorků. Používají se separační kapiláry, které mají potlačený EOF a ionty jsou separovány pouze podle jejich elektroforetických pohyblivostí. Kapilární gelová elektroforéza je technika vhodná k separaci látek o vysoké molekulové hmotnosti, zejména oligonukleotidů. K separaci dochází podle rozdílných elektroforetických pohyblivostí v kapiláře naplněné gelem (nejčastěji polyakrylamidem) s póry různé velikosti. Analyzované látky se pak dělí podle svých tvarů a velikostí, které ovlivňují to, jak rychle prochází póry v gelu, tedy jejich elektroforetickou pohyblivost. Během této separační techniky jsou děleny pouze ionty o stejném náboji, jelikož v kapiláře naplněné gelem není EOF a tak k detektoru putuji pouze kationty nebo anionty. Micelární elektrokinetická chromatografie je na rozdíl od ostatních elektroforetických technik vhodná pro separaci i neutrálních látek. Do separačního roztoku je přidán tenzid (povrchově aktivní látka). Molekuly tenzidu (nejčastěji SDS) spolu agregují v micely a tvoří micelární fázi. Analyt se pak rozděluje podle svojí chemické afinity mezi fázi micelární nebo fázi 17

18 elektrolytu. Micely mají buď hydrofóbní nebo hydrofilní dutinu, podle toho v jakém rozpouštědle se tvoří. Ve vodném roztoku vzniklé hydrofóbní dutiny do sebe pojímají látky hydrofóbní, jsou tedy rozpuštěny v micelární fázi. A naopak v hydrofóbním rozpouštědle vzniknou micely s dutinou hydrofilní a uzavírají do sebe látky hydrofilní. Neutrální analyty se pohybují díky disociovaným skupinám tenzidu a čím silnější je interakce s micelou, tím více dojde k ovlivnění jejich migračního času. Elektrochromatografie separuje látky nabité i neutrální a využívá k tomu jak elektroforetický, tak chromatografický mechanismus. Separační kapilára je naplněna stacionární fází a její konce jsou ponořeny do mobilní fáze. Na elektrody ponořené do mobilní fáze je při separaci vloženo napětí a dojde k vytvoření elektrického pole v kapiláře. Dojde ke vzniku EOF, který pohání mobilní fázi kapilárou spolu s analyty, které zároveň interagují se stacionární fází a tím jsou zpoždovány. Nenabité látky jsou separovány díky odlišné distribuci mezi mobilní a stacionární fází, jsou tedy separovány podle svých retenčních faktorů. Látky nabité jsou kromě interakce se stacionární fází ještě separovány dle různé elektroforetické mobility. Izoelektrická fokusace separuje látky dle jejich různého izoelektrického bodu, používá se hlavně k separaci proteinů. Látky jsou separovány v ph gradientu amfolytu, kterým je naplněna kapilára. Kapilára je na vstupním konci ponořena do bazického elektrolytu současně s katodou a na výstupním konci do kyselého elektrolytu do nějž je ponořena i anoda. Separované amfolyty putují v elektrickém poli dokud se v kapiláře nedostanou k hodnotě ph která je rovna jejich pi. V tom momentě jsou látky jako celek neutrální a zastaví se a fokusují. Dojde k vytvoření zón, každá zóna obsahuje pouze analyty o stejném izoelektrickém bodu, často jediný analyt. Po fokusaci se zóny uvedou do pohybu a migrují směrem k detektoru kde jsou detekovány [2, 8]. 1.3 Metody detekce používané pro kapilární zónovou elektroforézu Spektrofotometrická detekce Nejpoužívanější detekční technikou je pro kapilární elektroforézu detekce fotometrická v UV oblasti, zejména pro látky organické obsahující chromofory. Jedná se o metodu optickou při níž dochází k výměně energie mezi analytem a zářením. Výměnou energie je zde absorpce záření a absorbující látka energii záření přijímá. Podmínkou pro použití této detekční techniky je, že analyty musí absorbovat záření podstatně více než separační elektrolyt, kterým je naplněna kapilára. Fotometrický detektor je umístěný u výstupního konce separační kapiláry. Detektor měří absorbanci roztoku v separační kapiláře v optickém okénku vytvořeném na kapiláře, jímž prochází světelný paprsek o dané vlnové 18

