MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta NEPRAVIDELNÉ ANTIERYTROCYTÁRNÍ PROTILÁTKY U KLIENTŮ FN BRNO ANALÝZA PŘÍČIN IMUNIZACE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta NEPRAVIDELNÉ ANTIERYTROCYTÁRNÍ PROTILÁTKY U KLIENTŮ FN BRNO ANALÝZA PŘÍČIN IMUNIZACE Bakalářská práce v oboru Zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Simona Hohlová Autor: Dagmar Pantůčková Brno, duben 2012

2 Prohlašuji, že jsem vypracovala bakalářskou práci samostatně dle pokynů vedoucí práce MUDr. Simony Hohlové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne:.. Dagmar Pantůčková

3 ANOTACE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Autor: Univerzita, fakulta: Obor: Dagmar Pantůčková Masarykova univerzita, Lékařská fakulta Zdravotní laborant Název práce: Nepravidelné antierytrocytární protilátky u klientů FN Brno analýza příčin imunizace Název práce v angličtině: Clients with irregular anti-erythrocytic antibodies in University Hospital Brno - analysis of causes of immunization Pracoviště: Vedoucí práce: Transfuzní a tkáňové oddělení FN Bohunice, Brno MUDr. Simona Hohlová Rok obhajoby: 2012 Abstrakt: Předmětem této bakalářské práce je seznámit se s problematikou nepravidelných antierytrocytárních protilátek. V úvodu teoretické části práce jsou shrnuty informace týkající se antigenů a protilátek obecně. V dalších částech se pak zabývám výskytem nepravidelných antierytrocytárních protilátek v systémech krevních skupin, komplikacemi, které mohou způsobovat a možnostmi jejich imunohematologického vyšetření. Praktická část je zaměřena na výskyt nepravidelných antierytrocytárních protilátek u pacientů FN Brno vyšetřených na Transfuzním a tkáňovém oddělení v letech a analýzu příčin imunizace pacientů zejména s ohledem na podané transfuze. Klíčová slova: antigeny, protilátky, erytrocyty, transfuze Souhlasím, aby práce byla zpřístupněna ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

4 Poděkování: Chtěla bych poděkovat MUDr. Simoně Hohlové z Transfuzního a tkáňového oddělení FN Bohunice Brno za její odborné vedení po celou dobu mé bakalářské práce, za poskytnutí informací, cenných rad a připomínek. Velice děkuji za věnovaný čas, ochotu a trpělivost, kterou mi poskytla společně s dalšími pracovníky TTO FN Brno.

5 Použité symboly a zkratky AGH antiglobulinové sérum (Anti Human Globulin) AIHA autoimunní hemolytická anémie ARDS syndrom dechové tísně dospělých (Adult Respiratory Distress Syndrome) DIC diseminovaná intravaskulární koagulace DNA deoxyribonukleová kyselina ELISA analýza s enzymem navázaným na imunosorbent (protilátku) (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) FN fakultní nemocnice HLA hlavní histokompatibilní systém člověka (Human Leukocytes Antigens) HON hemolytické onemocnění plodu a novorozence IgA imunoglobulin A IgD imunoglobulin D IgE imunoglobulin E IgG imunoglobulin G IgM imunoglobulin M LF:BLTS0411p Imunohematologie a transfuzní služba - přednáška (jaro 2011) LISS médium s nízkou iontovou silou (Low Ionic Strenght Solution) MAC komplex atakující membránu (Membrane Attack Complex) NAT nepřímý antiglobulinový test NK buňky přirození zabiječi (Natural killers) PAT přímý antiglobulinový test PEG polyethylenglykol RHEGA imunoglobulin anti-d TP transfuzní přípravek TTO transfuzní a tkáňové oddělení

6 Obsah 1 Úvod... 9 I TEORETICKÁ ČÁST Základní imunohematologické pojmy Antigeny Protilátky Protilátky krevních skupin Reakce mezi antigenem a protilátkou Aglutinace Inhibice aglutinace Precipitace Hemolýza Nepravidelné antierytrocytární protilátky v systémech krevních skupin Krevní skupinový systém Rh a jeho protilátky Rh protilátky Krevní skupinový systém Kell a jeho protilátky Kell protilátky Krevní skupinový systém Duffy a jeho protilátky Duffy protilátky Krevní skupinový systém Kidd a jeho protilátky Kidd protilátky Krevní skupinový systém Lutheran a jeho protilátky Lutheran protilátky Krevní skupinový systém MNSs a jeho protilátky MNSs protilátky Krevní skupinový systém Lewis a jeho protilátky Lewis protilátky Některé další krevní skupinové systémy a jejich protilátky Protilátky krevně skupinového systému P Protilátky krevně skupinového systému Ii... 31

7 3.8.3 Protilátky krevně skupinového systému Diego Protilátky krevně skupinového systému Colton Protilátky krevně skupinového systému Dombrock Protilátky krevně skupinového systému Xg Protilátky krevně skupinového systému Gerbich Protilátky krevně skupinového systému Cartwright, Scianna, Cromer, Knops, Indian Komplikace způsobené nepravidelnými antierytrocytárními protilátkami Hemolytické onemocnění novorozence a aloimunizace v těhotenství Formy hemolytického onemocnění novorozence Vyšetření v těhotenství s rizikem aloimunizace Léčba hemolytického onemocnění novorozence Prevence aloimunizace matek a hemolytického onemocnění novorozence Hemolytické potransfuzní reakce Rozdělení hemolytických potransfuzních reakcí Hemolytické potransfuzní reakce - akutní (intravaskulární) Hemolytické potransfuzní reakce - akutní (extravaskulární) Hemolytické potransfuzní reakce - opožděný typ Prevence hemolytických potransfuzních reakcí Průkaz nepravidelných antierytrocytárních protilátek Antiglobulinové (Coombsovy) testy Rozdělení antiglobulinových testů Provedení antiglobulinových testů Screening a identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek Screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek Identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek II PRAKTICKÁ ČÁST Výsledky Výskyt protilátek z hlediska pohlaví Výskyt protilátek z hlediska věku Výskyt protilátek z hlediska diagnóz Počet protilátek v krvi u jednotlivých osob Zastoupení protilátek z jednotlivých krevních skupinových systémů Zastoupení konkrétních protilátek v procentech... 53

8 7.7 Tvorba protilátek na základě antigenního složení transfuzního přípravku Transfuze jako možná příčina imunizace Závěrečné zhodnocení Závěr SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 60

9 1 Úvod Transfuze erytrocytů představuje pro příjemce z hlediska imunohematologie velké riziko, neboť se na povrchu erytrocytů dárce mohou vyskytovat antigeny krevních skupin, které příjemci na jeho erytrocytech chybí. Imunitní systém příjemce pak na tyto antigeny, které jsou mu cizí, reaguje tvorbou protilátek. Taková transfuze obsahující cizí antigeny pak může u příjemce vyvolat nežádoucí reakci, jakou je destrukce erytrocytů. Při transfuzích je nutné dodržovat shodu v AB0 a RhD skupině. Ostatní Rh antigeny stejně jako antigeny jiných krevních skupin se u příjemce transfuze nevyšetřují, pokud u něj nebyly detekovány nepravidelné antierytrocytární protilátky. V případě, že jsou u příjemce protilátky zjištěny, je nutné pro něj zajistit transfuzi, která neobsahuje antigeny, s nimiž by vytvořené protilátky mohly reagovat. Zajištění vhodné transfuze bývá velmi obtížné v situacích, kdy je u příjemce zjištěno více nepravidelných antierytrocytárních protilátek. V takovém případě je možné využít k vyhledání kompatibilní transfuze registr dárců se vzácnými krevními skupinami. K imunizaci a k vytvoření nepravidelných antierytrocytárních protilátek nemusí dojít pouze po podání transfuze. Může k ní dojít i v těhotenství a to v případech, kdy jsou erytrocytární antigeny matky a plodu odlišné. Teoretická část práce je rozdělena do několika kapitol. Po úvodu, který je obsahem první kapitoly následuje kapitola druhá, která obsahuje obecné informace týkající se antigenů a protilátek. Třetí kapitola je zaměřena na výskyt nepravidelných antierytrocytárních protilátek v jednotlivých systémech krevních skupin. Další kapitola popisuje jejich význam pro vznik hemolytického onemocnění plodu a novorozence a hemolytických potransfuzních reakcí. Pátá a šestá kapitola pak popisuje způsoby a metody využívané ke screeningu a identifikaci nepravidelných antierytrocytárních protilátek. Praktická část práce se zabývá výskytem nepravidelných antierytrocytárních protilátek u pacientů FN Brno vyšetřených na Transfuzním a tkáňovém oddělení v letech a analýzu příčin imunizace pacientů zejména s ohledem na podané transfuze. 9

10 I TEORETICKÁ ČÁST 2 Základní imunohematologické pojmy 2.1 Antigeny Antigeny jsou látky, které mají schopnost vyvolat v organismu tvorbu protilátek nebo aktivaci některých druhů leukocytů. Proces, při kterém jsou antigeny rozpoznávány a je na ně tímto způsobem reagováno, se označuje jako imunizace. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Antigeny mohou pocházet z vnějšího prostředí, jsou cizorodé a označují se jako aloantigeny nebo pocházejí z vlastního organismu, nejsou cizorodé a označují se jako autoantigeny. (Hořejší a Bartůňková, 2009) Antigenem může být v podstatě každá chemická struktura. Nejčastěji se vyskytují v podobě proteinů, polysacharidů, lipidů či lipoproteinů. Důležité je, aby byly přítomny v podobě makromolekul, neboť jen tehdy na ně může imunitní systém správně reagovat. (Hořejší a Bartůňková, 2009) Antigeny s nízkou molekulovou hmotností se sice s protilátkou také váží, za to ale nemají schopnost vyvolat její tvorbu. Takové antigeny pak označujeme jako tzv. hapteny. (Smetana a kol., 1992) Na povrchu antigenu se nacházejí specifické oblasti, se kterými se v případě výskytu váže odpovídající protilátka. Tyto oblasti se označují jako antigenní determinanty neboli epitopy. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Některé antigenní struktury jsou typické jen pro jeden typ krevních buněk (např: pouze na erytrocytech se vyskytují antigeny Rh systému). Naopak jiné antigenní struktury se společně vyskytují na několika krevních elementech zároveň (HLA antigeny, antigeny AB0 systému). (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Ve fosfolipidové membráně erytrocytů se nachází velké množství proteinových molekul. Některé z těchto proteinů mají podíl na vzniku erytrocytárních antigenů. Často bývají tyto proteiny vázány s oligosacharidovými řetězci a nazýváme je jako tzv. glykoproteiny. Vazbou těchto glykoproteinů na fosfolipidovou membránu vznikají glykolipidy. Jako antigeny krevních skupin se pak označují právě tyto glykoproteiny, glykolipidy a řada dalších proteinů v membráně. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) V krvi mají antigenní strukturu, kromě krevních buněk, také bílkoviny nebo enzymy. Označujeme je jako bílkovinné (sérové) skupiny a enzymové skupiny. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) 10

11 2.2 Protilátky Za tvorbu protilátek jsou zodpovědné plazmatické buňky, které vznikají z B-lymfocytů. Samotné B-lymfocyty dozrávají ve fetálních játrech, slezině a kostní dřeni. Prostřednictvím svých receptorů dokážou B-lymfocyty antigen rozpoznat a následně na něj reagovat tím, že se začnou dělit. Dělením dochází ke vzniku plazmatických buněk, které proti antigenu zahájí tvorbu protilátek. (Bartůňková, Paulík a kol., 2005) V krevní plazmě se vyskytuje velké množství bílkovin, ke kterým protilátky řadíme. Ty se při elektroforéze séra pohybují v elektrickém poli nejpomaleji, neboť jsou vázány na gamaglobulinovou frakci. Jako imunoglobuliny je označujeme tehdy, pokud mají vztah k imunitním reakcím. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Molekula imunoglobulinů má tvar písmene Y. Struktura je tvořena dvěma těžkými (H) řetězci a dvěma lehkými (L) řetězci navzájem spojenými disulfidickými můstky. Těžké řetězce jsou tvořeny čtyřmi doménami a lehké řetězce dvěma doménami. Domény těžkého a lehkého řetězce na konci rozvětvené části imunoglobulinové molekuly, označujeme jako variabilní. Jako konstantní jsou označovány ostatní domény. (Hořejší a Bartůňková, 2009) Variabilní část imunoglobulinové molekuly nese vazebné místo, do kterého se váže antigen. Určuje tedy, proti jakému antigenu je protilátka konkrétně namířena. Konstantní část imunoglobulinové molekuly je zodpovědná za jejich rozdělení do 5 tříd: G, M, A, D, E. Prostřednictvím této části se také imunoglobuliny váží na receptory NK buněk, makrofágů, granulocytů a podílejí se tak na odstraňování cizorodých látek, které jsou na těchto buňkách navázány. (Bartůňková, Paulík a kol. 2005) Obrázek 1: Struktura imunoglobulinové molekuly (Dostupné z: 11

