Testy toxicity s konzumenty. Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha

Transkript

1 Testy toxicity s konzumenty Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha

2 Konzumenti vodních ekosystémů 2

3 Testy toxicity na rybách Základní okruhy použití testů na rybách: Testy toxicity látek a přípravků používaných v chovu ryb (nátěry sádek, krmiva, hnojiva ) Testy na chovných rybách (např. pstruh) Testy látek potenciálně škodlivých pro vodní ekosystémy (pesticidy, antibiotika, detergenty ) Organismy doporučené v normách (pstruh, akvarijní ryby) Testy toxicity odpadů Akvarijní ryby (potřebné velké množství jedinců akvarijní méně náročné na chov) 3

4 Velké ryby Pstruh duhový - test subchronické toxicity látek na růstovou rychlost ČSN ISO Jakost vod Stanovení subchronické toxicity látek pro sladkovodní ryby Metoda vyhodnocení účinků látek na růstovou rychlost pstruha duhového Oncorhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae). 4

5 Pstruh duhový Oncorhynchus mykiss Pstruh duhový (syn. Americký) říše Animalia - živočichové kmen Chordata - strunatci třída Actinopterygii paprskoploutví řád Salmoniformes - lososotvární čeleď Salmonidae - lososovití Dorůstá délky až 120 cm, běžná velikost 50 cm Sladkovodní ryba - žije ve stojatých i tekoucích vodách, není tak náročný na kyslík, jako pstruh obecný. Vyznačuje se červeným nebo purpurovým pruhem, táhnoucím se středem těla, posetého černými skvrnami. Hřbet má modrý až olivově zelený, boky stříbřité a břicho bílé. U nás dorůstá výjimečně hmotnosti až 7 kg. Kapitální úlovek z českých revírů je z roku 1985, měřil 89 cm a vážil 7,05 kg. V USA však největší úlovek vážil 25,4 kg! Nejstarší dokumentovaná ryba tohoto druhu byla stará 11 let. 5

6 Rozšíření pstruha duhového Pstruh duhový dříve označovaný jako Salmo gairdneri Richardson. 6

7 Princip testu Test spočívá ve sledování inhibice růstové rychlosti testovacích ryb při expozici toxickou látkou po dobu 14 a 28 dní. Test patří mezi testy náročné na prostor a vlastní přípravu. Zejména zajištění chovných podmínek pro získávání dostatečného množství testovacích organizmů vyžaduje zkušenosti a dostatečné zázemí. Metoda může být přizpůsobena k použití pro ostatní sladkovodní, mořské a brakické ryby patřičnými úpravami zkušebních podmínek, zejména vzhledem k teplotě, objemu a jakosti (složení) ředicí vody, potravě a technice označování jednotlivých ryb. 7

8 Akutní test toxicity na hepatocytech pstruha duhového Test spočívá v expozici jaterních buněk pstruha duhového (rainbow trout hepatocytes - RTH) tkáňový test Není třeba obětovat tak velké množství jedinců jako u testu mortality Snížení ceny testu Test je vhodný zejména pro: komunální a průmyslové odpadní vody Povrchové vody Podzemní vody a výluhy ze zemin Pórové vody sedimentů Ve vodě rozpustné látky Organické látky rozpustné v DMSO 8

9 Princip testu Test se provádí na čerstvých jaterních buňkách pohlavně nedospělých pstruhů Kultura hepatocytů se izoluje alespoň ze tří jedinců (odstranění rozdílů v citlivosti mezi jedinci) Hepatocyty se umístí do mikrodestiček ve speciálním médiu L-15 Expozice koncentrační řadě toxikantů probíhá v temnu za teploty 15 C. Po 24 a 48 hodinách se testuje životaschopnost jaterních buněk 9

10 Test životaschopnosti hepatocytů RTH Živé buňky jsou schopné absorbovat barvivo a ukládat jej v lysozomech Ke kultuře buněk se po expozici přidá barvivo (neutrální červeň nebo fluorescein) Po krátké době se přebytečné barvivo vymyje K buňkám se přidá směs methanolu a kys. octové a získá se zabarvený roztok jehož barevná intenzita odpovídá množství absorbovaného barviva v buněčné kultuře Množství absorbovaného barviva se stanovuje spektrofotometricky 10

11 Výhody testu na RTH Snadno kontrolovatelné standardní podmínky ph, teplota, množství živin Snížení variability testů Menší objemy RTH vyžaduje jen 1 ml vzorku, zatímco test na rybách až 60 nebo 200 litrů. Menší utrpení ryb Pro RTH test je nutné obětovat 3 ryby, zatímco pro konvenční test cca 120 kusů. Více toxikologických informací Z hepatocytů lze stanovit další biomarkry jaterních systémů genotoxicita, endocrinnní poruchy (estrogeny), biotransformace a měření oxidativního stresu aniž by bylo nutné obětovat další ryby Kratší expozice RTH test trvá 24 až 48 h, místo 96 h u testu růstovou rychlost pstruha Test je citlivý na hepatotoxiny, na jedy ovlivňující základní procesy všech buněk jako je DNA syntéza a integrita, buněčné dělení, respirace, oxidativní stres, dýchání apod.) 11

12 Relevance testu Omezení testu na RTH Každý alternativní test in vitro musí být validován, zda jsou výsledky srovnatelné s původním testem in vivo. Neposkytuje systémové účinky Test je citlivý pouze na látky působící na hepatocyty. I když jsou jaterní pochody základem metabolismu organismů, nejsou tímto testem zaznamenány účinky jiných jedů (nervové jedy, immunosupresory, atd.) Nižší citlivost na kovy Kultivační médium RTH obsahuje relativně vysoké koncentrace solí 7-9 g/l za účelem udržení pro RTH příznivých osmotických podmínek Přítomnost solí může snižovat citlivost na kovy přítomné ve vzorcích. 12

13 Akvarijní ryby Podle normy (ISO : 1997) se používají následující akvarijní ryby: Danio pruhované, Brachydanio rerio, Živorodka duhová, Poecilia reticulata, Slunečnice, Lepomis macrochirus, Halančík japonský, Oryzias latipes, Pimephales promelas. 13

14 Poecilia reticulata říše Animalia živočichové kmen Chordata strunatci třída Actinopterygii paprskoploutví řád Cyprinodontiformes halančíkovci čeleď Poeciliidae - živorodkovití 14

15 Brachydanio rerio Danio pruhované (Zebřička pruhovaná) říše Animalia živočichové kmen Chordata strunatci třída Actinopterygii paprskoploutví řád Cypriniformes máloostní čeleď Cyprinidae - kaprovití 18h. 35h. 15