19 délce. Optické okénko je vytvořeno odleptáním polyimidové vrstvy na kapiláře v místě kde prochází záření. Absorbance A je definována Lambert-Beerovým zákonem a je přímo úměrná molárnímu absorpčnímu koeficientu ε [lcm -1 mol -1 ] jehož hodnota závisí na vlnové délce, koncentraci látky ve vzorku c [mol/l] a délce absorbujícího záření L [cm]: A cl (1-6) K absorpci záření dochází vzhledem k malému vnitřnímu průměru separační kapiláry na velmi krátké optické dráze, to má za následek snížení citlivosti tohoto detektoru. Při průchodu analytu absorbujícího záření o dané vlnové délce tímto okénkem, dojde k záznamu této látky detektorem a zpracování na signál elektrický a na elektroforeogramu vidíme tuto látku jako kladný pík. Píky analytů jsou v elektroforeogramu v tom pořadí, ve kterém procházely kapilárou, jsou tedy seřazeny podle svých migračních časů. Citlivost této detekce je nižší, než je citlivost bezkontaktní vodivostní detekce, viz. dále, navíc absorbující aminokyseliny stanovované v této práci nemají příliš silné chromofory [4, 8, 11, 20, 21]. Fotometrický detektor je součástí standardních komerčních elektroforetických sestav [21] Nepřímá fotometrická detekce Další důležitou detekční technikou, kterou lze detekovat anorganické ionty a látky, které neobsahují chromofory je nepřímá fotometrie. Tato technika je založena na přídavku silně absorbujícího iontu majícího stejný náboj jako separovaný analyt do separačního elektrolytu. Neabsorbující analyty vytěsňují ze své zóny silně absorbující ko-iont a při průchodu zóny detektorem je snížená odezva UV fotometrického detektoru, jenž se projevuje záporným píkem [4, 11] Fluorescenční detekce Nejčastěji používanou fluorescenční detekcí je laserem indukovaná fluorescenční detekce (LIF), tato metoda je vhodná zejména pro její vysokou citlivost a selektivitu. Využívá se budícího laserového paprsku o vhodné vlnové délce procházejícího kapilárou, kterou absorbují pouze analyty. Absorbující látky jsou uvedeny do excitovaného stavu ze kterého se opět vrátí do klidového stavu a je detegována uvolněná (vyzářená) energie ve formě fotonů. Pokud analyt vyžaduje použití nákladného laseru nebo nelze sledovat jeho přirozenou fluorescenci, je to řešeno derivatizací analytu začleněním fluoroforu do jeho struktury. Kombinace kapilární zónové elektroforézy s LIF detekcí umožňuje dosažení velmi nízkých detekčních limitů a to až na úroveň jednotlivých molekul. Využití této detekční metody je však omezeno fluorescenčními vlastnostmi analytů v kombinaci se zdrojem budícího laserového paprsku [22, 23, 24]. 19

20 1.3.4 Bezkontaktní vodivostní detekce Vodivostní detekce je vhodná zejména pro detekci anorganických iontů a některých organických látek, které neabsorbují UV záření. V současné době se tato detekce stává běžnou technikou a detektory jsou komerčně dostupné, viz např. [25, 26, 27], i když ještě nebývají standardně dodávány s elektroforetickými aparaturami. Vodivostní detekce je založena na měření elektrické vodivosti roztoku, která je odlišná v zóně analytu a mimo jeho zónu v separačním pufru. Elektrická vodivost roztoku je měřena mezi elektrodami, které jsou umístěny na vnějším povrchu separační kapiláry, tj. nejsou v kontaktu přímo s roztokem. Křemenná kapilára