Chirální separace v CE

Transkript

1 Chirální separace v CE Chiralitu vykazují jak organické sloučeniny tak anorganické sloučeniny. Projevuje se existencí dvou konstitučně identických molekul (enantiomerů), které se liší pouze ve vzájemném uspořádání atomů a vazeb v prostoru. Enantiomery mají v achirálním prostředí shodné fyzikálně-chemické vlastnosti. Vykazují odlišné biologické, toxikologické a farmakologické vlastnosti. Potřeba účinných analytických technik, které umožní separaci jednotlivých enantiomerů a jejich stanovení. Klepnutím lze upravit styl předlohy podnadpisů. S-enantiomer: teratogenní účinky R-enantiomer: sedativum R-enantiomer je sedativum S-enantiomer S-enantiomer má teratogenní účinnky

2 Enantioselektivní rozpoznávání patří mezi základní vlastnosti přírody, protože enantiomery vykazují shodné vlastnosti pouze v izotropním prostředí, zatím v chirálním (což je obecné prostředí organismů) vykazují chování odlišné. Pro úspěšnou separaci enantiomerů je nutné v separačním prostředí vytvořit chirální (stereoselektivní) prostředí. Dalglish model 3-bodové interakce Pro enantioselektivní rozpoznání je nutné, aby analyt současně interagoval třemi různými interakceni s chirálním selektorem (CS) a alespoň jedna interakce s CS musí být stereoselektivní. Má-li dojít k separaci enantiomerů, pak každý z nich musí interagovat různě silně. Síly, které se podílejí na stereoselektivní interakci mohou být jak přitažlivé, tak odpudivé

3 Typy interakcí podílejících se na molekulárním rozpoznávání Pro uskutečnění chirálních separací se v praxi používají separační metody GC, LC, SFC, CE a v poslední době se objevují práce využívající k stereoselektivní diskriminaci MS

4 Způsoby realizace enantioselektivní prostředí v moderních separačních technikách

5 Chirální separace uskutečňované kapilární elektroforézou Nepřímá chirální separace k tvorbě diastereomerů mezi CS a separovanými enantiomery probíhá před separací (nejčastěji jako derivatizace chirálním derivatizačním činidlem). Separace probíhá v achirálním prostředí. Přímá chirální separace k tvorbě diastereomerů dochází během separace interakcí separovaných enantiomerů s chirálním selektrorem, který je součástí pracovního elektrolytu. Separace probíhá v chirálním prostředí. Nepřímé separace vyžadují nutnost derivatizace činidlem, které musí být čistým enantiomerem, derivatizační krok je nutné validovat a analyty musí mít vhodné funkční skupiny pro derivatizaci. Např. Marfyho činidlo (1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-L-alaninamid), GITC (2,3,4,6-tetra-Oacetyl- -D-glukopyranozylizothiokyanát). Přímé separace vyžadují přítomnost CS v pracovním elektrolytu, případně může být součástí gelové matrice, nebo být navázán na stěnu kapiláry. Pro úspěšnou přímou chirální separaci je nutné najít vhodný CS a optimalizovat podmínky, tak aby rozlišení bylo vhodné pro kvantifikaci každého enantiomeru zvlášť. V přímých chirálních separacích jsou enantiomery separovány na základě různých konstant stability vzniklých přechodných stabilních diastereomerních komplexů s chirálním selektorem

6 Nutné podmínky pro přímé chirální separace Selektor musí být čistým enantiomerem a musí být k dispozici v dostatečné čistotě. Se selektorem musí interagovat oba enantiomery Rychlost tvorby diastereomerních komplexů mezi enantiomery a chirálním selektorem musí být dostatečně velká Diastereomerní komplexy se musí lišit v konstantách stability. Chirální selektory využívané pro přímé CE separace: 1. Cyklodextriny a jejich deriváty, 2. Antibiotika (makrocyklické, glykopeptidy, makrolidy...) 3. Crown ethery 4. Proteiny 5. Polysacharidy 6. Komplexy přechodných kovů s chirálními ligandy (aminokyselina, peptidy apod.) 7. Chirální tenzidy (žlučové kyseliny, deriváty aminokyselin apod.)

7 Chirální selektory používané v CE (přímé separace) 1. Nativní cyklodextriny Cyklodextriny (CD) jsou produkty enzymatické degradace škrobu glukosyltransferázami bakterií Bacilus macerans. Jsou to cyklické oligosacharidy složené ze 6 a více D-glukopyranosových jednotek spojených α-1,4 vazbami. Nejčastěji užívané CD mají 6 (α), 7 (β) a 8 (γ) glukosových jednotek v kruhu

8 Vnitřní kavita má hydrofóbní charakter a vnější obal má polární hydrofilní charakter. Mechanismy interakcí CD s enantiomery - Inkluzní komplexace - Interakce na povrchu