16 Akutní test toxicity na rybách EN ISO : 1997 Jakost vod- Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby. ČNI 1999 Praha, s.15. Test spočívá ve sledování chování a přežívání (většinou akvarijních) ryb v odstupňovaných koncentracích testované látky po dobu 96 hodin. Jako testovací organizmy se používají sladkovodní ryby, které lze snadno chovat v laboratorních podmínkách. 16

17 Podmínky testu toxicity na akvarijních rybách Stáří ryb 3-4 měsíce Sledovaná odezva je úhyn Opakování 2-3; Počet organizmů v jedné paralelce 10 Objem testované koncentrace: minimálně 1 gram ryb na 1 litr vody Teplota dle druhu ryb; většinou 23 C 1 C Osvětlení: světelný hodinový cyklus 16:8 (jako v chovu) Bez aerace a bez krmení (před pokusem se ryby 24 hodin nekrmí) Doba expozice 96 hodin; mortalita se odečítá ve 24 hodinových intervalech 17

18 OECD normy Kromě ISO metod existují i OECD normy Test No. 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 210: Fish, Early-Life Stage Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 18

19 Testy toxicity na perloočkách ČSN EN ISO 6341 Jakost vod. Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Zkouška akutní toxicity. ČNI Praha, 1997, s.16. Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Hrotnatky Daphnia magna, jakožto základní potrava ryb, jsou významnou složkou vodní biocenosy. 19

20 Testovací organismus Hrotnatky druhu Daphnia magna a Daphnia pulex Dále existuje dlouhodobější test na perloočce Ceriodaphnia dubia kmen členovci Arthropoda třída korýši Crustacea podtřída lupenonožci Phyllopoda řád perloočky Cladocera Velmi četný organismus sladkovodních ekosystémů: od drobných tůní po velká jezera a údolní nádrže či mírně tekoucí vody. Zooplanktonní organismus Nesmáčivý chitinový krunýř svléká jej při růstu 20

21 Princip akutního testu Jako sledovaná odezva organizmu je testu použita imobilizace. Test spočívá ve sledování imobilizace perlooček v odstupňovaných koncentracích toxické látky s expozicí 24 nebo 48 hodin. Zkouška je založena na určení koncentrace, která imobilizuje 50 % jedinců. Test se obvykle provádí za statických podmínek, lze jej však provádět i semistaticky či průtokově. Varianta testu: CCD kamerové snímání pohybu rychlejší a citlivější odezva 21

22 Imobilizace perlooček Je definována jako makroskopicky pozorovatelná neschopnost samostatného prostorového pohybu hrotnatek do 15 s po krouživém zamíchání lázně. Jako imobilizované organizmy hodnotíme např. i jedince, kteří pohybují tykadly 2. páru, ale výše uvedeného samostatného pohybu nejsou schopni. 22

23 Podmínky akutního testu toxicity hrotnatkách Stáří 24 hodin; velikost 0,4-1 mm Sledovaná odezva imobilizace Podmínky testu: Bez aerace a bez krmení Opakování 2-3; počet organizmů v jedné paralelce 10 Objem testované koncentrace je minimálně 5 ml na 1 perloočku Teplota 25 C Světelný hodinový cyklus 16:8 hodin jako v chovu Doba expozice 48 hodin (24 hod) 23

24 Vajíčka vs. efipium Snímek Adam Petrusek 24

25 Princip chronického testu Exponuje se vždy 1 hrotnatka v kádince zpravidla v 10 replikacích na koncentraci (objem vzorku v 1 kádince ml) Sleduje se počet snůšek a počet narozených jedinců v intervalu 21 dní Narození jedinci se vždy z testu odstraňují V 1-3 denních intervalech je nutné vyměňovat médium, pravidelný přísun potravy 25

26 Korýš Thamnocephalus platyurus TNV Test akutní toxicity na korýši Thamnocephalus platyurus Organizmus je dostupný ve stadiu trvalých vajíček, cyst. Líhnutí na světle. Expozice 24 hodin v destičkách 4 6 jamek po 1 ml Teplota testu 25 C Expozice v temnu Vývojová stádia: Nauplius, Instar II, III 26

27 Žábronožky Artemia salina říše Animalia živočichové kmen Arthropoda členovci třída Branchiopoda lupenonožci řád Anostraca žábronožky čeleď Artemiidae Organismus žijící v mineralizované vodě. Není však mořský. Akutní test toxicity může být prolongován přídavkem glukosy 27

28 Klidová stádia žábronožek Cysty jsou opouzdřená embrya, jež jsou v klidovém stavu. Cysty jsou velice odolné vydrží krátkodobě zamražení i teplotu varu vody Líhnutí: laboratorní mořská voda o salinitě 1,2-3,0% NaCl Mírný pohyb vody vzduchováním - tím se zajistí i adekvátní aerace. Je třeba nastavit proudění vzduchu tak, aby cysty vířily ve vodním sloupci a neležely na dně nebo na hladině. Líhnivost kvalitních cyst se obvykle blíží 100%. Optimální teplota pro líhnutí je C, kdy k vylíhnutí dochází přibližně do 18 hodin. Snížením teploty na 25 C nedochází ke změně v citlivosti nauplií, ale k prodloužení doby líhnutí; při této teplotě se líhnou za 24 hodin a to je pro provozní podmínky v laboratořích často příznivější. 28

29 Testy toxicity s vířníky Test slouží k testování toxicity kapalných vzorků jak pro sladkovodní tak pro mořské ekosystémy lze použít v testu jak sladkovodní tak mořský druh Vířníci jsou citlivé organismy na široké spektrum látek kovy, organické polutanty, pesticidy, endokrinní disruptory apod. 29

30 Akutní test toxicity na vířnících Zooplankton, obrněnky Vířníci mají významné místo v potravní pyramidě Velikost m Vzhledem k tomu, že na jeden organizmus stačí 300 l roztoku, jsou velmi úsporným organismem pro testy toxicity z hlediska prostoru i chemikálií. Je možné použití testovacích destiček 30

31 říše Animalia živočichové kmen Rotifera vířníci třída Monogononta točivky čeleď Brachionidae obrněnky Obrněnky Brachionus Tělo vířníků sestává pouze z několika set buněk. Ačkoli je to již poměrně složitý organismus, velikostí odpovídá protozoálním organismům (jednobuněčným). Brachionus calyciflorus Sladkovodní druh Brachionus plicatilis Test slouží k určení toxického vlivu látek na mořské organizmy a organizmy žijící ve vodách s vyšším obsahem rozpuštěných i nerozpuštěných látek 31

