UNIVERZITA KARLOVA V P RAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V P RAZE 2. LÉKA SKÁ FAKULTA Katedra experimentální chirurgie Lubomír Hyr l Exprese CA IX anti genu u urogenitálních nádor, zejména se zam ením na karcinom ledviny a uroteliální tumory dolních mo ových cest. Praha 2012

2 Obsah OBSAH... 1 ÚVOD LITERÁRNÍ ÚVOD A P EHLED DANÉ PROBLEMATIKY Karcinom ledviny Uroteliální nádory mo ových cest CÍLE PRÁCE SOUBOR A METODY Soubor Metody Bun né experimentální a nádorové bun né kultury Imunologické reagencie a metody ELISA Western blot Histologické vy et ení Immunohistochemie (IHC) Statistické hodnocení VÝSLEDKY RCC soubor Soubor uroteliálního karcinomu mo ových cest DISKUZE ZÁV R SOUHRN POD KOVÁNÍ POU ITÁ LITERATURA SEZNAM P ÍLOH P ÍLOHY VLASTNÍ PUBLIKACE K TÉMATU

3 Úvod Maligní nádorová onemocn ní jsou v dne ní dob nejen záva ným zdravotnickým, ale i celospole enským problémem. Jejich výskyt v posledních letech neustále vzr stá. Po kardiovaskulárních chorobách jsou druhou nej ast j í p í inou úmrtí. Z t chto d vod se stále více pozornosti v nuje jejich asné diagnostice. Hledají se látky v organismu, které by umo ovaly rozpoznat nádorové onemocn ní p ed jeho klinickou manifestací, stanovit jeho rozsah, prognózu a také mo nou asnou recidivu. Urologické nádory, krom karcinomu prostaty a nádor varlat, nemají vhodné markery, které by umo ovaly bu jejich primární diagnostiku nebo by byly vhodné pro sledování nemocných po radikální lé b a zji t ní asné a tudí chirurgicky e itelné recidivy onemocn ní. Proto jsem se rozhodl na základ 1) ady literárních údaj o p ítomnosti karbonické anhydrázy IX (CA IX) na membránách bun k n kterých urologických nádor, 2) mého zájmu o onkologickou problematiku a 3) nabídnuté spolupráce koleg z Institutu organické chemie a biochemie AV R v novat této problematice a stanovit, zda se CA IX uvol uje do t lních tekutin a je v nich stanovitelná. P i kladném výsledku posoudit mo nost vyu ití jejího stanovení jako markeru p íslu ného nádoru. 1. Literární úvod a p ehled dané problematiky. Jednou z typických vlastností maligních nádorových bun k je produkce r zných biochemických látek. Nejvýsti n j í a nej ast ji pou ívaný název pro tyto látky je nádorový marker. Mén asto jsou v literatu e ozna ovány jako "s tumorem asociovaná substance", "nádorový antigen" a jiné. Do této skupiny adíme látky produkované maligními bu kami, které 1) se uvol ují do t lesných tekutin, kde je mo no kvantitativn m it jejich koncentrace, 2) jsou produkované maligními bu kami, které v ak do t lesných tekutin nep echázejí a jejich p ítomnost lze stanovit imunohistochemickými metodami pouze v nádorové tkáni a 3) vznikají ve zdravých tkáních jako jejich odpov na p ítomnost nádoru v organismu (1). Jednotlivé nádorové markery se od sebe li í jak svojí chemickou strukturou tak i biologickou funkcí. Podle chemického slo ení jich p evá ná ást pat í mezi glykoproteiny, glykolipidy a polypeptidy. Podle biologické funkce v t ina z nich pat í mezi onkofetální látky, které se uplat ují p i vývoji plodu. Nej ast ji zde p sobí jako diferencia ní antigeny, p ítomné 3

4 ve form glykoproteinových a glykolipidových molekul na povrchu membrán diferencujících se embryonálních a fetálních bun k. N které markery fungují jako hormony, jiné jsou enzymy, katalyzující r zné biochemické reakce v organismu. Dal í se ú astní na transportu biologicky d le itých látek, nebo jsou spojené se zvý enou prolifera ní aktivitou bun k. Poslední skupinou nádorových marker jsou produkty r zných tkání se specifickými funkcemi b hem vývoje plodu a v období dosp losti, které nem eme za adit do p edchozích skupin. N které z t chto látek fungují nap íklad jako zásobní bílkoviny, jiné pat í mezi proteiny akutní fáze a mají ochranné funkce p i po kozování tkání organismu, dal í jsou zapojeny do imunitních reakcí (1,2). Aby se nádorové markery mohly úsp n vyu ívat v onkologické praxi, m ly by spl ovat následující po adavky: 1) být produkovány samotnými nádorovými tkán mi, 2) z maligní tkán se pohotov a v dostate né mí e uvol ovat do t lesných tekutin, 3) zm ny jejich koncentrací v t lesných tekutinách by m ly co nejlépe odrá et zm ny nádorového r stu a velikost nádorové masy, 4) jejich tvorba zdravými tkán mi by m la být co nejmen í nebo ádná a jejich koncentrace v t lesných tekutinách u zdravého jedince co nejni í nebo nulové, 5) vykazovat maximální specificitu, t.j. správnou negativitu. Specificita udává pravd podobnost, s jakou má pacient bez diagnostikované choroby negativní výsledek testu. Nem la by být ni í ne 90 %. K racionálnímu posouzení správné negativity a fale né pozitivity v souboru nemocných u jednotlivého pacienta by její hodnota m la být nejlépe 95 %. 6) vykazovat dostate nou senzitivitu, tj. správnou pozitivitu. Udává pravd podobnost, e pacient s pozitivním výsledkem testu má hledanou chorobu. Nem la by být pod 80 % pro vysoký záchyt správné pozitivity s nízkou fale nou negativitou. 7) mít dostate ný predik ní as ( lead time ), co je as, který uplyne od pr kazu zvý ení nádorového markeru do klinické diagnózy. 4

5 Nádorové markery by m ly umo ovat: 1) screening maligních nádor, 2) diferenciální diagnostiku mezi maligními a nemaligními onemocn ními, 3) stanovení prognózy, 4) stanovení klinického stádia, 5) sledování ú innosti protinádorové lé by, 6) asné zji t ní recidivy nádoru (1,2). Karbonické anhydrázy (CA) jsou skupinou metaloenzym obsahujících zinek, které najdeme tém u v ech ivých organism (3). Rozd lujeme je do t í rozdílných CA skupin,,, které nevykazují významnou podobnost sekvencí a z ejm jsou kompletn odli ného fylogenetického p vodu. V bu kách savc se vyskytují výhradn karbonické anhydrázy skupiny. Tato skupina zahrnuje 14 len, z nich 11 vykazuje aktivitu karbonické anhydrázy. Podle lokalizace v bu ce je m eme rozd lit do 4 skupin: a) cytozolová (CA I, II, III, VII, VIII) b) membránová (CA IV, IX, XII, XIV) c) mitochondriální (CA V) d) sekre ní (CA VI) Cytozolové a mitochondriální CA mají pouze doménu karbonické anhydrázy. Sekre ní CA má je t krátký C-terminální et zec a transmembránové navíc transmembránovou kotvu a krom CA IV i cytoplasmatický úsek. CA IX jako jediná karbonická anhydráza má N-terminální proteoglykanovou sekvenci, zprost edkovávající mezibun nou adhezi. Aktivitu karbonické anhydrázy r zné intenzity vykazují v echny CA krom CA VIII, X a XI (P íloha 1). Vysoce heterogenní distribuce karbonických anhydráz v r zných diferencovaných bu kách a orgánech ukazuje na jejich funk n odli né úlohy v procesech jako je udr ování acidobazické rovnováhy, vým na plyn, transport iont, fixace uhlíku, ochrana sliznic, resorpce kostí, regulace ph alude ní kyseliny v blízkosti alude ní st ny a jiných t lních tekutin. Ztráta nebo deregulace aktivity n kterých isoenzym se ú astní na vzniku onemocn ní jako glaukom, osteopetróza, otoky p i srde ním a ledvinném selhání, neurologická a neuromuskulární onemocn ní (4). 5

6 Karbonická anhydráza IX (CA IX), d íve nazývaná MN nebo MN/CA9 protein, je povrchový bun ný protein, který byl objeven neo ekávan p i studiu protein obálky hypotetického lidského defektního retroviru tvorbou fenotypicky smí ených virion viru vezikulární stomatitidy. Ty byly vytvo eny v bun né linii MaTu, odvozené z tumoru prsu (5). Extrakty z t chto bun k obsahovaly protein o molekulové hmotnosti 58 kda, který imunoprecipitoval s r znými lidskými i zví ecími séry. Ke zji t ní jeho identity byly vytvo eny monoklonální protilátky, které umo nily rozli it dv komponenty, MN a MX (6). Membránov vázaný MN protein byl detekován monoklonální protilátkou M75 a na Western blotu se zobrazil jako dva prou ky o molekulové hmotnosti 54 a 58 kda. Druhá komponenta komplexu MaTu je p enosné agens, provizorn ozna ené jako MX. To bylo identifikováno jako bílkovina o hmotnosti 58 kda, která se p ekrývá se zónou 58 kda z dvojité zóny MN. Rozdíl v ak tkví v tom, e MX reaguje s protilátkou M67, kde to MN s protilátkou M75. Mezi nimi není ádná zk í ená reakce. MX navíc reaguje s adou normálních ivo i ných sér v etn asi 40 % sér lidských. MX byla pozd ji identifikována jako defektní varianta LCMV (virus lymfocytární choriomeningitidy), která se in vitro í í jen p ímým kontaktem mezi bu kami. V infikovaných bu kách v ak elektronový mikroskop neodhalil ádné viriony. (7, 8) Sekvenci CA9 genu publikoval Opavský a spol. v roce 1996 (9). cdna kóduje protein skládající se z 459 aminokyselin. Z toho 414 aminokyselin N-terminální extracelulární ásti je 20 aminokyselinovou hydrofobní transmembránovou oblastí spojeno s C-terminálním intracelulárním koncem, slo eným z 25 aminokyselin. Extracelulární ást se skládá ze signálního peptidu (37 aminokyselin), z oblasti podobné keratan sulfát vázající domén velkého proteoglykanového aggrecanu (59 AK) a z domény karbonické anhydrázy (257 AK). Protein MN tvo í homodiméry nebo homotriméry spojené disulfidovými vazbami mezi rezidui cystinu (P íloha 2). Proto e CA doména MN proteinu je významn identická s extracelulárními karbonickými anhydrázami a proto e v té dob byla devátou isoformou identifikovanou ve skupin -CA, byl MN protein p ejmenován na karbonickou anhydrázu IX (10). P íslu nost do -CA rodiny podporuje také struktura oblasti CA9 genu kódující CA doménu, která je obdobná jiným sav ím gen m karbonické anhydrázy. Exony kódující dal í domény a oblasti CA IX byly získány z ejm p esunem exon. Zvlá t PG oblast je pro CA IX jedine ná a nevyskytuje se u dal ích karbonických anhydráz -CA rodiny. 6

