MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 VERONIKA NIEDROVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství Mikrobiologické parametry vybraných jogurtů Diplomová práce Vedoucí práce: Mgr. Ing. Eva Mrkvicová, Ph.D. Vypracovala: Bc. Veronika Niedrová Brno 2013

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma MIKROBIOLOGICKÉ PARAMETRY VYBRANÝCH JOGURTŮ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis.

4 PODĚKOVÁNÍ Děkuji Mgr. Ing. Evě Mrkvicové, Ph.D., Ing. Daně Bednaříkové, Ph.D. a v neposlední řadě Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za cenné rady, připomínky a odborné vedení práce. Poděkování patří také mé rodině a nejbližším za podporu a zázemí, které mi poskytovali v průběhu celého studia.

5 ABSTRAKT Tato práce se zabývá mikrobiologickým obrazem vybraných jogurtů. Jogurty patří k nejrozšířenějším produktům ze skupiny kysaných mléčných výrobků. Jejich úloha ve výživě člověka má nezastupitelné místo, zejména pro zdravotní přínosy, se kterými je spojena jejich konzumace. Jedná se zejména o jejich významnou roli v rámci funkčních potravin, mezi které se řadí díky obsahu mléčných a probiotických bakterií Mechanismus účinku probiotik spočívá v jejich schopnosti soutěžit s patogenními mikroorganismy o osídlení střevní sliznice a zamezit tak rozvoji onemocnění po vymícení vyvážené střevní mikroflóry například po užívání antibiotik. Probiotika prokazatelně zlepšují imunitní odpověď organismu a lze je využít při léčbě i prevenci gastrointestinálních infekcí, chronických střevních zánětů, některých alergií a dalších onemocnění. Řada studií poukazuje také na možné antikarcinogenní účinky těchto bakterií. Během rozboru bylo zjištěno, že všechny testované jogurty odpovídají požadavkům vyhlášky 77/2003 Sb. ve znění pozdějších novel, která ukládá za povinnost, aby počet mikroorganismů mléčné mikroflóry v 1 g jogurtu byl alespoň Klíčová slova: Kysané mléčné výrobky, jogurt, probiotika, prebiotika.

6 ABSTRACT This work is concerned with a microbiological perspective of selected yoghurts. Yoghurts are the most widespread product in the whole fermented milk products cathegory. Their role in human s nutrition is irreplaceable, especially due to it s health benefits, which are associated with their consumption. In particular, yoghurts play important role in functional eatables and ranks among them due to milk and probiotic bacteria. The mechanism of action of probiotics consists in their ability to struggle with the pathogenic microorganisms for colonization of intestinal mucosa and thus to prevent the development of disease after an eradication of balanced intestinal microflora especially after antibiotic treatment. Probiotics provably improve the immune system response and can be used as treatment in prevention of gastrointestinal infections, chronic inflammatory bowel disease, some allergies and other disorders. Many studies also certify the possible anticancerogenic effects of those bacteria. During the analysis, it has been found that all of the tested yoghurts had met the requirements of Decree 77/2003 Sb. as amended in novel, which obliges to have at least 10 7 of milk microflora mircroorganisms per 1 g of yoghurt. Key words: Fermented dairy products, yoghurt, probiotics, prebiotics.

7 OBSAH 1 ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Mlékárenské ošetření mléka Kysané mléčné výrobky Stručný popis výroby kysaných mléčných výrobků Změny složek mléka při výrobě kysaných mléčných výrobků Laktóza Bílkoviny Mléčný tuk Vitaminy Minerální látky Jogurt Mikroorganismy potenciálně kontaminující jogurty Výroba jogurtů Dělení jogurtů Probiotika Probiotické kultury Stručná charakteristika vybraných rodů probiotických mikroorganismů Rod Lactobacillius Rod Streptococcus Rod Enterococcus Rod Bifidobacterium Prebiotika Synbiotika CÍL VLASTNÍ PRÁCE MATERIÁL A METODIKA Analyzované vzorky Stručný popis použitých vzorků Příprava vzorků Použité půdy VÝSLEDKY A DISKUZE Celkové počty mikroorganismů Bakterie mléčného kvašení Bifidobakterie... 44

8 5.4 Koliformní bakterie Kvasinky a plísně ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 52

9 1 ÚVOD Kysané mléčné výrobky patří již tradičně k hojně zastoupeným mlékárenským výrobkům. Jejich tržní sortiment je velice pestrý a neustále se rozšiřuje. Pro svoji rozmanitost složení se mnohé z nich uplatňují při dietách nebo při léčebné výživě. Na jejich snazší stravitelnosti se nenahraditelně podílí bakterie mléčného kysání. Vzhledem k lepší využitelnosti vápníku je lze využít při léčbě osteoporózy. Dále jsou nenahraditelným zdrojem mléčné bílkoviny pro osoby s laktózovou intolerancí. Při jejich obohacení o probiotické kmeny bakterií mléčného kysání lze poukázat na řadu dalších výhod. Probiotické mikroorganismy obsažené v kysaných mléčných výrobcích podle řady výzkumů omezují usídlení a rozvoj patogenních mikroorganismů ve střevě, příznivě ovlivňují mikroflóru například po léčbě antibiotiky a posilují funkci imunitního systému. Četné studie hovoří také o protektivním účinku probiotik proti rozvoji karcinomu tlustého střeva. Terapeutický účinek probiotických bakterií nelze předpokládat při jednorázové konzumaci. Výrobky s obsahem těchto prospěšných mikroorganismů je třeba do našeho jídelníčku zařazovat pravidelně. Za terapeutické minimum je považována konzumace alespoň 100 ml výrobku s obsahem probiotických bakterií 10 6 v 1 ml jednou denně. Předmětem výzkumu nadále zůstává zvýšení a prodloužení životaschopnosti probiotických kmenů v mléčných výrobcích. Jednou z možností je obohacení finálního výrobku o prebiotikum, které selektivně podporuje růst jednoho kmene nebo omezeného počtu bakterií. 9

10 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Mléko určené pro výrobu kysaných mléčných výrobků musí svými vlastnostmi a složením vytvářet vhodné podmínky pro rozvoj přidaných čistých mlékařských kultur. Musí být tedy získáno od zdravých, dobře krmených dojnic a prosté inhibičních látek. Pro výrobu kysaných mléčných výrobků se používá mléko o různé tučnosti, případně i obnovené sušené mléko. Pro zlepšení konzistence se někdy přidávají látky zlepšující konzistenci, např. škroby, želatina a další (KALHOTKA et al., 2009). 2.1 Mlékárenské ošetření mléka Mléko nakoupené mlékárnami podléhá základnímu mlékárenskému ošetření. Jeho zpracování se skládá ze 4 základních stupňů: třídění, čištění, tepelné ošetření a vychlazení (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Tříděním rozumíme separaci mléka, které neodpovídá požadovaným znakům jakosti. Toto mléko se odděluje a zpracovává zvlášť. V této fázi dochází také k měření množství mléka objemovými čerpadly, magneticko-indukčními průtokoměry nebo vážením na hmotnostních vahách. Hmotnost mléka v kg je poté přepočítána na litry. Současně při měření množství dochází k odběru vzorků odkapem (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Mléko je čištěno již v zemědělských závodech pomocí filtrace a cezení. Po nadojení může obsahovat nečistoty z povrchu těla dojnic, ze vzduchu, krmiva, steliva apod. Čím dříve dojde k odstranění těchto nečistot, tím méně mikroorganizmů se do mléka uvolní. V mlékárnách se provádí opakované čištění filtrací před zpracováním, poté při odstřeďování na čistících a odsmetaňovávacích odstředivkách (separátorech) a dále také při baktofugaci. Odstřeďování je jedním z nejdůležitějších fyzikálních procesů v mlékárenském průmyslu (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001, JANŠTOVÁ et al., 2012, NAVRÁTILOVÁ et al., 2012). Účelem tepelného ošetření mléka je zničení patogenních a technologicky nežádoucích mikroorganizmů a zajištění jeho zdravotní nezávadnosti a údržnosti za současné minimalizace vzniku chemických, fyzikálních a organoleptických změn mléka (JANŠTOVÁ et al., 2012, LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). 10