je zde izolantem, který odděluje roztok od elektrod. Jedná se o bezkontaktní vodivostní detekci, jejíž použití vytlačilo starší vodivostní detekci, kdy byly elektrody přímo v kontaktu se separovaným roztokem. Bezkontaktní vodivostní detekce je označována zkratkou C 4 D podle Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection. Střídavý signál z generátoru je vkládán na jednu z vodivostních elektrod (vysílací elektroda) a je po průchodu přes stěnu kapiláry (izolant) ovlivněn vodivostí zóny v detekční mezeře mezi elektrodami. Signál prochází přes kapiláru (izolant) díky vysoké frekvenci, řádově stovky khz. Signál prošlý roztokem, střídavý proud, je poté snímán elektrodou přijímací. Velikost měřeného proudu závisí na impedanci cely Z. Impedance je definována vztahem: Z R ix (1-7) kde R je elektrický odpor, který závisí na geometrii cely a vodivosti roztoku a X je kapacitance. Pokud je uspořádání cely neměnné, je měřený proud ovlivněn především vodivostí roztoku v kapiláře. Výhodou bezkontaktní vodivostní detekce proti starší kontaktní detekci je, že elektroda není v kontaktu s analyzovaným roztokem a nedochází tak k adsorpci látek na elektrody a poškození či změně vlastností elektrody. Další podstatnou výhodou je, že nedochází k interferenci separačního pole a signálu vodivostního detektoru [4, 21, 28, 29, 30, 31] Duální detekce Jelikož zejména biologické a medicínské obory požadují stanovení látek ve stále složitějších vzorcích, jedna detekční technika už nepostačuje. Při analýze komplexních vzorků, například směsi anorganických a organických iontů, je používána detekce duální, například kombinace vodivostní a spektrofotometrické detekce, která byla použita i v této práci. Pro analýzu anorganických iontů je vhodná detekce založená na měření elektrické vodivosti a pro analýzu organických iontů je nejvhodnější detekce spektrofotometrická v UV oblasti, proto je nejvhodnější kombinace těchto dvou detektorů pro analýzu komplexní směsi. Tato kombinace umožňuje stanovení anorganických i organických látek zároveň při jediné separaci. Není nutné tedy separaci provádět zvlášť pro získání vodivostního a optického záznamu. 20

21 Nejčastěji používané duální detektory v CE jsou [32]: Bezkontaktní vodivostní detektor + UV detekce, C 4 D/UV Kontaktní vodivostní detektor + UV detekce, COND/UV Bezkontaktní vodivostní detektor + fluorescenční detekce, C 4 D/LIF Ampérometrický detektor + elektrochemiluminiscenční detekce, AMP/ECL. 1.4 Způsoby dávkování v CZE Dávkování je velice důležitou částí kapilární elektroforézy, protože se může stát zdrojem chyb, zejména u dávkování neautomatizovaného. Vzhledem k malému průměru kapiláry a jejímu malému objemu 1-10 µl, je nutné dávkovat i velice malé objemy vzorku. Objem nadávkovaného vzorku by neměl být větší než asi 2 % objemu kapiláry, aby nedošlo ke ztrátě vysoké separační účinnosti jenž CZE poskytuje. Vzorky jsou dávkovány v řádech nl pro zachování vysoké separační účinnosti. Proto musí být použité detektory citlivé, aby byly schopny detekovat tak malá množství vzorku [2, 7] Standardní dávkování hydrodynamické V komerčních elektroforetických aparaturách je vzorek hydrodynamicky dávkován přesně řízeným tlakem působícím na hladinu roztoku v dávkovací nádobce po definovanou dobu. V laboratorních elektroforetických sestavách je standardně vzorek do kapiláry dávkován ručně a to tak, že na dávkovacím konci kapiláry je vyměněna vialka se separačním elektrolytem za vialku se vzorkem. Dávkovací konec kapiláry se spolu s vialkou se vzorkem zvedne do určité výšky