7 Normáln se CA IX vyskytuje ve v t ím mno ství pouze ve sliznici aludku a lu níku (11). Malá mno ství CA IX lze prokázat ve sliznici st eva a to v oblasti krypt, kde jsou bu ky s vysokou prolifera ní kapacitou (12). Sm rem distálním od aludku její mno ství ubývá. Minimální hladiny lze dále zjistit v epiteliích pankreatického duktu, mu ských gonád a epiteliálních bu kách vystýlajících t lní dutiny (13, 14, 15). P ítomnost CA IX byla zji t na ve vysokém procentu (tém 100 %) u n kterých typ lidských karcinom jako je karcinom hrdla d lo ního, karcinom jícnu a karcinom ledviny (12, 13, 14, 15, 16, 17). V ni ím procentu p ípad (40 60 %) byla stanovena i u karcinom hlavy, krku, plic, prsu a kolorektálního karcinomu. V dy se jedná o ektopickou expresi, kdy antigen je p ítomen v nádorech vycházejících z CA IX negativních tkání. Nevyskytuje se ve tkáni zdravé ledviny, u nenádorových onemocn ní ledviny ani u benigních nádor, chromofóbní varianty karcinomu ledviny a karcinomu z jasných bun k extrarenálního p vodu (18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25). Naopak u nádor, vycházejících z CA IX pozitivních tkání ( aludek, lu ník) se exprese CA IX proteinu ztrácí nebo je sní ená (26, 27). Dal í studie ukázaly, e sekvence genu v nádorových bu kách je identická se sekvencí genu v normální tkáni (11). To dává p edpoklad, e by karbonická anhydráza IX mohla být slibným nádorovým biomarkerem. Mechanismy, které vedou k ektopické expresi CA IX, nejsou zcela známy. Experimentáln lze expresi CA IX vyvolat vysokou denzitou bun k, která aktivuje promotor CA9 (28). Ten ídí p t regula ních oblastí, obsahujících n kolik cisú inkujících faktor (29). Dv oblasti sousedící s transkrip ním inicia ním místem vá í aktiva ní protein 1 (AP-1) a specificity protein (SP). Jsou to transkrip ní faktory, jejich synergie je nutná k základní transkrip ní aktivaci CA9 genu (30). Nejd le it j í regula ní ást CA9 promotoru je ulo ena na kódujícím (pozitivním) DNA et zci mezi SP-1 vazebným místem a za átkem transkripce na pozici -10/-3 a sestává ze sekvence nukleotid 5 -TACGTGCA-3 odpovídající na HRE ( hypoxia response element ) (31). HRE je rozpoznán HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) transkrip ním faktorem, který vzniká za hypoxie ze základní beta podjednotky a alfa-podjednotky, regulované kyslíkem. P i normální tenzi kyslíku HIF-1 je modifikován prolinovou hydroxylázou na dv prolinová rezidua v centrální na kyslíku závislé degrada ní domén a následn degradován pvhl tumor supresorovým proteinem (32). Navíc je jeho transkrip ní aktivita blokována faktorem inhibujícím HIF, která je zp sobena hydroxylací reziduí argininu v C-terminální transaktiva ní domén (33). Pokud je bu ka vystavena hypoxii 7

8 nebo dokonce anoxii, HIF-1 uniká hydroxylaci, akumuluje se a po dimerizaci s HIF-1 se stává transkrip n aktivní. P ítomností funk ního HRE se CA9 stává transkrip ním cílem HIF-1 a tak se adí mezi skupinu gen ízených hypoxií (34). HRE se uplat uje také v transkripci genu CA9, která je spu t na vysokou denzitou bun k. Zde pot ebuje ale kooperaci s vedle le ícím SP-1 vazebným místem. Proto e hladina HIF-1 alfa je kontrolována proteinem pvhl, dochází p i expresi standardního typu VHL transgenu k supresi transkripce CA9 m-rna v normooxických bu kách. Naopak delece nebo inaktivující mutace vede k uvoln ní transkripce CA9 (35). Ztráta funk ního proteinu pvhl je spojena s v t inou karcinom ledviny z jasných bun k a vysv tluje astou p ítomnost CA IX proteinu na jejich membránách. Samotná ztráta funk ního proteinu pvhl ale k transkripci CA9 genu nesta í. Navíc je nutná hypometylace v promotorové oblasti genu CA9, zvlá t CpG dinukleotid v pozici -74 a -6 vzhledem k za átku transkripce (36). Stav metylace CpG v oblasti -74 ovliv uje z ejm expresi CA IX u jiných karcinom ne RCC (37). Lze p edpokládat, e exprese CA IX je regulována také na vy ích stupních biosyntetické dráhy podobn jako u jiných gen indukovaných hypoxií. In vivo exprese CA IX jasn odrá í lokalizaci hypoxických oblastí. Protein je detekován v perinekrotických oblastech r zných solidních nádor, v etn karcinomu prsu, k e, ovaria, hrdla d lo ního, hlavy a krku, plic a mo ového m chý e (38, 39, 41, 42, 43). M ením u karcinom hlavy a krku se zjistilo, e exprese CA IX za íná ve vzdálenosti m (medián 80 m) od kapiláry a pokra uje sm rem k nekróze (44). Podobné prostorové rozlo ení CA IX k mikrocirkulaci lze nalézt i u karcinomu mo ového m chý e a plic (45, 46). Srovnáme-li CA IX expresi s distribucí HIF-1 a chemického markeru hypoxie EF5, exprese CA IX za íná dále ne HIF-1 a d íve ne EF5. To znamená, e indukce CA IX vy aduje ni í hladinu kyslíku ne HIF-1alfa a e se vyskytuje v perinekrotické oblasti, která je v t í ne zóna ozna ená EF5 (47). Dále prokázali, e CA IX exprimující bu ky, izolované z nádorových xenograft jsou ivotaschopné, klonovatelné a rezistentní k letálnímu efektu ionizujícího zá ení. To ukazuje, e ást nádorových bun k exprimujících CA IX je st edn závislá na oxygenaci a p edstavuje potenciální zdroj metastáz. P edchozí nálezy intranádorové distribuce CA IX ukazují, e hypoxie není jediným spou t cím faktorem její exprese. Imunohistochemické studie ukazují, e exprese CA IX je i u nádor, které nevykazují známky hypoxie (p ítomnost nekróz, exprese HIF-1, VEGF atd.) a naopak. Koexprese 8

9 CA IX s c-erbb2, EGFR a MUC-1 ukazuje na mo nou ú ast v regulaci onkogenních mechanism. To vy aduje je t dal í zkoumání (40, 25). V normální alude ní sliznici CA IX slou í jako diferencia ní antigen (48). P edpokládá se, e anhydrázová ást funguje jako regulátor ph a ú astní se na transmembránovém transportu iont. Ni í extracelulární ph podporuje invazivní r st nádorových bun k, zvý ená koncentrace Ca 2+ kationt v cytoplazm aktivuje bun né tyrosin-specifické proteinkinázy. Proteoglykanová doména CA IX funguje jako adhezívní molekula, která se ú astní diferenciace sliznice za ívacího traktu, zprost edkuje spojení bun k mezi sebou a s neadhezívními solidními tkán mi. P edpokládá se, e i zprost edkuje komunikaci mezi bu kami. P i ektopické expresi m e ale vést k p enosu fale ných signál. To z ejm hraje d le itou úlohu i v karcinogenezi. Jeho 100 % ektopická exprese u t í lidských karcinom a ni í ale významná i u n kterých dal ích podporuje tuto domn nku. Jednou z dal ích mo ných rolí je inhibice apoptózy v nádorové bu ce (49). Na základ ady pozorování se p edpokládá, e CA9 je protoonkogenem. CA IX protein lze prokázat b n imunohistochemickým barvením v histologickém preparátu na bun né membrán a na toto téma bylo publikováno doposud asi 1509 prací. Pomocí reverzní transkrip ní polymerázové et zové reakce (RT-PCR) lze v krevním vzorku zjistit mrna kódující CA IX protein v uvoln ných cirkulujících bu kách. Specificita vy et ení byla 100 %, senzitivita metody je obrovská sta í k odhalení jediné nádorové bu ky v 1 ml krve, av ak záchytnost je nízká, pouze %. Nevýhodou této metody je, e stanovuje CA9-mRNA v nádorových bu kách p i jejich diseminaci (50). Tím lze i vysv tlit nízkou záchytnost této metody. Vzhledem k publikované vysoké expresi CA IX na membránách bun k karcinomu ledviny a expresi u uroteliálních karcinom vývodných mo ový cest jsme se zam ili v na í práci na tyto dva nádory (45). Oba jsou v na í populaci asté, dokonce v incidenci karcinomu ledviny zaujala eská republika nelichotivé první místo na sv t. Ani u jednoho nádoru doposud neexistuje skute ný diagnostický marker, který by umo oval jeho jednoduché a neinvazivní stanovení v asném stadiu a tak umo nil jejich radikální lé bu nebo se dal pou ít p i sledování nemocných po radikální lé b k odhalení asné recidivy onemocn ní. 9

10 1.1. Karcinom ledviny Karcinom ledviny (RCC) tvo í p ibli n 2-3 % v ech solidních nádor dosp lé populace. Jedná se o heterogenní skupinu karcinom s jedine ným morfologickým obrazem vycházejících z epitelu renálních tubul. Ka dý rok se diagnostikuje kolem nádor v USA a v Evropské unii. Nádor se vyskytuje nej ast ji mezi pátou a sedmou dekádou ivota. Mu i jsou posti eni p ibli n dvakrát ast ji ne eny. V t ina karcinom je sporadických, pouze asi 4 % jich je familiárních. U jedné t etiny nemocných je v dob diagnózy zji t na generalizace onemocn ní a u více ne poloviny nemocných s lokalizovaným nádorem onemocn ní progreduje v dal ím pr b hu. Karcinom ledviny je nejletáln j ím urologickým zhoubným nádorem. Zem e na n j více ne 40 % nemocných. V roce 2000 bylo v eské republice hlá eno celkem 2289 nových karcinom ledviny (1346 u mu a 943 u en). To znamenalo hrubou incidenci 22,3/ obyvatel (26,9 pro mu e a 17,9 pro eny). V tom samém roce 2000 zem elo na tento nádor 1185 nemocných (728 mu a 457 en). Mortalita byla 11,5/ obyvatel (14,6/ mu a 8,7/ en) (51). V roce 2008 byla incidence ji 27,14/ a mortalita jen 11,13/ obyvatel, to znamená ni í ne v roce 2000 (P íloha 3). Od roku 1980 do roku 2008 se incidence zvý ila více ne 3,5 krát, mortalita stoupala mírn ji. Tyto rozevírající se n ky jsou d sledkem jednak pokroku v úsp nosti komplexních lé ebných postup, jednak ve zvý ení záchytu asn j ích, radikáln e itelných stádií onemocn ní. To bylo umo n no rozvojem zobrazovacích metod, zejména ultrasonografie, výpo etní tomografie a magnetické rezonance v pr b hu osmdesátých let. Jejich postupné zavedení do b né klinické praxe zvý ilo záchytnost incidentálních tumor u asymptomatických nemocných (52, 53, 54, 55, 56, 57). ada odborných prací potvrzuje nov fakt, e incidentální nádory jsou významn ni ího stadia, gradeu a je ni í procento lokálních recidiv i vzniku vzdálených metastáz oproti nádor m symptomatickým. Také p tileté nádorov specifické p e ívání nemocných s incidentálním RCC oproti symptomatickému (85,3 % versus 62,5 %) je statisticky významn lep í (58, 59, 60, 61, 62). Proto se pro dal í zlep ení výsledk lé by diskutuje provád ní systematického screeningu pomocí ultrasonografického vy et ení ledvin v populaci. Názory na jeho provád ní jsou rozporuplné a jeho oponenti argumentují jeho vysokou cenou k záchytnosti nových nádor u onemocn ní s tak nízkou prevalencí v populaci. Nejv t í studie byly provedeny v Japonsku, kde bylo p i preventivních 10

