Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici. Obsah THC v technickém konopí (Cannabis sativa) Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Obsah THC v technickém konopí (Cannabis sativa) Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Petra Krejčí, Ph.D. Vypracovala: Veronika Bílková Lednice 2008

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Obsah THC v technickém konopí (Cannabis sativa) vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne podpis. Bílková Veronika

3 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat vedoucí bakalářské práce Ing. Petře Krejčí, Ph.D. za ochotu, vstřícný přístup a cenné rady při koncepci bakalářské práce. Poděkování patří též Ing. Vlastimilu Hanušovi z Ústavu biologie rostlin za pomoc při laboratorních pracích. Také velmi děkuji paní Marii Široké z Konopářského svazu České republiky za veškerou velice ochotnou pomoc. Můj dík patří také všem, které jsem v průběhu vypracování bakalářské práce kontaktovala a kteří mi poradili a pomohli. V neposlední řadě patří můj velký dík mému manželovi za pomoc, podporu a vytvoření vhodných podmínek pro vypracování předkládané bakalářské práce.

4 OBSAH 1. ÚVOD CÍL LITERÁRNÍ PŘEHLED PĚSTOVÁNÍ KONOPÍ V ČR HISTORIE A SOUČASNOST BOTANICKÉ ZAŘAZENÍ A POPIS ROSTLINY Charakteristika čeledi Cannabaceae Charakteristika rodu Cannabis Popis druhu Cannabis sativa Morfologie a anatomie konopí setého Vývojové fáze konopí setého OBSAHOVÉ LÁTKY V ROSTLINĚ KONOPÍ Chemické složky konopí Přehled několika hlavních kanabinoidů Biogeneze kanabinoidů Ovlivnění produkce kanabinoidů životním prostředím rostliny ZÁSADY PRO PĚSTOVÁNÍ KONOPÍ SETÉHO Nároky na stanoviště Zařazení konopí v osevním postupu Agrotechnika Hnojení Ochrana rostlin Sklizeň LEGISLATIVA PRO PĚSTITELE KONOPÍ SETÉHO V ČR STRUČNÝ PŘEHLED VYUŽITÍ KONOPÍ SETÉHO MATERIÁL A METODY ODRŮDY KONOPÍ SETÉHO Odrůda BENIKO Odrůda FEDORA Odrůda FELINA Odrůda FUTURA Odrůda BIALOBRZESKIE Odrůda JUSO Odrůda FIBROL Odrůda MONOICA LABORATORNÍ STANOVENÍ OBSAHU THC Obecný princip chromatografie Plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) Vlastní metodika stanovení THC v dodaných vzorcích konopí setého VÝSLEDKY PRÁCE DISKUZE A ZÁVĚR ABSTRAKT SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHA... 44

5 1. ÚVOD Konopí seté (nazývané též konopí technické) je v dnešní době jedna z nejdiskutovanějších polních plodin ve světě. Je to všestranně využitelná přadná, olejnatá a energetická plodina, která by mohla nahradit mnohé syntetické suroviny, jejichž výroba zatěžuje životní prostředí. Konopí je dobrá protierozní rostlina a také je ji možno využít k rekultivaci. Bohužel veřejnost díky malé informovanosti často zaměňuje konopí seté (Cannabis sativa L.) s jeho příbuzným konopím indickým (Cannabis indica Lm). Díky tomu podléhá pěstování konopí setého přísné legislativě a je často mylně spojováno s drogovou problematikou. Konopí se v Čechách pěstovalo po staletí, ale roce 1956 bylo pěstování konopí zcela přerušeno. K jeho obnově došlo až na konci 90. let 20. století. V současné době se každým rokem zvětšují výměry osevních ploch a opět roste zájem o konopí seté mezi pěstiteli a zpracovateli z různých průmyslových odvětví v ČR i ve světě. Konopí je málo náchylné na poškození chorobami a škůdci a nemá větší problémy se zaplevelením. To vše tedy znamená snížení nákladů pro pěstitele a menší ekologickou zátěž životního prostředí. Konopí je taktéž velmi dobře přizpůsobené klimatickým podmínkám mírného (tedy našeho) pásma, je možné ho pěstovat všude s výjimkou oblastí trvale zamokřených nebo trvale vysušených. Navíc je to rostlina s největším výnosem vlákna, kterou je možno v Evropě pěstovat. Konopí by mohlo být alternativní variantou i pro bývalé pěstitele cukrové řepy i vzhledem k tomu, že v dnešní době vláda ČR schválila návrh ministra zemědělství o podpoře bývalých pěstitelů cukrové řepy. Návrh a dotace (z 80 % financované z EU) mají za cíl motivovat pěstitele na přechod k pěstování alternativních plodin a tudíž konopí seté by pro tyto pěstitele mohlo být zvažovanou plodinou číslo jedna. 5

6 2. CÍL Cílem bakalářské práce bylo zpracovat literární přehled o pěstování konopí setého v ČR, především se zaměřením na historii, dnešní způsoby kultivace a využití této plodiny v našich podmínkách a v praktické části provést laboratorní stanovení obsahu THC v odrůdách konopí setého, dodaných společností Agritec, výzkum, šlechtění a služby, s.r.o. Šumperk. Výsledky budou srovnány s hodnotami uvedenými v platné legislativě a vyhodnoceny. 6

7 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Pěstování konopí v ČR historie a současnost Konopí seté se v Čechách pěstovalo po staletí, což je mimo jiné nepřímo doloženo místními jmény jako např. Konopiště a Konopná. Konopí nebylo nikdy pěstováno jako hlavní plodina, ale bylo pěstováno v malém rozsahu pro domácí spotřebu a zpracování. V minulosti se vlákno využívalo hlavně na výrobu plachet a lanoví, ve válečném období sloužilo především pro potřeby armády. Fungovalo zde několik přádelen konopí (např. přádelna konopí Heinika dědici a spol. v Přerově) a také konopná provazárna. Zasažením zámořské konkurence do českého hospodářství ubýval rozsah pěstování konopí díky přílivu zámořských vláknin, zejména juty a sisálu. Následkem toho už v druhé polovině 19. století klesalo pěstování konopí a jeho místo postupně zaujímaly jiné průmyslové rostliny jako například cukrová řepa. Po druhé světové válce nastal velký úpadek pěstování konopí v důsledku převahy bavlny a umělých vláken. V roce 1956 bylo pěstování konopí v Československu zcela přerušeno a k jeho obnově došlo až na konci 90. let 20. století. V letech 1996 až 1999 probíhalo v rámci projektu Národní agentury pro zemědělský výzkum Mze ČR s názvem Pěstování konopí pro průmyslové využití jeho opětovné pokusné pěstování na plochách do 2 ha. V dalších letech se postupně rozšiřovaly plochy oseté konopím setým. (Tab.I) Rok Osevní plocha [ha] Tab. I Plochy konopí setého v ČR (Tošovská et al. 2007) Dle Konopářského svazu České republiky stoupla výměra osetých ploch v roce 2007 na 1600 ha. Zájem o pěstování konopí u nás i ve světě stále stoupá a to hlavně z důvodu, že je to nejvýnosnější vlákenná plodina, kterou je možno v Evropě pěstovat. Také to je plodina málo náchylná na poškození chorobami nebo škůdci a taktéž vzhledem k hustotě porostu a rychlosti růstu nemá větší problémy se zaplevelením. 7