12 Jednotlivé třídy imunoglobulinů: IgG - ze všech imunoglobulinů mají v séru největší zastoupení, je známo několik podtříd IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), jsou schopny pronikat placentou, řadíme je mezi inkompletní protilátky a na rozdíl od IgM vznikají až při sekundární imunitní odpovědi (Smetana a kol., 1992) Obrázek 2: Struktura jednotlivých podtříd imunoglobulinu IgG (Dostupné z: IgM - je to protilátka, která se tvoří jako první při imunitní reakci, zodpovídá tedy za primární imunitní odpověď, má podobu pentametru, z důvodu velikosti své molekuly placentou neprochází (Smetana a kol., 1992) IgA - jsou známy dvě formy tohoto imunoglobulinu- slizniční a sérová, rozlišujeme podtřídy IgA1 a IgA2, slouží převážně k ochraně sliznic (Hořejší a Bartůňková, 2009) IgD - jeho koncentrace v séru je velmi nízká a uplatňuje se jako receptor na povrchu B-lymfocytů (Hořejší a Bartůňková, 2009) IgE - jeho koncentrace v séru je za normálních okolností velmi nízká, výrazně se zvyšuje až při alergických a parazitárních onemocněních (Hořejší a Bartůňková, 2009) Z hlediska imunohematologie mají význam zejména IgG a IgM. (Smetana a kol., 1992) Obrázek 3: Jednotlivé třídy imunoglobulinů (Dostupné z: 12

13 Tabulka 1: Základní charakteristiky izotypů lidských imunoglobulinů (Hořejší a Bartůňková, 2009) Izotyp Molekulová Biologický Obsah hmotnost Lokalizace poločas v séru (g/l) (kda) (dny) Funkce Opsonizace, IgG neutralizace, Sérum, přestupuje intersticiální 21 placentu, tekutina sekundární odpověď IgM 900 0,9-2,5 Aktivace komplementu, Sérum, primární povrch 6 odpověď, B-buněk receptor pro antigen IgA ,9-3,5 Sérum, slzy, Ochrana sliny, povrch 6 sliznic, sliznic, opsonizace mléko IgD 180 0,1 Sérum, Receptor pro povrch 3 antigen B-buněk IgE 190 3x10-4 Sérum, Ochrana proti intersticiální 2 parazitům tekutina Protilátky krevních skupin Tvorba protilátek krevních skupin může být vyvolána přítomností příslušného krevně skupinového antigenu, který se do organismu dostal prostřednictvím transfuze nebo těhotenstvím. 13

14 Tyto protilátky můžeme rozdělit na základě několika hledisek: 1. Podle antigenu, proti kterému působí: a) autoprotilátky - působí proti antigenům vlastního těla b) aloprotilátky - působí proti cizím antigenům, které dotyčný získal od jiného jedince 2. Podle příčiny vzniku: a) přirozené protilátky - vyskytují se přirozeně, aniž by se organismu kdy dostal do styku s erytrocyty jiného jedince b) imunní protilátky - se v organismu vyskytují jako následek imunizace způsobené transfuzí nebo těhotenstvím. Je velmi obtížné, až téměř nemožné, zajistit takovou transfuzi, která by se mezi dárcem a příjemcem (kromě AB0 a RhD antigenů) zcela shodovala. Je třeba si uvědomit, že téměř vždy se na erytrocytech dárce vyskytují antigeny, které příjemci na jeho erytrocytech chybí. Jelikož jsou tyto antigeny většinou málo imunogenní, příjemce si proti nim protilátky obvykle netvoří. Pokud je však u příjemce některá z protilátek zjištěna, je třeba pro něj zajistit transfuzi, která neobsahuje příslušný antigen, proti kterému je protilátka namířena. K tvorbě protilátek může dojít také z důvodu těhotenství. Jestliže má dítě na svých erytrocytech antigeny, které zdědilo od otce a matka tyto antigeny na erytrocytech nemá, může proti nim zahájit tvorbu protilátek. Aby však k této situaci došlo, musí se erytrocyty dítěte dostat do krevního oběhu maky. K tomu dochází většinou při porodu, neboť za normálních okolností jsou krevní oběhy matky a dítěte od sebe oddělené. Přirozené a imunní protilátky se od sebe, kromě výše uvedeného, liší také tím, že optimálně reagují při různých teplotách. Přirozené protilátky při teplotách nižších než 30 C (k takovým řadíme imunoglobuliny třídy IgM). Imunní protilátky při teplotě 37 C (k takovým řadíme IgG). 3. Podle schopnosti aglutinovat erytrocyty (serologických vlastností) a) kompletní protilátky - patří do třídy IgM, vzhledem k velikosti své molekuly dokážou překonat vzdálenost mezi erytrocyty, která je udržována prostřednictvím tzv. zeta-potenciálu a způsobovat jejich aglutinaci přímo 14

15 b) inkompletní protilátky - patří do třídy IgG, nemají schopnost aglutinovat erytrocyty přímo, protože nedokážou překonat vzdálenost mezi nimi, a to na základě toho, že jejich molekula je mnohem menší než u kompletních protilátek (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (Smetana a kol., 1992) Tabulka 2: Nejdůležitější rozdíly mezi IgG a IgM protilátkami (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) IgG IgM Malá molekula ( D) Velká molekula ( D) Inkompletní protilátka Kompletní protilátka Klinicky důležitá Klinicky méně důležitá (s výjimkou anti-a a anti-b) Může procházet placentou Nemůže procházet placentou Optimální teplota reakce 37 C Optimální teplota reakce < 30 C 2.3 Reakce mezi antigenem a protilátkou Vazba mezi antigenem a protilátkou je nekovalentní a reverzibilní. Pohromadě jsou drženy prostřednictvím slabých intermolekulárních sil (hydrofobní, vodíkové, elektrostatické, Van der Waalsovy síly). (Smetana a kol., 1992) Síla vazby mezi jedním antigenem a jednou protilátkou se nazývá afinita. Celková síla vazby více protilátek k jednomu antigenu, obsahujícímu více různých epitopů se nazývá avidita (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003). Ke sledování reakce mezi antigenem a protilátkou, respektive ke zjištění množství vytvořeného imunokomplexu, se v imunohematologických laboratořích využívá řada reakcí. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Patří k nim např: aglutinace, inhibice aglutinace, průkaz hemolýzy, precipitace, ELISA, imunofluorescence. (Smetana a kol., 1992) Aglutinace Při této reakci se protilátky váží svými vazebnými místy na antigen, při čemž dochází ke shlukování, či-li aglutinaci. Pokud jsou nositelem antigenu erytrocyty, mluvíme o hemaglutinaci. Povrch erytrocytů je vybaven negativním elektrickým nábojem, který 15

16 způsobuje, že jsou drženy v určité vzdálenosti od sebe. Kompletní protilátky mají schopnost překonat tuto vzdálenost a vyvolat tak aglutinaci. Inkompletní protilátky naproti tomu viditelnou aglutinaci vyvolat nedokážou, přestože se s antigenem váží. Zviditelnění aglutinace je možné dosáhnout prostřednictvím centrifugace, proteolytických enzymů, hovězího albuminu, dextranem, snížením množství elektrolytů v suspenzi atd. Co by naopak mohlo aglutinaci omezit, je zvýšené množství elektrolytů v suspenzi. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) (Smetana a kol., 1992) Inhibice aglutinace Inhibice aglutinace se využívá převážně při reakci s hapteny. Hapteny se s protilátkami váží, ale nedochází k přímo viditelné reakci. V tomto testu se před přidáním detekčního systému inkubuje hapten s protilátkami. Případný stupeň inhibice se pak zhodnotí podle výsledku kontrolní reakce, v niž hapten použit k inhibici nebyl (Smetana a kol., 1992) Precipitace Precipitace je proces, při kterém tvoří antigen s protilátkou nerozpustný komplex, tzv. precipitát. Aby reakce správně probíhala, je důležitý optimální poměr mezi reagujícími složkami (tedy antigenem a protilátkou). Precipitát se pak při takovém poměru tvoří nejrychleji. Na druhou stranu, jestliže jedna z reagujících složek výrazně převažuje, k precipitaci a k vytvoření precipitátu většinou vůbec nedojde. Tento stav se nazývá fenomén prozóny. Pokud se při precipitaci spotřebovaly všechny protilátky i všechny antigeny, označuje se tento stav jako tzv. bod ekvivalence. (Smetana a kol., 1992) Hemolýza Protilátky vazbou na erytrocyty vyvolají jejich rozpad neboli hemolýzu. Stykem antigenu s protilátkou dochází k aktivaci komplementu, který se na rozpadu podílí. Komplement se skládá z 9 hlavních sérových bílkovin, které jsou očíslovány C1-C9. Na základě podnětu nejprve dojde k aktivaci C1 a teprve poté následuje kaskádovitá aktivace i dalších komplementových složek. Rozpad erytrocytu pak nastává kvůli otvoru, který do jeho membrány vytvoří poslední aktivované složky komplementu tzv. MAC. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) (Hořejší a Bartůňková, 2009) 16

17 3 Nepravidelné antierytrocytární protilátky v systémech krevních skupin Mezi nepravidelné antierytrocytární protilátky řadíme protilátky všech systémů, kromě systému AB0. Pouze v AB0 systému se vyskytují pravidelné protilátky, které jsou přirozené a označují se jako izoaglutininy. Jedná se o protilátky anti-a a anti-b. Jedinci s antigenem A na erytrocytech mají v krvi protilátku anti-b, a naopak jedinci s antigenem B na erytrocytech mají v krvi protilátku anti-a. Pokud na erytrocytech není přítomen žádný antigen, pak se v krvi vyskytují obě protilátky, anti-a i anti-b. Jsou-li na erytrocytech oba antigeny, A i B, tak se v krvi žádné protilátky nevyskytují. (Eckstein, 1994) Při screeningu je velmi důležité odhalit přítomnost nepravidelných antierytrocytárních protilátek. Jejich následnou identifikací zjistíme, zda tyto protilátky přítomné v séru pacienta, jsou nebo nejsou klinicky významné. Za klinicky významné jsou považovány protilátky ze systému Rh: anti-d, anti-c, anti-c, anti-e, anti-e; ze systému Kell: anti-k, anti-k; ze systému Duffy: anti-fy a, anti-fy b ; ze systému Kidd: anti-jk a, anti-jk b a ze systému MNSs: anti-s a anti-s. Na základě zhodnocení významnosti protilátky můžeme pro pacienta zajistit kompatibilní transfuzi a usuzovat o možnosti vzniku hemolytického onemocnění novorozence (HON). Ostatní nepravidelné antierytrocytární protilátky jsou považovaný za klinicky méně významné nebo zcela nevýznamné. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 3.1 Krevní skupinový systém Rh a jeho protilátky Po AB0 systému je Rh druhým velmi významným systémem v lidské imunohematologii. Byl objeven v roce 1940 Landsteinerem a Wienerem. Postupem času bylo zjištěno, že příčinou HON a většiny potransfuzních reakcí není jenom přítomnost nebo nepřítomnost Rh antigenu na krvinkách (Rh faktoru), ale že celý Rh systém je mnohem složitější, a že zahrnuje celou řadu genů a antigenů. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Rh systém má základ ve třech velmi blízko sebe ležících lokusech genů na krátkém raménku chromozomu 1, přičemž na lokusu 1 je alela C a c, na lokusu 2 alela D a d a na lokusu 3 alela E a e, které se mohou vzájemně zastoupit (Eckstein, 1994). Jako Rh-komplex je označována společně děděná kombinace alel. Zastoupit se mohou vždy jen 2 ze 6 alel (C, c, D, d, E, e) na určitém lokusu genového komplexu, proto rozeznáváme 8 možných typů genových kombinací: cde, Cde, CDe, CdE, CDE, cde, cde, cde. (Eckstein, 1994) 17