na určitou dobu. Toto uspořádání můžeme vidět na obr. 5. Dávkovací konec kapiláry je tak oproti výstupnímu konci kapiláry výše a vzorek je nadávkován tlakovým rozdílem P [Pa], P = hρg (1-8) kde h [m] je rozdíl výšek hladin v dávkovací koncové nádobce, ρ [kg m -3 ] je hustota vzorku a g [m s -2 ] je gravitační zrychlení. Po uplynutí nastavené dávkovací doby a nadávkování vzorku je dávkovací konec vrácen zpět do původní polohy, v níž jsou hladiny roztoků ve stejné výšce. Vialka se vzorkem je nahrazena vialkou se separačním elektrolytem. Tento způsob dávkování je tedy více ovlivněn subjektivním postupem pracovníka a může dojít k chybě v dávkovacím postupu [7]. 21

22 Obr. 5. Schéma standardního hydrodynamického dávkování do laboratorní elektroforetické aparatury. Nádobka se vzorkem je zvednuta nad úroveň nádobky koncové s elektrolytem. Převzato z [7] Elektrokinetické dávkování Tento způsob dávkování je také velice často využíván. Na elektrody ponořené do roztoků ve vialkách je přivedeno vysoké napětí. To jak velké látkové množství vzorku bude nadávkováno závisí nejen na vloženém napětí, ale i na elektroforetické pohyblivosti iontů ve vzorku. Z toho vyplývá nevýhoda tohoto způsobu dávkování, látky ve vzorku mají různé elektroforetické pohyblivosti a jejich nadávkované množství se bude podle jejich elektroforetické pohyblivosti lišit. Mobilnější ionty budou nadávkovány více než látky neutrální či méně mobilní. Nadávkované množství látky tedy neodpovídá jeho množství ve vzorku. Tento způsob dávkování je používán zejména pro kapilární gelovou elektroforézu. Uspořádání elektrokinetického dávkování můžeme vidět na obr. 6 [2, 4, 7]. Obr. 6. Schéma elektrokinetického dávkování. Na elektrody je vloženo napětí ze zdroje vysokého napětí. Převzato z [7]. 22

23 1.4.3 Nový způsob dávkování V této práci je testován jiný způsob dávkování v laboratorních elektroforetických aparaturách, který je méně zatížen chybou experimentátora. Jedná se o softwarově řízené dávkování, kdy je dobu dávkování možné přesně nastavit v počítačovém programu. Vzorek je nadávkován zvýšeným tlakem na hladinu roztoku vzorku ve vialce. Dávkovací konec kapiláry zůstává při tomto postupu stále ve stejné poloze. Subjektivní postup experimentátora tedy při tomto způsobu dávkování není tak zásadní, spočívá pouze ve výměně vialek se vzorkem a elektrolytem a toto dávkování je tedy oproti dávkování ručnímu méně náchylné k chybám. Obr. 7. Principiální znázornění nového způsobu hydrodynamického dávkování. Vzorek je dávkován zvýšeným tlakem působícím na hladinu roztoku ve vialce. Převzato z [7]. 1.5 Využití kapilární elektroforézy moči Kapilární elektroforéza je díky velké separační účinnosti často využívána k separaci látek ze složitých biologických vzorků jako je například moč. Moč je ideálním vzorkem pro lékařská vyšetření sloužící k objevení markerů nemocí i pro klinické výzkumy. Její získání je rychlé a neinvazivní. Moč separovaná pomocí CE na rozdíl od jiných separačních technik, nemusí být před použitím nijak upravována, stačí ji pouze přefiltrovat a v případě potřeby naředit. Analýza je tudíž mnohem rychlejší než u kapalinové chromatografie, kde je třeba provést úpravu vzorku moči před jeho separací. Normální moč obsahuje anorganické ionty, chlorid sodný, močovinu, aminokyseliny a jiné látky. Koncentrace iontů je ovlivněna mnoha faktory, například potravou, pitným režimem, ale i nemocemi. Sledováním koncentrací iontů v moči může být užitečné pro diagnózu různých nemocí například hypokalemie či hyponatremie. Důležitým ukazatelem zdravotního stavu je poměr sodných a draselných iontů, který by měl být u zdravého jedince 2:1, pokud je tento poměr zvýšený či obrácený jedná se o poruchu aktivity mineralokortikoidů. Pomocí kapilární elektroforézy moči mohou být poměry a koncentrace iontů v moči poměrně jednoduše, rychle a levně sledovány [33, 34, 35]. 23