32 Schéma nepohlavního a pohlavního rozmnožování vířníků Brachionus plicatilis Vířníci se rozmnožují především parthenogeneticky z mateřského organismu se rodí dceřiné organismy stejné genetické výbavy (průměrně 6 za den). Samčí organismy se vyskytují jen u některých druhů a obvykle ani nemají ústní otvor ani zažívací trakt a hynou v řádu hodin eventuelně dnů. 32

33 Podmínky testu na vířnících Objem testované koncentrace 3 ml (destičky) Zdroj vajíček: vlastní chov nebo cysty Stáří organismů 24 hodin Opakování 3-6; 10 ks v jedné paralelce Bez aerace a bez krmení, stálé světlo, 25 C Doba expozice 24 hodin Sledovaná odezva: Imobilizace (živý vířník se vždy pohybuje) 33

34 Test inhibice příjmu potravy vířníků Princip: Za normálních podmínek vířníci přijímají potravu kontinuálně stálou rychlostí. Příjem potravy je ovlivněn přítomností toxických látek. Čím je vyšší toxický účinek, tím méně vířníci přijímají potravu. Pokles rychlosti příjmu potravy je úměrný toxickému účinku Tato metoda slouží jako rychlý screeningový test toxicity. 34

35 Postup testu 24 jamková destička umožňuje nasadit vedle kontroly 5 koncentrací ve 4 replikacích Do každé jamky se umístí 10 vířníků Expozice 45 min Následuje přídavek 5 µm červeně obarvených částic (tzv. red microspheres) nebo suspenze karmínové barvy ve vodě Aktivní vířníci přijímají suspendované obarvené částice jako potravu Po 15 minutách se vyhodnotí kolik vířníků přijalo obarvenou potravu v jejich střevech je patrná jasná červeň 35

36 Identifikace zabarvení Červeně zabarvený zažívací trakt vířníků je dobře patrný v mikroskopu již při 25 násobném zvětšení Vířníci se zabarvenými střevy jsou hodnoceni jako nezasažení toxickými účinky A) vířník s červenými střevy; B) bez zabarvení 36

37 Test toxicity na nezmaru Účelem testu je určení nejvyšší koncentrace látek nebo odpadní vody, která nepůsobí toxicky během 7 denní expozice na nezmary Hydra Nezmar je citlivým organismem na expozici zejména kovy jak v čisté podobě, tak ve směsích v odpadních vodách. Nezmar vykazuje nízkou citlivost na organické látky. 37

38 Testovací organismus Nezmaři Hydrae (Cnidaria:Hydrozoa) jsou všudypřítomné mnohobuněčné organismy sladkovodních ekosystémů. Jedná se o mikro-bezobratlé organismy široké přibližně 2-3 mm a dlouhé cca 5-20 mm. Mají jednoduchou tělesnou stavbu: dvě tkáňové vrstvy ektoderm a endoderm s bezbuněčnou výplní mezi (mesoglea) Tudíž v podstatě všechny buňky nezmarů jsou v přímém kontaktu se všemi toxikanty ve vodním prostředí Rozmnožování nezmarů Nepohlavně: Při příznivých podmínkách pučí dceřiní jedinci na mateřském organismu Pohlavně: při nepříznivých podmínkách jako jsou výkyvy teploty v přírodě často předznamenávající vysychání či zmrznutí 38

39 Testovací organismus říše Animalia živočichové kmen Cnidaria žahavci třída Hydrozoa polypovci řád Hydroida nezmaři čeleď Hydridae - nezmarovití Pro testování toxicity se používají dva druhy nezmarů: Nezmar zelený (H. viridissima) se stálými řasovými symbionty Nezmar obecný (H. vulgaris) bez symbiontů Oba druhy jsou velmi citlivé na kovy a obývají rozdílné přírodní habity Zelený nezmar čisté stojaté vody Růžový nezmar zakalené tekoucí vody Oba druhy se v laboratorních podmínkách dobře chovají množí se pučením 39

40 Chov nezmarů Nezmaři se chovají v 1 litrových skleněných dobře provzdušňovaných lahvích Pohyb vody provzdušňováním zajišťuje přichycení nezmarů na stěny nádob, což usnadňuje výměnu kultivačního roztoku. Nezmaři se krmí dvakrát týdně suspenzí čerstvě vylíhnutých žábronožek Artemia salina Týden před nasazením do testu se krmí jednou denně s cílem co nejvíce stimulovat pučení. 40

41 Princip testu Pučící nezmaři se umístí do testované koncentrační řady v 90 mm Petriho miskách Do každé Petriho misky se umístí 5 pučících nezmarů Expozice probíhá při teplotě 25 C a fotoperiodě 12:12 Krmí se denně přebytkem (0,5 ml) suspenzí žábronožek Po 30 min krmení se vymění roztok v Petriho miskách odpovídající koncentrací toxikantu Test se ukončuje po 7 dnech Pozorují se změny v počtu celých nezmarů (jeden nezmar odpovídá jednomu organismu včetně všech na něm pučících dceřiných organismů). 41

42 Konzumenti sedimentů Testování toxicity sedimentů 42

43 Vlastnosti sedimentů Sedimenty představují významný zdroj znečištění pro aquatické organismy. Lipofilní látky a některé kovy jsou v sedimentech zadržovány a mají dlouhý poločas uvolnění či rozkladu Určování toxicity látek obsažených v sedimentech je náročné, neboť není zřejmé, jaké množství v sedimentech obsažených polutantů je v kontaktu s organismy jak jsou biodostupné. Pevně vázané látky vyskytující se v nízkých koncentracích (i vysoce toxické) nemusí být organismem vstřebány jak při pohybu organismu sedimentem, tak při průchodu sedimentu zažívacím traktem organismu či přes dýchací orgány. Vývoj nových a optimalizace stávajících testů toxicity sedimentů je aktuálním tématem. 43

44 Vzorkování sedimentů Podstatně komplikovanější úkol ve srovnání s vodním prostředím. Vzorky sedimentů se odebírají z hloubky 2-5 cm pod rozhraním voda-sediment. Po homogenizaci následuje sítování přes síto o porozitě 0,5 mm (odstranění velkých částic a organismů). Umístění podílů sedimentu do 1 l lahvích s vodou (sladkovodní či mořskou) hladina vody je 2 cm nad povrchem sedimentu V případě potřeby lze sediment ředit podíly nekontaminovaného sedimentu s cílem získat koncentrační řadu. Kontroly se provádějí v čistém sedimentu (problémy se standardním sedimentem ) Při testování látek či jiných vzorků lze čistý sediment uměle kontaminovat známou koncentrací testované látky. 44