18 Tabulka 3: Rh komplexy a jejich četnost výskytu u středoevropské populace (Eckstein, 1994) CDE nomenklatura Wiesnerova nomenklatura Četnost výskytu CDe R 1 40,52 % cde R 39,17 % cde R 2 14,16 % cde R 0 2,69 % Cde r 0,94 % cde r 0,62 % CDE R Z 0, 23 % CdE r y 0,01 % 98,34 % Na C lokusu Rh komplexu se může vyskytovat ještě třetí alela. Je to alela C w. Proto se četnost výskytu Rh-komplexů, která je uvedena v tabulce 3, po součtu nerovná 100 %. Co se týče alely D, existuje také její slabá varianta D weak (D u ). (Eckstein, 1994) Jak již bylo řečeno, Rh systém zahrnuje 6 alel. Jedna z těchto alel je amorfní neboli afunkční. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Touto alelou je alela d. Ve skutečnosti se však o žádnou alelu nejedná, pouze se tak označuje situace, kdy chybí gen D, který za normálních okolností kóduje D protein. Z toho vyplývá, že žádný protein d a tedy žádný antigen d neexistují. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Zbylých 5 alel podmiňuje vznik specifických antigenů: D, C, c, E, e. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Tabulka 4: Výskyt jednotlivých Rh antigenů ve střední Evropě (Eckstein, 1994) Antigen Četnost výskytu e 96,52 % D 82,17 % c 80,31 % C 64,58 % E 27,23 % C w 2,11 % 18

19 Rh antigeny bývají u plodu zastoupeny v časných stádiích embryonálního vývoje. Co se týká světové populace, je zastoupení Rh antigenu různé. Běloši bývají pozitivní v 85 % a negativní v 15 % případů. Naopak černoši bývají pozitivní až v % případů. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Rh protilátky Protilátky Rh systému bývají zřídka kdy přirozené. Zpravidla vznikají díky imunizačnímu podnětu, kterým může být opakovaná transfuze nebo těhotenství. Jedná se tedy o imunní, inkompletní protilátky nejčastěji třídy IgG, které bývají příčinou hemolytických potransfuzních reakcí a HON. (Kubisz a kol., 2006) Kromě toho se mohou uplatňovat také jako autoprotilátky u autoimunních hemolytických anemií tepelného typu. (Penka aj., 2001) K rozpadu erytrocytů dochází prostřednictvím makrofágu ve slezině, neboť Rh protilátky jen zřídka váží komplement. Tomuto procesu se říká extravaskulární hemolýza. (Dean, 2005) Optimálně reagují při teplotě 37 C. K jejich odhalení se používají antiglobulinové testy (NAT) nebo krvinky enzymaticky ošetřené bromelinem či papainem. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) K nejčastějším protilátkám Rh systému řadíme: anti-d, -C, -E, -c, méně pak anti-e, -C w. Anti-D je po anti-a a anti-b klinicky nejvýznamnější antierytrocytární protilátkou. (Daniels a Bromilow, 2007) Je namířena proti antigenu D, který je ze všech Rh antigenů nejvíce imunogenní. V současné době se však jedná o protilátku vzácnou a to hlavně díky dodržování kompatibility v antigenu D při transfuzi a na základě podávání profylaxe Rh negativním matkám. Společně s anti-d se mohou vyskytovat také protilátky anti-c, anti-e a anti-g. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (Eckstein, 1994) Kromě toho existuje také slabá varianta této protilátky a tou je protilátka anti-d weak (D u ), kterou si mohou vytvořit pouze D negativní jedinci, kteří tvoří také anti-d. D pozitivní jedinci tuto protilátku naopak netvoří, neboť by reagovala s antigenem D přítomným na jejich vlastních erytrocytech. (Eckstein, 1994) Při vyšetření RhD skupiny je tedy důležité odhalit nejenom antigen D, ale i jeho slabou variantu D weak (D u ) antigen. Jedinci s D weak (D u ) antigenem jsou totiž jako dárci považováni za RhD pozitivní, ale jako příjemci jsou RhD negativní. (Kubisz a kol., 2006) Anti-G je protilátka, která reaguje jak s D, tak s C pozitivními erytrocyty. Může být proto zaměněna za anti-c nebo anti-d protilátku, se kterými se také často společně vyskytuje. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 19

20 Anti-C bývá většinou směsí anti-cc w protilátek. Po imunizaci antigenem C se u jedince bez tohoto antigenu vytvoří protilátka anti-cc w. Je-li imunizace vyvolána antigenem C w, pak si jedinec vytvoří pouze protilátku anti-c w. Téměř vždy se anti-c vyskytuje v přítomnosti protilátky anti-d a je častější u Rh negativních jedinců. (Eckstein, 1994) Anti-E se často vyskytuje společně s anti-d, po které je druhou nejvíce zastoupenou protilátkou v Rh systému. Nacházíme ji u jedinců s fenotypem ee. Může se však také vyskytovat jako přirozená protilátka. V takovém případě ale nemá klinického významu. Většina anti-e protilátek reaguje pouze s E-pozitivními erytrocyty ošetřenými proteázou. (Eckstein, 1994) (Daniels, 2002) (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Anti-c se tvoří proti antigenu c. Ten je po antigenu D nejvíce imunogenní a tedy klinicky nejdůležitější. Tuto protilátku tvoří především D pozitivních jedinci s fenotypem CC. Někdy se vyskytuje také společně s anti-e protilátkou. (Eckstein, 1994) (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Anti-e protilátka se vyskytuje společně s anti-ce nebo anti-ce protilátkami. (Daniels, 2002) Vzhledem k pouhému 3,5 % výskytu jedinců bez e antigenu je velmi vzácná. Antigen e je totiž v populaci, co se týče střední Evropy, hojně zastoupen. Lidem bez e antigenu na erytrocytech se proto obtížně zajišťuje transfuze. (Eckstein, 1994) Anti-C w je vzácnou protilátkou nejenom proto, že se antigen C w vyskytuje pouze u 2 % populace, jak je uvedeno v tabulce 4, ale také proto, že antigen C w je poměrně slabým antigenem. (Eckstein, 1994) Význam Rh systému pro transfuzi spočívá především v určení, zda je krev RhD pozitivní nebo RhD negativní. Jako Rh pozitivní se označují jedinci, kteří na svých erytrocytech nesou antigen D. Naopak jako Rh negativní se označují jedinci, kteří na svých erytrocytech antigen D nemají. (Kubisz a kol., 2006) Jak již bylo řečeno, antigen D je antigenem velmi silným. Odhaduje se, že až s 80 % pravděpodobnosti dojde u RhD negativního jedince k imunizaci a tedy k vytvoření anti-d, pokud jsou mu podány RhD pozitivní erytrocyty. (Kubisz a kol., 2006) K zahájení tvorby protilátek u RhD negativního jedince při tom obvykle stačí podání pouze 0,1 ml RhD pozitivních erytrocytů. K první imunizaci dochází většinou až po 3 měsících. První inkompatibilní transfuze bývá u Rh negativních příjemců snášena poměrně dobře. Dojde-li však k opakované inkompatibilitě v rámci transfuze, je tvorba protilátek velmi rychle vystupňována a může nastat situace, kdy se všechny transfundované erytrocyty začnou 20

21 působením protilátek rozpadat. Výsledkem může být potransfuzní reakce vedoucí až ke smrti. Obdobná situace může nastat u Rh inkompatibilního těhotenství. (Eckstein, 1994) 3.2 Krevní skupinový systém Kell a jeho protilátky Tento systém dostal název podle pacienta jménem Kelleher, u kterého byla protilátka z tohoto systému poprvé objevena panem Coombsem v roce Postupem času bylo zjištěno, že tento systém je klinicky velmi významný. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Složitostí se Kell systém podobá Rh systému. (Eckstein, 1994) Genový komplex systému Kell leží na chromosomu 7 s minimálně třemi lokusy. Na lokusu 1 se mohou vzájemně střídat alely K a k, na lokusu 2 alely Kp a a Kp b a na lokusu 3 alely Js a a Js b. Jako u Rh systému musí tedy také u systému Kell existovat 8 haplotypů, z nichž však dodnes byly prokázány pouze 4 (Eckstein, 1994). K nejvýznamnějším antigenům Kell systému řadíme: K a k, Kp a a Kp b, Js a a Js b. Z nich je nejvíce imunogenní antigen K. Antigeny tohoto systému bývají umístěny na povrchu erytrocytů na tzv. glykoproteinech. Někteří jedinci však na svých erytrocytech žádné Kell antigeny nemají. Hovoříme pak o fenotypu K 0 (K null). Tito lidé pak tvoří protilátky proti všem Kell antigenům. Je proto velmi obtížné jim v případě potřeby zajistit transfuzi, neboť mohou dostat pouze takovou, která obsahuje erytrocyty se stejný fenotypem. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) U plodu bývají antigeny K a k prokazatelné již ve velmi časných stádiích embryonálního vývoje. Z toho vyplývá, že jsou při porodu plně vyvinuty a mohou tak způsobovat obdobné komplikace jako Rh antigeny. (Meulenbroek, Engelfriet et al., 2003) Tabulka 5: Výskyt antigenů Kell ve střední Evropě (Eckstein, 1994) Antigen Četnost výskytu K 8,00 % k 92,00 % Kp a 0,02 % Kp b 99,98 % Js a - Js b 100,00 % 21

22 Většina obyvatel střední Evropy je kk homozygotní, asi 7,98 % obyvatel je Kk heterozygotní a jen 0,02 % je KK homozygotní. (Eckstein, 1994) Kell protilátky Převážně se jedná o protilátky třídy IgG, zejména IgG1. Za klinicky významné jsou protilátky Kell systému považovány z toho důvodu, že mohou způsobovat závažné hemolytické potransfuzní reakce a HON. Všichni pacienti, u kterých jsou Kell protilátky v krvi nalezeny, musí dostat transfuzi, která je na Kell antigeny negativní. (Daniels a Bromilow, 2007) K jejích průkazu se používá nepřímý antiglobulinový test (NAT). (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Mezi protilátky Kell systému řadíme: anti-k, -k, -Kp a, -Kp b, -Js a, -Js b. Anti-K je vedle protilátek AB0 a Rh systému nejběžnější protilátkou proti erytrocytům. (Klein a Anstee, 2005) Vyplývá to zejména z toho, že antigen K, proti kterému je protilátka anti-k namířena, je silně imunogenní. Většina lidí, jak bylo uvedeno výše, jsou kk homozygoti a nemají tedy na povrchu svých erytrocytů antigen K. Setká-li se tedy jedinec s kk homozygocií opakovaně s antigenm K, vyvolá to u něj tvorbu protilátek anti-k. K negativním jedincům se tedy podávají K negativní erytrocyty. Aby nedošlo k imunizaci, vyšetřují se dárci a příjemci krve na antigen K. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Zejména u pacientů s opakovanými transfuzemi, žen v plodném věku a dívek, je třeba tuto zásadu dodržovat. U dívek a žen v plodném věku to má význam z hlediska možnosti vzniku HON v těhotenství. (Kubisz a kol., 2006) Byly zjištěny případy, kdy anti-k imunizace byla vyvolána některými bakteriemi jako např: Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis nebo Morganella morganii. (Daniels, 2002) Anti-k protilátka byla poprvé objevena díky kojenci zasaženého hemolytickým onemocněním novorozence, v séru jehož matky byla následně detekována. (Klein a Anstee, 2005) Tato protilátka se vyskytuje poměrně vzácně a to z toho důvodu, že jsou schopny ji vytvořit jedině osoby s genotypem KK, který se v populaci vyskytuje ve velmi malém procentu. (Sakalová Lipšic aj., 1995) Anti-Ku (anti-kel5) jsou protilátky produkované K 0 jedinci, které reagují se všemi Kell pozitivními erytrocyty. (Daniels a Bromilow, 2007) Jsou známy případy, 22