11 prohlídkách vy et eno sonograficky a respondent s nálezem 192 (0,096%) respektive 14 (0,023%) karcinom ledviny (63, 64). Proto je screening doporu en pouze u populace s vysokým rizikem. Jde o nemocné v kone ném stadiu renálního selhání, nemocné s von Hippel-Lindauovým onemocn ním a jejich p íbuzné, p íbuzné nemocných s dal ími familiárními karcinomy ledviny a tuberózní sklerózou. Jedním z mo ných e ení aktivního screeningu RCC by bylo nalezení vhodného biomarkeru, který by bylo mo né stanovovat v krvi nebo mo i nemocných a který by vykazoval dostate nou senzitivitu i specificitu. Jako biomarker m eme pova ovat chemickou substanci, která je produkovaná bu samotným nádorem nebo jinými tkán mi jako reakce na p ítomnost maligního bujení v organismu. U zdravého jedince se nevyskytují nebo se vyskytují v podstatn ni í koncentraci ne v p ípad p ítomnosti nádoru. Ideální nádorový marker by m l být maximáln senzitivní (po et pozitivních nález /celkový po et vy et ovaných - nízká fale ná negativita), maximáln specifický (správn negativní vy et ení/po et zdravých vy et ených nemocných - nízká fale ná pozitivita), jeho koncentrace by m la korelovat s hmotností nádoru a mít dostate ný predik ní as (p edstih markeru p ed klinickým pr kazem). V sou asné dob zkoumané markery zahrnují DNA parametry, markery bun né proliferace, angiogeneze, apoptózy, r stové faktory, tumor-supresorové geny, adhezní molekuly, cytogenetické abnormality a adu dal ích. Tém v echny hodnotí do ur ité míry biologické chování nádoru a p edpokládá se jejich uplatn ní jako prognostických indikátor. Skute ný diagnostický marker pro screening karcinomu ledviny nebo sledování nemocných po radikální lé b zatím neexistuje. V literatu e lze nalézt zprávy o t chto mo ných markerech, stanovitelných v periferní krvi: vaskulární endoteliální faktor, sérový amyloid, insulinu podobný r stový faktor-1 a karbonická anhydráza IX. Pro diagnostiku uplatnitelný se zdá pouze CA IX protein, ostatní spí e hodnotí biologické chování tumoru. McKiernan stanovoval CA IX mrna pomocí reverzní transkrip ní polymerázové et zové reakce (RT-PCR) v p edopera ním krevním vzorku nemocných s lokalizovaným RCC a u zdravých kontrol. Nalezl CA IX mrna u 86 % nemocných s RCC. U nemocných s benigními lézemi byly hladiny CA IX mrna nulové a ve zdravé kontrolní skupin je nalezl v 1,8 % proband (65). Dal ím sledováním stejné skupiny 41 nemocných s RCC se ukázalo, e ve skupin nemocných s negativním CA 11

12 IX p ed operací bylo p tileté p e ití bez progrese 88 % proti 40 % ve skupin CA IX pozitivní (66) Uroteliální nádory mo ových cest Uroteliální karcinomy (UC) vývodných mo ových cest vycházejí z p echodního epitelu, který vystýlá mo ové cesty od ledvinné papily a po ást mo ové trubice. Tyto nádory se nej ast ji vyskytují v mo ovém m chý i, kde p edstavují a 98 % v ech zhoubných nádor. V oblasti ledvinné pánvi ky a mo ovodu jsou mnohem vzácn j í. Ze v ech maligních nádor ledvin je pouze 6-7 % nádor z urotelu. Tvo í pouze 4 % v ech uroteliálních tumor. Pom r nádor m chý ových ku nádor m ledvinné pánvi ky a mo ovodu je 51:3:1 (67). Uroteliální karcinomy mo ového m chý e jsou druhým nej ast j ím nádorem urogenitálního traktu. ast ji jsou posti eni mu i ne eny 2,7:1 a jejich záchyt je nejvy í v 6. dekád ivota. Incidence tohoto nádoru se stejn jako u RCC v eské republice zvy uje. V roce 1980 byla incidence 9,01/ obyvatel a mortalita 5,26/ , v roce 2008 byla incidence ji 24,52/ obyvatel a mortalita jen 8,31/ obyvatel (P íloha 4). V dob diagnózy je jich zhruba 85 % lokalizovaných na mo ový m chý a 15 % ji s generalizací do lymfatických uzlin nebo do jiných vzdálených orgán. V 90 % se jedná o karcinomy z p echodního epitelu, v 6-7 % o epidermoidní karcinom a pouze v 1-2 % o adenokarcinom. Onemocn ní je diagnostikováno a dále monitorováno uretrocystoskopií, cytologií a zobrazovacími metodami horních mo ových cest (IVU, CT). Cystoskopie, která je pova ována za zlatý standard, m e ale p ehlédnout oblasti karcinomu in situ. Navíc se jedná o vy et ení invazivní pro nemocného a i finan n nákladné. Cytologické vy et ení vzorku mo e má st ední senzitivitu pouze 35 % a st ední specificitu 94 % (68). Uplat uje se zejména v diagnostice high-grade nádor a karcinomu in situ. Nízká senzitivita u low-grade tumor sni uje její klinický význam. Limity cytologie a invazivita uretrocystoskopie vedou ke hledání mén invazivních diagnostických metod. V posledních letech se nejvíce studují a jsou publikovány práce o fluorescen ní in situ hybridizaci (FISH), mikrosatelitové analýze (MSA), imunocytologické diagnostice nádoru p idru ených antigen (ImmunoCyt), stanovení telomerázové aktivity, stanovení komplementovému faktoru H- p íbuzného proteinu (BTA-TRAK, BTA-stat), stanovení kyseliny hyaluronové a hyaluronidázy 12

13 v mo i (HA-HA-áza), stanovení proteinu nukleární matrix 22 (NMP22), stanovení proteinu nukleární matrix BLCA-4, cytokeratin (CYFRA 21-1) a survivinu. Ideální marker by m l op t mít vysokou senzitivitu a specificitu, snadnou reprodukovatelnost a nízkou cenu. V echny vý e uvedené markery jsou lep í ne cytologie v senzitivit ale mírn hor í ve specificit (P íloha 5). Pro klinickou praxi je dostupný NMP22Bladder Check assay, který je snadno proveditelný, senzitivitu má mírn lep í n cytologie, specificita se pohybuje mezi %, je citlivý i u low-grade tumor a není ovliv ován BCG terapií. Nevýhodou je, e není jasn definována hodnota výsledku, kdy doporu it provedení cystoskopie. Dal í dostupný test je BTA-TRAK a BTA-stat. Oba testy vykazují ni í senzitivitu i specificitu ne cytologie a jejich výsledky jsou ovliv ovány benigními urologickými onemocn ními (uroinfekce, hematurie). Posledním v praxi dostupným je UBC Rapid test (UBC Urinary Bladder Cancer Antigen). Tímto testem se detekují v mo i cytokeratiny 8 a 18, které jsou markerem karcinomu epiteliálních bun k. Specificita testu je 90 % a senzitivita %, pozitivní prediktivní hodnota 86 % a negativní prediktivní hodnota 81 % (69). Ostatní testy jsou náro né na provedení a dra í. Z nich nejslibn j í se zdá mikrosatelitová analýza, která vykazuje dobrou senzitivitu (72-97 %) i specificitu ( %) a je schopná detekovat tumory nízkého gradeu a T kategorie. Provedení testu je ale náro né. Dal í perspektivní jsou stanovení kyseliny hyaluronové a hyaluronidázy a survivinu. Vykazují dobrou specificitu i senzitivitu, jsou schopny detekovat tumory nízkého gradeu. Jsou ale nutné dal í studie (P íloha. 5). Zatím neexistuje jediný marker, vhodný pro sledování nemocných s uroteliálními tumory, který by sní il etnost nutných uretrocystoskopií v rámci dispenzarizace (70). 13

14 2. Cíle práce V na í práci jsme si stanovili tyto cíle: 1) Zjistit, zda dochází k uvol ování CA IX do média b hem kultivace nádorových bun ných experimentálních kultur, které mají na své bun né membrán CA IX protein. 2) Li í se solubilní forma CA IX od formy membránové? 3) Jaká je koncentrace CA IX v kultiva ním médiu experimentálních kultur? 4) Uvol ují také krátkodob p e ívající kultury lidských nádor CA IX do kultiva ního média a pokud ano, jaké jsou koncentrace? 5) Je solubilní CA IX (s-ca IX) stanovitelná v séru nebo mo i nemocných s urologickými tumory exprimujícími CA IX? 6) Pokusit se stanovit clearance s-ca IX po chirurgickém odstran ní nádoru. 7) Má vliv na koncetraci s-ca IX velikost nádoru nebo jeho grade? 8) Je detekovatelná s-ca IX v krvi nebo séru zdravých dobrovolník? 9) Je s-ca IX vhodným markerem pro mo né stanovení zkoumaných nádor? Pro na e experimenty jsme si vybrali nemocné s adenokarcinomem ledviny a poté s uroteliálními tumory, kde z literárních údaj je exprese CA IX proteinu ve velkém mno ství a u vysokého po tu nádor. 14

15 3. Soubor a metody 3.1. Soubor V na í prospektivní studii probíhající v letech jsme vytvo ili dv skupiny pacient : 1) nemocní s karcinomem ledviny, 2) nemocní s uroteliálními tumory mo ového m chý e nebo kalichopánvi kového systému. V první skupin bylo testováno 44 pacient s adenokarcinomem ledviny (RCC), 15 pacient s nonrcc tumory, ty i pacienti s nenádorovým urologickým onemocn ním a 42 zdravých slou ilo jako kontrolní skupina (P íloha 6). U nemocných s RCC jsme odebírali krev a eventuáln mo p ed výkonem a znovu krev pátý den po operaci. Vzorky byly co nejrychleji transportovány do laborato e a zmrazeny p i teplot -80º Celsia. U n kterých nemocných jsme odebrali po nefrektomii ást vitální nádorové tkán pro krátkodob p e ívající bun né kultury. Do druhé skupiny bylo za azeno 31 pacient s endoskopickým podez ením na uroteliální karcinom mo ového m chý e (UC), v jednom p ípad ledvinné pánvi ky a 16 kontrol (P íloha 7). V této skupin jsme odebírali krev a mo pouze p ed opera ním výkonem. Nádorová tká se mikroskopicky vy et ovala jednak po barvení hematoxylinem a eosinem a jednak v indikovaných p ípadech imunohistochemicky na membránovou formu CA IX proteinu. Velikost nádoru se stanovila zobrazovacími metodami (ultrazvuk, CT, NMR), z opera ního preparátu nebo endoskopicky porovnáním s velikostí resek ní kli ky endoresektoru. Tato studie byla schválena etickou komisí Fakultní nemocnice v Motole Metody Bun né experimentální a nádorové bun né kultury Jako standardní nádorovou linii, která se snadno kultivuje a mno í in vitro a obsahuje CA IX protein o molekulové hmotnosti 54 a 58 kda ve velkém mno ství, jsme pou ili bun nou linii HT29 (DSMZ ACC299), odvozenou z bun k kolorektálního karcinomu. Bu ky byly kultivovány v Dulbeccem modifikovaném Eaglov roztoku (DMEM) obohaceném 10 % fetálním telecím sérem (FCS, Gibco). Primární kultury z bun k lidských karcinom se p stují in vitro obtí n. Proto jsme pou ili krátkodobé kultury, které jen p e ívají, ale bu ky se trvaleji nemno í. 15

16 Nádorové bu ky získané z excizí nádorové tkán byly propláchnuty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS, ph 7,2), suspendovány v DMEM s 10 % FCS (cca mg erstvé váhy nádorové tkán do 5 ml média) a inkubovány v 5 cm Petriho miskách p i teplot 37,1 Celsia v inkubátoru v atmosfé e s 5 % CO 2. Pufr k lýze bun k obsahoval PBS s 1 % Igepal CA-630 (Sigma), 0,25 % deoxycholát a inhibitory proteáz (1mM fenylmetylsulfonylfluorid a 200 trypsin inhibi ních jednotek Trasylolu/ml) Imunologické reagencie a metody Ke stanovení koncentrace CA IX proteinu v extraktech a kultiva ních médiích z experimentálních bun ných linií a krátkodob p e ívajících RCC bun ných kultur jsme pou ili monoklonální protilátku M75 (mab M75), vyvinutou Pastorekovou a kol. (6). Její isotyp je IgG 2b. Epitop MAb M75 je lokalizován v PG domén a jeho sekvence aminokyselin je PGEEDLP (49). V t lních tekutinách jsou koncentrace CA IX velmi nízké, proto bylo nutné pou ít dv protilátky, jednu ke koncentraci antigenu a druhou k vizualizaci potencovanou chemiluminiscencí. Ke koncentraci jsme pou ili mab V-10, její isotyp je IgG 2a a její epitop je lokalizovaný v CA domén CA IX proteinu. K vizualizaci slou ila vý e zmín ná mab M75. Imunoglobuliny IgG byly purifikovány z kultiva ního media hybridomových bun k afinitivní chromatografií (49). Ke koncentraci imunokomplex tvo ených mab s CA IX antigenem z média nádorových bun k nebo bun ného extraktu jsme pou ili Protein A-Sepharosu (Sigma). Komplexy mab-ca IX z lidského séra nebo mo e byly adsorbovány na agarosu s navázanou protilátkou k my ímu IgG. Imunoperoxidázový konjugát mab M75-Px byl p ipraven za pou ití kitu pro zna ení peroxidázou (Roche Diagnostics, GmBH, Mannheim, N mecko). Imunoprecipitace s-ca IX z lidského séra nebo mo e se provád la následovn : k 0,75 ml séra nebo 10 ml mo e vy e ených centrifugací byly p idány 2 µg mab IgG V-10 a ponechány reagovat 60 minut p i pokojové teplot. Poté bylo do ka dého vzorku p idáno 50 l 50 % p edepraných anti-my ích IgG agarózových perli ek a suspenze byla dána do rotátoru na 4 hodiny nebo p es noc p i teplot 4º C. Následn jsme agarózová zrna s navázaným my ím IgG a imunitními komplexy centrifugovali p i 1200 otá kách/minutu dv minuty. Pelety jsme resuspendovali v 1 ml PBS s 0,05 % Tweenem 20 (PBS-T, Sigma), znovu centrifugovali a zah áli na 100 C 16