45 Test toxicity sedimentů na různonožci Amphipod Hyalella azteca Různonožci - Amphipoda Jeden z nejcitlivějších organismů sedimentů Chronický test toxicity 4 týdny s mladými organismy na počátku Vysoký poměr voda / sediment Během testu několikrát výměna vodní fáze Test bioakumulace 1 týden s dospělými organismy 45

46 Testovací organismus říše Animalia živočichové kmen Arthropoda členovci třída Malacostraca rakovci řád Amphipoda různonožci čeleď Hyalellidae Hyalella azteca velmi rozšířený organismus od severní po jižní Ameriku. Je všežravý, živí se detritem a není kanibalistický. Žije zahrabán ve svrchní oxické zóně sedimentů Po většinu času je skryt v sedimentu, opouští jej pouze v případě nedostatku potravy. Stálý kontakt se sedimentem činí tento organismus vhodným pro testování toxicity. Na rozdíl od ostatních bentických organismů může být chován i bez sedimentu náhrada vhodným pevným substrátem. 46

47 Taxonomické nejasnosti Hyalella azteca je ve skutečnosti skupina několika velmi blízkých druhů je nutná bližší taxonomická revize Tato skutečnost je příčinou publikovaných rozdílných citlivostí na stejné látky zjištěných v různých laboratořích (s různými druhy). Druhová rozdílnost je pravděpodobnou příčinou rozdílů v chování i citlivosti. 47

48 Význam testu Hyalella je velmi citlivý organismus. Ačkoli je to sladkovodní druh, byl úspěšně použit i pro testování vod s mineralizací až do 15 g/l. Existuje již několik standardizovaných metod pro rutinní testování toxicity sedimentů. Ačkoli se jedná o původně americký druh, používá se často i v evropských a asijských laboratořích a výzkumných projektech. Snadno se v laboratoři chová při laboratorní teplotě i mimo specializované kultivátory. 48

49 Popis testu Test se provádí v Imhoffových kuželích se zavedenou aerací doprostřed vodního sloupce. V úzkém hrdle je zátka (čtyřčetná), na které je umístěno 15 ml sedimentu o hloubce 2,3 cm a s průměrem 3,1 cm na povrchu. Sediment je přelit 1 l vody. Množství sedimentu v kuželu umožňuje umístění až 15 kusů Organismy lze exponovat pouze ve vodním sloupci v malých klíckách umístěných v kuželu. To umožňuje rozlišení toxicity/bioakumulace pouze z vodního prostředí od sedimentů. 49

50 Podmínky testu Teplota C Fotoperioda 16:8 Potrava: Tetra-Min Expozice: 4 týdny (1 týden bioakumulace) Ukončení testu Opatrná dekantace vodního sloupce Přenesení sedimentu na jemné síto vylití z kužele za pomoci jemného proudu vody Přenesení organismů do skleněné misky, kde jsou spočítány a zváženy Kultivace bývá realizována v min. 2 l skleněných nebo polypropylénových nádobách 50

51 Test toxicity sedimentů na larvách pakomára Test slouží ke zjištění toxických účinků sedimentů či látek a vzorků uměle do sedimentů přidaných na růst a přežívání larev pakomára Chironomus riparius. Z pohledu bentických organismů je test poměrně krátký (7 dní), pokrývá ovšem významný úsek životního cyklu pakomára. Test je dobře zdokumentovaný a dostatečně citlivý. Laboratorně dobře proveditelný. 51

52 Testovacím organismem je larva nebodavého pakomára. Testovací organismus Pakomár Chironomus riparius je velmi rozšířený na severní polokouli. Má významné místo v aquatických ekosystémech jakožto potrava pro ryby a ptáky. Chironomidae patří mezi nejčetnější bentické organismy téměř všech sladkovodních ekosystémů. 52

53 Test Podmínky testu a kultivace Objem testovacích nádob 0,5 až 1 l Počet organismů: 50 až 70 v jedné testované koncentraci Fotoperioda 16:8 h Teplota 21 ± 1 C Chov se realizuje v cca 20 l akváriích s uzavíratelným prostorem pro pohyb dospělých jedinců umožňující jejich rozmnožování. Potrava TetraMin 53

54 Průběh testu Do kádinek (cca 0,5 1 l) s povrchem dna cca 14 cm 2 se umístí testovaný sediment ve vrstvě 1,5-3 cm. Sediment se přelije 4 násobným množstvím vody 2 dny staré larvy se po 10 kusech umístí do každé kádinky Potrava: během testu se larvy krmí TetraMinem Expozice 7 dní Sledovaná odezva: počet živých larev, jejich délka Pro určení délky larev jsou larvy zahubeny roztokem formaldehydu (20%), odstraněny ze sedimentu a s použitím binokulárního mikroskopu se stanovuje jejich délka. 54

55 Standardizace testů na pakomárech Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 219: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 55

56 Nítěnka Tubifex tubifex Nítěnka Organismus žijící i v relativně kontaminovaných sedimentech Používá se pro testy fototoxických látek Špatně se laboratorně chová zdroj z přírodních lokalit (nestejné podmínky; možná přírodní kontaminace) 56

57 Půdní konzumenti Testování toxicity půd a pevných vzorků 57

58 Funkce půdy Půda má široký rozsah funkcí - je multifunkční. Z hlediska člověka byla dlouhodobě uvažována pouze její produkční funkce v zemědělství a lesnictví, nebo jako zdroj stavebních materiálů či plocha k zástavbě či jinému užití. V ekosystému je však půda filtračním, akumulačním a transportním prostředím pro vodu a roztoky, je pufračním, stabilizačním, transformačním a asanačním médiem. Je prostředím pro výměnu energie mezi atmosférou, hydrosférou a geosférou. Problémy vznikají, jestliže nějaký způsob antropického užití nebo nějaké přírodní vlivy naruší nebo zničí některou nebo více funkcí půdy. Ochrana půdy tudíž zahrnuje ochranu heterogenního systému s dynamickou povahou. 58