23 kdy potransfuzní reakce vyvolaná anti-ku vedla k anurii, žloutence a selhání ledvin. (Daniels, 2002) Anti-Kp a a anti-kp b jsou protilátky vzácné a z toho anti-kp b je vzácnější, než anti-kp a. Pokud se vyskytují, mají schopnost vyvolat HON. Mohou se nacházet i jako autoprotilátky. Zejména anti-kp b se v rámci autoimunní hemolytické anemie (AIHA) objevuje jako autoprotilátka. (Klein a Anstee, 2005) Anti-Js a a anti-js b jsou taktéž protilátky vzácné. Anti-Js b spolu s anti-kp a a anti-kp b způsobují závažnou formu HON. Naproti tomu Anti-Js a spolu s anti-ku vyvolávají mírnější formu tohoto onemocnění. (Klein a Anstee, 2005) 3.3 Krevní skupinový systém Duffy a jeho protilátky Název systému je odvozen od jména prvního pacienta, v jehož krvi byly objeveny protilátky proti antigenu z tohoto systému. Objev byl učiněn v roce 1950 panem Cutbushem. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Geny Duffy systému jsou lokalizovány na chromosomu 1 stejně jako Rh systému. Existují 4 alely Fy a, Fy b, Fy x a Fy-, které se mohou vzájemně zastoupit na lokusu pro gen (Eckstein, 1994). U systému Duffy rozeznáváme celkem 7 antigenů. Z nich jsou nejvýznamnější antigeny Fy a a Fy b. Na rozdíl od Rh a některých Kell antigenů bývají mnohem méně imunogenní. Vyvíjejí se v časných stadiích embryonálního života, a proto bývají při porodu již plně vyvinuty. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Tabulka 6: Fenotypy a genotypy Duffy systému (Eckstein, 1994) Fenotypy Genotypy Četnost výskytu Fy(a+b+) Fy a Fy b 47,40 % Fy(a-b+) Fy b Fy b 33,00 % Fy(a+b-) Fy a Fy a 18,20 % Fy(a-b-) FyFy 0,06 % 23

24 3.3.1 Duffy protilátky Řadíme je převážně mezi protilátky třídy IgG. Stejně jako protilátky systému Rh a Kell mohou být příčinou HON a hemolytických potransfuzních reakcí. K jejich odhalení se používá nepřímý antiglobulinový test (NAT). Je důležité vědět, že k jejich detekci se nesmí používat enzymaticky ošetřené erytrocyty. Enzym má totiž v takovém případě tu vlastnost, že Duffy antigeny z vyšetřovaných erytrocytů odstraňuje. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Mezi protilátky Duffy systému řadíme: anti-fy a, -Fy b, -Fy3, -Fy4, -Fy5. Anti-Fy a reagují s erytrocyty nesoucími antigen Fy a. U jedinců s fenotypem Fy(a+b-) je reakce silnější než u jedinců s fenotypem Fy(a+b+). Erytrocyty s antigenem Fy a, suspendované v solném roztoku bývají těmito protilátkami příležitostně aglutinovány. Anti-Fy a jsou obvyklejší než anti-fy b. Naproti tomu je frekvence jejich výskytu třikrát nižší než u protilátek anti-k. Imunogenita antigenu Fy a je také čtyřicetkrát nižší než u antigenu K. Můžeme je nalézt samostatně nebo společně s dalšími protilátkami. Jako přirozené protilátky se objevují jen velmi málo. (Daniels a Bromilow, 2007) (Klein a Anstee, 2005) (Daniels, 2002) Anti-Fy b reagují s erytrocyty nesoucími antigen Fy b. Frekvence jejich výskytu je v porovnání s anti-fy a dvacetkrát nižší. I zde bývají erytrocyty suspendované v solném roztoku v některých případech aglutinovány. (Klein a Anstee, 2005) V krvi se nacházejí většinou společně s dalšími protilátkami. (Daniels, 2002) Anti-Fy3 protilátku jsou schopni produkovat pouze lidé s fenotypem Fy(a-b-), který je velmi vzácný. Tito lidé mohou dostat erytrocyty jedině od dárce, jehož fenotyp je stejný. Pokud dostanou erytrocyty jiné, tato protilátka se u nich vytvoří. S fenotypem Fy(a-b-) se setkáváme častěji u černochů než bělochů. Má také určitou spojitost s malárií, protože erytrocyty Fy(a-b-) jsou rezistentní k infekci Plasmodiem vivax. (Klein a Anstee, 2005). Anti-Fy4 protilátka se vyskytla u černochů a reagovala jak s erytrocyty s fenotypem Fy(a+b-) a Fy(a-b+), tak s erytrocyty s fenotypem Fy(a-b-). Takový případ je ovšem znám jediný. (Klein a Anstee, 2005) Anti-Fy5 protilátka se převážně vyskytuje společně s dalšími protilátkami majícími imunologický význam. (Daniels, 2002) 24

25 3.4 Krevní skupinový systém Kidd a jeho protilátky Kidd systém je charakterizován třemi alelami genu, které jsou umístěny na 18. chromosomu. Těmito alelami jsou Jk a, Jk b a Jk. Na rozdíl od Jk a a Jk b, je Jk němá alela a tedy žádný antigen nekóduje. (Eckstein, 1994) Antigeny tohoto systému jsou Jk a, Jk b a Jk3. Antigen Jk3 se vyskytuje u všech jedinců, kromě těch, kteří nesou fenotyp Jk(a-b-). Na rozdíl od Rh a některých Kell antigenů bývají Kidd antigeny méně imunogenní. Při porodu jsou plně vyvinuty, neboť se tvoří v časných fázích embryonálního vývoje. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Tabulka 7: Fenotypy a genotypy Kidd systému (Eckstein, 1994) Fenotyp Genotyp Četnost výskytu Jk(a+b+) Jk a Jk b 49,960 % Jk(a+b-) Jk a Jk a 26,436 % Jk(a-b+) Jk b Jk b 23,595 % Jk(a-b-) JkJk 0,001 % Kidd protilátky Převážně se jedná o protilátky třídy IgG, někdy také IgM, vážící komplement. Často se nacházejí ve směsi společně s dalšími protilátkami. Důvodem vzniku je stejně jako u ostatních uvedených systémů, transfuze nebo těhotenství. Nebezpečnost těchto protilátek spočívá zejména v možnosti zapříčinění hemolytických potransfuzních reakcí. Jde téměř výhradně o opožděný typ hemolytických potransfuzních reakcí. Kromě toho se mohou vyskytovat i jako autoprotilátky. (Daniels a Bromilow, 2007) (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Kidd protilátky mají tendenci klesat na velmi nízké hladiny, které se v krvi obtížně detekují. K detekci se nejčastěji využívají metody jako LISS-NAT nebo enzymem-nat. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Mezi protilátky Kidd systému řadíme: anti-jk a, anti-jk b a anti-jk3. Anti-Jk a protilátky reagují s erytrocyty nesoucími antigen Jk a. Reakce s genotypem Jk a Jk a je silnější než s genotypem Jk a Jk b. Screeningové panely, využívané 25

26 k detekci protilátek, by proto měly obsahovat buňky s Jk a Jk a. V souvislosti s AIHA se mohou vyskytovat i jako autoprotilátky. (Klein a Anstee, 2005) (Daniels, 2002) Anti-Jk b protilátky reagují s erytrocyty nesoucími antigen Jk b. Vyskytují se v krvi společně s dalšími imunními protilátkami a bývají méně časté než anti-jk a. (Klein a Anstee, 2005) Anti-Jk3 protilátky se tvoří pouze u jedinců s fenotypem Jk(a-b-) a proto reagují se všemi erytrocyty bez tohoto fenotypu. Je to dáno tím, že antigen Jk3 se vyskytuje jen u lidí, kteří společně s ním mají i antigen Jk a anebo Jk b. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 3.5 Krevní skupinový systém Lutheran a jeho protilátky Stejně jako systém Kidd je i Lutheran systém charakterizován třemi alelami genu. Jsou to alely Lu a, Lu b a Lu, vyskytující se na 19. chromosomu. Alela Lu je němou a velmi vzácnou alelou. (Eckstein, 1994) Tabulka 8: Fenotypy a genotypy Lutheran systému (Eckstein, 1994) Fenotyp Genotyp Četnost výskytu Lu(a-b+) Lu b Lu b 92,72 % Lu(a+b+) Lu a Lu b 7,14 % Lu(a+b-) Lu a Lu a 0,14 % Lu(a-b-) LuLu < 0,01 % V tomto systému rozeznáváme celkem 18 antigenů. Nejvýznamnějšími jsou antigeny Lu a a Lu b, které však bývají málo imunogenní. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Lutheran protilátky Patří do třídy IgM (jako přirozené protilátky) nebo IgG (jako imunní protilátky). K jejich odhalení se využívá NAT a solné testy. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Mezi protilátky Lutheran systému řadíme: anti-lu a, anti-lu b a anti-lu3. Anti-Lu a protilátky reagují s erytrocyty nesoucími antigen Lu a. Tento antigen je slabý a v populaci ojedinělý, proto i tato protilátka se vyskytuje méně často. Mnohem více, než při 26

27 teplotě 37 C, reagují při pokojové teplotě. Situace, kdy by tyto protilátky způsobovaly HON nebo hemolytické potransfuzní reakce nejsou v podstatě známy. V případě jejich výskytu však není problém zajistit transfuzi, která je na Lu a antigen negativní. (Eckstein, 1994) (Klein a Anstee, 2005) Anti-Lu a mohou být také přirozenými protilátkami, v některých případech pak může dojít k jejich rozšíření prostřednictvím transfuze. (Daniels, 2002) Anti-Lu b protilátky reagují s erytrocyty nesoucími antigen Lu b. Jejich výskyt je také vzácný a to hlavně z toho důvodu, že antigen Lu b má v populaci velmi vysoké zastoupení. Velké obtíže pak v případě jejich výskytu činí vyhledávání kompatibilní transfuze bez antigenu Lu b. Při teplotě 37 C reagují stejně jako při pokojové teplotě. Často se vyskytují samostatně a jako přirozené protilátky dosud nalezeny nebyly. Na rozdíl od anti-lu a jsou známy případy HON a hemolytických potransfuzních reakcí, které byly těmito protilátkami způsobeny. (Eckstein, 1994) (Daniels, 2002) Anti-Lu3 protilátky reagují s erytrocyty s fenotypem Lu(a+b+), Lu(a+b-) a Lu(a-b+) a to z toho důvodu, že antigen Lu3 se nachází na všech erytrocytech, které již nesou některý z antigenů Lutheran systému. (Daniels, 2002) 3.6 Krevní skupinový systém MNSs a jeho protilátky Tento systém je charakterizován dvěma geny nacházejícími se na chromosomu 4. Dohromady oba geny kódují čtyři alely. První gen kóduje alelu M a N, druhý kóduje alelu S a s. (Eckstein, 1994) Tabulka 9: Fenotypy a genotypy MNSs systému (Eckstein, 1994) Fenotyp Četnost výskytu Genotyp Četnost výskytu MNSs 23,5 % MS/Ns 19,0 % Ms/NS 4,5 % MNs 22,0 % Ms/Ns 22,0 % Ns 14,5 % Ns/Ns 14,5 % MSs 14,0 % MS/Ms 14,0 % Ms 8,5 % Ms/Ms 8,5 % MS 6,0 % MS/MS 6,0 % NSs 6,0 % NS/Ns 6,0 % MNS 5,0 % MS/NS 5,0 % 27