8 To vše tedy znamená snížení nákladů pro pěstitele (menší náklady na chemické postřiky, pohonné hmoty, hnojiva). Také je dobré zdůraznit, že konopí je velmi hodnotná plodina v osevních postupech a mohla by se využít jako přerušovač obilného nebo řepkového sledu. Zvláště v podmínkách ekologického zemědělství, kdy je snaha o mnohaplodinové pěstování by tato plodina měla svoje místo. (Adamec 1923, Sladký 2004, Tošovská et al. 2007, www-7) 8

9 3.2 Botanické zařazení a popis rostliny Konopí seté (Cannabis sativa L.) patří do řádu Urticales (kopřivotvaré), čeledi Cannabaceae (konopovité), rodu Cannabis (konopí) Charakteristika čeledi Cannabaceae Jedná se o jednoleté až vytrvalé byliny s přímou nebo ovíjivou lodyhou. Listy vstřícné (v horní části lodyhy mnohdy střídavé), řapíkaté, palistnaté, dlanitě složené až celistvé. Květy jsou drobné, jednopohlavné, ve vrcholičnatých květenstvích. Rostliny dvoudomé, jen vzácně jednodomé. Prašníkové květy s pěti okvětními lístky a pěti tyčinkami, pestíkové květy s nepatrným srostlým okvětím. Plody jsou nažky. Konopovité zahrnují dva rody - Humulus (chmel) a Cannabis (konopí). Původně zástupci čeledi rostli v mírném pásmu Eurasie, ovšem pěstováním a zplaněním jsou rozšíření téměř po celém světě. (www-1) Charakteristika rodu Cannabis Jednoleté byliny. Lodyha přímá, tuhá, drsná, zejména v horní polovině chlupatá. Listy řapíkaté, v dolní části lodyhy zpravidla vstřícné, v horní nejčastěji střídavé, vzácněji všechny listy střídavé, ve střední části lodyhy 5-7četné. Květy jednopohlavné, rostliny dvoudomé, vzácněji jednodomé, prašníkové květy v řídkých úžlabních nebo koncových vrcholičnatých latách, pestíkové ve velmi redukovaných vrcholičnatých květenstvích (často jen jeden květ), skládajících husté, bohatě olistěné klasy. Nažky vejcovité až elipsoidní, slabě zploštělé, se 2 nevýraznými kýly, hladké, obalené chrupavčitými, dlouze zašpičatělými, na vnější straně krátce chlupatými listeny. Semena se srpovitě zahnutým zárodkem. Rozeznáváme 4 druhy konopí indické (Cannabis indica Lm.), konopí rumištní (Cannabis ruderalis JANISCH), konopí seté (Cannabis sativa L.) a Cannabis ruderalis x sativa SOJÁK. Původní v mírném pásmu Asie a druhotně rozšířené téměř po celém světě. (Hejný, Slavík 1997) 9

10 3.2.3 Popis druhu Cannabis sativa U tohoto druhu rozeznáváme 3 základní formy : 1) severní - nízké, v průměru 0,6-0,8m vysoké. Je rané, dozrává za dní. Malý výnos stonků i semen. U nás se nepěstuje. 2) jižní - původní typ konopí, dorůstá výšky 3,5-4m. Dozrává za dní. Dává vysoký výnos vlákna, ale relativně malý výnos semen 3) přechodný typ - vznikl křížením předchozích typů pro pěstování ve střední Evropě. Dorůstá výšky 1,7 2,5m (výjimečně až 3,5m). Dozrává za dní.dává dobrý výnos vlákna i semene. (Sladký 2004) Morfologie a anatomie konopí setého Typ rostliny Konopí seté je rostlina dvoudomá nebo jednodomá. Dvoudomé odrůdy konopí vytváří na 1 rostlině konopí samčí květenství a na druhé rostlině samičí květenství. Zastoupení obou rostlin je v porostu přibližně 47 % : 53 %. Jednodomé odrůdy vytváří na každé rostlině květenství samčí i samičí, ojediněle se mohou vyskytovat i typy hermafroditní, které jsou neplodné. (Jednodomé variety více vyhovují pěstitelským potřebám). Samčí rostliny (tzv. konopí poskonné) mají vyšší štíhlejší stonek, méně olistěný, listy jsou světlejší a méněčetné. Květenství je řídké u vrcholu rostliny, uspořádané v latu. Kvetou až o 14 dnů dříve a i dříve dozrávají. Ve stonku mají více vlákna vyšší kvality než rostliny samičí. Samičí rostliny (tzv. konopí hlavaté, klubkaté) jsou nižší, mají mohutnější stonek. Jsou více olistěné, s delší vegetační dobou. Květy jsou soustředěny v klubku na delší části stonku. Kořenový systém Rostlina vytváří vřetenovitý kořen sahající do hloubky cm, na sušších stanovištích i hlouběji. Je však málo rozvětvený. Postranní kořeny mají převážně vodorovný růst. Částečně lze považovat konopí za aridní rostlinu, do určité míry odolnou suchu. 10

11 Stonek Stonek je přímý, v horní polovině krátce větvený, podle typu konopí dosahuje délky až 3,5 m a tloušťky až 3 cm. Na spodu rostliny je kulatý, uprostřed pak šestihranný a v horní části čtyřhranný, často podélně rýhovaný. Je dutý, rozdělen na 7-15 internodií. Čím je menší počet internodií a jejich větší délka, tím je vlákno kvalitnější. Svazky vláken ve stonku konopí jsou rozmístěny nepravidelně, vytváří primární i sekundární vlákna. Primární vlákna jsou uložena ve vnějším kruhu lýkových svazků, sekundární vlákna ve vnitřním kruhu lýkových svazků. Na spodní části stonku jsou převážně sekundární vlákna, ve vrchní části jsou převážně primární vlákna. Sekundární vlákna jsou horší jakosti (kratší, dřevnatější, méně elastické). Konopné vlákno je pevné, avšak méně pružné. List Děložní listy jsou jednodílné, podlouhle oválné. Pravé listy jsou střídavé, dlanitě složené, 3-13četné, protáhlé, na konci zašpičatělé, s pilovitým okrajem. Na listech můžeme také nalézt největší množství žlaznatých trichomů s vyměšovací funkcí všeobecně nazývaných pryskyřičné žlázky. Tyto trichomy vyměšují kanabinoidy v tekuté, poněkud olejovité hmotě pryskyřici. Množství trichomů závisí na pozici listů na rostlině listy v dolní části rostliny obsahují méně žlázek než listy z vyšších partií. Větší hustotu žlázek také nalezneme na rubové straně listů. Žlázky se však nacházející na povrchu všech částí rostliny s výjimkou kořenů a semen. Rozmístění a hustota žlázek se mění také podle odrůdy. Listeny v samičích květenstvích obsahují ještě větší hustotu žlázek než listy a listence potom zcela největší množství kanabinoidů z celé rostliny. Tyto pokožkové žláznaté trichomy (žlázky) můžeme rozdělit do dvou skupin: a) přisedlé b) stopkovité. 11

