Biofyzikální chemie membrány a děje na membránách. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Transkript

1 Biofyzikální chemie membrány a děje na membránách Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

2 Amfifilní molekula ve vodě D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

3 Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005 Kritická micelární koncentrace povrchové napětí CMC/KMK (kritická micelární koncentrace) koncentrace

4 Povrchové napětí povrchové napětí síla, která působí ve směru tečny k povrchu na úsečku jednotkové délky, tedy mezifázové napětí v systémech kapalina/plyn N/m (mn/m) mezifázové napětí tečná síla, působící ve směru fázového rozhraní na úsečku jednotkové délky

5 liposom micela Kritická micelární koncentrace koncentrace monomeru/micely CMC/KMK (kritická micelární koncentrace) celková koncentrace

6 Tenzid/detergent detergent x tenzid x látka snižující povrchové napětí tenzid organická látka, která je schopna se hromadit již při nízké koncentraci na fázovém rozhraní a tím snižovat mezifázovou energii soustavy povrchově aktivní látka detergent směs tenzidů a dalších látek, která má detergenční vlastnosti (tedy schopnost převádět nečistotu z pevného povrchu do objemové fáze roztoku) SDS Triton X-100 Tween 80

7 Druhy tenzidů dělení dle přítomnosti náboje: detergenty nesoucí náboj anionické (anionaktivní) SDS deoxycholát kationické (kationaktivní) amfoterní (zwitterionic) CHAPS neionické (neionogenní) Triton X-100 n-oktylglucosid Tween 80

8 Detergent a. D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

9 Kolik detergentu použít?

10 Kritická micelární koncentrace II Garavito R.M., Ferguson-Miller S.: Detergents as Tools in Membrane Biochemistry, JBC 276(35), ,2001.

11 sfingosin sfingosin steroidní jádro Membránové lipidy fosfolipidy glykolipidy steroly glycerofosfolipidy sfingolipidy cholesterol alkohol PO 4 3- alkohol PO 4 3- sacharid OH glycerol alifatický řetězec mastná kyselina mastná kyselina mastná kyselina mastná kyselina

12 Membránové lipidy fosfatidylcholin sfingomyelin cholesterol kritické parametry uspořádání molekul lipidů objem hydrofóbní složky (v) délka řetězce (l) plocha, kterou zaujímá lipid na mezifázovém rozhraní (s o )

13 Tvar molekuly lipidu Kritický sbalovací parametr (v/l.s) Vznikající fáze Příklad lipidu < 1/3 (koule) 1/3 1/2 (tyčinka) lysofosfolipidy volné mastné kyseliny 1/2 1 ~ 1 > 1 (lamelární vrstva, liposomy) (lamelární vrstva, planární dvojvrstva) (hexagonální útvary H II ) lipidy se dvěma řetězci, velkou polární hlavicí a fluidními řetězci (fosfatidylcholin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerol, fosfatidylinositol, kys. fosfatidová, sfingomyelin) lipidy se dvěma řetězci, malou polární hlavicí, záporně nabité lipidy a nabité řetězce (fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin+ Ca 2+ ) lipidy se dvěma řetězci, malou polární hlavicí, lipidy bez náboje a polynenasycené lipidy (nenasycený fosfatidylethanolamin, kys. fosfatidová + Ca 2+ (ph<6), kys. fosfatidová (ph<3), fosfatidylserin (ph<4))

14 Několik poznámek membránu tvořící lipid x detergent účinek fosfolipas hexagonální útvary některé buněčné organely (př. tubuly) dělení membrán specifické lokální podmínky

15 Gerrit van Meer, Dennis R. Voelker, Gerald W. Feigenson: Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, (February 2008) doi: /nrm2330 Biologická membrána I bariéra definující buňku a její organely bariéra oddělující vnitřní obsah buňky (organely) a zároveň zajišťující komunikaci s okolím základní kameny jsou membránové lipidy (25 70 %) a proteiny (30 75%) podíl lipidy/proteiny není konstantní a je závislý na organismu, tkáni i konkrétní části buňky savci kvasinky semipermeabilní (polopropustná) přenos hmoty a informace dynamický útvar model fluidní mozaiky (1972, Singer a Nicolson)