28 NS 0,5 % NS/NS 0,5 % Nejvýznamnějšími antigeny tohoto systému jsou antigeny: M, N, S, s. Tyto se mohou různým způsobem kombinovat. Na základě těchto kombinací rozlišujeme velký počet různých genotypů a fenotypů, jak uvádí tabulka 9. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Antigeny tohoto systému se na erytrocytech vyskytují vázané na tzv. sialogylkoproteiny. Rozlišujeme sialoglykoprotein α a β. K sialoglykoproteinu α jsou vázány antigeny M a N. K sialoglykoproteinu β jsou vázány antigeny S a s. Na erytrocytech plodu jsou přítomny již během porodu, neboť se vyvíjejí v časných fázích embryonálního života. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) MNSs protilátky Mezi nejvýznamnější protilátky MNSs systému řadíme: anti-m, anti-n, anti-s a anti-s. Anti-M protilátka je namířena proti antigenu M. Může být třídy IgM i IgG. Jako IgG má schopnost pronikat placentou a způsobovat HON. Stejně jako anti-k protilátky pak ničí progenitorové buňky červené krevní řady namísto zralých erytrocytů. Tyto případy jsou však velmi vzácné. Převážně se jedná o chladovou protilátku, která jen zřídka reaguje při teplotě 37 C. Pokud při této teplotě dokáže reagovat, má pak i potenciál k vyvolání potransfuzní hemolytické reakce a již zmíněného HON. (Eckstein, 1994) (Daniels, 2002) Anti-N protilátka je namířena proti antigenu N. Bývá chladové povahy a proto je při teplotách vyšších než C neaktivní. Patří do třídy IgM a vyskytuje se vzácněji než protilátka anti-m. (Klein a Anstee, 2005) Obě zmíněné protilátky neváží komplement a vyskytují se převážně přirozeně. Jak bylo řečeno, antigeny M a N jsou umístěny na sialoglykoproteinu α. Na ten nepříznivě působí enzymy papain a bromelin, protože odstraňují některé jeho části. Z toho vyplývá, že k průkazu protilátek anti-m a anti-n se nesmí používat enzymaticky ošetřené erytrocyty. Nejvíce se tedy prokazují v NAT a v solném testu. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Anti-S protilátka působí proti slabému antigenu S. Patří do třídy IgG a přesto, že vzniká vzácně, má pokaždé imunní povahu. Reaguje při teplotě 37 C. V případě jejího výskytu vyžaduje zajištění kompatibilní transfuze, stejně jako je tomu u všech ostatních imunních protilátek. Má tedy schopnost zapříčinit hemolytické potransfuzní reakce a kromě toho také 28

29 HON. (Eckstein, 1994) (Daniels a Bromilow, 2007) K průkazu se využívá NAT, případně i solný test. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Anti-s protilátka působí proti antigenu s, který je stejně slabý jako antigen S. Je imunní IgG protilátkou reagující při 37 C. Stejně jako anti-s může být příčinou hemolytických potransfuzních reakcí a HON. (Eckstein, 1994) (Daniels a Bromilow, 2007) Vyskytuje se však méně často než anti-s. (Dean, 2005) K detekci se využívá NAT. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 3.7 Krevní skupinový systém Lewis a jeho protilátky Jedná se o zvláštní systém, neboť antigeny tohoto systému nejsou primární součástí erytrocytární membrány. Na povrch erytrocytů jsou absorbovány až sekundárně z plazmy. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Lewis systém je také charakterizován jedním genem, který má jistou souvislost s ABH a sekretorskými geny. (Eckstein, 1994) Mezi nejvýznamnější antigeny Lewis systému řadíme Le a a Le b. U non-sekretorů (netvoří antigen H) pomocí specifické transferázy produkované Le genem dochází k vytvoření antigenu Le a. Naproti tomu u sekretorů (tvoří antigen H), kteří kromě Le genu mají také Se gen, dochází při společném působení jimi produkovaných enzymů ke vzniku antigenu Le b. Protože účinnost Se transferázy je mnohem větší než účinnost Le transferázy, tvoří se více H antigenu a tím pádem i více antigenu Le b ve srovnání s antigenem Le a. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Tabulka 10: Fenotypy a genotypy Lewis systému (Eckstein, 1994) Fenotyp Četnost výskytu Genotyp Le(a-b+) 72 % LeLeHSe nebo LeleHSe Le(a+b-) 22 % LeLeHse nebo LeleHse Le(a-b-) 6 % lelehse nebo lelehse Lewis fenotyp se po narození běžnými metodami určit nedá, neboť jeho konečná podoba může být prokázána až kolem sedmého roku života. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 29

30 3.7.1 Lewis protilátky Jsou to protilátky, které se vyskytují převážně přirozeně, bez toho aniž by se jedinec dostaly do styku s cizími erytrocyty. Patří do třídy IgM, vzácně k IgG. Protože jen velmi zřídka reagují při 37 C, nemají v podstatě klinický význam. Často je sice nacházíme u těhotných žen, ale k ohrožení dítěte hemolytickým onemocněním dojít nemůže, neboť Lewis antigeny nejsou při porodu na erytrocytech dítěte zastoupeny. Tyto protilátky však mohou způsobovat hemolytické potransfuzní reakce. Dochází k tomu ale jen v ojedinělých případech a to z toho důvodu, že Lewis antigeny přítomné v plazmě dárce obvykle neutralizují Lewis protilátky přítomné v séru příjemce. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Mezi nejvýznamnější protilátky Lewis systému řadíme: anti-le a a anti-le b. Kromě nich existují ještě protilátky anti-le c a anti-le d. Anti- Le a protilátky se vyskytují poměrně běžně. (Klein a Anstee, 2005) Tvoří si je pouze jedinci s fenotypem Le(a-b-). Je to dáno tím, že jedinci s Le(a-b+) mají antigen Le a jako součást jejich antigenního uspořádání. (Eckstein, 1994) Anti-Le b protilátky se vyskytují méně často. Tvoří je jedinci s fenotypem Le(a-b-) nebo Le(a+b-). (Eckstein, 1994) Tyto protilátky existují ve dvojí podobě: anti- Le bh a anti-le bl. (přednášky z LF:BLTS0411p) 3.8 Některé další krevní skupinové systémy a jejich protilátky Protilátky krevně skupinového systému P Nejčastější protilátkou tohoto systému je anti-p1. Jedná se o přirozenou chladovou protilátku třídy IgM, která je při 37 C neaktivní a proto nezpůsobuje HON a hemolytické potransfuzní reakce. Jen vzácně může být třídy IgG a způsobovat hemolýzu. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (přednášky z LF:BLTS0411p) Dalšími protilátkami jsou anti-p, anti-p k a anti-p, které se vyskytují vzácně. Anti-P (někdy i anti-p) se většinou uplatňuje jako bifazická chladová autoprotilátka při vzniku paroxysmální chladové hemoglobinurie. (přednášky z LF:BLTS0411p) (Penka aj., 2001) 30

31 3.8.2 Protilátky krevně skupinového systému Ii Anti-I a anti-i se téměř výhradně vyskytují jako autoprotilátky. Jsou to chladové IgM protilátky, které způsobují autoimunní hemolytickou anemii, pokud se vyskytují ve vysokém titru. Naopak nízký titr těchto protilátek můžeme nalézt i u zdravých jedinců. Ve vztahu k HON nejsou významné. Dokážou-li však reagovat při teplotě vyšší než 30 C, mohou být příčinou zkráceného přežívání transfuzí podaných erytrocytů. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Protilátky krevně skupinového systému Diego Mezi protilátky tohoto systému řadíme: anti-di a, anti-di b a anti-wr a. Anti-Di a a anti-di b patří mezi IgG protilátky, které se více podílejí na vzniku HON než na hemolytických potransfuzních reakcích. Anti-Wr a se naopak může vyskytovat jako IgM i jako IgG protilátka a je zodpovědná převážně za možný vznik hemolytické potransfuzní reakce. (Dean, 2005) Protilátky krevně skupinového systému Colton Protilátky tohoto systému jsou anti-co a, anti-co b a anti-co3. Anti-Co a je nejčastější a obvykle patří mezi IgG protilátky. Spolu s anti-co3 může způsobovat HON a spolu s anti-co b hemolytické potransfuzní reakce. (Klein a Anstee, 2005) Protilátky krevně skupinového systému Dombrock Jedná se o vzácné a většinou poměrně slabé protilátky, které mohou být příčinou hemolytických reakcí po transfuzi. Patří sem: anti-do a, anti-do b, anti-gy a a anti-hy. (Klein a Anstee, 2005) Protilátky krevně skupinového systému Xg Nebývají považovány za příčinu HON nebo hemolytických potransfuzních reakcí. (Klein a Anstee, 2005) 31

32 3.8.7 Protilátky krevně skupinového systému Gerbich Patří do imunoglobulinové třídy IgG. Mohou se vyskytovat jako autoprotilátky u AIHA a ve vzácných případech způsobovat HON a hemolytické potransfuzní reakce. (přednášky z LF:BLTS0411p) Protilátky krevně skupinového systému Cartwright, Scianna, Cromer, Knops, Indian Nejsou pokládány za klinicky významné. (Daniels a Bromilow, 2007) 32

33 4 Komplikace způsobené nepravidelnými antierytrocytárními protilátkami Nepravidelné antierytrocytární protilátky jsou zodpovědné za řadu imunitních hemolytických stavů. Při těchto stavech dochází ke zkrácenému přežívání a destrukci erytrocytů, což je způsobeno právě těmito protilátkami. Jedná se buď o aloprotilátky, které si jedinec tvoří, pokud se dostane do kontaktu s cizími erytrocytárními antigeny, nebo o autoprotilátky, které jsou naopak zaměřeny na vlastní erytrocytární antigeny. Aloimunní hemolytické stavy vyvolávají aloprotilátky a takovými stavy jsou hemolytické onemocnění novorozence (HON) a hemolytické potransfuzní reakce. Autoimunní hemolytické anemie (AIHA) naopak způsobují autoprotilátky. (Penka aj., 2009) 4.1 Hemolytické onemocnění novorozence a aloimunizace v těhotenství HON je důsledkem aloimunizace matek, neboť se jedná o onemocnění indukované mateřskými protilátkami (třídy IgG), které se přes placentu dostávají do krevního oběhu dítěte a způsobují zde destrukci jeho erytrocytů. Taková situace nastává v případě inkompatibility mezi krevní skupinou matky a dítěte. (Muntau, 2009) Inkompatibilita je způsobena tím, že dítě po otci zdědí takový erytrocytární antigen, který matka na svých erytrocytech nemá, a proto proti němu začne tvořit protilátky. Aby k vytvoření těchto antierytrocytárních protilátek u matky vůbec došlo, musí se erytrocyty dítěte dostat do jejího oběhu. (Eckstein, 1994) K tomu může docházet při porodu, potratu, traumatu, mimoděložním těhotenství, případně následkem invazivních výkonů, které jsou v těhotenství prováděny z diagnostických nebo terapeutických důvodů. Matka však může mít vytvořeny protilátky i následkem předchozí inkompatibilní transfuze. (Roztočil a kol., 2008) Obrázek 4: Mechanismus HON (upraveno přednášky z LF:BLTS0411p) 33