17 na 5 minut v 60 µl Laemmliho pufru s p ídavkem 2,5 % merkaptoethanolu a 1,5-2 % FCS ELISA ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), n kdy také ozna ovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpou ívan j ích imunologických metod slou ících k detekci protilátek nebo antigenu. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a vyu ívá dvou základních vlastností imunoglobulin. Za prvé je to jejich schopnost vázat se na povrch um lých hmot (nap. polystyrenu) a za druhé pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty imunoglobulinových molekul. Pro pr kaz antigen existují r zné modifikace ELISA testu: P ímá ELISA a p ímá sendvi ová ELISA (71). Sendvi byl slo ený z t chto vrstev: 1) dno mikrotitra ní desti ky nebo prou k bylo pokryto monoklonální protilátkou IgG V-10 (capture antibody), 5µg/ml v 50 mm karbonátovém pufru o ph 9,6, který byl adsorbován 3 hodiny p i pokojové teplot, 2) roztok testovaného antigenu v PBS s 0,05 % Tween 20 byl adsorbován p es noc p i teplot 4 C, 3) M75-Px konjugát (detector antibody) 1:5000 v PBS s 0,05 % Tween 20 se nechal 2 hodiny vázat p i pokojové teplot. Po krocích 1-3 byly desti ky vymyty PBS Tween. 4) Nakonec byla p idána sm s ortofenylen diaminu (OPD, Sigma) 1mg/ml ve 100mM fosfát/citrátovém pufru o ph 5,0, 1 µl 30 % H 2 O 2 (Sigma). Reakce probíhala 30 minut v temnu p i pokojové teplot. Reakce byla ukon ena p idáním dvou kapek 2N H 2 SO 4 na jamku. Pou ili jsme prou ky MaxiSorp nebo desti ky (NUNC, Denmark). Po ukon ení reakce jsme m ili absorbanci pomocí fotometru p i vlnové délce 485 nm Western blot Western blot (té ozna ovaný jako imunoblot) je analytická technika vhodná k detekci specifického proteinu ve sm si s dal ími proteiny, nap íklad ve vzorku homogenátu tkán i jiného biologického vzorku. Separace protein podle jejich velikosti (denaturující SDS-PAGE) nebo jejich celkové trojrozm rné struktury (nativní elektroforéza) se dosahuje gelovou elektroforézou. Následn jsou proteiny p eneseny ("p eblotovány") z gelu na povrch membrány (nej ast ji nitrocelulosové i PVDF), na jejím povrchu jsou detekovány specifickými protilátkami. Proti b ným 17

18 sérologickým metodám jako je ELISA, je western blot sice asov náro n j í a dra í, ale vykazuje v t í specifi nost. Metoda dostala své jméno western blot jako slovní h í ka na podobnou metodu Southern blot, pou ívanou k detekci DNA vyvinutou d íve Edwinem Southernem. První ást se skládá z klasické SDS-PAGE elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli podle své molekulové hmotnosti. Jednotlivé proteiny vytvá ejí v gelu prou ky. Gel z elektroforézy se následn p ilo í na PVDF i nitrocelulózovou membránu a pomocí blotovacího za ízení dojde p sobením elektrického proudu k p enosu protein z gelu na povrch membrány. Na membrán vznikne jakoby kopie protein separovaných na gelu. P ístroj je realizován jako soustava anody a katody. Záporn nabité proteiny obalené SDS jsou elektrickým proudem p eneseny z gelu sm rem k anod. Aby povrch membrány nevázal i p idané protilátky, je nutné jej zablokovat. Blokování t chto nespecifických míst se nej ast ji provádí umíst ním membrány do z ed ného roztoku n jakého proteinu - nap. 3-5 % BSA i netu né suché mléko v TBS, s p ídavkem slabého detergentu jako je Tween 20 (0,05 %). Proteiny BSA i mlé ného kaseinu z roztoku se navá í na v echna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny p i p enosu. Po p idání protilátky se u molekuly imunoglobulin nemohou nespecificky navázat na prázdný povrch membrány, ale vá í se pouze specificky na sv j epitop na p eblotovaných antigenech. Blokováni výrazn sni uje um pozadí a odstra uje fale né pozitivity. Pro zviditeln ní daného proteinu je nutné pou ít specifickou protilátku proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce. Jednokroková detekce vyu ívá primární protilátku, která je konjugována s reportérovým enzymem. Dvoukroková detekce kombinuje primární protilátku a sekundární protilátku konjugovanou s reportérovým enzymem. U dvoukrokové detekce je po blokování membrána p enesena do z ed ného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5-5 g/ml) v pufrovaném roztoku (nap. TBS i PBS) BSA i mlé ného kaseinu. Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod a p es noc za laboratorní teploty i p i 4 C. Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem detergentu (nap. PBS+ 0,05 % Tween 20) je membrána p enesena do roztoku sekundární protilátky. Komer n dodávané protilátky jsou proti celé kále primárních protilátek nej ast ji my ího i králi ího p vodu, co jsou skoro v dy primární protilátky. Tyto sekundární protilátky jsou konjugovány s n jakým reportérovým 18

19 enzymem umo ujícím vizualizaci, nap íklad k enovou peroxidázou i alkalickou fosfatázou. P i jednokrokové detekci je reportérovým enzymem zna ena p ímo primární protilátka. Vizualizace je dosa eno dv ma zp soby. Kolorimetrie vyu ívá reakce reportérového enzymu (nap. peroxidázy) s chromogenním substrátem. Enzym p em uje rozpustný (a bezbarvý) substrát na nerozpustný a barevný (nap. modrý) produkt. Mno ství proteinu je poté semikvantitativn stanoveno densitometrií ("jak moc barevná je daná skvrna"). U chemiluminiscence reportérový enzym (peroxidáza) p em uje chemiluminiscen ní substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzá ením kvanta sv tla. Intensita sv tla je poté úm rné mno ství peroxidázy, které je p ímo úm rné mno ství daného proteinu. Uvol ované sv tlo je pak zachyceno na sv tlocitlivém filmu nebo nov ji pou itím CCD-kamer. Pro kvantifikaci je op t mo né pou ít densitometrii (71). Natrium dodecyl sulfát-polyakrylamidová gelová elektroforéza a western blotting byly provedeny jak bylo uvedeno d íve (49). CA IX antigen byl na blotech zobrazen pomocí M75-Px konjugátu s následnou potencovanou chemiluminiscencí (ECL) a expozicí na Rtg film Medix XG (FOMA, eská republika) s maximální citlivostí na luto-zelené sv tlo. Ka dou membránu s navázanými proteiny vyvoláváme nap ed v roztoku monoklonální protilátky M75 konjugované s peroxidázou, která ozna í antigen CA IX. Následuje láze obsahující luminol, H 2 O 2 a kyselinu kumarovou. Peroxidáza navázaná na protilátku katalyzuje oxidaci luminolu peroxidem vodíku, ím vznikají záblesky sv tla. Ty se exponují na citlivý film. Pro ka dý blot u íváme nejmén dv expozice: 5 minut pro materiály od pacient s vy í hladinou antigenu a 30 minut pro materiály od zdravých individuí. Ty pokládáme za negativní, a obsahují také CA IX, ale jen pg/ml. Ka dý blot obsahuje také standardní koncentrace CA IX jako kalibraci. V tomto p ípad to byla CA IX vyrobená metodami genového in enýrství, purifikovaná afinitní chromatografií a koncentrace zásobního preparátu byla stanovena chemicky Histologické vy et ení Chirurgicky odstran né nádorové tkán byly co nejd íve po odb ru fixovány v 10 % formalinu, zality do parafinu a barveny standardn hematoxylinem-eosinem pro mikroskopické vy et ení. 19

20 Immunohistochemie (IHC) Tká ové ezy o tlou ce 4 µm byly deparafinovány xylenem a rehydratovány sni ujícími se koncentracemi roztoku alkoholu ve vod. Po standardní blokád endogenní peroxidázové aktivity po 20 minut p i pokojové teplot, byly tká ové ezy inkubovány p es noc p i 4 C s anti-ca IX protilátkou M75 (tká ová tekutina z hybridomu v ed ní 1:50) (7). Komplexy antigen-protilátka se zobrazily pomocí univerzálního imunoperoxidázového polymerního detek ního kitu N-Histofine, Simple Stain MAXPO multi (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) s 3,3 diaminobenzidinem (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) jako chromogenem. Pouze membránové barvení bylo bráno jako pozitivní výsledek. Imunohistochemické barvení CA IX bylo hodnoceno pod malým zv t ením semikvantitativn do 4 kategorií procentem CA IX pozitivních nádorových bun k. Skóre 0 znamená 0 %, skóre 1 < 10 %, skóre % a skóre 3 > 50 % CA IX protein pozitivních bun k. Distribuce a rozsah CA IX pozitivity byl hodnocen se zam ením na perinekrotické oblasti nádoru Statistické hodnocení Pro statistický výpo et byl pou it program StatView (SAS Institute, Cary, NC, USA). Rozdíly mezi studijními skupinami byly porovnány pomocí neparametrického Mann Whitney testu a chí-kvadrát testu. Hranice signifikance byla p<0,05. 20

21 4. Výsledky 4.1. RCC soubor V souboru karcinomu ledviny byly vy et ovány vzorky od 63 nemocných. Soubor byl dále rozd len na podskupinu nemocných s histologicky prokázaným karcinomem ledviny (n=44). Nemocní s histologicky odli ným nádorem ne karcinom (n=15) byli za azeni spolu s nemocnými s nenádorovými onemocn ními (n=4) do podskupiny kontrolní. Jako dal í kontroly jsme je t za adili séra, získaná od zdravých dárc krve (n=42). V podskupin nemocných s prokázaným RCC velikost tumoru byla 20 a 170 mm (pr m r 65 mm), dále jsme z histologického nálezu stanovili pt kategorii a grade (P íloha 8, P íloha 9). Retroperitoneální lymfatické uzliny byly posti eny u 4 nemocných (1x N1, 3x N2) a vzdálené metastázy u 5 nemocných z nich pouze u dvou byly posti eny také retroperitoneální lymfatické uzliny. Z tkán zdravé ledviny, angiomyolipomu a esti preparát karcinomu ledviny získané po nefrektomii jsme odebrali vzorky k p íprav extraktu, ve kterém jsme stanovili p ítomnost a koncentraci CA IX proteinu. Na western blotu se CA IX protein zobrazuje jako dvojitý prou ek o molekulové hmotnosti 58 a 54 kda. Ve v ech esti extraktech z RCC nádorové tkán byl p ítomen CA IX protein ve vysoké koncentraci 0,5-2 mg/g celkového proteinu. V extraktu tkán zdravé ledviny a angiomyolipomu CA IX nebyl p ítomen (P íloha 10). ást vitální tkán nádoru jsme také kultivovali in vitro a v t chto krátkodobých tká ových kulturách jsme poté prokázali uvol ování extracelulární ásti CA IX proteinu do kultiva ního média jako solubilní formy CA IX proteinu (s-ca IX). Solubilní CA IX je krat í o transmembránovou a intracytoplazmatickou ást a má molekulovou hmotnost 54 a 50 kda. Koncentrace s-ca IX v r stovém médiu z nádorových explantát se pohybuje v rozmezí 20-50ng/ml.(P íloha 11) V séru pozitivní s-ca IX protein jsme zjistili pouze v podskupin s histologicky prokázaným karcinomem ledviny (P íloha 12). Z 35 vy et ovaných vzork jich bylo 26 (74,3 %) pozitivních. Ve druhé podskupin non-rcc tumor a jiných nenádorových urologických onemocn ní byly v echny vzorky na s-ca IX protein negativní. V mo i je vy et ení usnadn no tím, e od pacient m eme získat v t í odb ry ne v p ípad krve a dále tím e mo obsahuje mnohem mén bílkovin ne sérum. 21