9 Příklady separací chirálních sloučenin s cyklodextriny R,S-Tamsulosin Sulfatovaný-b-CD jako chirální selektor

10 Chirální selekotor S-beta-cyklodextrin

11 Chirální separace s využítím makrocyklických antibiotik v CE Makrocyklické antibiotika - chirální selektory nesoucí několik stereoselektivních center Vankomycin Teikoplanin Ristocetin, Rifamicyn, (Avoparcin, Balhymicin) Teicoplanin Vankomycin Rifamycin

12 Ristocetin Nejpoužívanějším makrocyklickým antibiotikem pro chirální separace v CE je vankomycin.

13 Fyzikálně chemické vlastnosti vankomycinu Charakteristika Vankomycin Molekulová hmotnost 1449 Počet stereogenních center 18 Počet mikrocyklů 3 Počet hydroxylových skupin 9 (z toho 3 fenolické) Počet aminoskupin 2 Počet karboxylových skupin 1 Počet amido skupin 7 Počet aromatických jader 5 pi 7,2 Relativní stabilita až 2 týdny pk a 2,9;7,2;8,6;9,6;10,5;11,7 Vankomycin se používá nejčastěji pro chirální separace karboxylových kyselin. Vankomycin vykazuje i několik nevýhod pro CE: Poměrně silná absorpce UV záření v oblasti 190 až 260 nm Sorpce na křemennou kapiláru Omezená stabilita v extrémních hodnotách ph

14 Uvedené nevýhody je možné odstranit: Separací v kapilárách s kovalentním pokrytím omezení sorpce -> zvýšení účinnosti separace Využití techniky částečného plnění kapiláry vankomycinem -> možnost UV detekce separovaných analytů v oblasti nm. Základní princip techniky částečného plnění Pracovat v pokryté kapiláře, kde je potlačení EOF. V kyselém prostředí je vankomycin kladně nabitý (ph 4 7), karboxylové kyseliny jsou v tomto ph záporně nabité. Do kapiláry se dávkuje pufr s vankomycinem po detekční okénko (nutno experimentálně změřit čas a tlak potřebný k nadávkování pufru s vankomycinem po detekční okénko). Po vložení negativní polarity, vankomycin migruje směre od detekčního okénka k inletu a karboxylová kyselina migruje v opačném směru. V průběhu migrace enantiomerů přes zónu vankomycinu dochází ke stereoselektivní interakci

15 Technika částečného plnění je použitelná pro jakékoli absorbující nebo pro detekci nevhodné adititivum v pracovním elektrolytu.

16 Porovnání s cyklodextriny

17 Využití crown-etherů pro chirální separace ( )-(18-Crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid Crownethertetrakarboxylová kyselina (CETK) je použitálná pouze pro separace chirální primárních aminů (aminokyseliny, dipeptidy, léčiv). Používá se buď samostatně nebo v kombinaci s nenabitými cyklodextriny. CETK je možné využít ve vodném i nevodném prostředí. Mechanismus separace spočívá v interakcí vodíků primární aminoskupiny s kyslíky polyetherovým kruhu pomocí vodíkových vazeb.

18 S polyetherovým kruhem komplexují také i některé kationty např. K + a NH 4 + Separační účinnost je možné zvýšit přídavkem cca 100 mm tetra-nbutylammonium perchlorátu jako podpůrného elektrolytu. Přídavke triethylaminu je možné v některých případech výrazně zvýšit rozlišení. Chirální separace s využitím mechanismu ligandové výměny Mechanismus ligandové výměny využívá tvorby ternární diastereomerních komplexů mezi komplexem kov (II, III) + chirální ligand (L-prolin, L-tartrát, L- aspartam) a separovanými enantiomery. Je nutné aby separovaném enantiomery ve své struktuře měli funknčí skupiny vhodné ke tvorbě ternárních diastereomerních komplexů.

19

20 Chirální tenzidy v CE Žlučové kyseliny je možné použít jako chirální selektory, které se chovají jako tenzidy. Mají schopnost tvořit micely. Díky chirálním centrům mohou interagovat jak s nabitými, tak nenabitými chirálními látkami. Kyselina cholová několik opticky aktivních center

21 Omezení použití žlučových kyselin pro chirální separace v CE žlučové kyseliny se rozpuštějí ve vodných pracovních elektrolytech pouze v alkalickém ph. Nejčastěji používáná oblast ph je 8 až 11. Přispívají v generaci Joulova tepla při průchodu proudu kapilárou Žlučové kyseliny se hodí k separaci pouze omezeného typu látek, které by měli mít planární strukturu.

22 Syntetické chirální tenzidy Pindolol

23 Využití proteinů pro chirální separace v CE Hovězí sérový albumin (BSA) Produkován v játrech, nejvíc zastoupený protein v séru savců. Monomerní a poměrně dobře rozpustný ve vodných elektrolytech. Obsahuje velké množství stereoselektivních center. Nevýhody: sorpce na stěnu kapiláry, absorpce UV záření hrozí možnost denaturace při vyšších teplotách, nebo při použití extrémních ph

24 Separace derivatů D,Ltryptofanu s pomocí BSA ph 7,4

25 Využití vaječného proteinu pro chirální separace