12 a) Stopkovité žlázky se skládají z 1 nebo malé skupiny buněk vytvářejících růžici, která je nesena na 1 či vícebuněčné stopce. (obrázek č.1) Obrázek č.1 - Stopkovitá pryskyřičná žlázka (Ranalli 1999) b) Přisedlé žlázky nemají stopku a jejich vyměšovací buňky leží buď na povrchu nebo pod povrchem pokožky. Květ Květenství samčích rostlin je seskupeno v úžlabních latách na dlouhých stopkách vyrůstajících z úžlabí listů. Samčí květy jsou pětičetné (obrázek č.2-2). Květenství samičích rostlin je rozloženo v horní části rostliny v několika vrstvách a tvoří hustě olistěné, krátce složité hrozny tmavozelených kvítků (obrázek č.2-3,4). Konopí je rostlina cizosprašná (větrosnubná), pyl je přenášen na vzdálenost až 10 km. Na kališních lístcích, prašníku a tyčinkách v samčích pohlavních orgánech byly také nalezeny žlaznaté vyměšovací trichomy (pryskyřičné žlázky). Předpokládá se tedy, že i vyprodukovaný pyl může obsahovat kanabinoidy. Plod a semena Plodem je vejčitá jednosemenná nažka (obrázek č.2-5). Délka nažky 2 5mm, šířka 2 4 mm, tloušťka 2,3 2,8 mm. Barva semena šedozelená s jemným mramorováním. HTS je 8 26 g. Semena obsahují mnoho významných látek pro výživu člověka (kapitola 2.2.1,Tab. I). Semena brzy ztrácí klíčivost (třetím rokem o %). (Šnobl 2004, Sladký 2004, Dupal 1994, Ranalli 1999, Petříková et al. 2006) 12

13 Obrázek č.2 - Cannabis sativa - morfologie 1- část lodyhy samičí rostliny, 2-samčí květy, 3-svazeček samičích květů, 4-samičí květ, 5-nažka obalená listenem. (Novák 1961) Vývojové fáze konopí setého 1) Vzcházení vzcházení trvá 3-15 dnů, vyznačuje se pomalejším růstem lodyhy a silnějším růstem kořenů, nepříznivě jej ovlivňuje nedostatek vody, nízká teplota a půdní škraloup. 2) Fáze rychlého růstu - trvá od vytvoření 3. páru pravých lístků až do začátku tvorby květních pupenů. nastává silný růst lodyhy a zapojení porostu. 3) Nasazování pupenů - v této době jsou rovněž největší přírůstky lodyhy do délky. 4) Kvetení - u samčího květenství se otvírají první květy a postupně dozrávají prašníky, u samičího květenství vyrůstají 1-2 mm dlouhé blizny z plodolistu. V této růstové fázi se tvoří maximální množství vlákna. 5) Zrání semene - Zrání semene začíná po oplodnění blizny samičích rostlin, semeno dozrává odspodu k vrcholu květenství dnů. (Šnobl 2004) 13

14 3.3 Obsahové látky v rostlině konopí Chemické složky konopí Konopí obsahuje alespoň 483 chemických složek z nichž 66 jsou kanabinoidy. Byly identifikovány různé podtřídy kanabinoidů: -typy kanabigerolu (CBG) -typy kanabichromenu (CBC) -typy kanabidiolu (CBD) -typy 9 tetrahydrokanabinolu ( 9 -THC) -typy 8 -tetrahydrokanabinolu ( 8 -THC) -typy kanabinolu (CBN) a kanabinodiolu -jiné kanabinoidy (Fišar 2006) Množství a zastoupení kanabinoidů má zásadní vliv na to, jaké vlastnosti bude mít rostlina z hlediska psychoaktivních účinků. Kanabinoidy samy o sobě jsou látky bez vůně a pachu. Charakteristická vůně konopí pochází od asi pěti složek, tvořících pouze 5-10 % éterických olejů (mono- i vyšší terpeny, alfa a beta kimonem, myrtcen, beta-phalandren). Tyto látky jsou prchavé a unikají do vzduchu, takže časem jejich obsah v rostlinném materiálu klesá.(dupal 1994) Konopí ovšem neobsahuje jen kanabinoidy, ale řadu dalších chemických látek, z nichž některé jsou velmi cenné pro lidskou výživu. Pro příklad je v tab. II uvedena chemická analýza konopného semene. Tato práce je však zaměřena pouze na stanovení celkového obsahu THC, neboť jeho % zastoupení v rostlinách technického konopí je důležité pro pěstitele z hlediska legislativy. Podle norem EU není možné pěstovat rostliny s obsahem vyšším než 0,3 % THC (více o legislativních opatřeních v kapitole 3.5). 14

15 Tab.II - Analýza složení konopného semene Analýza složení konopného semene Bílkoviny 23% vitamin A 7,63 I.U. (karoten) Sacharidy 52,67% vitamin E 3 mg/100g z toho jednoduché 2,47% vitamin C 1,4 mg/100g cukry tuky 9% vitamin B1 0,9 mg/100g sodík (mg 100g) 17,70% vitamin B2 1,1 mg/100g dietní vláknina 35,35% vitamin B3 2,5 mg/100g kcal 384 vitamin B6 0,3 mg/100g kj 1606 hořčík 605,9 mg/100g nasyc. mastné 1% draslík 170 mg/100g kyseliny monoenové 1,10% sodík 22 mg/100g nenasycené mastné kyseliny polyenové nenasycené mastné kyseliny 6,50% vápník 168 mg/100g trans - formy mastných kyselin <0,1% chlorofyl 50 miliontin olej 30% voda (vlhkost) 10,40% popeloviny 5,60% Monokarboxylové Aminokyseliny nasycené mastné kyseliny (v % z tuku) kyselina máselná C4 <0,1% alanin 9 mg/g kyselina kapronová C6 <0,1% arginin 18,8 mg/g kyselina kaprylová C8 <0,1% cystin 19,8 mg/g kyselina kaprinová C10 <0,1% glutamin 34,8 mg/g kyselina laurová C12 <0,1% glycin 9,7 mg/g kyselina myristová C14 <0,1% histidin 2,5 mg/g kyselina palmitová C16 <0,1% isoleucin 1,5 mg/g kyselina stearová C18 <0,1% leucin 7,1 mg/g kyselina arachidová C20 <0,1% lysin 4,3 mg/g polyeonové nenasycené mastné kyseliny methionin 2 mg/g 15

16 kyselina linolová C18 (LK) kyselina linolenová C18 (LNK) kyselina gamalinolenová C18 (GLK) trans - formy mastných kyselin kyselina palmitoolejová C18 56% fenylalanin 3,5 mg/g 19,40% prolamin 7,3 mg/g 1,09% serin 8,6 mg/g treonin 3,7 mg/g <0,1% tryptofan 0,6 mg/g kyselina olejová C18 <0,1% tyrozin 5,8 mg/g kyselina gamalinolenová C18 (GLK) 1,09% valin 3 mg/g Pozn.: Analýza byla provedena na čerstvých semenech, které nebyly ničím ošetřeny ani sterilizovány. Konopí bylo vypěstováno oficiálně v ekologických podmínkách. (www - 2) Přehled několika hlavních kanabinoidů 1) 9 tetrahydrokanabinol ( 9 -THC) Obvykle uváděn pouze jako THC. Je to hlavní účinná halucinogenní složka Cannabis. Vyskytuje se prakticky ve všech odrůdách a kultivarech ovšem v různém množství od stop až po téměř 95 % ze všech obsažených kanabinoidů. Velmi pečlivě připravená droga může mít až 12 % THC v sušině (po odstranění semen a stonků), obvykle ovšem stačí podstatně méně. Obsah 1 % bývá považován za minimální, aby bylo možno hovořit o dostatečně potentní (psychogenně účinné) rostlině. (Dupal 1994) Obrázek č.2-9 tetrahydrokanabinol (C 21 H 30 O 2 ) (Fišar 2006) 16