22 Vysoký obsah bílkovin v koncentrovaném preparátu znemo uje analýzu s-ca IX. V podskupin s p ítomným RCC byl s-ca IX protein prokázán v mo i u 19 (63,3 %) z 30 vzork. V kontrolní skupin, zahrnující 30 vzork (25 zdravých kontrol, 3 non- RCC tumory, 2 jiná urologická onemocn ní), byly v echny vzorky s-ca IX negativní. U p ti nemocných s RCC jsme stanovili koncentraci s-ca IX p ed a pátý den po opera ním výkonu (P íloha 13). Ve t ech p ípadech je vid t významný pokles hladiny s-ca IX po výkonu, u jednoho nemocného pouze mírný (druhý vzorek odebrán z technických d vod ji první den po operaci). U jednoho nemocného (. 68) je naopak pozorovatelná vy í hladina s-ca IX. Zde byla provedena pouze opera ní revize a pro opera n ne e itelný nález nádor nebyl odstran n. To dokazuje, e zdrojem s-ca IX jsou jasn bu ky RCC. V p íloze. 14 jsou uvedeny p ehledn údaje koncentrace CA IX proteinu v jednotlivých biologických materiálech, jak jsme je stanovili b hem na í práce. Výsledky v bun ných extraktech a kultiva ním mediu byly stanoveny metodou ELISA. V séru a mo i, pro nízkou koncentraci s-ca IX, bylo nutno pou ít densitometrické hodnocení film exponovaných Western bloty a porovnání se standardními koncentracemi s-ca IX. Statistickým hodnocením jsme neprokázali ádný statisticky významný rozdíl ve výskytu parametr pt, G, N, M a velikosti nádoru mezi CA IX pozitivními a CA IX negativními skupinami a dále mezi CA IX pozitivní skupinou v séru a CA IX pozitivní skupinou v mo i. Senzititivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota pro CA IX v séru, mo i a ob skupiny dohromady je uvedena v p íloze Soubor uroteliálního karcinomu mo ových cest Ve druhé skupin nemocných s uroteliálními tumory dolních a horních mo ových cest bylo hodnoceno 32 nemocných s podez ením nebo prokázaným uroteliálním karcinomem. U sedmi byla provedena radikální cystektomie, u jednoho nefroureterektomie a u ostatních transuretrální resekce tumoru mo ového m chý e. Karcinom vycházející z urotelu byl histologicky prokázán u 23 (71,9 %) nemocných, u jednoho z nich se jednalo o karcinom spinocelulární. Zastoupení pt kategorií a gradeu je uvedeno v následujících grafech (p íloha 16, p íloha 17). 22

23 V této skupin byla s-ca IX v mo i pozitivní u 16 (69,6 %) nemocných a jeho koncentrace se ve v t in p ípad pohybovaly mezi 5-40 pg/ml (P íloha 18). Sérové koncentrace s-caix byly u v ech superficiálních tumor negativní. Negativní nález s-ca IX byl u 7 (30,4 %) pacient s mikroskopicky prokázaným uroteliálním karcinomem. V tabulce 4 je soubor UC pozitivních nemocných rozd len do skupin podle výsledk mikroskopického, imunohistochemického vy et ení a Western blotu (P íloha 19). U 10 nemocných, i p es endoskopicky pozitivní nález, UC ve vzorku získaném transuretrální resekcí nebyl mikroskopicky prokázán. U 7 z nich byl s-ca IX pozitivní.u dvou z nich se p i dal ím sledování prokázala recidiva UC, u dvou byl preparát drobný a termicky znehodnocený a u jednoho byla zji t na metaplasie urotelu. Imunohistochemické barvení prokázalo CA IX protein zejména v povrchových vrstvách nádoru u 13 nemocných. Nekrózu jsme nalezli pouze u t í UC a jednoho SCC. Jeden z t chto UC nádor s nekrózou byl kompletn CA IX negativní, ostatní byly st edn a výrazn pozitivní. Ani v jednom p ípad jsme nepozorovali vy í intenzitu barvení v perinekrotické oblasti (P íloha 20, 21) Statistickým hodnocením jsme nezjistili ádný významný rozdíl mezi skupinami WB+ a WB 0 v hodnot G (Mann-Whitney test, p=0.983) a velikosti tumoru (Chi-square test, p=0.259). Senzititivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota pro CA IX v séru, mo i a ob skupiny dohromady je uvedena v p íloze

24 5. Diskuze Zdá se, e CA IX protein hraje d le itou úlohu v patogenezi mnoha karcinom u lidí. K jeho expresi na membrán nádorových bun k dochází v d sledku hypoxie (inaktivace VHL genu a upregulace dal ích protein jako HIF,VEGF atd.). Tento membránový protein lze pom rn snadno detekovat na povrchu nádorových bun k v preparátu pomocí IHC barvení specifickou monoklonální protilátkou mab M75. V literatu e je uvád na p ítomnost CA IX tém u 100 % karcinom ledviny (18, 19) a dále u uroteliálních nádor vývodných cest mo ových (45). P edpokládali jsme, e by mohlo docházet k uvol ování tohoto antigenu do okolních t lních tekutin. K ov ení tohoto p edpokladu jsme pou ili standardní nádorové bun né linie obsahující velké mno ství CA IX proteinu na svých bun ných cytoplazmatických membránách. Na za átku na í práce jsme m li ke stanovení CA IX proteinu k dispozici pouze jednu známou monoklonální protilátku M75, její epitop je lokalizovaný v PG domén. Tou jsme spolehliv prokázali p ítomnost vysokých koncentrací CA IX v bun ných extraktech, která se zobrazovala metodou western blot jako dva prou ky o molekulové hmotnosti 58 a 54 kda. Také v kultiva ním médiu experimentálních bun ných linií a také krátkodob p e ívajících RCC bun ných kultur je s-ca IX v pom rn vysokých koncentracích. Vzniká z ejm od t pením extracelulární ásti molekuly do kultiva ního média a tká ových tekutin vlivem membránových proteáz. Proto je tato solubilní forma men í a zobrazuje se jako dva pruhy o molekulové hmotnosti 54 a 50 kda. Tato velikost odpovídá proteoglykanové a karboanhydrázové domén (9). Problém nastal p i stanovování s-ca IX v t lních tekutinách, kde jsou jeho koncentrace velmi nízké (1000x ni í ne v mediu z nádorových kultur). V tomto p ípad se krom specifických zón CA IX zobrazovaly i zk í en reagující molekuly o molekulové hmotnosti 92 a 125 kda, které znemo ovaly hodnocení (P íloha 23). P í inou tohoto jevu bylo to, e jsme museli pou ívat jedinou dostupnou protilátku, specifickou proti jedinému epitopu, jak ke koncentraci antigenu ze vzorku krve nebo mo e tak i k vizualizaci. K odstran ní tohoto ne ádoucího jevu bylo nutné získat nejmén dal í jednu specifickou, nejlépe monoklonální protilátku, namí enou proti jinému epitopu proteinu CA IX ne je mab M75. K vývoji nových my ích protilátek byla d le itá znalost sekvence genu Car9, který je homologem lidského CA9 genu. Ta ukázala, e N-terminální, proteoglykanové domény (PG) CA IX proteinu jsou odli né u lidí a my í. Naopak doména karbonické anhydrázy (CA) je vývojov 24

25 konzervativní. Proto my rozezná lidskou PG doménu jako cizí a produkuje proti ní protilátky. Naopak nerozezná CA doménu. Tento problém byl p ekonán vytvo ením my i bez genu Car9 technikou knock-out (48). Pro ni je jakýkoliv CA IX protein cizí, lidský jako my í, a produkuje proto protilátky proti r zným antigenním míst m CA IX. Pomocí této my i bez Car genu bylo mo né vytvo it adu monoklonálních protilátek, z nich ada je specifická proti antigenním sekvencím, lokalizovaným v CA domén (72). V práci jsme pak pou ili takto vytvo enou mab V-10 ke koncentraci CA IX antigenu a M75 s navázanou peroxidázou k vizualizaci. Tím se poda ilo odstranit ne ádoucí, zk í en reagující molekuly, znemo ující hodnocení (P íloha 24). A koliv in vitro nádorové bu ky nebo fragmenty nádor produkují pom rn vysokou koncentraci CA IX, v celém organismu pacient i s velikými nádory je tohoto antigenu velice málo. Jeho koncentrace je p ibli n 100x ni í ne jakou známe u jiných lidských marker, jako PSA nebo CEA. Musíme proto p edpokládat, e existují mechanismy, které rychle odstra ují s-ca IX protein z lidského organizmu. Jedním z nich je vylu ování s-ca IX v nezm n né form mo í. Koncentrace s-ca IX proteinu u RCC pacient v mo i p ibli n odpovídají koncentracím v krvi (P íloha 14). Pozitivita s-ca IX v mo i je o n co ni í. Vy et ení mo i by bylo výhodn j í pro mo nost v t ího objemu materiálu, men í invazivnosti a p ítomnosti men ího mno ství protein. Druhá mo nost je, e se ást s-ca IX proteinu degraduje v krvi na men í fragmenty o kda, pro jejich stanovení nemáme v sou asnosti vhodnou metodu. Velkým problémem v této ásti výzkumu byly velmi nízké koncentrace s-ca IX proteinu v séru i mo i, v ádu n kolika pikogram, které jsou na hranici citlivosti sou asných metod. Proto v echny výsledky jsou stanoveny ze vzork krve (1ml) a mo e (10 ml) po imunoprecipitaci pomocí western blotu v kombinaci s potencovanou chemiluminiscencí. Výhodou této metody je dostate ná citlivost, naopak nevýhodou je, e je pouze metodou semikvantitativní a velmi pracnou, nevhodnou pro hodnocení v t ího po tu vzork. Velice nízká koncentrace CA IX v t lních tekutinách pacient s nádory (hlavn RCC), p edstavuje v na í laborato i zásadní technickou potí (73). Tento problém se e í i v jiných ústavech majících mnohem v t í zku enosti s diagnostikou nádorových marker. Hlavní snahou je vypracovat test ELISA pro diagnostiku s-ca IX. Jejich výsledky vypadají zna n slibn, nebo dokonce p esv d iv, ale vy adovaly by si 25