16 Model fluidní mozaiky I Singer SJ, Nicolson GL (February 1972). "The fluid mosaic model of the structure of cell membranes". Science 175 (4023):

17 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, nm Model fluidní mozaiky II VNĚ UVNITŘ integrální periferní

18 Biologická membrána II Copyright 2002 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

19 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Membránové proteiny integrální x periferní proteiny ovlivňují vlastnosti a funkci membrány těsnější x volnější asociace s membránou integrální k uvolnění nutno použít účinné detergenty, při uvolnění dojde k rozbití membrány periferní bílkoviny mohou být asociovány s integrálními bílkovinami či cytoskletem integrální protein interaguje s membránou pomocí: iontových interakcí mezi bazickými aminokyselinami v proteinu a negativně nabitými fosfolipidy kovalentně připojených lipidových struktur (např. acyl, prenyl, GPI) nepolárních transmembránových segmentů GPI = glykosylfosfatidylinositolová kotva

20 Lipoproteiny a lokalizace v membráně D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

21 Vlastnosti biologické membrány McMahon and Gallop; Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling, Nature, Dec 2005; 438(7068):590.

22 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Asymetrie membrány projevuje se v lipidovém složení i v proteinovém složení orientace membránových proteinů glykosylace vždy směrem vně nábojová asymetrie (viz dále)

23 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Pohyb monomerů v membráně rotační pohyb lipidových molekul a uhlovodíkových řetězců pohyb celých molekul fosfolipidů možno i pro molekuly bílkovin velmi rychlý (mm/s) laterální pohyb difuzní koeficient velmi pomalý (dny) překlopení (flip-flop) rychlý (sekundy) flip-flopasa

24 Pohyb proteinů v membráně Garth L. Nicolson, The Fluid Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, Volume 1838, Issue 6, June 2014, Pages , ISSN , A) transient confinement by obstacle clusters B) transient confinement by the cytoskeleton C) directed motion by direct attachment to the cytoskeleton D) free, random difussion

25 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Fluidita membrány fázový přechod gelová fáze tekutá uspořádaná fáze tekutá neuspořádaná fáze teplota

26 R.H. Garrett, Ch. M. Grisham : Biochemistry, Saunders College Publishing, Diferenciální skenovací kalorimetrie pro některé fosfolipidy (např. fosfatidylcholin) teplota tání (T m )

27 Diferenciální skenovací kalorimetrie D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4 th edition, Elsevier, gelová fáze dipalmitoyl fosfatidylcholin (DPPC) tekutá krystalická fáze Di16:0 PA = dipalmitoyl fosfatidová kyselina

28 Diferenciální skenovací kalorimetrie D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4 th edition, Elsevier, Di16:0 PA = dipalmitoyl fosfatidová kyselina

29 D. E. Vance, J. E. Vance : Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes, 4 th edition, Elsevier, Vliv délky acylu na teplotu tání C 12 C 12 C 18 C 20 diacyl-fosfatidylethanolamin dialkyl-fosfatidylethanolamin

30 Ladbroke et al., Biochim. Biophys. Acta 1968, 150, 333. Vliv cholesterolu na teplotu tání Rate of heat flow dipalmitoyl fosfatidylcholin (DPPC) gelová fáze přechodná fáze tekutá krystalická fáze

31 Fluidita membrány I Fluiditu membrány ovlivňuje: lipidové složení membrány T m a fázové přechody jednotlivých fosfolipidů přítomnost cholesterolu - nízké teploty zvýšení fluidity - vyšší teploty snížení fluidity vlastnosti lipidů přítomnost dvojných vazeb - zvýšení fluidity - trans dvojná vazba T m - cis dvojná vazba T m délka řetězce - delší řetězec T m