17 2) Kanabidiol (CBD) Taktéž se vyskytuje téměř ve všech odrůdách, opět od téměř nulových hodnot po zhruba 95 % všech přítomných kanabinoidů. Nemá však psychoaktivní účinky, ačkoliv projevuje jisté sedativní, analgetické a také antibiotické vlastnosti. Ukazuje se, že CBD má tlumivé účinky a působí proti povzbudivým efektům THC. (Dupal 1994) Obrázek č.3 - kanabidiol (C 21 H 30 O 2 ) (Fišar 2006) 3) Kanabinol (CBN) CBN je degradačním produktem THC, není tedy produkován rostlinou a přirozeně se v pryskyřici nevyskytuje. Čerstvé vzorky rostlin ho obsahují minimálně. Kanabinol je velmi slabě psychotropní látka. (Dupal 1994) Obrázek č.4 - kanabinol (C 21 H 26 O 2 ) (Fišar 2006) Biogeneze kanabinoidů Dlouho se předpokládalo, že THC je v rostlině tvořeno z kanabidiolu (CBD), který je derivátem kanabigerolu (CBG). Výzkumy z roku 1995 však ukazují, že CBG je přímým prekurzorem v biosyntéze THC. Biosyntéza CBG vzniká reakcí jednoduchých sloučenin obsahujících terpenové jednotky, např. geranylpyrofosfát a kyselina olivetová. Sám kanabigerol je nepsychotropní látka. Z něho vzniklé kanabinoidy mají kyselou formu a také nemají psychoaktivní účinky (v čerstvém rostlinném materiálu jsou vesměs všechny kanabinoidy v této kyselé formě). Aplikace tepla (sušení, pečení,smažení ) odstraní karboxylové skupiny za vzniku oxidu uhličitého (dekarboxylace) a vzniká neutrální forma příslušného kanabinoidu, která již může být psychoaktivní. (Ranalli 1999, Fišar 2006, Dupal 1994). 17

18 3.3.5 Ovlivnění produkce kanabinoidů životním prostředím rostliny 1. Sucho THC je viskózní hydrofobní olej, který nemá sklony ke krystalizaci. Kanabinoidy jsou látky všeobecně málo těkavé. Lepivé pryskyřice produkované a vylučované na povrch rostliny jsou různými kombinacemi THC, kanabinoidů a různých terpenů a lze je považovat za analogii k látkám vytvářejících kutikulu kaktusů a jiných sukulentních rostlin, které slouží jako ochrana před výparem v suchém prostředí. Experimenty dokazují větší přítomnost pryskyřičných žlázek u rostlin pěstovaných v suchých oblastech a větší obsah kanabinoidů v pylu konopí při nižší vlhkosti. Byl zjištěn větší obsah THC u rostlin pěstovaných v kontinentálním podnebí než v podnebí přímořském v Itálii. Bylo také pokusně zjištěno, že čím horší byly podmínky pro růst rostlin, tím větší byl obsah THC v rostlinách, tedy je-li vyšší míra růstového stresu, je také větší obsah THC. 2. Teplota Teplota také může ovlivnit množství kanabinoidů, ale pravděpodobně pouze v souvislosti s mírou dostupnosti vláhy. Byl zaznamenán jak zvýšený tak i snížený obsah kanabinoidů (při teplotě 32 ºC oproti teplotě 22 ºC). Jsou tedy nutné další studie vlivu teploty na produkci THC rostlinou. 3. Výživa Vyváženost minerálních látek v půdě pravděpodobně ovlivňuje produkci kanabinoidů. Studie prováděné na rostlinách konopí v Illinois ukazují vliv koncentrací K, P, Ca a N v půdě. Zejména byl zaznamenán zřetelný negativní vliv draslíku na obsah 9 tetrahydrokanabinolu (THC), přestože vliv P, Ca a N byl pozitivní. Také optimální hladina Fe a Mg v půdě je velmi důležitá pro syntézu THC v rostlině; zvažuje se možnost působení těchto minerálů jakožto kofaktorů enzymů pro syntézu. U jamajského konopí byl zjištěn vyšší obsah THC v souvislosti s použitím organických hnojiv (na rozdíl od hnojiv minerálních). 18

19 4. Škůdci Poškození (poranění) rostlin hmyzími škůdci může vést ke zvýšené produkci pryskyřice. Tento nárůst produkce může být odpovědí na vysušení místa v oblasti poškození cévy rostliny. Produkcí terpenů a kanabinoidů se rostlina snaží minimalizovat tento stres. Konopí není objektem mnoha škůdců a zvažuje se o jeho využití jako insekticidu nebo repelentu (díky produkci terpenů). Rostlina konopí má 3 zjevné obranné mechanismy velmi husté pokrytí nežlaznatými trichomy, uvolňování těkavých terpenoidů a vyměšování lepkavých kanabinoidů. Při studii s velmi potentním mexickým konopí bylo zjištěno, že působí smrtelně na larvu přástevníka medvědího (Arctia caja) a na saranče pustinné (Schistocerca gregaria). Na jiný druh sarančete (Zonocerus elegans) z Nigérie však vliv neměl. Turecké konopí bohaté na CBD nemělo žádný smrtelný účinek na škůdce, kteří se tímto konopím živili. Kanabinoidy mohou působit také jako čistě mechanická obrana. Drobný hmyz, který se dostane na povrch listu může poškodit cisterny pryskyřičných žlázek a může tak zůstat uvězněn v lepivé pryskyřici. Škůdci s kousacím ústrojím mají problémy při kousání gumovité pryskyřice a křemičitých a cystolitických trichomů pokrývajících povrch listu. 5. Konkurence okolních rostlin Terpeny mohou napomoci v potlačení růstu okolní vegetace. Spekuluje se, že takovéto mechanismy mohou fungovat i u konopí vysvětlovala by to nedostatečná konkurenceschopnost velmi mladých rostlinek konopí vůči okolní vegetaci. Mladé rostliny konopí nemohou totiž ještě plně produkovat terpeny. 6. Bakterie a plísně Kanabinoidy mohou chránit rostlinu proti napadení škodlivými mikroorganismy. Preparáty z konopí již dlouho slouží jako léčiva (bez ohledu na jejich psychoaktivní účinky) a jsou účinné proti širokému spektru infekčních chorob. Tyto antibiotické vlastnosti byly ověřovány na extraktech z rostliny konopí a na různých izolovaných kanabinoidech. Kanabigerol (CBG) je přirovnáván (co se týče struktury a antibakteriálních účinků) ke grifolinu, což je antibiotikum z Grifolia conflens (patřící mezi Basidiomycety).Také u semene konopí byly zjištěny antibiotické vlastnosti, které mohou hrát jistou pomocnou roli při přezimování semene. 19

20 7. Ultrafialové záření Další stres, kterému jsou rostliny během dne vystaveny, je sluneční záření. Sluneční záření je na jedné straně nezbytné pro fotosyntézu, ale na druhé straně obsahuje biologicky destruktivní ultrafialové záření. Tento tlak jistě vyvolal vývoj obranných mechanismů, vedle jiných například různé analogické látky k lidským kožním pigmentům. Experimentálně bylo zjištěno ovlivnění množství produkce THC při stresu způsobeném UV-B zářením. Za podmínek, kdy byly rostliny konopí vystaveny vysokému působení UV-B záření, produkovaly větší množství THC. Byly zjištěny pouze malé rozdíly v absorpčních schopnostech THC a CBD. Ale pravděpodobně vztah mezi kanabinoidy a UV-B není tak přímočarý, jak se dříve předpokládalo. Je teď třeba zvážit ještě další možná vysvětlení. (Ranalli 1999) 20