34 4.1.1 Formy hemolytického onemocnění novorozence HON může vznikat na základě inkompatibility v: 1. Rh-systému - v etiologii HON se v rámci tohoto systému uplatňují protilátky anti-d, anti-c, anti-c, anti-e a anti-e. Za klasickou příčinu HON pak bývá považována protilátka anti-d, to znamená, že matka je RhD negativní a dítě RhD pozitivní. V rámci prvního těhotenství k ohrožení dítěte hemolytickým onemocněním nedochází. Je to dáno tím, že erytrocyty plodu potřebné k vyvolání imunizace u matky se mohou do jejího těla dostat až během porodu. Každým dalším následným těhotenstvím je riziko HON větší, tedy v případě je-li dítě opět RhD pozitivní. V takové situaci pak i malé množství erytrocytů vyvolá u matky zvýšenou tvorbu anti-d protilátek, ty procházejí placentou a následně destruují erytrocyty dítěte. (Eckstein, 1994) Hemolýzou (destrukcí) erytrocytů dochází k vyplavování hemoglobinu do oběhu dítěte. Hemoglobin je následně odbouráván za vzniku bilirubinu. Jedná se o tzv. nekonjugovaný (nepřímý) bilirubin. Z důvodu nezralosti jater novorozence a nedostatečného množství albuminu, který by bilirubin do jater transportoval, nedochází k jeho konjugaci s kyselinou glukuronovou. Konjugace nepřímého bilirubinu je velmi důležitá, neboť tak dochází k jeho přeměně na bilirubin přímý, který je rozpustný ve vodě a může být vylučován do žluče. Nepřímý bilirubin je naproti tomu rozpustný v tucích, a proto je schopen pronikat do buněk obsahujících lipidy. Poškozuje tak některé orgány, zejména mozek (jádrový ikterus). (Muntau, 2009) (Penka aj., 2009) K této situaci, kdy novorozenec není schopen zpracovat přebytečný bilirubin, dochází kromě velmi těžkých případů až po porodu. Je to dáno tím, že před porodem se o zpracování nadbytečného bilirubinu postará organismus matky. (Penka aj., 2009) Podle nálezu koncentrace bilirubinu v plodové vodě můžeme usuzovat o závažnosti HON. (Vacek, 2006) HON tedy bývá provázen hyperbilirubinémií, různě závažnou anemií, žloutenkou, hepatosplenomegalií, hydropsem a ascitem plodu. V těžkých případech dochází i k úmrtím a potratům. (Roztočil a kol., 2008) 2. AB0 systému - v takovém případě bývají postiženy děti s krevní skupinou A nebo B, kdy jejich matky mají naopak krevní skupinu 0. V krvi matek se totiž kromě přirozených IgM protilátek anti-a a anti-b mohou vyskytovat také imunní IgG protilátky anti-a a anti-b. K závažnému ohrožení dítěte však nedochází, neboť jen málo těchto protilátek prostoupí placentou a také proto, že antigeny A a B nemusí být na erytrocytech plodu ještě plně 34

35 vyvinuty. Při AB0 inkompatibilitě bývá většinou postiženo už i první dítě, k čemuž u Rh inkompatibilit nedochází. (Muntau, 2009) (Penka aj., 2009) 3. jiných skupinových systémech - uplatňují se zde protilátky ze systémů Kell (anti-k, anti-k), Kidd (anti-jk a, anti-jk b ), Duffy (anti-fy a, anti-fy b ), MNSs (anti-s, anti-s) a další. (Eckstein, 1994) Závažná je především anti-k protilátka, kterou si Kell negativní žena tvoří zejména následkem předchozí Kell pozitivní transfuze. V případě těhotenství, je-li plod po otci Kell pozitivní, dochází k jeho možnému ohrožení. Pokud je však otec stejně jako matka Kell negativní, není třeba provádět další opatření a vyšetření, neboť v takové případě nemůže být dítě ohroženo. (Moise a Lubušký, 2009) Tedy stejně jako anti-d může i anti-k protilátka způsobit závažnou formu HON. Je v tom však určitý rozdíl. Během erytropoezy se na erytroidních progenitorových buňkách objevují Kell antigeny mnohem dříve, než antigeny Rh systému. To má za následek to, že anti-k za účastí makrofágů ničí Kell pozitivní progenitorové buňky ještě před tím, než začnou produkovat hemoglobin. Nedochází tedy pouze k destrukci zralých erytrocytů plodu. Při rozpadu progenitorových buněk červené krevní řady se z nich neuvolňuje hemoglobin, neboť ještě žádný neobsahuji. Proto se také tvoří méně bilirubinu a tedy i žloutenka se vyskytuje méně často než u HON vyvolaného anti-d protilátkou. Vzniklá anemie však může být závažná a to i přesto, že hladina protilátky anti-k většinou nekoreluje se stupněm anémie. (Daniels a Bromilow, 2007) (Dean, 2005) Vyšetření v těhotenství s rizikem aloimunizace U každé ženy se na počátku těhotenství vyšetří krevní skupina AB0, RhD a screening protilátek. Je-li žena RhD negativní, provádí se stanovení antigenu D také u otce dítěte. Screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek se vyšetřuje obvykle dvakrát v průběhu těhotenství. U matek se provádí průkaz cirkulujících protilátek proti fetálním erytrocytům nepřímým Coombsový testem. U dítěte lze prokázat protilátky vázané na erytrocyty přímým Coombsovým testem (Moise a Lubušký, 2009). Pokud je u matky některá z protilátek zjištěna, je třeba ji přesně identifikovat a stanovit na kolik je riziková ve vztahu k HON. (Moise a Lubušký, 2009) (přednášky z LF:BLTS0411p) 35

36 Tabulka 11: Erytrocytární protilátky ve vztahu k HON (Roztočil a kol., 2008) Způsobují hemolýzu Často Méně často Vzácně Není znám žádný případ Typ protilátek D, K, c, E e, C, ce, Ce, C w, Kp a, Kp b, k, Jk a, s, Fy a Fy b, Jk b, Lu a, Lu b, M, N, S Le a, Le b, P V případě, že identifikací odhalíme některou z protilátek, která HON způsobuje, je nezbytné toto těhotenství nadále monitorovat. Zjistíme-li protilátky vyvolávající mírnou formu HON, využíváme k jejich sledování pouze neinvazivní metody. Naopak další monitorování není potřeba, pokud je detekovanou protilátkou jedna z těch, které se na vzniku HON nijak nepodílejí. (Roztočil a kol., 2008) Při odhalení klinicky významné protilátky je třeba stanovit její titr. Titr se však využívá pouze jako marker (ukazatel) možného ohrožení těhotenství aloimunizací, sám o sobě neposkytuje dostatečné informace o hemolytickém potenciálu příslušné protilátky. Tento potenciál je třeba hodnotit i z dalších hledisek: její koncentrace, avidity, specifity, IgG podtřídy, jak silně je příslušný antigen na fetálních erytrocytech exprimován, stáří plodu při zjištění kritické hodnoty koncentrace protilátek atd. (Moise a Lubušký, 2009) Kritickou hladinou, co se týká protilátky anti-d, je titr 16, u anti-k protilátky je to titr 8. (Čech aj., 2006) U matek se provádí vyšetření titru každé 4 týdny. (Moise a Lubušký, 2009) Na začátku těhotenství můžeme z krve matky provést také stanovení Rh genotypu dítěte. (Moise a Lubušký, 2009) Toto vyšetření se provádí z fetální DNA, která se do mateřské krve dostává ve fetálních buňkách prostupujících přes placentu. Fetální buňky jsou imunitním systémem matky destruovány a DNA je z nich tak uvolňována. (Roztočil a kol., 2008) Výsledkem vyšetření zjistíme, zda je dítě Rh pozitivní nebo Rh negativní. V případě Rh negativity nemůže být ohroženo rozvojem HON. Vyšetření Kell (K) genotypu plodu není v současné době v České republice k dispozici (Moise a Lubušký, 2009). Další možnosti vyšetření jsou: stanovení genotypu a erytrocytárních antigenů u otce, neinvazivní ultrazvukové vyšetření, amniocentéza a kordocentéza. (přednášky z LF:BLTS0411p) 36

37 4.1.3 Léčba hemolytického onemocnění novorozence 1. Fototerapie - slouží k odstranění nadbytečného bilirubinu, kdy je bilirubin přeměněn na produkty vylučitelné do žluče a moče, aniž by musela být provedena jeho konjugace. K fototerapii se využívá modré světlo s vlnovou délkou 460 nm. (Muntau, 2009) 2. Intrauterinní transfuze - používají se 0 RhD negativní erytrocyty staré méně než 5 dnů, respektující přítomné protilátky, deleukotizované, ozářené, s vysokým hematokritem a v NAT kompatibilní se sérem matky. (přednášky z LF:BLTS0411p) 3. Výměnná transfuze - použité erytrocyty musí být shodné s AB0 skupinou matky i dítěte a respektovat přítomné protilátky. Erytrocyty by neměly být starší než 5 dnů, musí být deleukotizované a ozářené pokud předcházela intrauterinní transfuze. (Tesařová a kol., v tisku) 4. Transfuze substituční je založena na tom, že se novorozenci převede malé množství erytrocytů, které jsou skupinově shodné nebo 0 RhD negativní, respektující přítomné protilátky, v NAT kompatibilní se sérem matky, starší méně než 5 dnů, musí být deleukotizované a ozářené pokud předcházela intrauterinní transfuze. (Tesařová a kol., v tisku) Prevence aloimunizace matek a hemolytického onemocnění novorozence V současné době lze imunizaci RhD negativních matek většinou zcela zabránit. Závisí to především na včasné aplikaci imunoglobulinu anti-d. (Calda a Čepický, 2009) Imunoglobulin anti-d (RHEGA) se získává z plazmy dárců uměle imunizovaných nebo od rekonvalescentů. (Zeman, Krška a kol., 2011) RHEGA má za úkol zničit všechny erytrocyty RhD pozitivního plodu, které se dostaly do krevního oběhu matky. (Trojan a kol., 2003) Obvyklou dávkou je 125 µg. Dvojnásobek této dávky by se měl podávat po komplikovaných porodech a císařských řezech. RHEGA se aplikuje do 72 hodin po porodu, podává se však také u potratů, interrupcí a při mimoděložním těhotenství. Výše uvedené se týká případu, kdy je dítě RhD pozitivní, v opačném případě se toto neprovádí. (Roztočil a kol. 2008) (Moise a Lubušký, 2009) Doposud byla vyvinuta pouze anti-d profylaxe, přestože existuje řada dalších antigenů způsobujících HON. (Moise a Lubušký, 2009) 37

38 4.2 Hemolytické potransfuzní reakce Jedná se o reakce, které vznikají u příjemců transfuze erytrocytů. Příjemce si vytvoří protilátky proti antigenním strukturám na povrchu transfundovaných erytrocytů, které sám na svých erytrocytech nemá. Následkem protilátek pak dochází k jejich destrukci. Málokdy nastává situace opačná, že by erytrocyty příjemce byly destruovány protilátkami získanými od dárce. Jsou-li protilátky v krvi příjemce přítomny již při transfuzi, dochází k akutní hemolytické reakci. Pokud se protilátky začnou tvořit až po transfuzi, jedná se o opožděný typ potransfuzní hemolytické reakce. (Penka aj., 2009) (Penka, Tesařová a kol., 2011) Za hemolytické reakce jsou zodpovědné převážně protilátky reagující při teplotě 37 C. O závažnosti hemolýzy pak rozhoduje titr příslušné protilátky, neboť čím je titr vyšší, tím je protilátka nebezpečnější. Pro jejich nebezpečnost je také rozhodující, do jaké podtřídy IgG protilátek patří. IgG1 a IgG3 na rozdíl od IgG2 a IgG4 dokážou lépe aktivovat komplement, a proto je jejich schopnost hemolýzy větší. Závažnost reakce ovlivňuje kromě protilátek také množství antigenu na erytrocytech, objem převedených inkompatibilních erytrocytů a včasné zahájení léčby. (Eckstein, 1994) Na vzniku hemolytických reakcí se podílejí především protilátky anti-d, -E, -e, -C, -c, -K, -Fy a, -Fy b, -Jk a, -Jk b. (Penka aj., 2009) Rozdělení hemolytických potransfuzních reakcí Hemolytické potransfuzní reakce rozdělujeme na: a) Intravaskulární - protilátkou aktivovaný komplement proděraví membránu erytrocytu a tím dojde k jeho rozpadu přímo v krevním řečišti b) Extravaskulární - k odstraňování senzibilizovaných erytrocytů dochází pomocí monocytomakrofágového systému (Turek, 2010) Hemolytické potransfuzní reakce - akutní (intravaskulární) K těmto reakcím dochází zejména v případě inkompatibility v AB0 systému. Protilátkami, které také mohou zapříčinit intravaskularní hemolýzu jsou anti-k, anti-le a a anti-jk a. Pro objevení prvních klinických příznaků obvykle stačí podání pouhých ml, přičemž u dospělého je za život ohrožující považována dávka okolo 200 ml inkompatibilní transfuze. 38

