Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

Transkript

1 Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

2 Obecné principy reakce antigenprotilátka 1929 Kendall a Heidelberg Precipitační reakce Oblast nadbytku protilátky vzrůstá množství precipitátu s přídavkem antigenu Oblast ekvivalence množství precipitátu je největší Oblast nadbytku antigenu- tvoří se malé IK, které neprecipitují

3 Imunoglobuliny membránově vázané a solubilní receptory

4 Imunogenicita a antigenicita Imunogenicita je schopnost substance vyvolat humorální/nebo buněčnou imunitní odpověd B bb + antigen.efektorové B bb a pamětové B bb T bb + antigen efektorové T bb a pamětové T bb Substance s imunogenicitou vykazují antigenicitu ale ne obráceně

5 Faktory ovlivňující imunogenicitu Vlastní nebo cizí ( např. BSA aplikace do jiného živočišného druhu excelentní imunogen) Molekulová hmotnostm ( Da, Da špatný imunogen Chemické složení a komplexnost Schopnost prezentace s MHC molekulami

6 Epitopy Antigen = částice rozpoznávaná protilátkou Epitop (antigenní determinanta) = část antigenu, na který se váže protilátka. Většina antigenů má více epitopů (multivalentní) Fig. 2.9 Většinou cukr nebo peptid.

7 Epitopy rozpoznávané protilátkami jsou obvykle lokalizovány na povrchu antigenu Fig. 2.8

8 Konformační vs. lineární epitopy Fig. 2.11

9 Epitopy heat, acid Konformační epitopy zničení při denaturaci Lineární epitopy neovlivněné denaturací

10 Imunoglobuliny Tiselius a Kabat 1939 Imunizovali králíky ovlabuminem a poté pomocí elektroforezy identifikovali Ig První albumin, alfa, beta a gama globuliny

11 Základní struktura imunoglobulinů 2 lehké řetězce -lambda (λ) -kappa (κ) 2těžké řetězce Fig. 2.2

12 Základní struktura imunoglobulinů Fig. 2.2 Fig. 2.2

13 Štěpení protilátek Antigen-binding Fragment (Fragment vážící protilátku) Crystallizable Fragment (krystalizovatelný fragmen

14 Třída imunoglobulinů (izotypy) H: γ µ δ α ε (IgG1 4) (IgA1 2) L-chain: κ or λ

15 Fyzikální vlastnosti imunoglobulinů

16 IgM Membránově vázaný monomer and sekretovaný pentamer. První třída protilátek syntetizovaná během ontogeneze a při imunitní odpovědi Aktivace komplementu; aglutinace. Může být transportována na slizniční povrch

17 IgG Nejvyšší koncentrace v séru 4 podtřídy: IgG1-4 Aktivace komplementu Binds to Fcγ -receptors on neutrophils, macrophages and NK cells

18 IgA Obvykle dimer Sekreční IgA je dimer se sekreční komponentou 2 podtřídy: IgA1 and IgA2 Nejčastější imunoglobulin ve slizničních sekretech Neutralizace; Zabraňuje vazbě mikroorganismů na receptory Není efektivní v aktivaci komplementu

19 IgE Velmi nízká sérová koncentrace u zdravých lidí. Koncentrace je vyšší u pacientů s parazitárními infekcemi a u pacientů s alergiemi Váže se na receptory na žírných buňkách a bazofilech. Následuje degranulace a uvolňování zánětlivých mediátorů

20 IgD Velmi nízká koncentrace v séru Primárně nalézána spolu s IgM na naivních B buňkách Neznámá funkce

21 Funkce imunoglobulinů

22 Funkce imunuglobulinů

23 Polyklonální vs. monoklonální protilátky Polyklonální protilátky Purifikace ze séra imunizovaných zvířat (koza, králík) Proti mnoha epitopům, různe affinitní Rozdíly mezi šaržemi Monoklonální protilátky Produkce imortalizovanými plazmatickými buňkami, většinou myší původ Jedna specificita, definovaná afinita

24 Monoklonální protilátky Imortalizace jednoho klonu B buněk produkujících určitou protilátku Fúze B buněk s buňkami myelomu

25 Antigen Autoantigen, alergen, antigen mikrobiální Nativní a rekombiantní antigeny Rekombinantní antigen se odsekvenuje a připraví se in vitro rekombinantně chemickou syntézou nebo genovým inženýrstvím Většina rekombinantních antigenů je lineární shodná primární a maximálně sekundární struktura

26 Interakce antigen - protilátka Nekovalentní vazba: Elektrostatická Vodíkové můstky Van der Waalsovy síly Hydrofobní síly Afinita: Síla interakce mezi epitopem a jedním vazebným místem protilátky Avidita: Suma všech interakcí mezi protilátkou a antigenem

27 Afinita Síla asociace mezi vazebným místem protilátky a určitým epitopem Asociační konstanta K = (AgAb)/(Ag) x (Ab) Pouze pro monoklonální protilátky Polyklonální protilátky jsou heterogenní ve své afinitě, takže K se nedá určit

28 Avidita Kombinovaní intenzita reaktivity antiséra nebo polyklonálních protilátek Afinita všech vazebných míst všech protilátek v séru za určitých fyz.- chem. podmínek Funkce afinity všech vazebných míst protilátek a antigenních determinant makromolekuly Klinické využití diagnostika infekčních chorob, autoimunitních onemocnění

29 Crosreaktivita A B Antiserum vyrobené proti antigenu A reaguje také s antigenem B Antigen A a B mají stejný epitop Antigen A a B mají podobný (ale ne stejný) epitop