21 3.4 Zásady pro pěstování konopí setého Nároky na stanoviště Konopí je možné v podmínkách ČR pěstovat ve všech úrodnějších oblastech, jižní forma potřebuje roční sumu teplot 2200 až 2800 C, kterých nemusí být dosaženo u nás v každém roce ani v nejnižších polohách, proto se pro naše i středoevropské podmínky spíš počítá s uplatněním konopí přechodného typu. Na jarní mráz je konopí citlivější než len. Kde hrozí dlouho přízemní ranní mrazy, vysévá se až po ledových mužích, mladé rostlinky snesou i slabé mrazíky do - 4 C. V prvních obdobích růstu, než si rostliny vytvoří silnější kořeny, vyžaduje dostatek jarní vláhy a hlubší, nevysýchavé půdy. Později už odolává i přísuškům díky svému delšímu kořenu. Na vytvoření 1 kg sušiny potřebuje za dobu růstu více vody než obiloviny, to je až 700 litrů na 1 kg sušiny. Po dobu největšího růstu, tj. v červnu a červenci, by měly být místní srážky nejméně 500 mm. Konopí seté vyžaduje hlinité až hlinitopísčité, dostatečně hluboké půdy s dobrou zásobou živin, především N a K. Konopí lze sít i na zúrodněných slatinách, rozoraných loukách nebo vysušených rybnících. Nesnáší kyselé půdy, nejlépe se mu daří na půdách neutrálních až slabě zásaditých. Nevhodné jsou půdy mělké, kamenité, písčité, ulehlé, jílovité, vysychavé. Konopí se dá pěstovat při nižších výnosech i na horších půdách v chladnějších oblastech. Konopí lze pěstovat ve výrobních oblastech kukuřičné, řepařské a bramborářské, zpravidla do 450 m n. m Pro efektivní výrobu a mechanizovanou sklizeň je nezbytné zajistit vyrovnanou úrodnost pole, aby byl dosažen vyrovnaný vzrůst, vývoj a stejná doba dozrávání. Konopí je výrazná rostlina pro precizní zemědělství. (Kára et al. 2005, www-8, Petříková et al. 2006, Sladký 2004) Zařazení konopí v osevním postupu Konopí není náročné, ale vyšších výnosů hmoty dosahuje po organicky hnojené předplodině. Nejvhodnější předplodinou pro konopí jsou rostliny které zanechávají půdu čistou, kyprou, dobře zásobenou živinami, zvláště dusíkem. Jsou to okopaniny, kukuřice, luskoviny, jetel, vojtěška. Někdy se konopí pěstuje i po obilninách. Snáší i pěstování po sobě. Vhodné je i zařazení v 1.trati. Konopí je také dobrou předplodinou pro všechny ostatní rostliny, protože zanechává pole s malou zátěží plevelů a škůdců. (www-8, Petříková et al. 2006, Sladký 2004). 21

22 3.4.3 Agrotechnika U nás je možné pěstovat konopí na vlákno nebo na semeno. V poslední době se uvažuje o pěstování pro energetické účely. Podle toho se řídí i způsob pěstování. Základní zpracování půdy pro pěstování na vlákno nebo semeno je stejné hluboká orba na hloubku 0,25-0,30 m na podzim, nejlépe se zaoráním zralé chlévské mrvy nebo polosuchého substrátu z bioplynové stanice. Jarní příprava je v podstatě stejná jako pro ostatní jarní plodiny. Doporučuje se, jakmile to počasí dovolí půdu smykovat nebo vláčet. Tato příprava urovná půdu a sníží ztráty vláhy. Po smykování je třeba hlídat, aby se půda nezaplevelila. Podle potřeby lze ještě jednou kypřit a současně zapravujeme do půdy průmyslová hnojiva. Při předseťovém zpracování půdy lze využít kombinátorů. Před setím je vhodné zkypřit povrch půdy jen do hloubky setí. Konopí se seje v nížinách v druhé polovině dubna až v první polovině května, ve vyšších polohách později. Při pěstování na vlákno se vysévá hustěji do řádků po 0,20-0,25 m, s výsevkem kg.ha -1, při pěstování na semeno se vysévá do řádků po 0,40-0,60 m, s výsevkem kg.ha -1. Při pěstování na vlákno i na semeno (tento způsob pěstování v Evropě převládá) je výsevek kolem 40 kg.ha -1. Doporučuje se 200 semen na 1 m 2. Při zaručené a ověřené klíčivosti se výsevek snižuje. Seje se do hloubky 2 až 3 cm, v dobrých půdních podmínkách i více. Po zasetí válíme, aby semeno brzy vzešlo. V širokých řádcích je možno během vegetace plečkovat. Při pěstování na semeno je třeba dbát na to, aby nebyly v okolí porosty s jinými odrůdami (nežádoucí sprášení). Při pěstování na semeno je možno plodinu pro zvýšení výnosu uměle opylovat (v době rozkvětu 1-3 samičích rostlin táhnou dva lidé napnutý provaz, který je uvázán na tyčích ve výši vrcholů rostlin, po řádcích). Konopí roste zpočátku rychle, brzy je silně olistěné a při hustějším výsevu potlačuje plevele. Minimální prostorová izolace u certifikovaného osiva je u konopí nejméně 1000m. Časová pauza od posledního pěstování téhož druhu na semeno na témže pozemku je minimálně 5 let. (Petříková et al. 2006, Sladký 2004, Kára et al. 2005) Hnojení Vysoký výnos hmoty a rychlý růst konopí vyžaduje dobrou zásobu snadno využitelných živin. K jejich získávání z půdy pomáhá kořenům i bohatá kořenová symbiózní mikroflóra, které je v poměru k mikroflóře obilovin asi milionkrát více. To se kladně projevuje při několikaletém pěstování konopí po sobě. Plným hnojením a při dostatku vláhy lze zvýšit výnos konopí bezmála na dvojnásobek průměru. 22

23 Potřebu živin na tunu konopných stonků a semene uvádí tab. III. Značný rozptyl uváděných hodnot svědčí o určité plasticitě konopí, ale i o vlivu rozdílnosti pěstebních a půdních podmínek. (Sladký 2004). Dusíkatá Fosforečná Draselná Vápenatá Hořečnatá Semeno 43,8-64,0 9,9-17,0 10,7-42,0 11,0-62,0 2,2 Stonky 8,3-19,0 2,1-5,0 9,1-12,0 15,0-18,0 1,5 Průměr rostliny 17,2-20,0 5,0-6,0 10,0-28,0 15,0-18,0 2,0 % využití živin Tab. III - Potřeba živin v kg na vytvoření 1 tuny semene nebo stébel konopí Základním hnojivem pro konopí je dobře uleželá chlévská mrva případně polosuchý substrát z bioplynové stanice nebo kompost. Dávka 20 až 30 t.ha -1 organických hnojiv zvýší výnos stonků až o 25 % a semene o 11 %. Při stávajícím nedostatku chlévské mrvy se pro základní vyhnojení na podzim pod konopí může využít zelené hnojení. Doporučuje se zejména dvouletá komonice bílá a jiné běžné podsevy. Zelené hnojení je vhodnější uplatnit již k předplodině. Hladina živin se pak doplňuje dávkou dusíkatého, fosforečného a draselného průmyslového hnojiva. (Sladký 2004). Význam jednotlivých živin pro výnosy konopí: Dusík Je nezbytný pro růst vegetativních orgánů, zejména při pěstování konopí na vlákno. Má vliv na dosažení maximální výšky a příznivě ovlivňuje poměr délky a tloušťky stonku a jeho pevnost. Přehnojení dusíkem má negativní vliv na jakost vláken. Fosfor Jako nezbytná základní živina urychluje dozrávání semen a zvyšuje jejich kvalitu. Jeho dostatek je nezbytný při pěstování konopí na semeno, ale s ostatními živinami zlepšuje i kvalitu stonků a tím vlákna. Draslík Nejvíce draslíku potřebuje konopí ve fázi počátečního rychlého růstu stonku. Vápník Vápnění je zpravidla nezbytné i na neutrálních půdách, protože spotřeba vápníku pro růst kořenového systému i semene je velká. 23