26 soustavnou kritickou porovnávací studii navzájem, jako i s na im detek ním systémem (74, 75). Ne ekané sv tlo do této problematiky p iná í skupina Li Y. a spol, Ti, pou ívajíce diagnostické reagencie od dvou firem (R&D Systems a Novus Biologicals) a na i protilátku M75 zjistili, e s antigenem CA IX pln specificky reaguje jen mab M75, zatímco králi í polyklonální protilátka NB100 krom antigenu CA IX dává je t zk í enou reakci s jinými, dosud neidentifikovanými bun nými antigeny. Je zvlá tní, e tyto antigeny rovn vykazují dvojitou zónu p 54/58. Navíc zjistili nový, cenný technický poznatek, e desferoxamin (DFO) indukuje v nádorových bu kách shodné biochemické pochody jako hypoxie. Tím se lze v dal ích studiích vyhnout nákladným inkubátor m s regulovatelnou koncentrací O 2 (76) Proto e se nezda ilo vhodnou metodou kvantifikovat s-ca IX protein u nemocných s RCC, soust edili jsme se v dal ích experimentech na uroteliální karcinomy mo ového m chý e a vývodných mo ových cest. P edpokládali jsme e, výhodou pro stanovování s-ca IX proteinu u t chto nádor je, e jsou p ímo omývány mo í a e nejvíce nádorových bun k, exprimujících CA IX protein je lokalizovaných na povrchu nádoru. Pravd podobnost ztráty s-ca IX je tím minimální a jsme jej schopni detekovat v mo i i u malých nádor (45). P edpokládá se, e exprese CA IX v nádorových bu kách je d sledkem fokální hypoxie, která indukuje ektopickou syntézu CA IX (77, 78, 42, 79). U UC je situace pon kud odli ná. P i IHC se CA IX protein asto barvil difúzn v povrchových vrstvách nádorových papilárních struktur. To lze vysv tlit jednak nízkou tenzí kyslíku v oblasti relativn vzdálené od vaskulárního zásobení ve stromatu nádoru a dále také v mo i. Kompletní IHC negativita jednoho UC s fokální nekrózou m e být d sledkem jiné biologické povahy nádoru s neschopností exprese CA IX. Z výsledk lze p edpokládat, e u nemocných s RCC s-ca IX cirkuluje v krvi. Proto e je bun ný adhezívní protein (49, 80), je vázán v tkáních, které exprimují p edpokládaný CA IX specifický receptor. Navázaný CA IX protein je poté v bu kách rozlo en. Men í ást je vylou ena do mo i. U nemocných, kde jsme stanovili vysoké koncentrace s-ca IX, lze p edpokládat, e v t ina receptor byla obsazena s- CA IX proteinem a nov tvo ený z stával voln v krvi a byl i ve vysoké koncentraci vylu ován mo í. Naopak u UC je s-ca IX tém výhradn uvol ován do mo e. Jeho pr niku do krve brání u superficiálních tumor bazální membrána, odd lující nádorové bu ky od cév. To vysv tluje nep ítomnost s-ca IX v krvi. 26

27 Záv r Zhodnocením dosa ených výsledk jsme zjistili, e: 1) Dochází k uvol ování s-ca IX do média b hem kultivace CA IX pozitivních nádorových bun ných experimentálních kultur. 2) Solubilní forma CA IX je men í o intracytoplasmatický úsek a transmembránovou oblast. Na Western blotu se zobrazuje jako dva prou ky o molekulové hmotnosti 54 a 50 kda proti CA IX, která má molekulovou hmotnost 58 a 54 kda. 3) Koncentrace s-ca IX v kultiva ním médiu experimentálních kultur se pohybují mezi ng/ml. 4) Krátkodob p e ívající kultury lidských RCC uvol ují CA IX jako s-ca IX do kultiva ního média ve stejné koncentraci jako stabilní linie nádorových bun k. 5) Solubilní CA IX (s-ca IX) je stanovitelná v RCC souboru v séru u 74,3 % a v mo i u 63,3 %. V UC skupin v mo i byla zji t na s-ca IX u 69,6 % pacient av ak v séru jsou u této skupiny koncentrace s-ca IX u superficiálních nádor negativní. 6) Po chirurgickém odstran ní nádoru ledviny dochází k rychlému poklesu koncentrace s-ca IX v séru s polo asem 1-2 dny. 7) U RCC ani u UC velikost nádoru a grade statisticky významn neovliv uje koncetraci s-ca IX v séru a mo i. Bohu el z vý e citovaných technických d vod je hodnocení zatí eno chybou malých soubor. 8) s-ca IX není detekovatelná v krvi nebo séru zdravých dobrovolník. 9) K vhodnosti s-ca IX jako markeru RCC a UC se nelze z této práce vyjád it. K nalezení odpov di je nutné modifikovat vhodnou kvantitativní rutinní metodu ke stanovení s-ca IX a statisticky vyhodnotit v t í soubory nemocných. 27

28 Souhrn Práce se zabývá studiem karbonické anhydrázy IX, která je p ítomna na membránách bun k n kterých urologických nádor, jako mo ného nádorového markeru. Cílem studie bylo p edev ím: 1) vy et it uvol ování solubilní formy karbonické anhydrázy IX z bun k stabilních nádorových linií a z krátkodobých kultur lidských nádor do kultiva ního média, 2) stanovit koncentrace s-ca IX v t lních tekutinách u nemocných s RCC a UC, 3) zhodnotit vliv velikosti nádoru nebo gradeu na koncentrace s-ca IX a 4) pokusit se zhodnotit mo nost vyu ití stanovení s-ca IX jako mo ného markeru t chto nádor. Vytvo ili jsme dv skupiny: 1. nemocní s RCC, 2. nemocní s UC vývodných mo ových cest. V obou skupinách byly krom pacient s p íslu nými nádory testovány kontrolní skupiny zdravých dobrovolník a nemocných s nenádorovými onemocn ními urogenitálního traktu a non-rcc nádory. U v ech nemocných byla hodnocena velikost nádoru rtg zobrazovacími metodami (sono, CT, NMR), endoskopicky nebo zm ením tumoru p i patologickém vy et ení preparátu. K pr kazu CA IX antigenu ve vzorcích nádor jsme pou ili imunohistochemické barvení pomocí monoklonální protilátky MAb M75. V extraktech z nádor a t lních tekutinách jsme koncentraci CA IX a s-ca IX stanovovali metodou western blot nebo ELISA. Výsledky: V 1. skupin jsme v séru zjistili s-ca IX pouze v podskupin s prokázaným RCC. Z 35 vzork jich bylo 26 (74,3 %) pozitivních. V mo i v podskupin s RCC byl s-ca IX protein prokázán u 19 (63,3 %) z 30 vzork. V kontrolní skupin byly v echny vzorky s-ca IX negativní. Ve 2. skupin byl UC histologicky prokázán u 23 nemocných. Pozitivní nález s- CA IX v mo i byl u 16 z nich (69,6%). Fale n negativní nález s-ca IX byl u 7 (30,4%) nemocných. Sérové koncentrace s-ca IX byly u v ech UC pozitivních negativní. V kontrolní skupin byly v echny vzorky a na jeden negativní. Vliv velikosti nádoru nebo jeho gradeu na koncentrace s-ca IX jsme neprokázali. Zhodnocením dosa ených výsledk jsme zjistili, e: 1) Dochází k uvol ování s-ca IX do média b hem kultivace CA IX pozitivních nádorových bun ných experimentálních kultur. Tato solubilní forma CA IX je men í o intracytoplasmatický úsek a transmembránovou oblast. Na Western 28

29 blotu se zobrazuje jako dva prou ky o molekulové hmotnosti 54 a 50 kda proti CA IX, která má molekulovou hmotnost 58 a 54 kda. 2) Koncentrace s-ca IX v kultiva ním médiu experimentálních kultur se pohybují mezi ng/ml. 3) Krátkodob p e ívající kultury lidských RCC uvol ují CA IX jako s-ca IX do kultiva ního média ve stejné koncentraci jako experimentální kultury. 4) Solubilní CA IX je stanovitelná v RCC souboru v séru u 74,3 %, v mo i u 63,3 % pacient a v UC skupin v mo i u 69,6 % pacient. V séru jsou u této skupiny koncentrace s-ca IX negativní. 5) Po chirurgickém odstran ní nádoru ledviny dochází k rychlému poklesu koncentrace s-ca IX v séru s polo asem 1-2 dny. 6) U RCC velikost nádoru a grade statisticky významn neovliv uje koncetraci s- CA IX v tká ových tekutinách. U UC mnohem men í nádory (ve srovnání s RCC) produkují do mo e prokazatelné mno ství s-ca IX, nebo antigen se neztrácí v krevním ob hu ani p i filtraci ledvinami. Velikost a grade op t významn neovliv ují koncentraci s-ca IX v mo i. Bohu el z vý e citovaných technických d vod je hodnocení zatí enou chybou malých soubor. 7) s-ca IX není detekovatelná v krvi nebo séru zdravých dobrovolník. 8) K vhodnosti s-ca IX jako markeru RCC a UC se nelze z této práce vyjád it. K nalezení odpov di je nutné modifikovat vhodnou kvantitativní rutinní metodu ke stanovení s-ca IX a statisticky vyhodnotit v t í soubory nemocných. 29

30 Pod kování D kuji RNDr. J. Závadovi, DrSc a RNDr. Z. Závadové z Ústavu organické chemie a biochemie AV R za metodické vedení, zpracování vzork a recenzi rukopis. Dále d kuji svému koliteli docentu MUDr. Ivanu Kawaciukovi, CSc. a profesoru MUDr. Marku Babjukovi, CSc. za odbornou pomoc a pomoc p i zpracování této práce. MUDr.. Veselému, PhD. z Urologické kliniky UK 2.LF a FNM, Praha d kuji za statistické zpracování výsledk a MUDr. P. kapovi z Kliniky patologie a molekulární medicíny UK 2.LF a FNM, Praha za mikroskopická hodnocení preparát. Obrázky 1 a 2 byly p evzaty a upraveny z práce Pastoreková S., Zavada J: Carbonic anhydrase IX (CA IX) as a potential target for cancer therapy publikované v Cancer Therapy, 2004, 2, , se svolením autor. 30

31 Pou itá literatura 1. Kau itz J: Rádioimunoanalýza v onkológii. Veda, vydavatelstvo SAV, Dienstbier Z: Mo nosti nádorové diagnostiky za pou ití tzv. nádorových marker. Praktický léka 1993;73: Tripp BC, Smith K, Ferry JG: Carbonic anhydrase: new insights for an ancient enzyme. J Biol Chem 2001;276: Pastorekova S, Parkkila S, Pastorek J, Supuran C.T: Carbonic anhydrases: Current state of the art, therapeutic applications and future prospects. J Enz Inhib Med Chem 2004;19: Zavada J, Zavadová Z, Malir A, Kocent A:VSV psedotype produced in cell line derived from human mammary carcinoma. Nature New Biol 1972;240: Pastorekova S, Závadová Z, Kostal M, Babusikova O, Závada J:A novel quasiviral agent, MaTu, is a two-component system. Virology 1992;187: Zavada J, Zavadova Z: An unusual transmissible agent MaTu. Arch Virol 1991;118: Reiserova L, Kaluzova M, Kaluz S, Willis AC, Zavada J, Zavodska E, Zavadova Z, Ciampor F, Pastorek J, Pastorekova S. Identification of MaTu MX agent as a new strain of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and serological indication of horizontal spread of LCMV in human population. Virology 1999;257: Opavsky R, Pastorekova S, Zelnik V, Gibadulinova A, Stanbridge EJ, Zavada J, Kettmann R, Pastorek J. Human MN/CA 9 gene, a novel member of the carbonic anhydrase family: structure and exon to protein domain relationships. Genomics 1996;33: Hewett-Emmett D., Tashian R.E:Functional diversity, conservation, and convergence in the evolution of the alpha-, beta-, and gamma-carbonic anhydrase gene families. Mol Phylogenet Evol 1996;5: Pastorekova S, Parkkila S, Parkkila AK, Opavský R, Zelnik V, Saarnio J, Pastorek J: Carbonic anhydrase IX, MN/CA IX: Analysis of stomach complementary DNA sequence and expression in human and rat alimentary tracts. Gastroenterology 1997; 112: Saarnio J, Parkkila S, Parkkila AK, Waheed A, Casey MC, Zhou XY, Pastoreková S, Pastorek J, Karttunen T, Haukipuro K, Kairaluoma MI, Sly WS. 31