11 Mezi základní mlékárenské ošetření nelze zahrnout termizaci, při které dochází k zahřátí na teplotu 63 až 65 C po dobu 20 sekund. Vzhledem k nízké zahřívací teplotě a krátké době působení není tento postup dostatečný k usmrcení patogenních mikroorganizmů. Rozlišujeme tedy tři základní postupy tepelného ošetření mléka dle výše teploty a času jejího působení (JANŠTOVÁ et al., 2012, LUKÁŠOVÁ a kol., 2001): 1. Pasterace: mléko je zahříváno na teplotu do 100 C. Trvanlivost zchlazeného pasterovaného mléka je omezena na několik dnů. Rozlišujeme tři způsoby pasterace podle teploty záhřevu a doby výdrže: a. Vysoká pasterace teplota 85 C, doba záhřevu není přesně stanovena, technologicky je 4 5 sekund. Používá se k ošetření konzumního mléka. Tento záhřev zhoršuje sýřitelnost. b. Krátkodobá (šetrná) pasterace teplota 71,7 75 C po dobu sekund. Takto ošetřené mléko je vhodné pro výrobu sýrů, dochází jen k malým změnám fyzikálně chemických vlastností. c. Dlouhodobá (nízká) pasterace teplota C po dobu 30 minut. Používá se ojediněle. Chemické vlastnosti mléka se téměř nemění. 2. Ultratepelné ošetření mléka (UHT): dle platné legislativy lze mléko ošetřit i velmi vysokou teplotou (UHT). Tento způsob záhřevu zahrnuje nejméně 135 C v kombinaci s přiměřenou dobou zdržení tak, aby v ošetřeném výrobku nebyly přítomny žádné živé mikroorganismy, ani spory schopné růstu v prostředí aseptické uzavřené nádoby při pokojové teplotě. 3. Sterilizace: při tomto procesu je mléko zahříváno na teploty nejméně 100 C v hermeticky uzavřených obalech, přičemž obal po dobu ošetření musí zůstat neporušený. Trvanlivost mléka je při pokojové teplotě několik týdnů. Cyklus mlékárenského ošetření končí zchlazením mléka. Děje se tak kontinuálně v přímé návaznosti na tepelné ošetření. Mléko je chlazeno nejlépe na 5 C. Při této teplotě se vytvoří podmínky, kdy prakticky úplně ustává schopnost růstu patogenů a přežívající mikroflóry (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). 11

12 2.2 Kysané mléčné výrobky Kysaným mléčným výrobkem rozumíme, dle národní legislativy, výrobek získaný kysáním mléka za použití mikroorganismů mléčného kysaní, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Základním biochemickým procesem při výrobě je anaerobní přeměna laktózy na kyselinu mléčnou činností beta-galaktosidázy, kterou podporují bakterie mléčného kysání. Tržní sortiment kysaných mléčných výrobků je velmi bohatý a neustále se rozšiřuje (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Tabulka 1. Členění kysaných mléčných výrobků na skupiny a podskupiny (podle Vyhlášky 328/97 Sb.) Druh Skupina Podskupina Kysaný mléčný výrobek Jogurt Jogurtové mléko Acidofilní mléko Kefír Kefírové mléko Kysané mléko nebo smetanový zákys Kysaná nebo zakysaná smetana Kysané podmáslí Kysaný mléčný výrobek s bifido kulturou Nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový Stručný popis výroby kysaných mléčných výrobků Pro výrobu kysaných mléčných výrobků je vhodné pouze mléko výběrové jakosti. Nežádoucí je především obsah psychrotrofních mikroorganismů, které mohou inhibovat růst bakterií mléčného kvašení nebo způsobovat vadnou konzistenci, chuť a vůni výsledného produktu. Chuť a reologické 1 vlastnosti výrobku velmi příznivě ovlivňuje homogenizace směsi na výrobu kysaných mléčných výrobků (ZADRAŽIL, 2002). Tepelné ošetření pro výrobu kysaných mléčných výrobků musí zajistit zdravotní nezávadnost suroviny, inaktivovat přirozené antimikrobiální látky a enzymy a zajistit denaturaci více než 80 % syrovátkových bílkovin (pro dosažení vhodné konzistence finálního výrobku). Uvedené požadavky splňuje vysoká pasterace nebo UHT záhřev. 1 Reologie - nauka o obecném deformačním chování látek. 12

13 S rostoucím obsahem tuku a sušiny se zvyšuje intenzita záhřevu (JANŠTOVÁ et al., 2012). Na výrobu kysaných mléčných výrobků se používá mléko o různé tučnosti, případně se obnovuje sušené mléko. Pro vlastní výrobu se standardizuje obsah tuku a sušiny. Národní legislativou jsou stanoveny skupiny a podskupiny kysaných mléčných výrobků dle obsahu tuku (tabulka 2) (JANŠTOVÁ et al., 2012, KALHOTKA et al., 2009). Tabulka 2. Obsah mléčného tuku a tukuprosté sušiny v kysaných mléčných výrobcích (podle Vyhlášky 328/97 Sb.) Druh výrobku (KMV) Obsah mléčného tuku v % Obsah tukuprosté sušiny v hmotnostních % Kysaná smetana Více než 10,0 včetně Kysaná mléka včetně jogurtového Kysaná mléka odtučněná Více než 0,5 Méně než 0,5 včetně Nejméně 8,0 Podmáslí Méně než 1,5 včetně Nejméně 7,0 Jogurt bílý smetanový Více než 10,0 včetně Jogurt bílý Více než 3,0 včetně Jogurt se sníženým obsahem tuku Méně než 3,0 Jogurt bílý nízkotučný nebo odtučněný Méně než 0,5 včetně Nejméně 8,2 Naproti širokému sortimentu kysaných mléčných výrobků na trhu je spektrum mikrobiálních druhů, které se uplatňují při jejich výrobě poměrně malé. Jako kysací kultury se uplatňují přesně určené, nepatogenní a netoxické kultury bakterií mléčného kysání. Tyto mikroorganismy tvoří velkou skupinu čistých mlékařských kultur, které fermentují laktózu (hlavní zdroj energie pro bakterie) za fakultativně anaerobních (mikroaerofilních) podmínek a tvoří především kyselinu mléčnou (JANŠTOVÁ et al., 2012, LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Podle vzniklých produktů rozlišujeme bakterie mléčného kysání s homofermentativní nebo heterofermentativní produkcí kyseliny mléčné, která je v obou případech hlavním metabolitem. Použité kultury u jednotlivých kysaných mléčných výrobků uvádí tabulka 3 (JANŠTOVÁ et al., 2012). Homofermentativním kvašením rozumíme takový rozklad, kdy z laktózy vzniká nejméně 90 % kyseliny mléčné. Zatímco při heterofermentativním kvašení vzniká 13