24 Hořčík Zajišťuje dobrý zdravotní stav rostliny a tvorbu chlorofylu. Stopové prvky V půdě nesmí chybět přístupná měď, bor, mangan a selen. (Sladký 2004) Ochrana rostlin Konopí nepotřebuje tak razantní ochranu proti škůdcům a nemocem jako jiné kultury. Musí být ale zaseto kvalitní semeno do dobré, nezaplevelené půdy ve správné době. Poskytuje určitou ochranu i okolním porostům. Choroby na konopí mají podstatně menší význam než u lnu. Není to však způsobeno odolností rostliny, ale tím, že rostlina je velmi mohutná a listové choroby nejsou vzhledem k velké listové ploše tak nebezpečné. Z listových chorob je např. běžná septorióza konopí. U konopí mohou být kritické jen takové choroby, které napadají stonky nebo kořeny, jako např.plíseň šedá (Botrytis cinerea Pers.), rakovina nebo fusariosa (Giberella pulicaris (Fr.) Sacc.). Nejnebezpečnější chorobou je asi bílá (sklerociová) hniloba, jejíž původcem je hlízenka obecná (Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) Masse). Z fyziologických chorob může trpět konopí zakrslým růstem z nedostatku živin nebo jen z nedostatku dusíku. Konopí může škodit dřepčík chmelový (Psylliodes attenuata Koch.), housenky můry gama (Autographa gamma L.), mšice konopná ( Phorodon cannabis Pass.) a zavíječ kukuřičný (Ostrinia nubialis Hübn.). Při slabém výskytu plevelů není třeba používat chemické prostředky proti plevelům. Konopí roste po vzejití relativně rychle a dobře založený porost tak snižuje možnost výskytu plevelů. Konopí je známo svým alelopatickým působením na plevele, takže v hustém a vysokém porostu konopí nemají plevele většinou šanci růst. Ke škodám na pěstovaném konopí dochází spíše tehdy, když se pěstuje delší dobu na stejném stanovišti, ale nově vyšlechtěné odrůdy vykazují vysokou rezistenci proti napadení. (Sladký 2004, Kára et al. 2005, Petříková et al. 2006) Sklizeň Sklizeň konopí patří k obtížnějším etapám jeho pěstování, zpracování a využívání. Vyplývá to z několika faktorů jako je délka, tloušťka, tuhost a hustota stébel, problémy s manipulací posečeného konopí na řádku, požadavky různých způsobů následného využití na vlákno pro textilní nebo papírenský průmysl nebo pro získání semene atd. 24

25 Sklizeň na vlákno probíhá od poloviny srpna, když vyskytující se samičí rostliny v porostu plně kvetou, až po 1-2 týdny po jejich odkvetení při zelené zralosti semen.. Semeno konopí dozrává odspodu k vrcholu květenství dalších cca dnů. Začátek sklizně na semeno začíná od poloviny září v době, kdy semena v dolní polovině květenství jsou plně vyzrálá, ve střední části ve voskové zralosti a na vrcholku zelená. Sklízí se před dozráním všech semen, jinak jsou velké ztráty výdrolem. Průměrné výnosy jsou uvedeny v tabulce IV. (Sladký 2004). Pěstovaná část Jednotka [t.ha -1 ] Semeno 0,8 Stonek 9,0 Vlákno 2,0 Výnos hmoty pro energetické využití 10,0 Tab.IV. Průměrná produkce konopí setého v ČR. (Tošovská et al. 2007) 25

26 3.5 Legislativa pro pěstitele konopí setého v ČR Pěstování konopí setého je v ČR legislativně ošetřeno zákonem o návykových látkách a o změně některých dalších zákonů č. 167/1998 Sb., v platném znění. V tomto zákoně v 24, bodu a) se zakazuje pěstovat druhy a odrůdy rostliny konopí (rod Cannabis), které mohou obsahovat více než 0,3 % látek ze skupiny tetrahydrokanabinolů. Dále 29 tohoto zákona ustanovuje ohlašovací povinnost, podle které: I. Osoby pěstující mák setý nebo konopí na celkové ploše větší než 100 m 2 jsou povinny předat hlášení místně příslušnému celnímu orgánu podle místa pěstování, písemně nebo v elektronické podobě, podepsané zaručeným elektronickým podpisem podle zvláštního právního předpisu a) do konce května: - výměru pozemků, které byly v příslušném kalendářním roce oseté konopím, včetně názvu použité registrované odrůdy, čísla parcely, názvu a čísla katastrálního území, - odhad výměry pozemků, na nichž bude pěstováno konopí v příštím kalendářním roce b) v průběhu vegetace a sklizně údaje o výměře pozemků a způsobu zneškodnění konopí, včetně názvu použité registrované odrůdy, čísla parcely, názvu a čísla katastrálního území, a to nejpozději do 5 dnů před provedením jejich zneškodnění c) do konce prosince příslušného kalendářního roku - výměru pozemků, které byly oseté konopím, výměru pozemků, ze kterých bylo sklizeno konopí, včetně názvu použité registrované odrůdy, čísla parcely, názvu a čísla katastrálního území, - množství sklizeného konopí (stonku) a semene konopí. (Tošovská et al. 2007) 26

27 3.6 Stručný přehled využití konopí setého a) potravinářství - bonbony, čokolády, čaje, pivo,limonády, proteinové nápoje, mouka, chléb a drobné pečivo, těstoviny, müsli, máslo, oleje, pražená loupaná semínka, chipsy b) farmaceutický průmysl léky c) textilní průmysl svrchní oblečení, obuv, klobouky a kšiltovky, ponožky, koberce, ložní prádlo, módní doplňky tašky, batohy, peněženky, pouzdra na mobilní telefony., lana provazy, nitě, motouzy, pytle, plachty, koberce, potahové látky (více jak druhů textilních produktů) d) chemický průmysl barvy, laky, fermeže,mýdla, mazivové oleje, bioplasty e) stavebnictví tepelné a zvukové stavební izolační materiály, omítky, podlahy, cihly, tvárnice, OSB desky, překližky, kompozity, těsnící materiál, přídavek do spojovacích směsí f) kosmetika balzámy na rty, šampony, kondicionéry, masážní oleje, parfémy, pleťové masky, tělová mýdla, tělové a vlasové šampony g) papírnictví bankovky, dopisní papíry, kancelářský papír, kartony,tiskový papír, čajové sáčky, filtry do kávovarů, cigaretové papírky h) automobilový průmysl lisování termoplastických dílů i) energetika peletky, brikety, motorová paliva j) sportovní využití bioplasty (skateboardy, snowboardy) k) zemědělství semeno jako krmivo (hospodářská zvířata, ryby, ptactvo), pazdeří jako podestýlka pro ustájená zvířata drůbež ve velkochovech, rekultivace půd (Robinson 2004, www-6, www-7) 27