32 Fluidita membrány II Fluiditu membrány ovlivňuje: přítomnost proteinů teplota iontová síla a ph - vliv na fosfolipidy s nábojem tlak - vysoký tlak zvyšuje stabilitu gelové fáze T m

33 Interakce cholesterolu s ostatními membránovými lipidy Expert Reviews in Molecular Medicine: Accession information: DOI: /S ; 20 December 2002

34 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Lipidové rafty oblasti bohaté na sfingolipidy a cholesterol obsahují specifické proteiny součásti signálních kaskád kaveolin tvorba kaveol ( caveola = malá jeskyně) odolné vůči detergentům lipidový raft cholesterol GPI-kotva VNĚ prenyl acyl kaveolin UVNITŘ

35 Model fluidní mozaiky po 43 letech Garth L. Nicolson, The Fluid Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, Volume 1838, Issue 6, June 2014, Pages , ISSN ,

36 Interakce s a přenos přes membránu Co je membrána? Co tvoří bariéru pro přechod látky přes membránu? Charakter látky x charakter membrány x charakter okolního prostředí

37 Bergethon P.R.:The Physical Basis of Biochemistry, 2 nd edition, Springer Science and Business Media, Elektrostatický profil membrány asymetrie membrány celkový profil (D) ovlivněn příspěvkem: membránového potenciálu (A) náboje na vnější straně membrány (B) náboje na vnitřní straně membrány (C)

38 Složky membránového potenciálu Demchenko A.P., Yesylevsky S.O.:Nanoscopic description of biomembrane electrostatics: results of molecular dynamics simulations and fluorescence probing. Chemistry and Physics of Lipids 160 (2009)

39 Biologická membrána jako bariéra interakce mezi molekulou a membránou vlastní interakce (asociace, adheze, inkorporace) x transport dána charakterem a vlastnostmi membrány... amfifilní povaha membrány náboj na povrchu membrány membránový potenciál dočasné póry v membráně (ohyby)... a charakterem látky (velikost a polarita) amfifilní molekuly adheze nebo inkorporace (závislé na koncentraci) nepolární molekula možná inkorporace molekula nesoucí náboj roli hraje elektrický potenciál ionty možné elektrostatické interakce s nábojem na povrchu membrány velikost je limitující faktor látky membránou procházejí bez svého solvatačního obalu... a vlivem okolního prostředí (ph, teplota)

40 Transport hmoty přes membránu dle mechanismu: volná difuse (nespecifická permeace) plyny a nízkomolekulární látky nepolární povahy 1. Fickův zákon malé polární molekuly (voda, močovina, ethanol) nespecificky dočasnými póry transport trvalými i nespecifickými póry póry tvořeny proteiny poriny možno přenášet širokou škálu látek od vody (aquaporiny) až po proteiny či RNA transport mechanismem exo- a endocytosy účast specifických proteinů exocytosa např. hemaglutinin, SNARE proteiny během synapse endocytosa klathrin jako receptor na povrchu membrány usnadněná difuse pomocí specifických přenašečů účast specifických integrálních proteinů transportery, translokasy, permeasy, specifické kanály vazba přenášené látky může a nemusí změnit konformaci proteinu elektricky nevyrovnaný přenos změna membránového potenciálu možná spoluúčast látky přenášené na druhou stranu saturační kinetika a možná inhibice

41 Transport hmoty přes membránu dle energetického hlediska: pasivní po směru elektrochemického potenciálu aktivní proti směru elektrochemického potenciálu energie může být dodávána několika způsoby: hydrolýza ATP (Na, K-ATPasa) oxidačně-redukční reakcí (proton-motivní síla) jinou chemickou reakcí nekatalyzovanou oxidoreduktasami světelná energie (F 0 F 1 -ATPasa) formou tzv. sekundárního aktivního transportu dle počtu transportovaných molekul a směru přenosu uniport kotransport (symport, antiport) Prostudovat kapitoly Přenos hmoty přes biologickou membránu a Přenos informace přes biologickou membránu a Příklady fysiologických dějů, v nichž hrají membrány rozhodující roli in Kodíček, Karpenko: Biofysikální chemie, Academia, 2000.