14 nejméně 50 % kyseliny mléčné a další produkty, například oxid uhličitý, etanol nebo kyselina octová (JANŠTOVÁ et al., 2012). Mezi hlavní funkce bakterií mléčného kysání patří funkce prokysávací, čímž rozumíme produkci kyseliny mléčné, dále funkce aromatizující, kdy dochází ke vzniku senzoricky významných složek, jako je diacetyl, acetaldehyd a další. V neposlední řadě funkce dieteticko-léčebná (JANŠTOVÁ et al., 2012). Tabulka 3. Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (podle Vyhlášky 328/97 Sb.) Název kysaného výrobku Použitá kultura Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g Acidofilní mléko Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení 10 6 Lactobacillus acidophilus Jogurty Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius ssp. thermohilus a Lactobacillus delbruckii ssp. bulgaricus 10 7 Kysané mléko vč. smetanového zákysu, podmáslí a kysané smetany Monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kysání Kefír Zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašujících laktózu Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství Kefírové mléko Zákys skládající se kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Kysaný mléčný výrobek s bifido-kulturou Bifidobacterium sp. V kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kysání 10 6 Bakterie kysání Bakterie kysání bifidobakterie mléčného a kvasinky mléčného a kvasinky Výroba jednotlivých kysaných mléčných výrobků se odlišuje na základě požadavků na tepelné ošetření, použitou mlékařskou kulturu, kultivační podmínky i mnohým dalším. Principielně lze však ve stručném schématu shrnout obecný postup výroby kysaných mléčných výrobků, který uvádí obrázek 1. 14

15 Obrázek 1. Princip výroby kysaných mléčných výrobků (FORMAN, 1994) 15

16 2.2.2 Změny složek mléka při výrobě kysaných mléčných výrobků Působením bakterií mléčného kysání dochází ke změnám základních složek, které jsou v mléčné surovině obsaženy Laktóza Mléčný cukr neboli laktóza je v mléce hlavním zdrojem energie pro metabolismus bakterií. Během fermentace podléhá homofermentativnímu kvašení, při němž dochází k enzymové hydrolýze laktózy na glukózu a galaktózu. Oba tyto monosacharidy jsou dále fermentovány na optické izomery kyseliny mléčné. Glukóza je fermentována na kyselinu mléčnou přímo, galaktóza po enzymové přeměně na glukózu. V menší míře se může uplatňovat také kvašení heterofermentativní, při němž jsou v malém množství produkovány těkavé mastné kyseliny (např. mravenčí, octová, propionová), karbonylové sloučeniny (acetaldehyd, diacetyl), etanol a oxid uhličitý (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001) Bílkoviny Složení aminokyselin a jejich celkové složení se u kysaných mléčných výrobků příliš neliší od mléka. Při fermentaci dochází k uvolňování peptidů a aminokyselin z kaseinu působením proteolyticky aktivnějších laktobacilů. Část proteolyticky uvolněných aminokyselin je využita jako zdroj dusíku, část zůstává ve zfermentovaném mléce. Stupeň degradace kaseinu závisí na použitém rodu a druhu čisté mlékařské kultury, ph, teplotě a době skladování (FORMAN, 1994) Mléčný tuk Nacházíme patrné změny v množství i zastoupení volných mastných kyselin ve zfermentovaném a nezfermentovaném mléce. Jejich relativní množství se mění v závislosti na druhu a složení mléka. Malá množství volných mastných kyselin vznikají i při enzymových změnách laktózy a degradaci aminokyselin (FORMAN, 1994) Vitaminy Vitaminy jsou při fermentaci spotřebovávány bakteriemi mléčného kvašení a to zejména v logaritmické fázi růstu. Následně jsou těmito bakteriemi produkovány. Existují rozdíly podle použitých bakteriálních kultur (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). 16

17 Minerální látky Během fermentace nedochází k významným změnám obsahu minerálních látek (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001) Jogurt Jogurt je kysaný mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi pomocí mikroorganismů. Vyrábí se z mléka s nastaveným obsahem tuku (nízkotučný, smetanový atd.). Někdy lze navýšit obsah sušiny přidáním zahuštěného nebo sušeného mléka. Takto připravená směs je prokysávána jogurtovou kulturou, u níž je základem Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Laktobacily stimulují růst streptokoků, uvolňováním aminokyselin, při proteolytickém rozkladu bílkovin mléka a streptokoky působí stimulačně na růst laktobacilů produkcí kyseliny mravenčí, která snižuje redoxní potenciál prostředí. V prvních fázích výroby převažuje v jogurtu Streptococcus thermophilus. Dokud ph neklesne pod 5,0. Růst Lactobacilla delbrueckii ssp. bulgaricus je stimulován poklesem ph z 6,5 na 5,5. Tento mikrob je významným producentem acetaldehydu a kyseliny mléčné. Dodává tak výrobku charakteristickou chuť. Pokračující produkce kyseliny snižuje ph na 4,6. Při této hodnotě dojde k zastavení fermentace (ANDĚL, 2010). Poměr tyčinek a koků v kultuře se pohybuje v rozmezí 1:1 až 1:2. Jejím úkolem při fermentaci je produkce kyseliny mléčné, aromatických látek, případně látek slizovitých, zlepšujících konzistenci jogurtů. V neposlední řadě také štěpení bílkovin. Látkou zodpovědnou za aroma jogurtů je acetaldehyd. Mikroorganismy musí být ve výrobku obsaženy minimálně v koncentraci 10 7 v 1 ml (MISTRY, 2001, ANDĚL, 2010). Jogurty jsou nejrozšířenějšími kysanými mléčnými výrobky s dlouholetou tradicí průmyslové výroby. Obsahují řadu biologicky aktivních látek, které jsou přínosné pro lidský organismus. Jedná se zejména o bakterie použité při jejich výrobě bakterie mléčného kysání a produkty jejich metabolismu. Do některých jogurtů jsou dále přidávány probiotické kultury Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum aj. (KALHOTKA et al., 2009). 17