28 4. MATERIÁL A METODY 4.1 Odrůdy konopí setého V roce 2007 je v ČR registrována pouze polská odrůda Beniko, ale k pěstování jsou povoleny i další odrůdy podle společného katalogu odrůd EU. Nařízení Komise (ES) č. 436/2005 v Příloze II stanovuje odrůdy konopí pěstované na vlákno, které jsou způsobilé pro přímé dotační platby (SAPS jednotná platba na plochu, TOP-UP doplňková platba na plochu). Jsou to: Beniko, Bialobrzeskie, Cannacomp, Carmagnola, CS, Delta 405, Delta-Llosa, Dioica 88, Epsilon 68, Fasamo, Fedora 17, Felina 32, Felina 34, Ferimon, Fibranova, Fibriko TC, Fibrimon 24, Finola, Futura 75, Juso 14, Lipko, Red Petiole, Santhica 23, Santhica 27, Tiborszállási, UNICO-B, Uso-31. (Tošovská et al. 2007) V následujících kapitolách jsou popsány odrůdy konopí, které byly testovány na obsah THC Odrůda BENIKO Šlechtitel: IKWN Poznaň, odrůdová stanice Wojciechow, Olesno, woj. Czestochowa, Polsko Původ: Polská jednodomá odrůda konopí, výběr z krajových materiálů Popis: Jednodomé konopí, délka cm, plod jednosemenná nažka, květy s odděleným pohlavím HTS: 14,92 g Klíčivost: 93 % Hmotnost 1 MKS (1 milion klíčivých semen) = 16,2 kg Doporučený výsevek je 1,5 5 MKS/ha Hnojení: kg N/ha při přípravě půdy na jaře Setí: do řádků cm, do hloubky 3 cm Termín setí: Výnos vlákna: 2,8-3,5t/ha 28

29 4.1.2 Odrůda FEDORA 17 Udržovatel odrůdy: Féderation Nationale des Producteurs de semences de Chanvre (FNPC), 20, rue Paul Ligneul, F Le Mans, Francie Původ: Francouzská jednodomá odrůda konopí, registrována v roce 1994 Popis: jednodomé konopí, jednodomé konopí, krátká vegetační doba vhodná pro pěstování na semeno i olej, obsah oleje 31,4 % výška rostlin 1,36 m, výnos suché hmoty 9,09 t.ha -1, podíl dřevoviny 62,8 %, síla stonku 6,54 mm Odrůda FELINA 34 Udržovatel odrůdy: Féderation Nationale des Producteurs de semences de Chanvre (FNPC), 20, rue Paul Ligneul, F Le Mans, Francie Původ: Francouzská jednodomá odrůda konopí, registrována v roce 1994 Popis: jednodomé konopí, krátká vegetační doba, vhodná pro pěstování na semeno i olej, obsah oleje 31,7 %, výška rostlin 1,36 m, výnos suché hmoty 9,28 t.ha -1, podíl dřevoviny 65,6 %, síla stonku 6,62 mm, Odrůda FUTURA 77 Udržovatel odrůdy: Původ: Popis: Féderation Nationale des Producteurs de semences de Chanvre (FNPC), 20, rue Paul Ligneul, F Le Mans, Francie Francouzská jednodomá odrůda konopí jednodomé konopí, středně dlouhá vegetační doba, vhodná pro pěstování na olej, obsah oleje 33,6 %, podíl dřevoviny 65,1 %, síla stonku 6,73 mm Odrůda BIALOBRZESKIE Udržovatel odrůdy: Institut Krajowych Wlokien Naturalnych, Vojska Polskiego 71b, PL Poznan Původ: Polská jednodomá odrůda konopí Popis: jednodomé konopí, délka vegetační doby dní, HTS: 15 g 29

30 4.1.6 Odrůda JUSO -11 Šlechtitel: UAAS, Institiute of Bast Fibres, Glukhiw, Sumy Region, Lenina 45, Ukrajina Původ: Ukrajina Popis: Jednodomé konopí, délka cm, plod jednosemenná nažka, barva od světlé po šedavou s mozaikou, list má složenou formu, dlanitě dělenou, květy s odděleným pohlavím, samčí seskupené do lat, samičí jako hrozny ve vrcholové části rostliny. HTS: 16, 08 g Klíčivost: 90 % Výsevek 1 milion klíčivých semen (MKS/ha) = 18,42 Kg (pěstování na semeno) Výsevek 2 MKS/ha = 36,84 Kg (při pěstování biomasy pro energetické využití) Výsevek 3,5 MKS/ha = 64,47 Kg (při pěstování na vlákno) Hnojení: kg N/ha při přípravě půdy na jaře Setí: do řádků 12-15cm, do hloubky 3 cm Termín setí: Rezistence vůči chorobám a škůdcům: dobrá odolnost vůči plísni šedé (Botrytis cinerea) a fusarioznímu vadnutí Odrůda FIBROL Udržovatel odrůdy: Károly Róbert Fıiskola MFK, Fleischmann Rudolf Kutató Intézete, 3356 Kompolt, Fleischmann u. 4. Původ: Maďarsko Popis: jednodomé konopí, vyšlechtěno z odrůdy Fibrimon 21-63, středně vysoké, vegetační doba dní, obsah oleje 35 % HTS: 14-15g Setí: do řádků cm Výsevek: kg/ha Výnos vlákna: 2-3t/ha Rezistence vůči záraze Orobanchae ramosa 30

31 4.1.8 Odrůda MONOICA Udržovatel odrůdy: Károly Róbert Fıiskola MFK, Fleischmann Rudolf Kutató Intézete, 3356 Kompolt, Fleischmann u. 4. Původ: Maďarsko Popis: jednodomé konopí, vyšlechtěno z čínské dvoudomé odrůdy, vysoký vzrůst Setí: do řádků cm Výsevek: kg/ha Výnos suché hmoty: 10-12t/ha Výnos semene: 0,9-1t/ha Rezistence vůči záraze Orobanchae ramosa (popis odrůd Agritec, výzkum, šlechtění a služby, s. r. o., Šumperk) 31

32 4.2 Laboratorní stanovení obsahu THC Pro vlastní stanovení obsahu THC v rostlinách konopí bylo použito devět odrůd vypěstovaných v roce 2006 ve společnosti Agritec, výzkum, šlechtění a služby, s. r. o., Šumperk a testování proběhlo v laboratoři Ústavu biologie rostlin MZLU v Brně. Vlastní analýza probíhala na plynovém chromatografu s hmotnostním detektorem (GC/MS) Obecný princip chromatografie Prostřednictvím této techniky je možno získat kvalitativní i kvantitativní informace, tzn.určení složení směsi i stanovení koncentrace jednotlivých složek. Pro úplnou identifikaci je nezbytné propojení s dalšími metodami analytické chemie, např. hmotnostní spektrometrií apod. Podstatou chromatografického procesu je distribuce složek směsi mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je označována jako mobilní a druhá jako stacionární. Zatímco mobilní fáze je buď kapalina nebo plyn, stacionární fáze může mít velmi rozdílnou formu (např. částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny nebo pevných částic, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry) a používá se pro ni pojem sorbent. Během chromatografického dělení dochází k opakovanému transportu složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní. Z hlediska provedení uspořádání chromatografického zařízení dělíme chromatografii na plošnou a sloupcovou, z hlediska určujícího mechanismu dělení látky mezi stacionární a mobilní fázi pak chromatografii adsorpční, rozdělovací, iontově výměnnou a další. (Zehnálek 2002) Ranalli (2004) uvádí, že pro detekci THC z rostlinného materiálu byly vyzkoušeny tyto chramotografické metody - chromatografie na tenké vrstvě (TLC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) a plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC/MS). Při analýze výše zmíněných devíti odrůd byla použita metoda plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC/MS), která bude dále podrobněji vysvětlena. 32