42 Difuze přes polopropustnou membránu Fickův zákon j D c x g R. T D D0e

43 Transport přes polopropustnou membránu ~ 0 i i m m RT ln a i z elektrochemický potenciál i F membránový potenciál rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu

44 Elektrochemický potenciál ~ m a z F 0 i, 1 mi,1 RT ln i,1 i 1 ~ m a z F 0 i, 2 mi,2 RT ln i,2 i 2 pasivní transport látky probíhá směr transportu ~ m i,1 m i,2 mi,1 m i, 2 ~ m ~ rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu G ~ m i i G i,1 i,2 pasivní transport látky neprobíhá i G i m m m m i,2 i,1 ~ i,1 m i,2 ~ ~

45 Difuse volná a usnadněná OUT IN volná difuse D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

46 K + kanál (Streptomyces lividans) D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 extracelulární prostor cytosol extracelulární prostor cytosol K + ionty (poloměr 1,33 A) procházejí x rychleji než Na + ionty (poloměr 0,95 A)

47 Na,K-ATPasa D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Membránový potenciál pro tento systém? ~ 0 i i m m in out RT M ln a i Na RT z F z i ln Elektroosmotická energie F c c Jaká je změna Gibbsovy energie spojená s přenosem iontu přes mebránu? G ~ m i i Na1 Na2 Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu vně kompartmentu

48 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Na,K-ATPasa Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu vně kompartmentu

49 (Klidový) membránový potenciál Donnanova rovnováha různá propustnost membrány pro jednotlivé ionty zachování elektroneutrality činnost Na, K-ATPas a dalších transportérů Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu vně kompartmentu

50 Měření (klidového) membránového potenciálu Membránový potenciál pro uzavřený kompartment = rozdíl elektrického potenciálu uvnitř kompartmentu vně kompartmentu

51 Proton-motivní síla D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

52 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Elektricky řízený přenašeč Jak může dojít k depolarizaci membrány?

53 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Chemicky řízený přenašeč polární AMK leucin

54 Přenos informace přes membránu fyzikální či chemický signál musí být dále předán přes/skrze membránu signální látka je schopna projít membránou (např. steroidní hormony, NO) signální látka není schopna proniknout do buňky vazba na receptor na vnějším povrchu, jeho aktivace a vyvolání odpovědi receptory jako součásti iontových kanálů receptory s vlastní enzymovou aktivitou receptory vyvolávající endocytosu signální molekuly receptory působící pomocí G-proteinů termodynamické a kinetické podmínky vazby receptor-agonista regulační kaskády, amplifikace signálu

55 Přenos informace přes membránu D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

56 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Přenos nervového vzruchu I resting potential

57 Přenos nervového vzruchu III

58 Přenos nervového vzruchu II Voet D., Voet J.G., Pratt C.W.: Fundamentals of biochemistry, 3 rd edition, Wiley, 2008.

59 Proces vidění I D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

60 tyčinka D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Proces vidění II

61 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Přenos čichových vjemů olfaktorický neuron

62 Receptor vykazuje enzymovou aktivitu V receptoru je přítomna tyrosin protein kinasa, která fosforyluje insulin receptor substrát-1. To zahájí celou kaskádu. D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

63 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Hormon je schopen projít membránou

64 Děkuji za pozornost.

65 Dodatečný materiál

66 Glykosylfosfatidylinositolová kotva - GPI = glykosylfosfatidylinositol(ová) kotva - sacharidová struktura je k proteinu připojena skrze C-koncovou aminokyselinu pomocí ethanolamin fosfátu - ukotvení proteinu do membrány (skrze lipid) vždy z vnější strany membrány 66