18 Mikroorganismy potenciálně kontaminující jogurty Jak bylo uvedeno výše, jogurtová kultura, při metabolismu laktózy, produkuje kyselinu mléčnou, čímž značně zvyšuje kyselost prostředí. Kyselé prostředí způsobuje snížení počtu kontaminujících mikroorganismů (například koliformních bakterií). Mikroorganismy, které byly ve výchozí surovině, však většinou přežívají (CEMPÍRKOVÁ a kol., 1997, GÖRNER, VALÍK, 2004). Některé mikrobiální druhy, rody nebo skupiny a jejich limity nás mohou informovat o mikrobiologickém stavu a mikrobiologických procesech probíhajících ve vyšetřovaných vzorcích. Tyto mikroorganismy a jejich počty se v mikrobiologické praxi nazývají indikátorové mikroorganismy (GÖRNER, VALÍK, 2004). Indikátorové mikroorganismy musí být snadno, rychle a levně zjistitelné pomocí standardizovaných metod. Tato skupina mikroorganismů nás informuje o primární, případně sekundární kontaminaci surovin nebo výrobku (GÖRNER, VALÍK, 2004). Celkový počet mikroorganismů (CPM) Pod pojmem celkový počet mikroorganismů (CPM) stanovený v 1 ml nebo v 1 g vzorku rozumíme počet kolonií označovaných zkratkou KTJ (kolonie tvořící jednotky), které vyrostly z očkovaného množství na nebo v předepsané živné půdě s dodržením podmínek výrobce (GÖRNER, VALÍK, 2004). CPM ukazatel zahrnuje mléčnou mikroflóru, která je běžnou součástí mléka nebo mléčného výrobku, ale také mikroflóru, která se do mléka dostává během dojení a představuje technologické a zdravotní komplikace (VYLETĚLOVÁ, 2005). Kvasinky a plísně V kysaných mléčných výrobcích působí rozklad častěji kvasinky, než plísně. Účinným opatřením proti těmto kontaminantům je kromě hygieny výroby chlazení pod 10 C. Aerogenní kontaminace působí zejména zástupci čeledi Mucoraceae, jejichž spory jsou ubikvitální a rychle se šíří. Z kvasinek přichází v úvahu nejčastěji Saccharomyces cerevisiae a Kluyveromyces fragilis (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Kvasinky a plísně se vyznačují výraznou proteolytickou, lipolytickou a sacharolytickou aktivitou a jsou poměrně náročné na živiny. Dobře snášejí kyselé 18

19 prostředí jogurtu a nižší teploty. Pokud kontaminují výchozí surovinu, mohou se při fermentaci a následně při nevhodném skladování výrobku pomnožit. Ke kontaminaci kvasinkami jsou mimořádně náchylné ovocné jogurty (ochucené džemem nebo sirupem). Výsledkem kontaminace mohou být nežádoucí senzorické změny, zejména v chuti (kvasničná chuť) a tvorba plynu, která se projeví jako bublinky na povrchu výrobku (GÖRNER, VALÍK, 2004). Koliformní mikroorganismy Obsah koliformních bakterií v potravinách se hodnotí jako indikátor zachování správného technologického postupu jejich získávání a zpracování, případně jejich chlazení a správné dekontaminace technologického zařízení a nářadí. Při posouzení jejich přítomnosti, je třeba mít na paměti, že potraviny, které tyto bakterie obsahují, nebyly a nejsou znečištěné fekáliemi, jak se mnohdy nesprávně usuzuje z jejich názvu (GÖRNER, VALÍK, 2004). V mléku a mléčných produktech, syrových nebo i tepelně upravených je určité množství koliformních bakterií součástí běžné mikroflóry. Hlavním zdrojem koliformních bakterií v syrovém mléce je kontaminované nářadí a zařízení používané při dojení mléka a následně rozvoj koliformních bakterií v nedostatečně chlazeném mléce (GÖRNER, VALÍK, 2004). Dle platné ČSN je ještě tolerované množství koliformních bakterií ve fermentovaných mléčných výrobcích 10 2, ve dvou vzorcích z pěti Výroba jogurtů Mléko je zakysáváno ve fermentačních tancích (fermentorech), a buď je plněno přímo do spotřebitelského balení, ve kterém probíhá fermentační proces, anebo fermentace probíhá přímo v tancích a po prokysání a případném promíchání je výrobek vychlazen a plněn do spotřebitelského balení. Podle toho rozlišujeme výrobu klasickou nebo tankovou. Klasická výroba Při klasické výrobě vznikají takzvané jogurty s pevným koagulátem. Vyrábí se z mléka o zvýšené sušině (21 %), která obsahuje 4,5 % tuku. Požadované sušiny se dosahuje zahuštěním nebo přídavkem kondenzovaného mléka. Zahuštěné mléko 19

20 je pasterováno při 95 C po dobu 20 sekund. Po ochlazení na 45 až 42 C se očkuje 1 až 2 % jogurtové kultury. Naočkované mléko je plněno do spotřebitelských obalů, ve kterých zraje při 45 až 42 C 2 až 4 hodiny. Kysání se zastavuje co nejrychlejším ochlazením na 10 C. Po ukončení fermentace má mít jogurt 60 až 65 SH 2 a v době expedice ne více, než 75 SH (GÖRNER, VALÍK, 2004). Takto vyrobený jogurt má bílou barvu, hladký povrch jemnou konzistenci. Při obrácení kelímku nevytéká. Jogurty lze vyrábět také ovocné, kdy se džem nebo sirup plní na dno spotřebitelského obalu (KALHOTKA et al., 2009). Tanková výroba Tento způsob výroby jogurtů vznikl především z provozních důvodů a využívá zrání ve zracích tancích při teplotě 30 C po dobu 16 až 18 hodin. Před plněním do spotřebitelského obalu se sraženina rozmíchává a chladí. Pro zabránění vyvstávání syrovátky, se vedle běžné jogurtové kultury, používá také kultura slizotvorná a přidává se vhodný hydrokoloid. Na konci fermentace má mít jogurt 70 až 75 SH (GÖRNER, VALÍK, 2004). Jogurt vyrobený tímto postupem je méně aromatický a méně kyselý, než jogurt vyrobený klasickým způsobem, má také řidší konzistenci (GÖRNER, VALÍK, 2004, KALHOTKA et al., 2009). Z důvodu prodlouženého zracího času a nízké teploty může docházet k růstu kontaminující mikroflóry, například koliformních bakterií nebo kvasinek a plísní (GÖRNER, VALÍK, 2004) Dělení jogurtů Jogurty lze obecně rozdělit na přírodní (bílé) jogurty (natural yogurts, yogurts) a ochucené jogurty (flavoured yogurts), které mohou obsahovat přírodní nemléčné složky (ovoce, zelenina), aromata, barviva a stabilizátory rostlinného nebo živočišného původu. Podle obsahu sušiny, technologie výroby a tím pádem rozdílné konzistence lze jogurty dělit dále na jogurty s pevným koagulátem, jogurty krémovité a jogurty pitné jogurtová mléka (ZADRAŽIL, 2002). 2 Stupně SH (Soxhlet-Henkela) termín používaný v mlékařství pro označení kyselosti mléčného výrobku. Kyselost mléka dle SH je dána počtem ml 0,25mol/l roztoku hydroxidu sodného, spotřebovaného při titraci 100 ml mléka za přídavku fenolftaleinu jako indikátoru. 20