33 4.2.2 Plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (GC/MS) Jak již bylo uvedeno výše, plynová chromatografie (GC) používá jako mobilní fázi plyn a jako stacionární fázi kapalinu zakotvenou na povrchu pevné látky. Přístroj používaný pro plynovou chromatografii se nazývá plynový chromatograf. (obrázek č.6). Plynový chromatograf je připojen ke zdroji nosného plynu (tlak. láhev) a k zařízení, které je schopné zpracovat signál z detektoru (PC s tiskárnou). Výsledný vytištěný záznam chromatografické analýzy se nazývá chromatogram. REGULÁTOR PRŮTOKU VZOREK NÁSTŘIK VZORKŮ A NOSNÉHO PLYNU ZESÍLENÍ SIGNÁLU A ZPRACOVÁNÍ CHROMATOGRAM DETEKTOR JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK TERMOSTAT NOSNÝ PLYN (hélium/dusík/vodík) CHROMATOGRAFICKÁ KOLONA Obrázek č.6 Schématický návrh plynového chromatografu (www 4) Hlavní části plynového chromatografu: 1. Regulátor průtoku nosného plynu, 2. Nástřikový port 3. Separační kolona 4. Termostat 5. Detektor. 33

34 ad 1). Regulátor průtoku nosného plynu Nosný plyn slouží v GC chromatografii jako transportní médium pro plynnou směs, která je analyzována. Nosný plyn neinteraguje se stacionární fází ani se složkami analyzované směsi na rozdíl od kapalinové chromatografie, kde dochází k významné interakci mezi mobilní fází a analyzovanou směsí. Jako nosný plyn se používají plyny He, Ar, N 2, H 2, CO 2. Regulátor průtoku slouží pro udržení konstantní průtokové rychlosti (nebo konstantního tlaku) nosného plynu v separační koloně během analýzy. ad 2). Nástřikový port Nástřikový port je místo, které slouží pro vpravení vzorku do plynového chromatografu a do separační kolony. Nástřik se provádí ručně nebo automaticky speciální injekční stříkačkou (typický objem 1 µl). Nastřikovaný vzorek může být kapalný nebo plynný. V případě kapalných vzorků musí mít nástřikový port dostatečně vysokou teplotu aby došlo k okamžitému převedení vzorku do plynného stavu. Plynný vzorek je z nástřikového portu zaveden do proudu nosného plynu, který ho pak transportuje přes kolonu, přičemž dochází k separaci složek analyzované směsi. ad 3). Separační kolona Separační kolona je nejdůležitější součástí plynového chromatografu. Současná GC používá zpravidla tzv. kapilární kolony a proto bývá označována jako kapilární GC. Kapilární kolona je tvořena kapilárou z taveného křemene, která je z venku potažena filmem polymeru, který ji chrání před zlomením nebo jiným mechanickým poškozením. Kapilára je umístěna na kruhovém držáku, na kterém je stočena dokola a tento držák s kolonou je upevněn uvnitř chromatografu. Vnitřní stěna kapiláry je v případě GC chromatografie pokryta filmem kapaliny, který představuje vlastní stacionární fázi. Právě vlastnosti chemické látky která tvoří film (zejména polarita), zcela zásadně rozhodují o tom, jaké směsi je možno na dané koloně rozdělovat na jednotlivé složky. ad 4). Termostat Termostat udržuje konstantní teplotu separační kolony během analýzy nebo teplotu plynule mění podle nastaveného programu. ad 5). Detektor V této práci používala hmotnostní spektrometr (MS- Mass Spectometer). Tento přístroj provede ionizaci a fragmentaci vzorku, separaci iontů, detekci četnosti daného typu iontů a zpracování signálu ve spektrální výstup. Vlastní identifikace látky ve vzorku je umožněna srovnáním měřených spekter s knihovnami dat uložených v PC. (www-3, www-5) 34

35 Popis průběhu vlastní analýzy: Separační kolona uvnitř termostatu je ohřátá na určitou teplotu, vhodnou pro danou analýzu, kterou udržuje nebo programovatelně mění termostat. Do kolony vchází nosný plyn o konstantní průtokové rychlosti. Výstup z kolony je zaveden do příslušného detektoru. Do proudu nosného plynu je přes nástřikový port nastříknut vzorek analyzované směsi (kapalný, plynný). Nosný plyn unáší plynnou směs analyzované látky a nosného plynu skrze kolonu kde nastává její dělení na jednotlivé složky. Principem dělení směsi na složky je v případě GC rozdílná rozpustnost těchto složek ve stacionární fázi (ve filmu zakotvené kapaliny). Čím je daná složka směsi rozpustnější ve stacionární fázi, tím více je kolonou její průchod zpomalován. Během chromatografické separace se neustále opakuje proces rozpouštění a odpařování složek směsi, takže na výstupu se objeví prakticky všechen analyt, který byl do kolony nastříknut. Jednotlivé složky směsi pak vchází do příslušného detektoru, jehož signál je zaznamenáván (počítač) a tisknut v podobě chromatogramu. Hlavními parametry, které ovlivňují kvalitu separace a dobu GC analýzy jsou teplota kolony a průtoková rychlost nosného plynu. Výstup v podobě chromatografu: V případě GC chromatografie je chromatogram (obrázek č.7) tvořen soustavou píků, které mají různou plochu a výšku, mají od sebe různou vzdálenost. Každý pík (č. 1-6) odpovídá jedné složce analyzované směsi. Vodorovná osa znázorňuje čas. Čas, který odpovídá vrcholu píku je tzv. retenční čas, který je na dané koloně a za daných experimentálních podmínek pro každou látku charakteristický. Obrázek č.7 - Ukázka chromatogramu. 35

36 Pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena, pak každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu) určuje o jakou látku se jedná (kvalitativní analýza), plocha píku (nebo jeho výška) určuje koncentraci látky ve směsi (kvantitativní analýza). Identifikace píků (látek) se provede tak, že se na stejné separační koloně za stejných experimentálních podmínek provede analýza předem připravené směsi o známém kvalitativním složení, tzv. standardní směs. Pokud se retenční časy píků na chromatogramu neznámé směsi shodují s retenčními časy píků směsi o známém složení, pak se jedná o stejné látky. Koncentrace látek ve směsi se určuje z ploch nebo výšek píků metodou kalibrace, pro kterou existuje více způsobů provedení. (www -3) Vlastní metodika stanovení THC v dodaných vzorcích konopí setého Metodika extrakce kanabinoidů z konopí je převzata z práce Meijera et al Instrumentace Plynový chromatograf GC 8000, Fisons Instruments s kvadrupólovým hmotnostním detektorem MD 800, Fison Instruments a autosamplerem AS 800, CE Instruments Ultrazvuková lázeň Sonorex RK 31, Bandelin electronic Kulový mlýnek Analysette 3, Fritsch Odstředivka CMC-2, Christ Chemikálie n-hexan pro HPLC, Baker cannabinol, 100 µg/ml v methanolu, Sigma cannabidiol, 100 µg/ml v methanolu, Sigma Squalan (2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosan), Sigma Postup stanovení: a) Příprava vzorku Dodaný suchý rostlinný materiál byl nahrubo rozdrcen, byly odstraněny zdřevnatělé části rostlin a následně byl postupnou kvartací vytvořen vzorek o hmotnosti cca 5 g. Z něj byly odstraněny zdřevnatělé části rostlin a semena větší než 2 mm. Takto připravený vzorek byl rozemlet na kulovém mlýnku a dále uchováván v uzavřené nádobě při teplotě 5-15 O C. 36