59 Vlastnosti půdních ekosystémů Půda je nezbytnou podmínkou rovnováhy různých ekosystémů živá půda je podmínkou života Úbytek kvalitní živé půdy ovlivňuje přírodu i člověka (nedostatek pitné vody, potravin atd.) Půda je komplexní médium obsahující neživé i živé složky - je živá hydrofóbní i hydrofilní látky ve vodě rozpustné i nerozpustné Půda je heterogenní na různých škálách Je to trojfázový systém: pevná, kapalná a plynná složka Souhrnně velmi komplikované médium pro testování 59

60 Nepříznivé účinky toxických látek na půdní ekosystémy 1. Ovlivnění půdních funkcí zejména schopnosti působit jako substrát pro rostliny a živočichy živící se půdou a přebývající v ní. 2. Snížení rostlinné produkce a transport jedů do rostlin (potravní řetězec) 3. Ovlivnění kvality prostředí jak pro půdní organismy, pro organismy žijící na povrchu půdy, tak i pro organismy žijící v listí (padance) Úhyn organismú narušuje rovnováhu ekosystému. 4. Akumulace toxických látek do v půdě žijících organismů a dále do potravního řetězce. 60

61 Standardní (artificiální) půda Pro testování je třeba zajistit přísun standardní půdy Obvykle se laboratorně připravuje z 10 % (hm) rašelina vysušená na vzduchu, jemně rozemletá, bez viditelných rostlinných zbytků 20 % (hm) kaolínový jíl na vzduchu vysušený, obsahující aspoň 30 % kaolínu 70 % (hm) průmyslový křemenný písek na vzduchu vysušený, převážně jemný s více než 50 % částic velikosti 0,05 0,2 mm Mezilaboratorní testy ukazují na určité odchylky ve vlastnostech 61

62 Stárnutí půdy V reálných podmínkách živé půdy dochází k přirozeným pochodům ovlivňujícím toxicitu a biodostupnost látek. Biodostupnost organických látek s časem klesá. Příčiny: sorpce: toxických látek na částice půdy Zachycení toxikantů v mikropórech půdy S časem obvykle toxicita látek klesá (po možném počátečním nárůstu toxicity způsobeném vznikem ve vodě lépe rozpustných metabolitů). Látky obvykle vykazují vyšší toxicitu v artificiální půdě než jejich stejná množství v reálných podmínkách in situ. Stárnutí půdy (snižování toxicity kontaminantů) je posilováno opakovaným vysycháním a vlhčením půdních vzorků Vhodné je při umělé kontaminaci artificiální půdy toxikantem podrobit připravenou půdu procesu stárnutí to ovšem v praktických podmínkách obvykle trvá příliš dlouho. 62

63 Biodostupnost v půdě Biodostupnost organických a anorganických látek v půdě je rozdílná. Kovy vykazují při stárnutí půdy zvýšenou i sníženou biodostupnost v závislosti na vlastnostech původně deponované látky. Organické látky téměř výhradně se stárnutím půdy snižují svoji biodostupnost a to jednak sorpcí na organickou složku půdy a v důsledku mikrobiální degradace. 63

64 Nematoda - hlístice Hlístice Nematoda jsou organismy žijící v půdní vodě jedná se vlastně o aquatické organismy Používají se 2 druhy: Háďátko Panagrellus redivivus Hlístice Caenorhabditis elegans Mají krátký životní cyklus výhodné pro testování Problematická je extrapolace na reálné prostředí test se provádí v roztoku nebo na agaru Metody jsou dosti vzdálené reálným podmínkám Používají se kultury organismů laboratorně chovaných po mnoho let Oba organismy se obtížně identifikují v reálných podmínkách in situ. 64

65 Nematoda testovací organismy Malé organismy mající po celý život pouze několik set somatických buněk říše Animalia živočichové kmen Nematoda hlístice třída Secernentea řád Rhabditida háďata Háďátko Panagrellus redivivus čeleď Panagrolaimidae 530 somatických buněk Hlístice Caenorhabditis elegans čeleď Rhabditidae 959 somatických buněk 65

66 Test toxicity s háďátkem Panagrellus redivivus Akutní test: 24 hodin Chronický a genotoxický test 96 hodin Přechod na dospělce je charakterizován vysokou genovou aktivitou citlivé na genotoxické a mutagenní látky Chovné podmínky Test nádoba se směsí mouky a vody Potrava kvasnice před testováním se chovají na Petriho miskách odkud se vyberou gravidní samičky (jsou větší mechanicky nebo filtrací na 12 µm filtru) Během 12 hodin dojde k produkci juvenilů selekce opět filtrací 2,5 ml nádobky; 10 jedinců Určení počtu organismů na konci testu (v kontrole min 10% reprodukce) 66

67 Test toxicity na hlísticích Caenorhabditis elegans Půdní test je variantou původní ho aquatického uspořádání ASTM: E2172 E Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with with the Nematode Caenorhabditis elegans. Do testu 3-4 dni staří jedinci Část původní kultury se ošetří roztokem chlornanu a NaOH vajíčka přežijí, dospělci nikoliv po vylíhnutí jsou všichni jedinci stejně staří Do malých nádobek (Petriho misky, destičky) se připraví koncentrační řada půdního vzorku 10 hlístic do jamky Expozice 24 hodin ve tmě (event. déle pak je nutné přidávat potravu E.coli) Na konci testu extrakce a centrifugace hlístice na hladině Přenesení jedinců pod lupu a určení počtu živých a mrtvých (mechanickým podrážděním) Výpočet LC50 67

68 Testy na žížalách Typický zástupce půdní fauny vyskytuje se téměř ve všech půdách Významný půdotvorný činitel podílí se na tvorbě půdy, dekompozičních procesech, zajišťuje úrodnost půdy Expozice potravou i dermálním kontaktem Klíčové místo v přenosu polutantů potravním řetězcem Tendence k bioakumulaci testy bioakumulace Snadná identifikace v reálných vzorcích (díky velikosti) Zavedené v mnoha laboratořích relativně nenáročný chov 68

69 Testovací organismus říše Animalia - živočichové / kmen Annelida - kroužkovci / třída Oligochaeta - máloštětinatci / řád Opisthopora - žížaly / čeleď Lumbricidae žížalovití Žížala hnojní Eisenia fetida Má poměrně rychlý vývoj dobře se chová pro testy V přírodě méně běžný druh žije v hnoji či vysoce humózní půdě, ne v půdě (nejedná se o čistě půdní organismus) Ekologicky méně relevantní organismus Žížala obecná Lumbricus terrestris Ekologicky relevantní pro většinu půd Množí se poměrně pomalu a vyžaduje velké objemy půd Nevhodné pro rutinní monitoring 69

70 Standardizace ISO :1993 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substráte ISO :1998 Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -Part 2: Determination of effects on reproduction Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/eisenia andrei) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 70