21 Bílé jogurty Jsou základním výrobkem z řady jogurtů, mají pevný koagulát a jsou od nich odvozeny ochucené varianty. Při výrobě se standardizovaná směs pasteruje při 95 a více C po dobu 20 sekund až několik minut. Po homogenizaci se tepelně standardizuje na 42 až 45 C a inokuluje se 1 ž 2 % zákysu. Zrání se ukončuje, když titrační kyselost dosáhne 65 SH, a to ochlazením tak, aby kyselost při expedici nepřesáhla 75 SH (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Ochucené jogurty Do této skupiny řadíme ovocné jogurty, což jsou bílé jogurty s přídavkem kusového ovoce nebo džemu. Ovocný přídavek se dávkuje na dno spotřebitelského obalu (lze dávkovat i na povrch hotového jogurtu nebo ovocnou směs úplně oddělit), na něj se vrství inokulovaná směs a dále se postupuje jako u bílého jogurtu (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001, ZADRAŽIL, 2002). Druhým zástupcem této skupiny jsou jogurty se sirupem. Vyrábí se z pasterované směsi pro bílý jogurt. Sirup se asi po hodině inkubace směsi ve fermentoru rozmíchá do jogurtu, jinak by ovlivnil zrání. Po dokonalém rozmíchání se ochucená směs plní do spotřebitelských obalů (LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). Jogurty klasické Jedná se o jogurty s nerozmíchaným koagulátem, zrající ve spotřebitelském obalu. Výrobky mají pevnou, porcelánovitou, až lomivou konzistenci (JANŠTOVÁ et al., 2012, ZADRAŽIL, 2002). Jogurty s rozmíchaným koagulátem, krémovité Fermentace a chlazení u těchto výrobků probíhá ve fermentačním tanku a po ochlazení a rozmíchání je plněn do spotřebitelských obalů. Jogurty mají konzistenci podle obsahu sušiny (JANŠTOVÁ et al., 2012). Jogurtová mléka Jogurtová mléka se konzumují jako nápoj, jejich konzistence je řídká, tekutá (JANŠTOVÁ et al., 2012, LUKÁŠOVÁ a kol., 2001). 21

22 2.3 Probiotika Jako probiotika označujeme mono- nebo směsné kultury živých mikroorganismů, které po konzumaci příznivě ovlivňují zdraví hostitele zlepšením jeho vlastní mikroflóry. Cílem přídavku vhodného probiotika je zvýšit v tlustém střevě četnost a tím i konkurenceschopnost mikroorganismů, které jsou přínosem pro lidské zdraví. V současné době řadíme do skupiny probiotik laktobacily, streptokoky, enterokoky, bifidobakterie, E. coli a Saccharomyces boulardii (KALAČ, 2003, ANDĚL, 2010). Konzumace probiotik je spojována s řadou zdravotních přínosů. Například laktobacily a bifidobakterie podporují využití minerálů z potravy, především vápníku, fosforu a železa. Zároveň tyto mikroorganizmy syntetizují některé vitamíny (thiamin, riboflavin, pyridoxin, kyanokobalamin, niacin, kyselinu listovou a kyselinu pantotenovou). U probiotických bakterií byla dále zjištěna produkce aktivních látek (bakteriociny, antibiotika a další) a podpora diferenciace některých buněk imunitního systému (HRONEK et al., 2009, TRAVERS et al., 2011, UHRÍN, 2002) Přínosy probiotik, které jsou považovány za prokázané (KALAČ, 2003): ustavení či obnovení vyvážené mikroflóry tlustého střeva, zvýšení odolnosti proti osídlení střeva mikroorganismy vyvolávajícími průjmy, snížení hladiny celkového krevního a LDL cholesterolu, snížení tvorby bakteriálních enzymů v tlustém střevě, které mají mutagenní účinky a mohou vyvolat růst nádorů, zmírnění intolerance vůči laktose, posílení imunitního systému, zvýšené vstřebávání vápníku, syntéza některých vitaminů, některá probiotika produkují bakteriociny, což jsou bílkoviny a peptidy potlačující choroboplodné bakterie. Konzumace probiotik musí být pravidelná a dlouhodobá. Za terapeutické minimum je považována konzumace alespoň 100 g mléčného výrobku s minimálním 22

23 obsahem 10 6 probiotických bakterií v 1 g nebo v 1 ml minimálně jednou denně (GILL, 1998, KOLÁŘOVÁ 2011). Tabulka 4. Přehled nejpoužívanějších probiotických mikroorganismů (ROUBAL, 2008) Lactobacillus Bifidobacteruim Streptococcus Enterococcus Lbc. delbrucki ssp. B. bifidum Str. thermophilus Ent. faecalis bulgaricus Lbc. acidophilus B. longum Ent. faecium Lbc. rhamnosus Lbc. reuteri Lbc. casei B. breve B. infantis Drtivá většina známých bakterií s probiotickými účinky patří do skupiny bakterií mléčného kvašení. Mezi jedny z nejpoužívanějších kmenů patří Lactobacillus acidophilus a některé příbuzné druhy. Dalším často používaným mikrobem je také Bifidobacterium bifidum (KALAČ, 2003) Probiotické kultury Probiotické mikroorganismy musí splňovat určité vlastnosti a to jednak z hlediska zdravotního, ale také z hlediska stability a technologických vlastností (ROUBAL, 2008). Při výběru vhodných kmenů bakterií musíme zohlednit především tři základní kritéria (KALAČ, 2003): Obecná hlediska, jako je původ, spolehlivá identifikace, bezpečnost a odolnost vůči mutacím a stresům vyvolaným prostředím a vůči nepříznivým podmínkám, zejména kyselému prostředí žaludku a trávicím enzymům v tenkém střevu. Technická hlediska, mezi která patří růstová schopnost během jejich kultivace, životnost během aplikace do potravin, jejich dopravy a skladování. Funkční hlediska, tedy zdravotní přínos pro konzumenta. Velmi významnou otázkou je koncentrace probiotických bakterií v potravině. Jak bylo již uvedeno výše, za účinný je považován obsah alespoň 10 6 životaschopných 23

24 bakterií v 1 g nebo v 1 ml potraviny. Nutné je ale také přihlédnout ke skutečnosti, jak dlouho zůstávají přijatá probiotika v lidském organismu účinná. Dosavadní výsledky výzkumu udávají, že se jim příliš nedaří v konkurenci přirozené mikroflóry se trvale usadit a kolonizovat tlusté střevo. Jednorázová konzumace je tedy přirozeně neúčinná (KALAČ, 2003). K nejdůležitějším funkčním, vědecky podloženým účinkům probiotik patří, jak již bylo uvedeno výše, modulace imunity a posílení slizniční bariéry střev. Probiotika využívají několika principů (HRONEK et al., 2009, KVASNIČKOVÁ, 2000): Úprava střevní mikroflóry. Adheze ke střevní sliznici, čímž zamezí adhezi patogenních mikroorganismů. Úprava dietetických proteinů střevní mikroflórou. Modifikace enzymové aktivity bakterií, zejména té, která má vliv na indukci nádorů. Ovlivnění permeability střevní sliznice. Obrázek 2. Schematické znázornění možných principů, kterými mohou probiotika zneškodnit patogen (podle TRAVERS et al., 2011) 24