32 Immunochemistry of carbonic anhydrase isozyme IX (MN/CA IX) in human gut reveals polarized expression in the epithelial cells with the highest proliferative capacity. J Histochem Cytochem 1998;46: Kivelä AJ, Parkkila S, Saarnio J, Karttunen TJ, Kivelä J, Parkkila AK, Pastoreková S, Pastorek J, Waheed A, Sly WS, Rajaniemi H. Expression of transmembrane carbonic anhydrase isoenzymes IX and XII in normal human pancreas and pancreatic tumours. Histochem Cell Biol 2000;114: Karhumaa P, Kaunisto K, Parkkila S, Waheed A, Pastoreková S, Pastorek J, Sly WS, Rajaniemi H. Expression of the transmembrane carbonic anhydrases, CA IX and CA XII, in the human male excurrent ducts. Mol Hum Reprod 2001;7: Ivanov S, Liao SY, Ivanova A, Danilkovitch-Miagkova A, Tarasova N, Weirich G, Merrill MJ, Proescholdt MA, Oldfield EH, Lee J, Zavada J, Waheed A, Sly W, Lerman MI, Stanbridge EJ. Expression of hypoxia-inducible cell-surface transmembrane carbonic anhydrases in human cancer. Am J Pathol 2001;158: Liao SY, Brewer C, Závada J, Pastorek J, Pastorekova S, Manetta A, Berman ML, DiSaia PJ, Stanbridge EJ. Identification of MN antigen as a diagnostic biomarker of cervical intraepithelial sqamous and glandular neoplasia and cervical carcinomas. Am J Pathol 1994;145: Liao SY, Stanbridge EJ. Expression of MN/CA9 protein in Papanicolaou smears containing atypical glandular cells of undetermined significance is a diagnostic biomarker of cervical dysplasia and neoplasia. Cancer 2000;88: Liao SY, Aurelio ON, Jan K, Zavada J, Stanbridge EJ. Identification of the MN/CA9 protein as a reliable diagnostic biomarker of clear cell carcinoma of the kidney. Cancer Res 1997; 57: Oosterwijk E, Ruiter DJ, Hoedemaeker PJ, Pauwels EK, Jonas U, Zwartendijk J, Warnaar SO. Monoclonal antibody G250 recognizes a determinant present in renal-cell carcinoma and absent from normal kidney. Int J Cancer 1986;38: Oosterwijk E, Debruyne FM. Radiolabeled monoclonal antibody G250 in renalcell carcinoma. World J Urol 1995;13:

33 21. Uemura H, Kitagawa H, Hirao Y et al. Expression of tumor-associated antigen MN/G250 in urologic carcinoma: Potential therapeutic target. J Urol 1997;157 (Suppl.): McKiernan JM, Buttyan R, Bander NH, Stifelman MD, Katz AE, Chen MW, Olsson CA, Sawczuk IS. Expression of the tumor-associated gene MN: A potential biomarker for human renal cell carcinoma. Cancer Res 1997;57: Turner JR, Odze RD, Crum CP, Resnick MB. MN antigen expression in normal, preneoplastic, and neoplastic esophagus: A clinicopathological study of a new cancerassociated biomarker. Hum Pathol 1997;28: Vermylen P, Roufosse C, Burny A, Verhest A, Bosschaerts T, Pastorekova S, Ninane V, Sculier JP. Carbonic anhydrase IX antigen differentiates between preneoplastic lesions in non-small-cell lung carcinoma. Eur Respir J 1999;14: Bartosová M, Parkkila S, Pohlodek K, Karttunen TJ, Galbavý S, Mucha V, Harris AL, Pastorek J, Pastoreková S. Expression of carbonic anhydrase IX in breast is associated with malignant tissues and is related to overexpression of cerbb2. J Pathol 2002;197: Saarnio J, Parkkila S, Parkkila AK, Pastorekova S, Haukipuro K, Pastorek J,Juvonen T,Karttunen TJ. Transmembrane carbonic anhydrase, MN/CA XI, is a potential biomarker for biliary tumors. J Hepatol 2001;35: Leppilampi M, Saarnio J, Tuomo j, Kivela J, Pastorekova S, Pastorek J, Waheeh A, Sly WS, Parkkila S. Carbonic anhydrase isoenzymes IX and XII in gastric Tumors. World J Gastroenterol 2003;9: Lieskovska J, Opavsky R, Zacikova L, Glasova M, Pastorek J, Pastorekova S: Study of in vitro conditions modulating expression of MN/CA IX protein in human cell lines derived from cervical carcinoma. Neoplasma 1999;46: Kaluz S, Kaluzova M, Opavsky R, Pastorekova S, Gibadulinova A, DEquiedt F, Kettmann R, Pastorek J. Transcriptional regulation of the MN/CA9 gene coding for the tumor-associated carbonic anhydrase IX. Identification and characterisation of a proximal silencer element. J Biol Chem 1999;274: Kaluzova M, Pastorekova S, Svastova E, Pastorek J, Stanbridge EJ, Kaluz S: Characterization of the MN/CA 9 promoter proximal region: a role for 33

34 specificity protein (SP) and activator protein 1 (AP1) factors. Biocem J 2001;359: Wykoff CC, Beasley NJ, Watson PH, Turner KJ, Pastorek J, Sibtain A, Wilson GD, Turley H, Talks KL, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ, Harris AL. Hypoxia inducible expression of tumor-associated carbonic anhydrases. Cancer Res 2000;60: Epstein ACR, Gleadle JM, McNeil LA, Hewitson KS, O Rourke J, Mole DR, Mukherji M, Metzen E, Wilson MI,Dhanda A, Tian YM, Masson N, Hamilton DL, Jaakkola P, Barstead R, Hodgkin J, Maxwell PH, Pugh CW, Schofield CJ, Ratclife PJ. C. elegans EGL-9 and mammalia homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 107, 2001, Mahon PC, Hirota K, Semenza GL. FIH-1: a novel protein that interacts with HIF-1alfa and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev 2001;15: Semenza G.L. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 2003;3: Ivanov SV, Kuzmin I, Wei MH, Pack S, Geil L, Johnson BE, Stanbridge EJ, Lerman MI. Down-regulation of transmembrane carbonic anhydrases in renal cell carcinoma cell lines by wild type von Hippel-Lindau transgenes. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: Ashida S, Nishimori I, Tanimura M, Onishi S, Shuin T. Effects of von Hippel- Lindau gene mutation and methylation status on expression of transmembrane carbonic anhydrases in renal cell carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2002;128: Jakubickova L, Biesova Z, Pastorekova S, Kettmann R, Pastorek J. Methylation of the CA9 promoter can modulate expression of the tumor-associated carbonic anhydrase IX in dense carcinoma cell lines. Int J Oncol 2005;26: Wykoff CC, Beasley NJ, Watson PH, Campo L, Chia SK, English R, Pastorek J, Sly WS, Ratcliffe PJ, Harris AL. Expression of the hypoxia-inducible and tumor-associated carbonic anhydrases in ductal carcinoma in situ of the breast. Am J Pathol 2001;158: Chia SK, Wykoff CC, Watson PH, Han C, Leek RD, Pastorek J, Barter KC, Ratcliffe PJ, Harris AL. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated 34

35 marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol 2001;19: Giatromanolaki A, Koukourakis MI, Sivridis E, Pastorek J,Wykoff CC, Gatter KC, Harris AL. Expression of hypoxia-inducible carbonic anhydrase-9 relates to angiogenic pathways and independently to poor outcome in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2001;61: Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, Simopoulos K, Pastorek J, Wykoff CC, Gatter KC, Harris AL. Hypoxia-regulated carbonic anhydrase-9 (CA9) relates to poor vascularization and resistance of squamous cell head and neck cancer to chemoradiotherapy. Clin Cancer Res 2001;7: Loncaster JA, Harris AL, Davidson SE, Logue JP, Hunter RD, Wykoff CC, Pastorek J, Ratcliffe P, Stratford IJ, West CML. Carbonic anhydrase IX expression, a potential new intrinsic marker of hypoxia: correlations with tumour oxygen measurements and prognosis in locally advanced carcinoma of the cervix. Cancer Res 2001;61: Olive PL, Aquino-Parsons C, MacPhail SH, Laio SY, Raleigh JA, Lerman MI, Stanbridge EJ. Carbonic anhydrase 9 as an endogenous marker for hypoxic cells in cervical cancor. Cancer Res 2001;61: Beasley NJP, Wykoff CC, Watson PH, Leek R, Turley H, Barter K, Pastorek J, Cox GJ, Ratcliffe P, Harris AL. Carbonic anhydrase IX, an endogenous hypoxia marker, expression in head and neck squamous cell carcinoma and its relationship to hypoxia, necrosis and microvessel density. Cancer Res 2001;61: Turner KJ, Crew JP, Wykoff CC, Watson PH, Poulsom R, Pastorek J, Ratcliffe PJ, Cranston D and Harris AL. The hypoxia-inducible genes VEGF and CA9 are differentially regulated in superficial vs invasive bladder cancer. Br J Cancer 2002;86: Swinson DE, Jones JL, Richardson D, Wykoff C, Turley H, Pastorek J, Taub N, Harris AL, O'Byrne KJ. Carbonic anhydrase IX expression, a novel surrogate marker of tumor hypoxia, is associated with a poor prognosis in non-smallcell lung cancer. J Clin Oncol 2003;21: Vukovic V, Haugland HK, Nicklee T, Morrison AJ, Hedley DW. Hypoxiainducible factor-1 is an intrinsic marker for hypoxia in cervical cancer xenografts. Cancer Res 2001;61:

36 48. Ortova-Gut M, Parkkila S, Vernerová Z, Rohde E, Závada J, Höcker M, Pastorek J, Karttunen T, Gibadulinová A, Závadová Z, Knobeloch KP, Wiedenmann B, Svoboda J, Horak I, Pastoreková S. Gastric hyperplasia in mice with targeted disruption of the carbonic anhydrase gene Car9. Gastroenterology 2002;123: Zavada J, Zavadova Z, Pastorek J, Biesova Z, Jezek J, Velek J. Human tumourassociated cell adhesion protein MN/CA IX: identification of M75 epitope and of the region mediating cell adhesion. Brit J Cancer 2000;82: de la Taille A, Katz A, Cao Y, McKiernan J, Buttyan R, Burchardt M, Burchardt T, Hayek O, Olsson CA, Chopin DK, Sawczuk IS. Blood-based RT-PCR assays of MN/CA9 or PSMA: Clinical application in renal cancer patients. Urology 2000;56: Kawaciuk I: Prognóza karcinomu ledviny, Galén, Praha Aso Y, Homma Y: A survey on incidental renal cell carcinoma in Japan. J Urol 1992;147: Konnak JW, Grossman HB. Renal cell carcinoma as an incidental finding. J Urol 1985;134: Rodríguez-Rubio FI, Díez-Caballero F, Martín-Marquina A, Abad JI, Berián JM. Incidentally detected renal cell carcinoma. Brit J Urol 1996;78: Nakano E, Iwasaki A, Seguchi T, Kokado Y, Yoshioka T, Sugao H, Koide T. Incidentally diagnosed renal cell carcinomas. Eur Urol 1992;21: Hellsten S, Johnsen J, Berge T, Lindell F. Clinically unrecognised renal cell carcinoma. Eur Urol 1990;18: Ozen H, Colowick A, Freiha FS. Incidentally discovered solid renal masses: what are they? Brit J Urol 1993;72: Tsui KH, Shvarts O, Smith RB, Figlin R, de Kernion JB, Belldegrun A. Renal cell carcinoma: Prognostic significance of incidentally detected tumors. J Urol 2000;163: Thompson IM, Peek M. Improvement in survival of patients with renal cell carcinoma - the role of serendipitously detected tumor. J Urol 1988;140: Yamaguchi K, Tominaga T, Nishimura Y. Clinical study on incidental renal carcinoma. Hinyokika-Kijo 1995;41: Bretheau D, Lechevallier E, Eghazarian C, Grisoni V, Coulange C. Prognostic significance of incidental renal cell carcinoma. Eur Urol 1995;27:

37 62. Kawaciuk I, Hyrsl L, Dusek P, Jarolim L, Schmidt M, Kaliska V, Chocholaty M, Vesely S. Influence of tumour-associated symptoms on the prognosis of patients with renal cell carcinoma. Scand J Urol Nephrol 2008;42: IF Mihara S, Kuroda K, Yoshioka R, Koyama W. Early detection of renal cell carcinoma by ultrasonographic screening: based on the results of 13 years screening in Japan. Ultrasound Med Biol 1999;25: Tsuboi N, Horiuchi K, Kimura G, Kondoh Y, Yoshida K, Nishimura T, Akimoto M, Miyashita T, Subosawa T. Renal masses detected by general health checkup. Int J Urol 2000;7: McKiernan JM, Buttyan R, Bander NH, de la Taille A, Stifelman MD, Emanuel ER, Bagiella E, Rubin MA, Katz AE, Olsson CA, Sawczuk IS. The detection of renal cell carcinoma cells in the peripheral blood with an enhanced reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for MN/CA9. Cancer 1999;86: Gilbert SM, Whitson JM, Mansukhani M, Buttyan R, Benson MC, Olsson CA, Sawczuk IS, McKiernan JM. Detection of carbonic anhydrase-9 gene expression in peripheral blood cells predicts risk od disease recurrence in patients with renal cortical tumors. Urology 2006;67: Williams CB, Mitchell JP: Carcinoma of the ureter--a review of 54 cases. Brit J Urol 1973;45: van Rhijn BWG, van der Poel HG, van der Kwast TH. Urine markers for bladder cancer surveillance: a systematic review. Eur Urol 2005;47: Babjuk M, Kostirová M, Mudra K, Pecher S, Smolova H, Pecen L, Ibrahim Z, Dvoracek J, Jarolim L, Novak J, Zima T. Qualitative and quantitative detection of urinary human complement factor H-related protein (BTA stat and BTA TRAK) and fragments of cytokeratins 8, 18 (UBC rapid and UBC IRMA) as markers for transitional cell carcinoma of the bladder. Eur Urol 2002;41: Vrooman OPJ, Witjes A. Urinary markers in Bladder Cancer. Eur Urol 2008; 53: Tijssen P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays. Elsevier, Amsterdam, Zat'ovicová M, Tarábková K, Svastová E, Gibadulinová A, Mucha V, Jakubícková L, Biesová Z, Rafajová M, Ortova Gut M, Parkkila S, Parkkila AK, 37

38 Waheed A, Sly WS, Horak I, Pastorek J, Pastoreková S. Monoclonal antibodies generated in carbonic anhydrase IX deficient mice recognize different domains of tumor-associated hypoxia-induced carbonic anhydrase IX. J Immunol Meth 2003;282: Zavada J, Zavadova Z, Zatovicova M, Hyrsl, Kawaciuk I: Soluble form of carbonic anhydrase IX (CA IX) in the serum and urine of renal carcinoma patients. Brit J Cancer 2003;89: Li G, Feng G, Gentil-Perret A, Genin C, Tostain J. Serum carbonic anhydrase IX level is associated with postoperative recurrence of conventional renal cell cancer. J.Urol 2008;180: Zhou GX, Ireland J, Rayman P, Finke J, Zhou M. (2010) Qantification of carbonic anhydrase IX expression in serum and tissue of renal cell carcinoma patients using enzyme-linked immunosorbent assay: Prognostic and diagnostics protocols. Urology 2010;75: Li Y, Wang H, Oosterwijk E, Selman Y, Mira JC, Medrano T, Shiverick KT, Frost S. Antibody specific detection of CA IX in breast and prostate cancers. Biochim Biophys Res Comm 2009;386: Pastorekova S, Zavada J. Carbonic anhydrase (CA IX) as a potential target for cancer therapy. Review article. Cancer Ther 2004;2: Pastorekova S, Parkkila S, Zavada J. Tumor associated carbonic anhydrases and their clinical significance. Adv Clin Chem 2006;42: Harris AL. Hypoxia a key regulatory factor in tumour growth. Nature Reviews Cancer 2002;2: Zavadova Z, Zavada J. Carbonic anhydrase IX (CA IX) mediates tumor cell interactions with microenvironment. Oncol Reports 2005;13:

39 Seznam p íloh P íloha. 1: Rozd lení karbonických anhydráz dle lokalizace a CA aktivity (obrázek) P íloha. 2: Struktura CA IX. SP - signální peptid, PG - proteoglykanová doména, CA doména karbonické anhydrázy, TM transmembránová oblast, IC intracelulární segment. (obrázek) P íloha. 3: RCC (C64) incidence a mortalita. Zdroj ÚZIS, Praha (graf) P íloha. 4: Uroteliální karcinom mo ového m chý e (C67) incidence a mortalita. Zdroj ÚZIS, Praha 2008.(graf) P íloha. 5: Tabulka nevýhody. (tabulka) 1: P ehled UC marker, senzitivita, specificita, výhody, P íloha. 6: Zastoupení proband v souboru RCC. (graf) P íloha. 7: Graf 4: Zastoupení proband v souboru UC. (graf) P íloha. 8: Zastoupení pt kategorií v podskupin RCC. (graf) P íloha. 9: Zastoupení G kategorií v podskupin RCC. (graf) P íloha. 10: Western blot, stanovení CA IX v bun ném extraktu a kultiva ním médiu RCC a kontrolních tkání. HT29: M = médium, C = bun ný extrakt. K1, K2 = kontroly,. 27 = angiomyolipom, ostatní RCC. (obrázek) P íloha. 11: CA IX protein z kultiva ního média krátkodobých kultur RCC (dv r zné protilátky). HT 29 bun ná linie ca coli, M médium, C bun ný extrakt, 1-6 médium z krátkodobých RCC kultur. (obrázek) P íloha. 12: CA IX protein v séru RCC nemocných. (obrázek) P íloha. 13: s-ca IX v séru nemocných p ed a po nefrektomii (B=p ed, A=po nefrektomii). (obrázek) P íloha. 14: Koncentrace CA IX a s-ca IX v r zných materiálech. (tabulka) P íloha. 15: Senzitivita, specificita, PPV a NPV pro CA IX v souboru RCC. (tabulka) P íloha. 16: Zastoupení pt kategorií v podskupin UC. (graf) P íloha. 17: Zastoupení G kategorií v podskupin UC. (graf) P íloha. 18: Koncentrace s-ca IX v mo i v souboru nemocných s histologicky prokázaným UC a zdravých kontrol. (graf) P íloha. 19: Porovnání výsledk mikroskopického vy et ení (barvení hematoxylinemeosinem), imunohistochemického vy et ení CA IX (IHC) a western blot (WB). (tabulka) P íloha. 20: UC mo ového m chý e, grade 2 (zv t ení 200x), barvení hematoxylineosin. (obrázek) P íloha. 21: UC mo ového m chý e, grade 2 (zv t ení 200x), imunohistochemické barvení na CAIX, barví se hlavn v povrchových ástech papilárních nádorových struktur (skóre 2). (obrázek) P íloha. 22: Senzitivita, specificita, PPV a NPV pro s-ca IX v souboru UC. (tabulka) P íloha. 23: CA IX protein ze séra RCC nemocných a zdravých kontrol (jedna protilátka). (obrázek) P íloha. 24: CA IX protein koncentrovaný ze séra RCC nemocných (dv r zné protilátky). (obrázek) 39

40 P ílohy P íloha. 1: Rozd lení karbonických anhydráz dle lokalizace a CA aktivity (obrázek) P íloha. 2: Struktura CA IX. SP - signální peptid, PG - proteoglykanová doména, CA doména karbonické anhydrázy, TM transmembránová oblast, IC intracelulární segment. (obrázek) 40

41 P íloha. 3: RCC (C64) incidence a mortalita. Zdroj ÚZIS, Praha (graf) Incidence Mortalita Po et nemocných/ Rok 41

42 P íloha. 4: Uroteliální karcinom mo ového m chý e (C67) incidence a mortalita. Zdroj ÚZIS, Praha 2008.(graf) Incience Mortalita 20 Po et nemocných/ Rok 42

43 P íloha. 5: P ehled UC marker, senzitivita, specificita, výhody, nevýhody. (tabulka) Marker Senzitivita (%) Specificita (%) Výhody Nevýhody FISH BCG neovliv uje MSA Detekce i low-grade tumor ImmunoCyt 38, ,2 Telomeráza Senzitivita BTA-TRAK BTA-stat On bench test HA, HA-Eza ,4 Detekce i low-grade tumor Neovlivn na BCG, NMP22 49, ,3 detekce i low-grade tumor BLCA , Senzitivita, specificita CYFRA , Survivin Senzitivita, specificita Drahá,náro ná provedením Drahá, náro ná provedením Vysoká variabilita hodnocení Ovlivn na zán tem, v kem Ovlivn na benig. genitourin. onemocn ními Ovlivn na benig. genitourin. onemocn ními Nutné dal í studie Nejasn definována normální hodnota Nutné dal í studie Ovlivn na benig. genitourin. onemocn ními, i.ves.terapií Nutné dal í studie 43

44 P íloha. 6: Zastoupení proband v souboru RCC. (graf) RCC Non-RCC tumory 4 15 Nenádorová urologická onemocn ní Zdravé kontroly P íloha. 7: Zastoupení proband v souboru UC. (graf) UC ves.urin. UC pelvis renalis Zdravé kontroly

45 P íloha. 8: Zastoupení pt kategorií v podskupin RCC. (graf) Po et pt1a pt1b pt2 pt3a pt3b P íloha. 9: Zastoupení G kategorií v podskupin RCC. (graf) Po et G1 G2 G3 G4 45

46 P íloha. 10: Western blot, stanovení CA IX v bun ném extraktu a kultiva ním médiu RCC a kontrolních tkání. HT29: M = médium, C = bun ný extrakt. K1, K2 = kontroly,. 27 = angiomyolipom, ostatní RCC. (obrázek) P íloha. 11: CA IX protein z kultiva ního média krátkodobých kultur RCC (dv r zné protilátky). HT 29 bun ná linie ca coli, M médium, C bun ný extrakt, 1-6 médium z krátkodobých RCC kultur. (obrázek) 46

47 P íloha. 12: CA IX protein v séru RCC nemocných. (obrázek) P íloha. 13: s-ca IX v séru nemocných p ed a po nefrektomii (B=p ed, A=po nefrektomii). (obrázek) 47

48 P íloha. 14: Koncentrace CA IX a s-ca IX v r zných materiálech. (tabulka) Materiál Koncentrace CA IX a s-ca IX HT29 bun ný extrakt 4 mgg -1 celkové bílkoviny erstvý extrakt RCC 0,5-2 mgg -1 celkové bílkoviny Extrakt normální ledviny nedetekovatelný HT29 TC medium ngml -1 RCC TC media ngml -1 Séra RCC pacient 20 pg - 3,6 ngml -1 Kontrolní séra 5-25 pgml -1 Mo RCC pacient 20 pg - 3 ngml -1 Kontrolní mo 0-2 pgml -1 P íloha. 15: Senzitivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota (PPV) a negativní prediktivní hodnota (NPV) pro CA IX v souboru RCC. (tabulka) CA IX sérum CA IX mo CA IX sérum+mo Senzitivita 60% 44% 77% Specificita 100% 100% 100% PPV 100% 100% 100% NPV 18% 14% 28% 48

49 P íloha. 16: Zastoupení pt kategorií v podskupin UC. (graf) Po et ptx pta pt1 pt2a pt2b pt3a pt3b pt4 P íloha. 17: Zastoupení G kategorií v podskupin UC. (graf) Po et G1 G2 G3 G4 1 49

50 P íloha. 18: Koncentrace s-ca IX v mo i v souboru nemocných s histologicky prokázaným UC a zdravých kontrol. (graf) UC + Kontroly Po et <1 1-4,9 5-9, , ,9 >40 < ,9 s-ca IX (pg/ml) P íloha. 19: Porovnání výsledk mikroskopického vy et ení (barvení hematoxylinem-eosinem), imunohistochemického vy et ení CA IX (IHC) a western blot (WB). (tabulka) Skupina Metoda Po et Histologie IHC WB * ND + 1 Celkem 23 * 12 - TCC a 1 - SCC ND neprovedeno pro malý vzorek 50

51 P íloha. 20: UC mo ového m chý e, grade 2 (zv t ení 200x), barvení hematoxylin-eosin. (obrázek) P íloha. 21: UC mo ového m chý e, grade 2 (zv t ení 200x), imunohistochemické barvení na CAIX, barví se hlavn v povrchových ástech papilárních nádorových struktur (skóre 2). (obrázek) 51

52 P íloha. 22: Senzitivita, specificita, PPV a NPV pro s-ca IX v souboru UC. (tabulka) s-ca IX mo Senzitivita 69% Specificita 22% PPV 69% NPV 22% P íloha. 23: CA IX protein ze séra RCC nemocných a zdravých kontrol (jedna protilátka). (obrázek) 52