Fungicidy jako prostředek k získání orchidejí s potlačenou mykorhizou

Transkript

1 PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ FYZIOLOGIE A ANATOMIE ROSTLIN Fungicidy jako prostředek k získání orchidejí s potlačenou mykorhizou DIPLOMOVÁ PRÁCE Vedoucí diplomové práce: RNDr. Milan Baláž, Ph.D. Brno 2008 Bc. Lenka Trojanová

2 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny a literaturu uvedenou na seznamu. Souhlasím s uložením práce v knihovně Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity a s jejím využitím ke studijním účelům. V Brně 15. května 2008 Podpis: Bc. Lenka Trojanová

3 Na tomto místě chci poděkovat všem, kteří svými návrhy, radami a připomínkami přispěli ke zpracování mé diplomové práce. Jmenovitě chci velmi poděkovat vedoucímu diplomové práce RNDr. Milanu Balážovi, PhD. za pomoc po metodické a odborné stránce, rady a trpělivost.

4 Abstract The nutritional role of orchid mycorrhiza in the early development of seedling and in the entire life cycle of chlorophyll-deficient species has already been established. But the roles of mycorrhiza in facilitating the acquisition and transfer of carbon and nitrogen to adult orchids are poorly understood. To explain this, I have to work with some control plants, it means plants with inhibited mycorrhizal association. In my thesis called Fungicides as a tool for the reduction of orchid mycorrhiza development the effects of seven fungicides (iprodione, thiabendazole, propiconazole, fosetyl-al, carbendazim, captan and benomyl) were assessed on two terrestrial orchids Serapias lingua a S. strictiflora, growing in either zeolite substrate or in its mixture with peatbased Klasmann Substrate No. 1. The fungicides were applied either directly into the mycorrhizosphere, or into lateral hyphoboxes attached to the rhizobox cultivation system. The efficiency of fungicides in the extraradical mycelia growth suppression was highly dependent on the cultivation system and substrate composition used. When the rhizobox system and zeolite as a substrate were used for cultivation of both the species, all the fungicides tested (except benomyl which was not tested) were highly effective in the suppression of the extraradical mycelium ingrowth into the hyphoboxes. However, when the same fungicides were applied directly into the mycorrhizosphere, some of them lost its efficiency. E.g., in zeolite it was thiabendazole, however in the mixture of zeolite and peatbased substrate there were thiabendazole, propiconazole and benomyl. These results indicate important role of substrate composition in determining fungicide efficiency. As a consequence, I can certainly say that fungicides carbendazim and iprodione appear to be the most suitable for the future experiments, as the use other two fungicides which were also highly effective, captan and fosetyl-al, are associated with the changes of soil environment as their application solutions have unsuitable ph and conductance.

5 Abstrakt Skutečnost, že orchideje jsou na vztahu s mykorhizním symbiontem závislé přinejmenším v raných vývojových stádiích je objasněna po dlouhou dobu. Stále však zůstávají některé otázky jejich života neobjasněny. Skutečnosti zatím nevysvětlené se týkají zejména role mykorhizního vztahu u dospělých orchidejí, zvláště pak transfer uhlíkatých a dusíkatých látek mezi orchidejí a houbovým symbiontem. Důvodem našich nedostatečných znalostí je bezesporu absence účinných metod přípravy kontrolních rostlin s potlačenou mykorhizou. Jedna z možností, jak tyto rostliny připravit, je aplikace fungicidů. Ve své práci, která nese název Fungicidy jako prostředek k získání orchidejí s potlačenou mykorhizou, jsem sledovala vliv sedmi fungicidních přípravků (iprodione, thiabendazole, benomyl, carbendazim, propiconazole, fosetyl-al a captan) na terestrické orchideje Serapias lingua a S. strictiflora pěstované v substrátu zeolit nebo v jeho kombinaci se substrátem na bázi rašeliny. Účinnost testovaných fungicidů potlačit rozvoj mimokořenového mycelia byla vysoce závislá na způsobu aplikace, stejně jako na zvoleném substrátu. Při aplikaci fungicidů do rhizoboxového systému, vykazovaly schopnost potlačit ERM všechny testované látky (mimo benomylu, který nebyl v rámci tohoto experimentu použit). Při aplikaci fungicidních látek přímo do mykorhizosféry rostlin byly však výsledky v některých případech odlišné. Při použití zeolitu ztratil schopnost eliminace ERM benomyl, při použití kombinace zeolitu a substrátu na bázi rašeliny, nebyly účinné látky thiabendazole, propiconazole a benomyl. Z výsledků tedy jasně vyplývá, že výběr substrátu a design experimentu je velmi důležitým faktorem ovlivňujícím účinnost fungicidních látek. Pro navazující experimenty lze tedy za nejvhodnější látky považovat carbendazim a iprodione. Fungicidy captan a fosetyl-al doporučuji, i přes jejich prokazatelnou schopnost potlačit rozvoj ERM, z následných experimentů vyloučit, neboť jejich použití s sebou nese změnu kultivačních podmínek - změnu ph a elektrické vodivosti.