25 Při zaměření na legislativu v oblasti probiotických bakterií zjistíme, že v rámci Evropské unie dosud neexistuje právní předpis, který by upravoval uvádění potravin s přidanými mikroorganismy na trh. Z části lze použít nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 258/97 o nových potravinách a nových složkách potravin. Na doporučení odborníků z FAO/WHO by na obale takového výrobku měly být uvedeny tyto údaje (Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002): Označení rodu, druhu a kmene probiotického mikroorganismu. Minimální množství živých buněk na konci doby trvanlivosti. Výživové tvrzení. Doporučená dávka ve vztahu k výživovému tvrzení. Podmínky skladování. Kontaktní údaje o výrobci. Podle průzkumů však byly zjištěny odchylky od tohoto doporučení. Například mikroorganismy nebyly správně označeny, počet mikroorganismů ke konci doby trvanlivosti nebyl shodný s deklarovaným množstvím, termín probiotický byl užíván neoprávněně, atd. (Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002) Stručná charakteristika vybraných rodů probiotických mikroorganismů Rod Lactobacillius Laktobacily jsou anaerobní nebo mikroaerofilní grampozitivní nesporulující tyčinky. Jejich hlavním metabolitem fermentace sacharidů je kyselina mléčná, ale také octová, etanol a oxid uhličitý. Optimální ph pro růst je 5,5 5,9. K zastavení růstu dochází, v závislosti na druhu při ph 4,0 až 3,6. Většina laktobacilů roste v mezofilních teplotách s horní hranicí asi 40 C (BEDNÁŘ et al., 1996, GÖRNER, VALÍK, 2004). Zástupci tohoto rodu jsou považováni za nepatogenní. Studie zabývající se příznivým vlivem lactobacilů na střevní mikroflóru poukazují na schopnosti těchto bakterií kolonizovat zažívací trakt po léčbě antibiotiky a zabránit tak rozvoji nežádoucí mikroflóry vyvolávající průjmová onemocnění (POCHAPIN, 2000). Laktobacily jsou náročné na živiny a růstové faktory, kromě fermentovatelných sacharidů, jako zdroje uhlíku a energie vyžadují také nukleotidy, aminokyseliny a vitaminy skupiny B. Laktobacilům vyhovuje živné médium obsahující kromě běžných 25

26 složek také růstové faktory jako například mangan, estery kyseliny octové a olejové. Konkrétně se jedná o Tween 80, který působí na mnoho laktobacilů stimulačně (GÖRNER, VALÍK, 2004, NOVÁKOVÁ, 2008). Do mléka se laktobacily dostávají z vnějšího prostředí, prachem, stykem s mlékárenským nářadím a zařízením. Speciálně adaptovaný na mléko je Lactobacillus delbruckii ssp. bulgaricus, který je spolu se Streptococcus salivarius ssp. thermophilus složkou jogurtové kultury. Pro výrobu kefíru je určen heterofermentativní druh L. kefir (GÖRNER, VALÍK, 2004). Z potravinářského a biotechnologického hlediska patří tento rod k nejdůležitějším. Základní členění se odvíjí od schopnosti laktobacilů vytvářet při fermentaci sacharidů hlavní a vedlejší produkty. Podle tohoto kritéria se člení na (ŠILHÁNKOVÁ, 2002): Obligátně homofermentativní (zástupci: L. delbruckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbruckii ssp. lactis). Fakultativně heterofermentativní (zástupci: L. casei ssp. rhamnosus, L. casei ssp. casei, L. plantarum). Obligátně heterofermentativní (zástupci: L. brevis, L. fermentum, L. kefir). Homofermentativní laktobacily zkvašují glukózu pouze na kyselinu mléčnou a nefermentují pentózy, ani glukonát, zatímco fakultativně heterofermentativní bakterie tvoří z glukózy kromě kyseliny mléčné také kyselinu octovou, mravenčí a etanol a pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Obligátně heterofermentativní laktobacily fermentují glukózu výhradně na kyselinu mléčnou, octovou a oxid uhličitý. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou (GÖRNER, VALÍK, 2004, KOHOUTKOVÁ, 2005) Rod Streptococcus Streptokoky jsou grampozitivní kataláza negativní koky uspořádané do dvojic a řetízků. Většina druhů je fakultativně anaerobních s teplotním optimem 37 C a nižší, s výjimkou termofilního Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, který má kultivační optimum mezi 30 až 42 C. Jsou to bakterie poměrně kultivačně náročné na živiny. Pro svůj růst a metabolismus vyžadují aminokyseliny, peptidy, puriny, pyrimidiny 26

27 a vitaminy. Pro optimální růst v syntetických živných médiích vyžadují glukosu nebo jiný fermentovatelný sacharid (BEDNÁŘ et al., 1996, GÖRNER, VALÍK, 2004). Tento rod zahrnuje druhy podmíněně patogenní i patogenní. Pro potravinářské využití přichází v úvahu Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, který je součástí jogurtové kultury a dále druhy Streptocossus lactis a Streptococcus cremoris, které najdeme jako součást máslařských kultur používaných k zakysávání smetany (BEDNÁŘ et al., 1996, ZORNÍKOVÁ, 2007). Mezi roky 1984 až 1985 byly z klasifikace streptokoků vyřazeny rody Enterococcus a Lactococcus, které byly až do té chvíle jeho součástí (GÖRNER, VALÍK, 2004) Rod Enterococcus Jde o grampozitivní aerotolerantní koky ve dvojicích a krátkých řetízcích. Od streptokoků se liší svojí kultivační nenáročností, rezistencí k vysokému ph (8,5) a schopností růst v hypertonickém roztoku (6,5% NaCl), rostou i při nízké teplotě (10 C) a při 45 C přežívají i půlhodinové zahřátí. Některé kmeny přežívají i předepsané pasterizační teploty, proto bývají běžnou flórou pasterovaného mléka (BEDNÁŘ et al., 1996, GIRAFFA, 2003). Enterokoky tvoří běžnou součást mikroflóry zažívacího traktu lidí i zvířat. Jejich výskyt v potravinách však nelze dávat do přímé souvislosti s fekálním znečištěním. Tyto bakterie můžeme najít běžně také na rostlinách a ve velkém množství v silážovaných krmivech (GÖRNER, VALÍK, 2004, ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Připisuje se jim však i toxicita a tvorba biogenních aminů. Své využití nachází, mimo jiné, také jako indikátory nedávného znečištění pitné vody. Jako původce lidských onemocnění je nacházíme především v močových a žlučových cestách a často také jako původce nozokomiálních 3 nákaz (BEDNÁŘ et al., 1996). Enterokoky izolované z potravin mají nízkou virulenci a byly u nich pozorovány antimikrobiální vlastnosti připisované schopnosti produkovat bakteriociny. Tato schopnost je činí konkurenceschopnými proti bakteriím v zažívacím traktu při jejich využití jako probiotik (BANWO et al., 2012). 3 Nozokomiální nákazy jsou onemocnění exogenního nebo endogenní původu, která vznikají v souvislosti s hospitalizací pacientů v nemocničním zařízení. 27