39 Proto je velmi důležité během transfuze pacienta sledovat, neboť případné akutní selhání ledvin, vznik DIC a ARDS ho ohrožují na životě. Po transfuzi bývá pozitivní NAT i PAT. (Penka aj., 2009) Hemolytické potransfuzní reakce - akutní (extravaskulární) Za tento typ reakcí bývají zodpovědné protilátky ze systému Rh, Kell, Kidd a Duffy. Klinické příznaky se neobjevují tak rychle jako v předchozím případě, protože kapacita monocytomakrofágového systému je omezena. K hemolýze senzibilizovaných erytrocytů dochází ve slezině. Selhání ledvin a DIC bývají vzácné. (Penka aj., 2009) (Eckstein, 1994) Vždy je třeba identifikovat příslušnou protilátku, která hemolýzu vyvolala. Provádějí se opakovaná vyšetření, neboť titr protilátky se zvyšuje až po několika dnech. (Penka aj., 2009) Hemolytické potransfuzní reakce - opožděný typ Tyto reakce způsobují protilátky anti-d, anti-c, anti-e, anti-jk a a další. Dochází k extravaskulární hemolýze pomocí monocytomakrofágového systému. Jedná se o případy, kdy jedinec má v krvi již vytvořeny protilátky následkem předchozí transfuze nebo těhotenství. Ty postupně klesají až pod hodnotu jejich možné detekce. Proto nejsou prokazatelné při screeningu protilátek a zkouškách kompatibility. Měřitelné hodnoty protilátek se v krvi pacienta objevují až 5 měsíců po transfuzi (všechny dárcovské erytrocyty jsou v tu dobu již odstraněny), i když k jejich postupnému zvyšování dochází již během 4-8 týdnů. Pokud pacient dostane další transfuzi, reaguje jeho imunitní systém mnohem rychleji a k vysokému nárůstu protilátek dochází již za pár dní. Příznakem těchto reakcí je fakt nedávné transfuze, teplota a lehká anemie objevující se až po několika dnech či týdnech, obvykle však za 5-7 dní. K vyšetření se využívá vzorek čerstvé pacientovy krve. (Penka aj., 2009) (Eckstein, 1994) PAT bývá pozitivní. (Kubešová a Tesařová, 2005) Terapie není většinou potřebná, ale pacient a jeho ošetřující lékař musí být informováni o přítomnosti a specificitě protilátky pro případ event. budoucí transfuzní léčby (Penka aj., 2009). Z výše uvedeného vyplývá, že při transfuzi je třeba dodržovat kompatibilitu v AB0 systému a respektovat přítomnost či nepřítomnost antigenu D. Zjistí-li se 39

40 před transfuzí u pacienta přítomnost některé z klinicky významných nepravidelných antierytrocytárních protilátek nebo došlo-li již k aloimunizace, je nutné, aby pacient dostal pouze takovou transfuzi erytrocytů, která neobsahuje příslušné antigeny, proti kterým je protilátka vytvořena. (Sakalová, Lipšic aj., 1995) Prevence hemolytických potransfuzních reakcí Jejich nejčastější příčinou bývá záměna transfuzních přípravků nebo pacientů. Vzácně se jedná o laboratorní chybu. Aby k těmto záměnám nedocházelo, je nutná plná soustředěnost a pečlivost v ověřování totožnosti pacienta a provádění kontrol krevní skupiny u lůžka nemocného (bed-side test). Je také nutné před každou další transfuzí provést křížový pokus s čerstvě odebranou pacientovou krví. Tím dokážeme odhalit dříve nedetekovatelné nebo nepřítomné protilátky. (Eckstein, 1994) 40

41 5 Průkaz nepravidelných antierytrocytárních protilátek K detekci nepravidelných antierytrocytárních protilátek se nejčastěji používají metody, při kterých dochází k aglutinaci (shlukování) erytrocytů předem senzibilizovaných protilátkami. Toto shlukování je viditelné pouhým okem a informuje nás o proběhlé reakci mezi antigenem erytrocytu a protilátkou. Protilátky, které jsou schopny aglutinovat erytrocyty přímo, se označují jako kompletní protilátky a řadíme je do třídy IgM. Protilátky, které jsou sice schopny erytrocyty senzibilizovat, ale nedokážou je přímo aglutinovat, se označují jako inkompletní protilátky a řadíme je do třídy IgG. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Na základě existence zeta-potenciálu nedochází k samovolnému shlukování erytrocytů, neboť díky němu se erytrocyty navzájem odpuzují a zachovávají si určitou vzdálenost od sebe. IgM protilátky (př: anti-a, anti-b) díky své velikosti dokážou tuto vzdálenost překonat a erytrocyty tak aglutinovat, na rozdíl od IgG (což jsou téměř všechny nepravidelné antierytrocytární protilátky). (Eckstein, 1994) Výše uvedené se týká průkazu in vitro. In vivo je pro destrukci erytrocytů podstatná reakce mezi antigenem a protilátkou, což nezáleží na zeta-potenciálu, ale na specifitě příslušné nepravidelné antierytrocytární protilátky. (Eckstein, 1994) Obrázek 5: Porovnání serologického účinku IgM protilátky (dochází k aglutinaci) s účinkem IgG protilátky (nedochází k aglutinaci) IgM IgG (Dostupné z: n.htm) In vitro lze nepravidelné antierytrocytární (inkompletní, IgG) protilátky prokázat pouze za použití určitých pomocných látek: 1. Snížením zeta-potenciálu - dojde ke zmenšení vzdálenosti mezi erytrocyty a protilátky pak mohou tyto erytrocyty aglutinovat. K tomuto se využívá: a) albumin - mění náboj na povrchu erytrocytů 41

42 b) polybren - s negativním nábojem erytrocytu reagují jeho pozitivně nabité molekuly, což napomáhá aglutinaci vytvořením můstku mezi erytrocyty c) proteolytické enzymy (bromelin, papain) - na povrchu erytrocytu se nacházejí glykoproteiny, jejichž cukerné složky nesou negativní náboj. Enzymy část těchto glykoproteinů odstraňují, tím dochází ke zmenšení negativního náboje a vzdálenosti mezi erytrocyty. Použití těchto enzymů je nevhodné v případě, kdy prokazujeme protilátky proti antigenům ze systému Duffy a MNSs, neboť tyto antigeny jsou vázány na povrch glykoproteinu erytrocytární membrány, který je enzymem částečně odstraňován. 2. Zlepšením aglutinace prostřednictvím posílení vazby mezi antigenem a protilátkou a) LISS - v prostředí s nízkou iontovou silou (koncentrací), dochází k silnější vazbě mezi antigenem a protilátkou b) PEG (polyethylenglykol) - je schopen odstraňovat vodu z okolí erytrocytu, čímž se koncentrace protilátek při testu zvyšuje a vazba se tak stává silnější (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 5.1 Antiglobulinové (Coombsovy) testy Antiglobulinové testy jsou nejpoužívanějšími metodami k průkazu nepravidelných antierytrocytáních protilátek. Při těchto testech jsou protilátky detekovány pomoci aniglobulinového séra (AGH), které obsahuje protilátky proti těmto stanovovaným protilátkám. Jsou-li erytrocyty protilátkami senzibilizovány, AGH přidané do reakce se na tyto protilátky naváže a vyvolá tak aglutinaci erytrocytů. Kromě protilátek můžeme tímto způsobem stanovovat také komplement. AGH může být buď polyspecifické nebo monospecifické. Polyspecifické AGH obsahuje anti-igg (a anti-igm) i anti-c3d složku. Monospecifické AGH naopak obsahuje jen anti-igg nebo jen anti-c3d. Je-li výsledek v polyspecifickém AGH pozitivní, vyšetření se pak opakuje i s monospecifickým AGH. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 42

43 5.1.1 Rozdělení antiglobulinových testů 1. PAT (přímý antiglobulinový test) - slouží k průkazu erytrocytů s navázanou protilátkou in vivo. Prostřednictvím tohoto testu můžeme diagnostikovat: HON - kdy zjišťujeme přítomnost mateřských protilátek na erytrocytech novorozence Hemolytické potransfuzní reakce - kdy pátráme po tom, zda si následkem transfuze pacient vytvořil protilátky, respektive jestli se tyto protilátky navázaly na erytrocyty podané transfuzí AIHA - detekujeme autoprotilátky navázané na vlastních erytrocytech. Autoprotilátky se tvoří následkem poruchy imunitních mechanismů, někdy se tvoří z důvodu přítomnosti některých léků, které jsou vázány na erytrocyty. Protilátky pak s takovými erytrocyty reagují a destruují je. Existují případy, kdy bývá PAT pozitivní i u zdravých jedinců, kteří nemají známky hemolýzy. (Dostupné z: Postup PAT: Erytrocyty pacienta se nejprve promyjí fyziologickým roztokem, aby se odstranily případné nenavázané protilátky nebo komplement, které by mohly falešně ovlivňovat výsledek vyšetření. Po promytí se erytrocyty inkubují s AGH. Jsou-li na erytrocytech navázány protilátky, dojde k viditelné aglutinaci a PAT je pozitivní. Jestliže protilátky na erytrocytech navázány nejsou, k aglutinaci nedochází a PAT je negativní. (Dostupné z: 2. NAT (nepřímý antiglobulinový test) - pomocí tohoto testu se in vitro odhaluje přítomnost nepravidelných antierytrocytárních protilátek v séru. NAT se provádí: v těhotenství, kdy se v krvi matky zjišťuje přítomnost protilátek proti antigenům plodu, který tak může být ohrožen vznikem HON při předtransfuzním vyšetřením v rámci screeningu a identifikace protilátek u křížového pokusu (Dostupné z: Postup NAT: Sérum pacienta se inkubuje s diagnostickými erytrocyty nebo s erytrocyty dárce (u křížového pokusu). Po inkubaci jsou erytrocyty několikrát promyty, aby se veškeré nezreagované protilátky odstranily, neboť by stejně jako u PAT mohly ovlivňovat výsledek vyšetření. Po promytí se do reakce přidá AGH. Dojde-li k aglutinaci je NAT pozitivní 43

44 a protilátky tudíž byly v séru přítomny. Nejsou-li však protilátky v séru přítomny k aglutinaci nedojde a NAT je negativní. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) V NAT se pro usnadnění a zesílení vazby mezi protilátkou a erytrocytem používají pomocné látky (LISS, PEG, albumin nebo polybren). U PAT se tyto pomocné látky nepoužívají, neboť se prokazují erytrocyty s již navázanou protilátkou a zesílení vazby proto není potřeba. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Provedení antiglobulinových testů Antiglobulinové (Coombsovy) testy se mohou provádět: ve zkumavkách sloupcovou aglutinační metodou sloupcovou afinitní metodou v mikrotitračních destičkách na pevné fázi (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Obrázek 6: Příklady karet pro sloupcovou aglutinaci (Dostupné z:

45 Obrázek 7: Příklady intenzity reakcí v kartách pro sloupcovou aglutinaci (Dostupné z: n.htm) A B C Na obrázku 7A je znázorněna pozitivní reakce, to znamená, že v séru byly přítomny protilátky a došlo tak k aglutinaci v podobě červené linii na gelu. Na obrázku 7B je vidět slabě pozitivní reakce a na 7C reakce negativní. 45

46 6 Screening a identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek Součástí každého předtransfuzního vyšetření je screening a případná identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek. Kromě toho se také provádí stanovení krevní skupiny AB0 a RhD u dárce i příjemce a zkouška kompatibility. Předtransfuzní vyšetření má význam v zajištění takové transfuze, která u příjemce nepovede k hemolýze transfundovaných erytrocytů. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) 6.1 Screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek Ke screeningu se používá sérum pacienta a panel se speciálními diagnostickými erytrocyty. Tyto erytrocyty jsou krevní skupiny 0, aby případné protilátky anti-a a anti-b v séru nemohly stanovení ovlivnit. Na povrchu screeningových erytrocytů bývají zastoupeny nejdůležitější krevně skupinové antigeny, což umožňuje odhalit v podstatě všechny nepravidelné antierytrocytární protilátky, které mají klinický význam. Antigeny by měly být na erytrocytech přítomny v homozygotní kombinaci, neboť jejich exprese je tak mnohem silnější. Některé slabé protilátky by totiž při použití erytrocytu s heterozygotní kombinací antigenů nemusely být odhaleny. Takové protilátky pak mohou hemolyzovat erytrocyty až za několik dnů po transfuzi, než se následkem sekundární imunitní odpovědi vytvoří protilátky silnější. U pacienta se pak objevuje opožděný typ hemolytických potransfuzních reakcí. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Screeningové erytrocyty se získávají minimálně od tří dárců a musí nést antigeny: D, C, c, C w, E, e, K, k, Fy a, Fy b, Jk a, Jk b, M, N, S, s. Kromě toho musí být jedny erytrocyty negativní pro antigen D, a dále by na jedněch z nich měly být zastoupeny fenotypy DCe/DCe a DcE/DcE. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07, 2011) Nepřímý antiglobulinový test (NAT) je nejpoužívanější metodou pro screening protilátek. Nejčastější formou je pak LISS/NAT. Screening lze provádět ve zkumavkách, na pevné fázi nebo sloupcovou aglutinací. Co se týče enzymových testů jsou to pouze doplňující metody využívané k průkazu některých Rh protilátek. (přednášky z LF:BLTS0411p) 46