24 CE umožňuje stanovení aminokyselin z moči. Všech 20 proteinogenních aminokyselin je možné separovat při jediné analýze biologických vzorků. Možnost automatizace této metody spolu s rychlostí a účinností separace je důvodem, proč je tato separační metoda v současné době hojně využívána v klinických výzkumech často právě pro stanovení aminokyselin. Výhodou CE před chromatografickými technikami při separaci AMK je, že většina je hydrofilní povahy a proto je obtížné je extrahovat v organických rozpouštědlech před separací plynovou chromatografií a u reverzní kapalinové chromatografie vykazují nízkou retenci [4]. Aminokyseliny a jejich sloučeniny jsou důležitými metabolity živých systémů a hrají významnou roli v energetickém metabolismu, přenosu nervového vzruchu a transportu lipidů a proto je jejich kvantitativní analýza z biologických vzorků pro diagnostiku chorob v biochemických a klinických laboratořích významná. Stanovení AMK v moči a také plasmě je významné zvláště pro diagnostiku dědičných metabolických chorob. Vzorek moči je také vyžadován pro analýzu aminokyselin při onemocnění diabetem typu I, toto onemocnění má dopad na metabolismus AMK a to kvůli změněné činnosti inzulínu [36]. Z aminokyselin, které mohou být v moči detekovány a jenž byly detekovány i v této práci je důležitý například histidin, jehož nedostatek může způsobit epilepsii, Parkinsonovu chorobu a poruchy normálního erytropoetického vývoje. Je hlavní AMK v moči. Pro sledování výživy a metabolismu svalových proteinů jsou v moči detekovány methylované deriváty histidinu 1-methyl a 3-methylhistidin [37, 38]. Sledováním hladiny 3-methylhistidinu v moči může být kontrolován metabolismus kontraktilních proteinů aktinu a myosinu, přesněji jejich degradace. Aktin a myosin patří mezi bílkoviny kosterního svalstva. Aminokyselina 3-methylhistidin vzniká methylací imidazolové skupiny histidinu. Vyskytuje se během posttranslační modifikace aktinu a myosinu, ke které dochází po jejich biosyntéze. 3-methylhistidin se dále neučastní proteosyntézy a je vylučován do moči. Zdrojem 3-methylhistidinu není pouze proteolytický děj, významné množství může být i exogenního původu, to znamená přijímáno potravou a to zejména s masem. V moči je tedy možné nalézt endogenní i exogenní 3-methylhistidin. Endogenní pocházející z katabolismu svalů v lidském těle a exogenní z potravy. Po příjmu masa jsou proteiny ve střevě metabolizovány za vzniku 3- methylhistidinu, který je v této formě vylučován do moči. Jedná se o marker pro sledování příjmu tepelně zpracovaného masa a ryb. Hladina 3-methylhistidinu v moči se výrazně zvyšuje u pacientů po operacích, u pacientů s mnohočetnými poraněními, při septických stavech a stresu a to proto, že se zvyšuje proteolýza aktinu a myosinu, jeho hladina je také vyšší u vrcholových sportovců. Hladina v moči je tedy u každého jedince jiná, záleží na věku, sportovní aktivitě, zdraví a příjmu masa. Dalším methylovaným derivátem histidinu separovaným v této práci je 1- methylhistidin, ten není tvořen u lidí, ale pouze u zvířat. Pomocí něj je možné odlišit od sebe exogenní a endogenní 3-methylhistidin. Jeho hladina v moči koreluje s hladinou exogenního 3-methylhistidinu v moči a jejich současné stanovení je využíváno k sledování proteolýzy proteinů kosterního svalstva. Stejně jako 3-methylhistidin může být využíván 24