71 Chov a varianty testu Žížaly E.f. jsou chovány v bednách s hnojem náročné na prostor, ale jinak docela dobře schůdné Ostatní druhy žížal jsou náročnější na prostor i na podmínky chovu Varianty testu: Akutní s filtračním papírem: žížala je exponována na nasyceném filtračním papíře Akutní test v půdním vzorku Reprodukční: sleduje se porodnost žížal v půdním vzorku 71

72 Akutní test na filtračním papíře Testuje se výluh, eventuelně připravený s pomocí rozpouštědla Ve zkumavce nebo na Petriho misce vždy filtrační papír nasycený vzorkem (udává se v mg/cm 2 ) a 1 žížala hodin expozice Expozice pouze pokožkou pouze ve vodě rozpustné látky Odezva organizmu reakce na podráždění předního konce těla Velmi umělý test téměř nemožná extrapolace výsledků na reálné podmínky 72

73 Akutní test v artificiální půdě Kontaktní test s pevným vzorkem Artificiální zemina + voda (35% hmotnosti) Do nádob se zeminou se umístí 10 dospělých jedinců 4 replikace 14 denní expozice Kontinuální osvětlení žížaly pak nevylézají na povrch Expozice jak pokožkou tak potravou Na konci testu se vyhodnotí počet živých jedinců a jejich hmotnost Vypočte se LC50 Ve většině studiích je v akutních testech L.terrestris citlivější než E.fetida 73

74 Reprodukční test Chronický test sledující vliv látek na rozmnožování žížal Nádoba cca 1 l s povrchem 200 cm 2 ; dávkuje se cca g, což odpovídá vrstvě zhruba 5-6 cm, 1 organismus v nádobě Expozice 4 týdenní 20 C Potrava: 5 g sušeného hnoje týdně Na konci testu se vyhodnocuje počet kokonů A následně počet nerozených jedinců z kokonů V kontrole musí být reproduce min. 30 juvenilů na 1 dospělce Test je citlivější, ekologicky relevantní Náročný na práci i na prostor a množství vzorku V chronických testech se ukazuje obvykle citlivější E.fetida. Juvenilní žížala rodící se z kokonu o průměru 2 mm. 74

75 Testy na roupicích Roupice jsou významnou skupinou půdních bezobratlých organismů, patří do podtřídy máloštětinatců (stejně jako žížaly). Zastupují velké procento půdní mikrofauny významná úloha při rozkladu organického materiálu a tvorbě půdy. Enchytraeus crypticus a Enchytraeus albidus Na rozdíl od žížaly hnojní E.fetida jsou roupice půdním organismem ekologicky relevantní test Toxické látky přijímají dermálně a potravou. Jsou díky své velikosti méně náročné na prostor jak v kultivaci tak v testu Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals ISO 16387:2004 Soil duality Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) Determination of effects on reproduction and survival 75

76 Testovací organismus Obývají nejsvrchnější vrstvy půdy a tím jsou vystaveny působení toxických látek mezi prvními živočichy. Roupice jsou převážně světle zbarvené, bělavé, s délkou těla mm a průměrem 0,1 1 mm. Významnou částí těla je opasek, který kryje segmenty obsahující vývody samčích a samičích pohlavních žláz. Je to oboupohlavní živočich (hermafrodit). Kokon může obsahovat jedno nebo více (až 15) vajíček, z oplodněného vajíčka se vyvine jedinec délky 1 mm, který prorazí kokon. Inkubační doba činí dní. Podmínky: 5 25 C; ph 4,5 7,5. Roupice se mohou dožít maximálně 1 roku života. Zatímco žížaly žijí hlavně v neutrálních či zásaditých půdách, roupice upřednostňují půdy kyselé. 76

77 říše Animalia živočichové kmen Annelida kroužkovci třída Oligochaeta máloštětinatci řád Tubificida čeleď Enchytraeidae - roupicovití Roupice 77

78 Přehled testu Jedná se o reprodukční test chronický. Pro test se používají dospělí jedinci (s vajíčky) s podobnou velikostí asi 10 mm. Do skleněných testovacích nádob o objemu 0,2 0,25 litrů se vloží 20 g suché půdy. Před přidáním organismů je nutné přidat deionizovanou nebo destilovanou vodu, aby bylo dosaženo vlhkosti %. Přidává se potrava pro roupice, což jsou sterilizované ovesné vločky v množství 50 mg. Do každé testovací nádoby se vloží 10 roupic. Celková doba expozice je 6 týdnů. 78

79 Zjišťování počtu roupic Sledovaná odezva počet narozených juvenilů Po ukončení testu usmrcení ethanolem. Zalití nádoby vodou a obarvení bengálskou červení. Počítání červených roupic na Petriho misce. 79

80

81 Test s chvostoskoky Chvostoskok Folsomia candida malý bezkřídlý členovec Mnoho druhů chvostoskoků - v půdách jsou velmi četní Patří mezi nejcitlivější organismy Dobře se chovají v laboratoři Test je ekologicky relevantní Rychlý životní cyklus snadná a rychlá reprodukce Dobře standardizovaný test ISO : 1999 Soil quality Inhibition of reproduction of Collombola (Folsomia candida) by soil pollutants 81

82 Testovací organismus Jejich tělo je členěno na hlavu, tříčlánkovou hruď, která nese tři páry končetin a zadeček tvořený šesti články. Vyskytují se téměř ve všech typech půd na povrchu, v hlubších vrstvách, ale i na vegetaci. Živí se řasami, baktériemi, prvoky, detritem všežravci Je slepý, nepigmentovaný a má dobře vyvinutou furku (skákací ústrojí). Velikost až 2 mm. říše Animalia živočichové kmen Arthropoda členovci třída Entognatha skrytočelistní řád Collembola chvostoskoci čeleď Isotomidae - poskokovití Folsomia candida se vyskytuje v půdách s dostatečným množstvím organické hmoty. Parthenogenese. Folsomia fimetaria pohlavní rozmnožování 82