28 Zástupci rodu Enterococcus intenzivně fermentují sacharidy a podílejí se na tvorbě aroma a chuti potravin. Této schopnosti využíváme v mnoha potravinářských odvětvích. Například při zrání sýrů a některých masných výrobků. V mléčných výrobcích plní svoji úlohu především během fermentačního procesu (GIRAFFA, 2003) Rod Bifidobacterium Jedná se o rod anaerobních nesporulujících tyčinek, někdy se větvících na konci. V některých případech mohou tolerovat malé množství kyslíku. Tato schopnost se liší mezi třídami i mezi druhy. Bifidobakterie jsou nepohyblivé a nesnáší příliš kyselé prostředí. Optimální ph pro růst je 6,5 až 7,0. Při ph 5,0 až 4,5 a 8,0 až 8,5 nerostou. Co se týká teploty, většina bifidobakterií má kultivační optimum mezi 36 až 38 C (BEDNÁŘ et al., 1996, TALWALKAR, KAILASAPATHY, 2003). Jejich hlavními metabolity sacharidů jsou kyselina mléčná a octová. Vedlejšími produkty jsou kyselina mravenčí, etanol a kyselina jantarová. Některé kmeny mají v mléku mírnou proteolytickou aktivitu (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bifidobakterií je dosud známo více než 30 druhů. Jedná se o téměř ideální probiotické bakterie, protože jsou v podstatě nepatogenní, jsou to typické střevní mikroorganismy, izolované ze zažívacího traktu člověka nebo jiných teplokrevných zvířat, u kterých jsou doloženy prokazatelné pozitivní efekty na zdravotní stav. Určitým problémem může být jejich citlivost na vnější podmínky (RADA, MAROUNEK, 2005, ZORNÍKOVÁ, 2007). 2.4 Prebiotika Jsou charakterizována jako nestravitelné složky potravy selektivně podporující růst nebo aktivitu jedné nebo omezeného počtu bakterií tlustého střeva, které mohou zlepšit zdravotní stav konzumenta. Brání tak růstu nežádoucí flóry, která se může podílet na vzniku toxických produktů (amoniak, aminy, nitrosaminy, fenoly, indoly, aj.) (MÜLLEROVÁ, 2003). Funkci současných prebiotik přidávaných do potravin plní některé oligosacharidy, které nesmějí být stravitelné, jelikož se stávají substrátem pro vybrané žádoucí bakterie, které je prokvašují na těkavé mastné kyseliny - máselnou, octovou 28

29 a propionovou. Oligosacharidy používané jako prebiotika mohou být přirozené (inulin) nebo umělé (vychází ze sacharosy, laktosy, škrobu) (KALAČ, 2003, KUNOVÁ, 2011). Proto, aby určité potravinářské přísady - některé oligosacharidy - fungovaly jako prebiotika, musí splňovat několik požadavků. Horní částí zažívacího traktu mají procházet v nezměněné podobě. Dále mají sloužit určitým bakteriím tlustého střeva jako substrát, který vede ke zvýšení metabolické aktivity těchto bakterií anebo k podpoře jejich růstu, tím mají pozitivně ovlivňovat složení mikroflóry tlustého střeva. V neposlední řadě mají mít celkově pozitivní vliv na zdraví příslušného jedince. Z technologického hlediska je pozoruhodné, že oligosacharidy zlepšují texturu a chuť výsledného produktu (GÖRNER, VALÍK, 2004, KVASNIČKOVÁ, 2000). 2.5 Synbiotika Název synbiotikum vznikl z pozorovaného jevu synergismu, což znamená, že zdravotní přínos kombinace dvou složek je větší, než vliv každé ze složek samostatně. Synbiotikem tedy rozumíme takovou potravinu, která obsahuje probiotickou kulturu a zároveň prebiotikum podporující růst konkrétního probiotika (KALAČ, 2003, KOLÁŘOVÁ, 2011). Synbiotikum se definuje jako směs probiotik a prebiotik, která prospěšně ovlivňuje hostitele zlepšením přežití a usídlení živých dietetických suplementů v zažívacím traktu tím, že selektivně stimuluje růst nebo aktivuje metabolismus jedné nebo omezeného počtu bakterií podporujících zdraví, čímž pozitivně působí na hostitele (KVASNIČKOVÁ, 2000). 29

30 3 CÍL VLASTNÍ PRÁCE Cílem předkládané práce bylo v literární rešerši stručně nastínit problematiku na základě dostupných literárních zdrojů. Zpracovat přehled technologie výroby jogurtů, jejich příznivých účinků na lidský organismus a mikrobiálního osídlení. Praktická část práce si kladla za cíl posoudit vybrané jogurty na základě zvolených mikrobiologických parametrů, zjistit množství a životaschopnost vybraných mikrobiologických ukazatelů na počátku a po uplynutí doby minimální trvanlivosti. 30

31 4 MATERIÁL A METODIKA Praktická část práce probíhala v prostorách Mendelovy univerzity v Brně na území Agronomické fakulty na Ústavu technologie potravin v mikrobiologické laboratoři. Jogurty byly zakoupeny v různých prodejních řetězcích, vždy dva vzorky stejné šarže. Jeden jogurt byl testován ihned po zakoupení a druhý po uplynutí doby minimální trvanlivosti. Uvedený testovací postup jsme zopakovali dvakrát. Pro práci se vzorky jogurtů byl vyhrazen mikrobiologický box pro zpracování potravin. Box byl před začátkem práce vždy ošetřen UV zářením po dobu minimálně jedné hodiny. Pracovní stoly byly po vyzáření otřeny 75% etanolem. Živná média spolu s fyziologickým roztokem pro ředění vzorků byla připravována čerstvá před každým rozborem a sterilizována v autoklávu 15 minut při 121 C. Pro očkování na mikrobiologické půdy jsme použili metodu zalití do půdy. Každé použité ředění příslušné skupiny mikroorganismů bylo prováděno ve dvojím vyhotovení, aby byla eliminována chyba provedení. Veškeré experimenty byly prováděny za aseptických podmínek s pomůckami sterilizovanými v horkovzdušném sterilizátoru 60 minut při 165 C (skleněné pipety, kádinky, Erlenmayerovy baňky, odměrné válce, zkumavky). Případně s pomůckami jednorázovými (Petriho misky, jednorázové sterilní sáčky na vzorky potravin). Vykultivované kolonie byly spočítány za pomocí počítačky kolonií a výsledky byly vyhodnoceny výpočtem. Výpočet byl proveden podle vzorce /= Ʃ ().(,.). a, b, c, d součty všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách V... použitý objem inokula n1. počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění n2. počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění d... faktor prvního pro výpočet použitého ředění 31

32 4.1 Analyzované vzorky Analyzováno bylo 10 vzorků jogurtů. Vybrali jsme zástupce jogurtů různých kategorií. Jogurty zrající ve spotřebitelských obalech, zrající v tanku. Jogurty bio, konvenční i farmářské. Další oblastí rozlišení jsou jogurty ovocné a bílé. Většina vzorků spadá minimálně do dvou kategorií. V jogurtech farmářských jsme předpokládali výskyt koliformních bakterií z důvodu potenciální zhoršené hygieny technologického procesu při zpracování mléčné suroviny a následné výrobě jogurtů. V ovocných jogurtech byl předpokládaný potenciální výskyt kvasinek, případně plísní. Jogurty zrající ve spotřebitelském obalu: Jogurt bílý Agrola Jogurt jahoda Agrola Farmářský jogurt bílý Farmářský jogurt s příchutí jahoda Selský jogurt bílý s probiotickou kulturou Bifi Selský jogurt jahoda s probiotickou kulturou Bifi Jogurty zrající v tanku: BIO jogurt bílý BIO jogurt jahodový Florian aktive jahoda + brusinka + 3 probiotické kultury Activia bílá s bifidokulturou Jogurty bio: BIO jogurt bílý BIO jogurt jahodový Jogurty farmářské: Farmářský jogurt bílý Farmářský jogurt bílý s příchutí jahoda 32