25 jako marker pro sledování příjmu masa (červeného, bílého masa a některých druhů ryb), protože dipeptid anserin beta-alanyl-1-methylhistidin, který obsahuje tuto aminokyselinu, je přítomen pouze ve svalech. Až 90 % přijatého anserinu z masa je degradováno na 1- methylhistidin a vylučováno do moči [33, 39, 40]. Pro kvantitativní analýzu aminokyselin v biologických vzorcích, je vzhledem k jejich koncentraci v řádu mikromolů, vyžadována vysoce citlivá technika. Proto se stále dává přednost složitějším a nákladnějším, ale citlivějším chromatografickým technikám, a to konkrétně pro analýzu AMK kationtově výměnné chromatografii následované UV detekcí po derivatizaci ninhydrinem. Ačkoliv při zvolení vhodné detekční techniky lze považovat i CE za vysoce citlivou metodu a to zejména ve spojení s LIF detekcí [6, 36]. 25

26 1.6 Cíl práce Cílem této diplomové práce v její první části bylo najít vhodný způsob dávkování vzorku pro laboratorní elektroforetické aparatury, který je méně zatížen chybou experimentátora. Jedná se o softwarově řízené dávkování, kdy je dobu dávkování možné přesně nastavit v počítačovém programu. Vzorek je nadávkován zvýšeným tlakem na hladinu roztoku vzorku ve vialce. Dávkovací konec kapiláry zůstává při tomto postupu stále ve stejné poloze. Subjektivní postup experimentátora tedy při tomto způsobu dávkování není tak zásadní, spočívá pouze ve výměně vialek se vzorkem a elektrolytem a toto dávkování je tedy oproti dávkování ručnímu méně náchylné k chybám. Jde o zjednodušený postup hydrodynamického dávkování používaný v komerčních elektroforetických sestavách. U navrženého způsobu dávkování experimentálně zjistit optimální dávkovací tlak a čas k dosažení co největší separační účinnosti a dostatečné citlivosti detekce. V druhé části diplomové práce bylo úkolem využít navrženého dávkování pro praktickou analýzu, separovat a analyzovat aminokyseliny a anorganické ionty v biologickém vzorku s duální UV/C 4 D detekcí. Jako biologický vzorek bude použita moč a sledován bude histidin a jeho deriváty. 26

27 2 Experimentální část Měření byla prováděna na laboratorně zhotovené elektroforetické aparatuře. Byla složena ze vstupní dávkovací části detaily viz. následující kapitola, křemenné kapiláry o vnitřním průměru 75 m (CACO, Slovensko) celkové délky 59 cm a efektivní délky, tj. délky k detektoru, 47 cm. Použitý duální detektor, UV/C 4 D, byl detailně popsán v pracích [41, 42]. Separační napětí bylo odebíráno z vysokonapěťového zdroje Spellman CZE 2000 (Spellman, USA); při všech měřeních bylo pracováno s napětím 25 kv. Signál z obou částí detektoru byl snímán převodníkem ORCA 2800 (Ecom s.r.o., ČR) a registrován počítačovým programem Ecomac, verze 0,238, od téže firmy. Ovládání všech částí aparatury bylo řízeno programem vytvořeným v prostředí LabView přes universální desku PCI 6024E (National Instruments, USA). 2.1 Popis dávkovacího zařízení Aparaturu dávkovacího zařízení můžeme vidět na obr. 8 a 9. Dávkovací konec separační křemenné kapiláry (2) je upevněn v bločku z plexiskla (1). Dále je v tomto plexisklovém bločku upevněna i vialka se separačním elektrolytem případně analyzovaným vzorkem (3), elektroforetická elektroda (4) a spojka (5). Upevnění těchto součástí v plexisklovém bločku je plynotěsné, toho bylo docíleno šroubením a těsněním silikonovým kaučukem. Zdroj tlaku je tvořen dvěma membránovými pumpami (6) a (7) a třícestnými ventily (8) a (9), které jsou ovládané elektromagneticky. Hadička ze zdroje tlaku je připojena do spojky (5) v bločku (1). Tlak je nastavován a udržován pomocí mechanických manostatů na výstupech z pump. Pomocí elektronického tlakoměru (10) byl kontrolován dávkovací tlak, který generovala pumpa (7). Dávkovací aparatura funguje následujícím způsobem. V činnosti jsou membránové pumpy a manostaty na jejich výstupech udržují konstantní tlak. Existují tři stavy ve kterých se může dávkovací aparatura nacházet. 