83 83

84 Průběh testu Testuje se koncentrační řada půdy/pevného vzorku a kontrola o objemu 30 g. Upravuje se WHC na hodnotu % deionizovanou vodou. Potrava - cca 2 mg suchých granulovaných kvasnic. Do každé nádoby se vloží 10 jedinců ve věku dnů. Testovací nádoby jsou přikryty krytem, provzdušnění se zajišťuje krátkým otevřením nádoby 2x týdně. Podmínky testu: 20 ± 2 C, osvětlení pod zářivkou lx, cyklus 12:12 nebo 16:8 (den:noc), ph 6,0 ± 0,5. Počet replikací: 3-5 Potrava: po 2 týdnech; cca 2 mg suchých granulovaných kvasnic Chvostoskoci jsou v podmínkách testu inkubováni po dobu nutnou k nakladení vajíček a následnému vylíhnutí juvenilů. Stanovovaným parametrem je mortalita dospělých jedinců a reprodukce počet juvenilů. Validita testu: mortalita dospělých v kontrole <20%; reprodukce minimálně 100 juvenilů 84

85 Odezva testu Pro snadné počítání dospělých jedinců a juvenilů se obsah testovací nádoby převede do větší nádoby a zalije se vodou. Vzniklou suspenzí jemně mícháme, abychom dostali chvostoskoky na povrch vodní hladiny a vodu obarvíme inkoustem. Poté spočítáme (obvykle po vyfotografování) Dospělce mortalita Juvenily reprodukce 85

86 Testy toxicity na měkkýších Měkkýši jsou významným indikátorem bioakumulace do svého těla zakoncenrovávají značná množství toxických látek Test na měkkýších další významná skupina organismů V ekotoxikologii se zatím uplatňují především stopkoocí plicnatí plži hlemýždi Hlemýždi se dostávají do kontaktu s jedy: Dotekem půda, výluhy, opadanka Potravou (půda, rostliny) Dýcháním Jsou citliví na kontaminaci Dobře se chovají v laboratorních podmínkách 86

87 Test toxicity na hlemýždi kropenatém Test se aplikuje pro: odpady a vodné výluhy z odpadů Půdy Odpady čisté látky (chemikálie), které se mohou přidávat do půd. Určují se účinky na přežití a růst juvenilů hlemýžďů po čtyř týdenní expozici v substrátu obsahujícím testované látky. Půdy se pro testovaní upravují sítováním na velikost max 4 mm. ISO 15952:2006 Soil quality Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) Determination of the effects on growth by siol contamination. Francouzská norma: AFNOR NF X

88 Testovací organismus Hlemýžď kropenatý (jihoevropský) Helix aspersa říše Animalia živočichové kmen Mollusca měkkýši třída Gastropoda plži řád Pulmonata plicnatí čeleď Helicidae hlemýžďovití Obývá lesy a pole, vyskytuje se v parcích, zahradách a vinicích. Velkou část života tráví v zemi kladení a líhnutí vajíček, ale i během ostatních fází života je v úzkém kontaktu s půdou Ulita žluto-hnědě kropenatá s 5ti tmavými, místy přerušovanými pásky. Má 4,5 5 rychle rostoucích závitů. Ústí je oválné. Obústí je ztlustlé se zřetelným bílým pyskem. 88

89 Postup testu Celková doba expozice je 4 týdny. Test probíhá v koncentrační řadě vzorku a v půdě kontrolní 150 g suché půdy ve skleněných nádobách Úprava vlhkosti na WHC % deionizovanou vodou Stáří organismů je 3 5 týdnů, 5 ks na koncentraci Krmivo na bázi mouky (spec. potrava Helixal) Varianta testu s kontaminovanou potravou. Testovací nádoby jsou přikryty krytem s otvory, které umožňují výměnu plynů mezi substrátem a atmosférou Optimální podmínky pro test jsou 20 ± 2 C, osvětlení zářivkou, fotoperioda18:6 (den:noc) a ph 6,0 ± 0,5. Doporučená replikace: 3 Odezva testu: inhibice růstu; mortalita Validace testu: mortalita v kontrole 10% a čtyřnásobný přírůstek hmotnosti. 89

90 Test na zlatohlávku tmavém Princip: stanovení akutní toxicity testované látky na larvy hmyzu. Ekologicky relevantní test - vajíčka i larva žijí v půdě Podílí se na tvorbě půdní struktury a provzdušňování Pro testování kontaminovaných půd, pevných vzorků, odpadů apod. ISO 20963:2005 Soil quality Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) Determination of acute toxicity 90

91 Zlatohlávek tmavý Zlatohlávek tmavý Oxythyrea funesta Je to leskle černý brouk s drobnými bílými skvrnami na štítu a na krovkách, tělo je bíle ochlupené. říše Animalia - živočichové kmen Arthropoda členovci třída Insecta hmyz řád Coleoptera brouci čeleď Cetoniidae (Scarabidae) - zlatohlávkovití Je veliký 8 14 mm. Larvy se vyvíjí v zemi, kde požírají kořínky rostlin. Hojně se vyskytuje na loukách a okrajích lesů, v období května až července. 91

92 Postup testu Celková doba expozice je 10 dní. Test probíhá v koncentrační řadě vzorku a v půdě kontrolní Do skleněných testovacích nádob se vloží 300 g suchého vzorku. 3 opakování. Úprava WHC na 50% deionizovanou vodou. Testovací organismus: třetí růstový stupeň stadia larvy. Stáří je zhruba 15 dní hmotnosti mg. Dávkuje se 10 larev. Krmivo: přidává suchý, jemně mletý kravský hnůj. Podmínky testu: 26 ± 1 C, bez osvětlení a ph 6,0 ± 0,5. Odezva testu: mortalita Validace: mortalita v kontrole <10%; nárůst biomasy v kontrole >80% 92

93 Další metody testování ekotoxicity Metody pro testování chemických individuí i chemických přípravků Např. pesticidy a obecně biocidní látky a přípravky Tyto skupiny látek se testují i dříve popsanými metodami zde pro úplnost vyjmenujeme i další testy používané v ekotoxikologii. 93

94 Testy toxicity s hmyzem Testy toxicity látek na hmyz slouží především k testování insekticidů, a to jak s ohledem na jejich toxické účinky na nežádoucí hmyz, tak na nežádoucí toxické účinky zástupce hmyzu, jež hodláme chránit (motýli, dvoukřídlí, brouci apod.). Tyto testy se často používají při schvalování nových pesticidů pro používání v přírodě. Testy obvykle slouží k určování letálních odezev a také k testování resistence k jedům. Podobné testy se provádějí s hospodářským hmyzem (včely, predátoři nežádoucího hmyzu apod.). 94

95 Testy na hmyzu Testování se obvykle provádí aplikací roztoku testované látky mikrostříkačkou - přímo na vnější krunýř organismu. Látka bývá rozpuštěna ve zvoleném organickém rozpouštědle (např. aceton). V tomto případě se dávka vztahuje na organismus a určuje se topická (místní) LD. Slouží k testování citlivosti organismů Expozice je ovšem nerealistická. Hmyz je obvykle v polních podmínkách exponován sprejem, granulemi nebo prachovými částicemi. V realističtějších testech se tudíž používají expozice skrze kontaminovanou potravu nebo kontaminovaný prach umístěný do pokusných nádob. 95