47 Výsledek screeningového vyšetření protilátek může být: negativní, kdy vyšetřované sérum neobsahovalo protilátky a proto nedošlo k aglutinaci pozitivní, kdy v séru přítomné protilátky reagovaly s některými screeningovými erytrocyty a tím došlo k aglutinaci. Pozitivita se hodnotí na + až 4+. Pokud je screening pozitivní, je třeba zjistit, o jakou protilátky se jedná. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (přednášky z LF:BLTS0411p) 6.2 Identifikace nepravidelných antierytrocytárních protilátek K identifikaci (určení specifity) protilátky se používá stejně jako u screeningu panel se speciálními diagnostickými erytrocyty. Identifikační panel na rozdíl od screeningového obsahuje 8-20 erytrocytárních suspenzí. Ty jsou negativní nebo pozitivní, co se týče zastoupení nejdůležitějších antigenů krevních skupin. Jedná se o antigeny: D, C, c, C w, E, e, K, k, Kp a, Kp b, Js a, Js b, Fy a, Fy b, Jk a, Jk b, M, N, S, s, P1, Le a, Le b, Lu a, Lu b. Je třeba, aby byly opět přítomny v homozygotní kombinaci. Protože antigeny K, Kp a a Lu a se v této formě vyskytují jen zřídka, používají se erytrocyty s jejich heterozygotní kombinaci. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Identifikace protilátek je stejně jako u screeningu založena na nepřímém antiglobulinovém testu (NAT). Do reakce se mohou přidávat některé pomocné látky (PEG, LISS, enzymy, albumin). Specifitu protilátky určíme na základě výsledné pozitivní nebo negativní reakce. Alespoň se dvěma typy diagnostických erytrocytů, na nichž je daný antigen zastoupen, by měla být reakce pozitivní a alespoň se dvěma typy diagnostických erytrocytů, na kterých příslušný antigen zastoupený není, by měla být reakce negativní. Pomocí autokontroly (vlastních erytrocytů pacienta) zjistíme, zda se jedná o aloprotilátky nebo autoprotilátky. Po identifikaci specifické protilátky se provádí typizace pacientových erytrocytárních antigenů. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07, 2011) Vždy je třeba mít na mysli, že v séru se může vyskytovat více protilátek současně. Vícečetné protilátky mohou být potvrzeny výběrem diagnostických erytrocytů negativních pro antigen odpovídající první protilátce a pozitivních pro ostatní antigeny, proti nimž mohou být tvořeny klinicky významné protilátky (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07, 2011). 47

48 Teprve na základě určení specifity protilátky může být pro pacienta zajištěna vhodná transfuze. Její antigenní složení musí být takové, aby na něj nalezená protilátka nereagovala a nedocházelo tak k hemolýze transfundovaných erytrocytů. (Engelfriet, Meulenbroek et al., 2003) Obrázek 8: Příklady karet sloupcové aglutinace využívané ke screeningu a identifikaci protilátek (Dostupné z: LISS/Coombs enzymatické a NAT prostředí Obrázek 9: Erytrocyty pro screeningové vyšetření protilátek a pro identifikaci protilátek (Dostupné z:

49 II PRAKTICKÁ ČÁST V praktické části se pokouším zjistit příčinu imunizace u 52 osob (pacientů FN Brno), v jejichž plazmě byly nalezeny nepravidelné antierytrocytární protilátky. Zejména se zabývám tím, zda k imunizaci pacientů erytrocytárními antigeny mohlo dojít na základě podané transfuze erytrocytů. Erytrocyty, jak známo, jsou nositeli krevně skupinových antigenů. Pokud tyto antigeny, tj. krevní skupiny, rozpoznává organismus jako cizí, může si dotyčný jedinec proti nim vytvořit protilátky. S ohledem na tuto skutečnost jsem se snažila zjistit antigenní složení erytrocytárních transfuzních přípravků, které byly podány 52 pacientům sledovaným ve zvoleném období. Toto období bylo specifikováno jako interval mezi negativním výsledkem screeningového vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům a prvním zachyceným pozitivním výsledkem stejného testu při některém z dalších předtransfuzních vyšetření. Na základě došetření přítomnosti čí nepřítomnosti antigenu odpovídajícího protilátce v podaném transfuzním přípravku lze potom odvodit, zda možnou příčinou imunizace byla některá z podaných transfuzí erytrocytů. Dále se zabývám identifikací protilátek, tj. zjištěním, proti kterému erytrocytárnímu antigenu protilátky vznikly, zda se častěji vyskytovaly u můžu či u žen, a u kterých věkových kategorií byly nejčastěji detekovány. Na začátku je třeba upozornit, že protilátky nemusí vznikat pouze na podkladě transfuze, ale také následkem inkompatibilního těhotenství, kdy matka tvoří protilátky proti erytrocytárním antigenům plodu. K této imunizaci dochází nejčastěji během porodu. Kromě toho se některé protilátky proti erytrocytům mohou vyskytovat přirozeně nebo se může jednat o autoprotilátky vzniklé v důsledku autoimunitní reakce. 49

50 7 Výsledky Pro analýzu byly vybrány osoby z řad pacientů vyšetřených na TTO FN Brno, u nichž byly nepravidelné antierytrocytární protilátky detekovány v letech Výskyt protilátek z hlediska pohlaví Z celkového počtu 52 analyzovaných jedinců bylo 21 mužů a 31 žen. Tento fakt může být pouhou náhodou ve výběru osob pro analýzu nebo příčinou častějšího výskytu protilátek u žen je předchozí těhotenství. Procentuální zastoupení mužů a žen Mužů- 21 Žen % 60% Obr. 10 Graf procentuálního zastoupení mužů a žen z celkového počtu analyzovaných osob 7.2 Výskyt protilátek z hlediska věku Z obr. 11 je patrné, že nejvíce byly protilátky u pacientů zastoupeny ve věkové skupině let. Domnívám se, že příčinou toho je to, že s pokročilejším věkem bývají spojeny různé zdravotní problémy včetně těch, při kterých jsou pacienti léčeni transfuzemi a zvyšuje se tak pravděpodobnost, že se ve sledované skupině objevili opakovaně transfundovaní pacienti. 50

51 7.3 Výskyt protilátek z hlediska diagnóz Dále s ohledem na spektrum diagnóz u pacientů je zřejmé, že v souboru byli zastoupeni z velké části pacienti onkologičtí, dlouhodobě léčeni pro anemii a tedy opakovaně transfundovaní. Stejně jako v předchozím případě se však může jednat o pouhou náhodu ve výběru analyzovaných jedinců. Výskyt protilátek z hlediska věku počet jedinců nad 76 věkové rozmezí Obr. 11 Graf výskytu protilátek z hlediska věku 7.4 Počet protilátek v krvi u jednotlivých osob Ne vždy se u pacientů vyskytovala pouze jedna protilátka. V několika případech měli pacienti protilátky dvě a v jednom případě dokonce tři. Většinou se však jednalo o pacienty, kteří obdrželi větší počet transfuzí. To znamená, že byli opakovaně vystavení většímu počtu imunizačních podnětů a měli tak větší příležitost si protilátky vytvořit. Při zajišťování transfuze se u neimunizovaných pacientů obvykle nepřihlíží ke shodě ve všech krevních skupinách, ale dodržuje se jen shoda v AB0 a RhD antigenech. Výjimkou jsou malé skupiny pacientů, ke kterým patří mladé ženy a RhD negativní pacienti, u nichž se při transfuzi respektuje shoda v antigenu K a fenotyp ccee. 51

52 počet protilátek Počet protilátek vyskytujících se v krvi u jednotlivých osob počet jedinců Obr. 12 Graf zaznamenávající počet protilátek vyskytujících se v krvi u jednotlivých osob 7.5 Zastoupení protilátek z jednotlivých krevních skupinových systémů Tabulka 12 uvádí, proti kterým antigenům krevních skupin se protilátky vytvořily a kolik jich na základě celkového počtu pacientů k jednotlivým skupinovým systémům patřilo. V první polovině tabulky se toto týká situace, kdy měl pacient jen jednu protilátku. Druhá polovina tabulky naopak uvádí situaci, kdy byly protilátky ve směsi dvě nebo tři, proto je zde také uvedena kombinace více systémů krevních skupin, ke kterým protilátky patřily. Následně, stejně jako v první polovině tabulky uvádím, u kolika jedinců se tyto kombinace vyskytovaly a o jaké kombinace konkrétních protilátek šlo. Tabulka 12: Zastoupení protilátek z jednotlivých krevních skupinových systémů Protilátky z jednotlivých krevních systémů Počet pacientů s těmito protilátkami Protilátka Protilátky Rh systému 28 -E, -e, -C, -c, -C w Protilátky Kell systému 2 -K Protilátky Kidd systému 3 -Jk a, -Jk b Protilátky Duffy systému 1 -Fy a Protilátky Lutheran systému 1 -Lu a Protilátky Lewis systému 2 -Le a 52

53 Kombinace Rh protilátek 10 -C+e; -E+c; -E+C w ; -c+c w Protilátky Rh a Kell systému 1 -e+k Protilátky Rh a Kidd systému 1 -E+Jk a Protilátky Rh a Lutheran systému 1 -E+c+Lu a Protilátky Rh a Lewis systému 2 -C+Le a ; -E+Le a Jak je patrné, nejvíce protilátek bylo proti antigenům Rh systému. Důvodem je to, že antigeny Rh systému jsou díky složitosti a velikosti své proteinové molekuly nejvýznamnější antigeny a současně imunogeny a antigenní rozdílnost mezi jedinci tak často způsobuje potransfuzní imunizaci. 7.6 Zastoupení konkrétních protilátek v procentech Na základě mé analýzy jsem chtěla zjistit, zda výsledky, ke kterým jsem se dopracovala, a které jsou vyznačeny na obr. 13 a 14, budou alespoň částečně odpovídat údajům uváděným v odborné literatuře, a to přesto, že počet analyzovaných jedinců je nízký a není vhodný pro statistické zpracování a k vyvozování jednoznačných závěrů. Obr. 13 Graf procentuálního zastoupení protilátek, které se u pacientů vyskytovaly samostatně 53

54 Obr. 14 Graf procentuálního zastoupení protilátek, které se u pacientů vyskytovaly ve směsi Pro lepší názornost uvádím ještě tabulku. Tabulka 13: Konkrétní protilátky proti jednotlivým krevně skupinovým antigenům, jejich číselné a procentuální zastoupení Protilátky Počet Procenta Protilátky Počet Procenta Anti-E 21 40% Anti-C+e 2 4% Anti-e 1 2% Anti-E+c 4 8% Anti-C 3 6% Anti-E+C w 3 6% Anti-c 2 4% Anti-c+C w 1 2% Anti-C w 1 2% Anti-e+K 1 2% Anti-K 2 4% Anti-E+Jk a 1 2% Anti-Jk a 2 4% Anti-E+Le a 1 2% Anti-Jk b 1 2% Anti-C+Le a 1 2% Anti-Fy a 1 2% Anti-E+c+Lu a 1 2% Anti-Lu a 1 2% Anti-Le a 2 4% 54