33 Jogurty bílé: Jogurt bílý Agrola BIO jogurt bílý Farmářský jogurt bílý Selský jogurt bílý s probiotickou kulturou Bifi Activia bílá s bifidokulturou Jogurty ovocné: Jogurt jahoda Agrola BIO jogurt jahodový Farmářský jogurt bílý s příchutí jahoda Selský jogurt jahoda s probiotickou kulturou Bifi Florian aktive jahoda + brusinka + 3 probiotické kultury Stručný popis použitých vzorků Jihočeský jogurt bílý 200g Výživové hodnoty ve 100 g: mléčný tuk 3,5 g, bílkoviny 5,9 g, sacharidy 5,1 g, vápník 210 mg, energie 360 kj/86 kcal. Složení: výrobce neudává. Trvanlivost: 21dnů. Výrobce: AGRO-LA, spol. s.r.o. Zdroj obrázku: Jihočeský jogurt jahoda 200g Výživové hodnoty ve 100 g: mléčný tuk 3 g, bílkoviny 5 g, sacharidy 10 g, vápník 190 mg, energie 400 kj/96 kcal. Složení: výrobce neudává. Trvanlivost: 21dnů. Výrobce: AGRO-LA, spol. s.r.o. Zdroj obrázku: 33

34 BIO jogurt bílý 150g Výživové hodnoty ve 100 g: obsah tuků 3,2%, obsah bílkovin 5 g, obsah sacharidů 4,8 g, energie 320 kj/77 kcal. Složení: výrobce neudává. Trvanlivost: 20 dnů. Výrobce: OLMA a.s. Zdroj obrázku: BIO jogurt jahodový 150g Výživové hodnoty ve 100 g: obsah tuků 2,4%, obsah bílkovin 3 g (ochucení jahoda 4 g), obsah sacharidů 15,3 g (ochucení jahoda 13,5 g), energie 420 kj/101 kcal. Složení: výrobce neudává. Trvanlivost: 20 dnů. Výrobce: OLMA a.s. Zdroj obrázku: Farmářský jogurt bílý 320g Výživové hodnoty ve 100g: energie 360 kj, bílkoviny 3,4%, sacharidy 4,5%. Složení: mléko, živá jogurtová kultura, A, B, T, probiotické kultury (dodává firma O.K.SERVIS BioPro, s.r.o. - definovaná směsná kultura obsahuje Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium a Streptococcus thermophilus), obsah tuku minimálně 4,5%. Trvanlivost: 10 dnů. Výrobce: Farma rodiny Němcovy s.r.o. Zdroj obrázku: Farmářský jogurt bílý s příchutí jahoda 130g Výživové hodnoty: výrobce neudává. Složení: 80% jogurt (mléko, jogurtová kultura), 20% marmeláda (sacharóza, jahoda, jahodová dřeň, kukuřičný škrob, karubin, karmin, citronan sodný, kyselina citronová), obsah tuku minimálně 4,5%. 34

35 Trvanlivost: 10 dnů. Výrobce: Farma rodiny Němcovy s.r.o. Zdroj obrázku: Selský jogurt bílý s probiotickou kulturou Bifi 200g Výživové hodnoty ve 100 g: tuky 3,9 g, bílkoviny 3,5 g, sacharidy 4,3 g, energie 277 kj/66 kcal. Složení: mléko, mléčná bílkovina, jogurtová kultura, probiotická kultura Bifidobacterium BB12 a Lactobacillus LA 5. Obsah tuku nejméně 3,5%. Trvanlivost: výrobce neudává. Výrobce: Hollandia Karlovy Vary a.s. Zdroj obrázku: Selský jogurt jahoda s probiotickou kulturou Bifi 200g Výživové hodnoty ve 100 g: tuky 3,2 g, bílkoviny 2,9 g, sacharidy 12,8 g, energie 387 kj/92 kcal. Složení: mléko, ovocná složka 18 % (cukr, jahody 43 %, aroma), mléčná bílkovina, jogurtová kultura, probiotická kultura Bifidobacterium BB12 a Lactobacillus LA 5. Obsah tuku nejméně 3,0%. Trvanlivost: výrobce neudává. Výrobce: Hollandia Karlovy Vary a.s. Zdroj obrázku: Florian aktive jahoda + brusinka + 3 probiotické kultury 135g Výživové hodnoty ve 100 g: obsah tuků 2,2%, obsah bílkovin 4,1 g, obsah sacharidů 14 g, energie 400 kj/95 kcal. Složení: mléko, ochucující složka 20% (cukr, jahody 25% brusinky 10%, koncentrát z černé mrkve, aroma), mléčná bílkovina. Trvanlivost: 20 dnů. Výrobce: OLMA a.s. Zdroj obrázku: 35

36 4.2 Příprava vzorků Activia bílá s bifidokulturou 180g Výživové hodnoty ve 100 g: tuk 3,4 g, nasycené mastné kyseliny 2,1 g, bílkoviny 4,5 g, sacharidy 5,1 g z toho cukry 5,1 g, sodík 61 mg, vápník 145 mg, energie 288 kj/69 kcal. Složení: výrobce neudává. Trvanlivost: výrobce neudává. Výrobce: Danone a.s. Zdroj obrázku: Uzávěr spotřebitelského balení a jeho okolí byly před otevřením otřeny 75% etanolem, také pro manipulaci se vzorkem byla použita lžíce otřená 75% etanolem. Vzorky byly očištěnou lžící důkladně homogenizovány, abychom ve všech částech jogurtu zajistili přítomnost všech jeho složek. Odebrali jsme 10 g vzorku a smíchali ho s 90 ml sterilního fyziologického roztoku (8,5 g NaCl na jeden litr destilované vody). Tato směs byla homogenizována na přístroji Stomacher 30 vteřin. Poté byla ze suspenze připravena řada desetinného ředění. Každá zkumavka s připraveným ředěním byla řádně promíchána na přístroji Vortex 10 vteřin. 1 ml příslušného desetinného ředění byl očkován na řádně označenou jednorázovou Petriho misku a zalit živným médiem připraveným podle návodu deklarovaného výrobcem. Každé příslušné ředění bylo provedeno v duplikátu. Po ztuhnutí živného média na Petriho misce byly vzorky umístěny do příslušných termostatů nastavených na teplotu kultivace deklarovaného výrobcem živného média, pro každou příslušnou skupinu mikroorganismů. V případě, že kultivace vyžadovala anaerobní prostředí, použili jsme systém firmy Merck. Tato souprava má k dispozici 2,5 litrový anaerostat do kterého se po umístění Petriho misek vloží činidlo pro vytvoření anaerobní atmosféry, nazvané Anaerocult A. Uvedený systém jsme připravili dle návodu výrobce. Po uplynutí kultivačního období jednotlivých mikroorganismů byly na Petriho miskách spočítány narostlé kolonie, zapsány do tabulek a následně vyhodnoceny dle vzorce uvedeného výše. 36