96 Test toxicity na včelách Standardní metoda určení toxicity pesticidů a chemických látek Test No. 213: Honeybees, Acute Oral Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Test No. 214: Honeybees, Acute Contact Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals V ČR provádí Výzkumný ústav včelařský: 96

97 Včela medonosná- Apis mellifica říše Animalia živočichové kmen Arthropoda členovci třída Insecta hmyz řád Hymenoptera blanokřídlí čeleď Apidae včelovití Testovací organismus 97

98 Oddělení dělnic od roje Postup testu toxicity na včelách Anaestezie pomocí CO 2 Umístění dělnic do válců uzavřených drátěným sítem V každém válci je v krmítku roztok cukru s definovanou koncentrací testované látky. Do válce se umísťuje 10 dělnic. 3 replikace. Konstantní teplota: 25 C Expozice: počet uhynulých dělnic se odečítá po 1, 2, 4, 24, a 48 hodinách. Některé látky se dávkují přímo na hruď (thorax) včel. 98

99 In situ test toxicity na včelách Metoda výrazně náročnější na prostor Včelí roj se umístí do uzavíratelného tunelu z PE nebo ze síťoviny s přehledným dnem pod rojem Pole, kam létají včely sbírat pyl, se nasprejuje testovanou látkou. Včely se vrací do roje ale během noci umírají. Mrtvé včely jsou dělnicemi odstraňovány z roje a na desce pod rojem je určován jejich počet. 99

100 Testy toxicity s obojživelníky Obojživelníci velmi citlivé organismy na znečištění prostředí Negativní dopady farmak (antikoncepce, antibiotika) Obojživelníci mají řadu unikátních biologických i ekologických charakteristik s významem pro (eko)toxikologické procesy: Jsou významnou součástí ekosystémů a reprezentují většinou konzumenty druhého řádu (většina druhů je insektivorních). Většina zástupců prodělává unikátní proces metamorfózy, kdy ve vodním prostředí žijící vajíčka a časná vývojová stadia (embrya a larvy) jsou přeměněna v převážně terestricky žijící dospělce. Tato životní strategie reprezentuje řadu rozličných expozičních cest a míst pro působení polutantů (vodní prostředí vs. terestrické prostředí). Značné riziko zvýšeného příjmu toxikantů u dospělců představuje velký význam povrchu kůže obojživelníků pro výměnu vody a plynů. 100

101 Testy na obojživelnících Testy s obojživelníky se provádějí většinou v embryonálním stádiu organismů Rutinní test FETAX teratogenita a toxicita na drápatce Xenopus laevis Publikovány testy na skokanech Rana sp. a ropuchách Bufo sp. 101

102 Testování látek v ptačí potravě Testy toxicity na ptácích Pesticidy, přípravky na ošetřování zrní apod. (jed na hraboše polní je testován v neškodnosti pro bažanta obecného Testy na křepelkách následují veterinární vyšetření Křepelka virginská Colinus virginianus Křepelka japonská Coturnis japonica Testy na bažantech Bažant obecný Phasianus colchicus 102

103 Význam testů na ptácích V současné době vzrůstá potřeba hodnotit účinnost pesticidů nejen z hlediska výsledného efektu, tzn. pozitivní inhibice cílového organismu, ale také z hlediska možného ohrožení necílových organismů. Vzhledem k použití pesticidů patří ptáci do skupiny necílových organismů. Údaje o toxicitě látek pro ptáky jsou nenahraditelné a nemohou být zastoupeny testy na laboratorních hlodavcích, poněvadž některé látky jsou více toxické pro ptáky než pro savce a naopak. Riziko pro ptáky představují zejména rodenticidní přípravky, které jsou vyráběny ve formě granulované nástrahy. Přestože výrobci těchto přípravků deklarují relativní bezpečnost pro necílové organismy, mohou tyto např. svým zbarvením představovat pro některé ptačí druhy atraktivní potravní nabídku a tím ohrožovat jejich populace. 103

104 Akutní perorální test toxicity u ptáků (OECD 205) Test No. 205: Avian Dietary Toxicity Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. 10 ptáků v 1 kleci; fotoperioda hodin světla Ptáci jsou krmeni potravou obsahující testovanou látku v různých koncentracích po dobu 5 dnů. Další 3 dny jsou krmeni základní krmnou směsí bez testované látky. V průběhu testu se kontroluje stav a chování ptáků a odstraňují se uhynulí jedinci. V časovém úseku 24, 48, 72, 96 a 120 hodin 104

105 Test reprodukční toxicity na ptácích (OECD 206) Test No. 206: Avian Reproduction Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Stanovení reprodukční toxicity látky podávané rodičovským jedincům. Testy reprodukční toxicity zahrnují účinky látek na reprodukci, fertilitu a teratogenitu. Ptáci jsou chováni v klecích v párech nebo ve skupinách o jednom samci a dvou samicích. Ptáci jsou krmeni potravou obsahující testovanou látku v různých koncentracích po dobu minimálně 20 týdnů. Prodloužením fotoperiody je navozena snáška vajec. Vejce se sbírají 10 týdnů, jsou uměle inkubována a líhnutá kuřata jsou chována po dobu 14 dní. Sledované odezvy: mortalita dospělců, produkce vajec, výskyt křapek, tloušťka skořápky, životnost, líhnivost a účinky na kuřata. 105

106 Testy toxicity se savci Testy pesticidních látek a přípravků Testy ošetřování zemědělských surovin Myš, potkan, křeček, morče V rutinních ekotoxikologických pracích se nevyužívají pouze pro speciální studie (např. bioakumulace kovů v srsti) Složí spíše pro účely humánní toxikologie Specifické testy účinku: Embryotoxicity, teratogenita, imunotoxicita, kožní iritance Dlouhodobé testy Akutní expozice hodin Chronická expozice dní 106

107 Mezidruhové rozdíly v citlivosti Mezidruhové rozdíly v citlivosti nejsou předpověditelné Nutný je experiment Validace laboratorních testů na podmínky ve volné přírodě obvykle chybí platí pro většinu testů. Neznáme účinky látek na společenstva Posun kupředu může přinést simultánní testování více organismů současně za stejných podmínek Poskytuje odhady dopadů jedů na společenstva 107