1) Třícestné ventilky jsou v klidovém stavu. Vialka se separačním elektrolytem či analyzovaným roztokem je spojena s atmosférou, obr. 8 A. 2) Třícestné ventilky se nachází v poloze pro dávkování vzorku. Ventilek (9) je na určenou dobu potřebnou k nadávkování vzorku přepnut a v tom případě působí na hladinu analyzovaného roztoku ve vialce tlak generovaný pomocí pumpy (7). Ventilek (9) se po dokončení dávkování vrací do klidové polohy a tlak v nádobce klesne na původní hodnotu, tedy na hodnotu atmosférického tlaku, obr. 8 B. 3) Třícestné ventilky se nachází v poloze pro promývání. Po separaci vzorku je kapilára promyta separačním elektrolytem tak, že ventilek (8) je na určitou promývací dobu přepnut a tak na hladinu elektrolytu ve vialce působí tlak tvořený pumpou (6). Ventilek (8) se po uplynutí nastavené promývací doby 27

28 vrací do klidové polohy. To způsobí pokles tlaku ve vialce s elektrolytem na tlak atmosferický, obr. 8 C. Na obr. 10 je celkový pohled na používanou elektroforetickou sestavu. Při práci s touto aparaturou bylo z bezpečnostních důvodů možno připojit na elektrody vysoké napětí až tehdy, když byla uzavřena ochranná plexisklová dvířka zamezující kontaktu experimentátora s vysokonapěťovou částí aparatury. Aby mohly být oba typy dávkování, tj. standardní pro laboratorní aparatury a testované, porovnány, byla aparatura navržena tak, aby umožnila i dávkování zvednutím dávkovacího konce kapiláry. Obr. 8. Schéma dávkovací a promývací části laboratorní elektroforetické aparatury. (1) plexisklový bloček, (2) dávkovací konec kapiláry, (3) nádobka s roztokem vzorku či elektrolytu (vialka 4 ml, P-lab, ČR), (4) elektroforetická Pt elektroda, (5) vstup pro připojení ke zdoji tlaku (Luer spojka AP16FLT1032N, Ark-Plas, Filipíny), (6) a (7) membránové pumpy (N86KN.18, Laborport, USA), (8) a (9) elektromagneticky ovládané třícestné ventilky (typ , Asco Scientific, USA), (10) elektronické měřidlo tlaku (GDH 13 AN, Greisinger, Německo). (A), (B) a (C) představují pracovní pozice třícestných ventilků (NO a NC označuje otevřenou a zavřenou cestu při klidovém stavu ventilku). Převzato z [43]. 28

29 Obr. 9. Detailní pohled na dávkovací část aparatury. 1 plexisklový bloček, 2 separační kapilára, 3 dávkovací nádobka (se vzorkem nebo se separačním elektrolytem), 4 přepínací elektromagnetické ventilky, 5 řízení dávkovacího tlaku, 6 membránové pumpy, 7 hadička přivádející tlakový vzduch nad hladinu roztoku v dávkovací nádobce. Obr. 10. Celková laboratorní elektroforetická sestava. 1 dávkovací část, detaily viz obr. 9 a text, 2 separační kapilára, 3 kombinovaný detektor, 4 koncová nádobka, 5 vysokonapěťový zdroj, 6 dvoukanálový převodník ORCA, 7 měřidlo dávkovacího tlaku, 8 interface mezi částmi aparatury a počítačem, 9 ochranná plexisklová dvířka. 29

30 2.2 Použité chemikálie a roztoky Deionizovaná voda (Milli-Q Plus, Millipore, USA) Zásobní roztoky: 0,1 M roztoky KCl, NaCl, BaCl 2, CaCl 2, MgCl 2, LiCl 2 a 0,01 M tyramin (Merck), Separační pufr 20 mmol H 3 BO mmol LiOH ph 9,2 Separační pufr 20 mmol MES/HIS ph 6,2 Separační pufr 20 mmol MES + 5 mmol LiOH ph 5,9 0,1 M NaOH Ranní moč 1-methylhistidin, L-histidin, 3-methylhistidin (Sigma-Aldrich) 1 % hydroxyethylcelulóza 2.3 Pracovní postup Měření byla prováděna za následujících experimentálních podmínek: Křemenná kapilára (Polymicro Technologies, USA) Celková délka kapiláry: 59 cm Délka kapiláry k detektoru: 47 cm, Vnitřní průměr kapiláry: 75 µm Separační napětí: 25 kv Separační proud: 13 µa pro separační pufr H 3 BO 3 + LiOH Separační proud: 6,5 µa pro separační pufr MES/HIS Separační proud: 4 µa pro separační pufr MES/LiOH i pro pufr s přídavkem HEC Testovaný roztok: 0,5 a 0,05 mm směs K +,Na + a tyraminu Dávkovací tlak: 1x10 5 Pa (1000 mbar) 0,4 s a 1x10 3 Pa 40 s Dávkovací tlak: 5x10 3 Pa (50 mbar) 4 s a 1x10 3 Pa 20 s Promývací tlak: 1x10 5 Pa (1000 mbar) po dobu 40 s Parametry C 4 D: sinusový signál, 330 khz, 7 V UV detektor - vlnová délka: 214 nm Byly připraveny testovací roztoky 0,5 a 0,05 mm K +, Na + a tyraminu ze zásobních roztoků 0,1 M KCl, 0,1 M NaCl a 0,01 M tyraminu. Pro separaci tohoto vzorku byl používán pufr H 3 BO 3 + LiOH o ph 9,2. Křemenná kapilára byla před začátkem měření a poté vždy před výměnou pufru promyta a aktivována 0,1 M NaOH, jenž byl v kapiláře asi 10 minut ponechán a poté vymyt deionizovanou vodou a následně pufrem. Kapilára zůstala 30

31 naplněna pufrem při spuštěném vysokém napětí asi 10 minut, pro ustálení odezvy detektoru. Poté mohl být do kapiláry nadávkován roztok vzorku. Před dávkováním byla vždy vyměněna vialka se separačním pufrem za vialku se vzorkem. Při standardním dávkování byl nadávkován vzorek zvednutím dávkovacího konce kapiláry do definované výšky oproti konci výstupnímu na stanovenou dobu. A při dávkování testovaném byl vzorek nadávkován zmáčknutím tlačítka Inject v programu LabView, které spustilo přepnutí třícestného ventilku (9) na obr. 8 do dávkovací polohy na stanovenou dobu. Po nadávkování byla vyměněna vialka se vzorkem za vialku se separačním elektrolytem a bylo spuštěno vysoké napětí a nastartována separace. Po separaci vzorku byla kapilára vždy promyta separačním pufrem po dobu 40 s a poté mohl být vzorek opět nadávkován a separován. Píky kationtů byly zaznamenány bezkontaktní vodivostní detekcí. Ve vyhodnocovacím programu CSW 1.7 (DataApex) byly odečteny výšky, plochy píků, migrační časy a šířky píků v poloviční výšce jednotlivých kationtů. Mediány ploch píků byly vyneseny do grafu v závislosti na dávkovacích časech spolu s intervaly spolehlivosti, jenž byly počítány ze vztahu: L ~ 1,2 x RK n (2-1) kde x ~ je medián dané veličiny a R rozpětí, tj. rozdíl mezi největší a nejmenší hodnotou a K n je konstanta odečtená z tabulky pro daný počet měření. K 3 pro tři měření je 1,3 a K 5 pro pět měření je 0,51. Ze získaných dat byly vypočítány separační účinnosti N pro jednotlivé dávkovací doby, a to ze vztahu: t N 5,54 w migr 1/ 2 2 (2-2) kde t migr je migrační čas příslušného iontu a w 1/2 je šířka píku v polovině jeho výšky pro příslušný iont. Byly také vypočítány odhady nadávkovaného objemu roztoku vzorku do separační kapiláry, zóny vzorku v kapiláře. Pro tento výpočet byla použita Hagen-Poiseuilleova rovnice. Nadávkovaný objem vzorku V [m 3 ] byl vypočítán ze vztahu: V 4 Pd t (2-3) 128 L c kde P je tlak na vstupu kapiláry [Pa], d je vnitřní průměr kapiláry [m], t je doba dávkování [s], L c je celková délka kapiláry [m] a η je viskozita roztoku 0,001 [Pa.s] [44]. Délka zóny vzorku l [mm] byla vypočítána ze vztahu: V1000 l (2-4) 2 r kde V je nadávkovaný objem vzorku [m 3 ] a r vnitřní poloměr kapiláry [m]. 31