6 Obsah 1. ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED MYKORHIZNÍ INTERAKCE ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZA MYKOHETEROTROFIE ZELENÉ FOTOSYNTETIZUJÍCÍ ORCHIDEJE HOUBY VYTVÁŘEJÍCÍ ORCHIDEOIDNÍ MYKORHIZU MIMOKOŘENOVÉ MYCELIUM MOŽNOSTI PŘÍPRAVY SEMIMYKORHIZNÍCH ROSTLIN FUNGICIDY KLASIFIKACE FUNGICIDŮ MATERIÁL A METODY ROSTLINNÝ MATERIÁL SYSTÉM KULTIVACE POUŽITÉ FUNGICIDY EXPERIMENT EXPERIMENT HODNOCENÍ ROZVOJE ERM STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ DAT VÝSLEDKY KLIMATICKÉ PODMÍNKY A RŮST ROSTLIN POKUS 1: VLIV FUNGICIDŮ NA VRŮSTÁNÍ ERM DO HYFOBOXŮ POKUS 2: VLIV FUNGICIDŮ PŘI PŘÍMÉ APLIKACI DO MYKORHIZOSFÉRY DISKUZE ZÁVĚR CITOVANÁ LITERATURA... 48

7

8 ÚVOD 1. Úvod Čeleď Orchidaceae (vstavačovité) lze díky počtu přesahující druhů, některé literární prameny uvádějí rozsah od do druhů (Cribb et al. 2003), považovat za jednu z největších a také vývojově nejpokročilejších čeledí světové flóry. Z celkového množství se nachází 215 planých druhů v Evropě, v České republice máme možnost se setkat s přibližně 24 rody a asi 60 druhy s početnými poddruhy a mezirodovými kříženci. Jako nejznámější lokality v České a Slovenské republice se uvádí například Belanské Tatry, Strážovské vrchy, Bílé Karpaty na moravské i slovenské straně, Beskydy, Vsetínská pahorkatina, ale druhově velmi bohaté naleziště orchidejí můžeme najít i v oblasti Českého středohoří (Průša 2005). Devadesát procent druhů této početné čeledi roste v tropech, setkat se s nimi můžeme ve všech klimatických oblastech kromě Antarktidy. Tato čeleď je bohužel zároveň nejohroženější rostlinnou čeledí nejen u nás, ale i na celé zeměkouli. V České republice považujeme za vyhynuté tři druhy - Orchis coriophora, Hammarbya paludosa, a Dactylorhiza russowii. Za hlavní důvody tohoto vývoje lze považovat např. přímou destrukci a zánik existujících stanovišť či znečištění životního prostředí eutrofizací, jejíž vyústěním je přemnožení vysokostébelnatých trav, které potlačují výskyt orchidejí. Ke stejné situaci vede i přeměna luk či pastvin na ornou půdu, tedy úplná devastace takových stanovišť (Wotavová et al. 2003), změna způsobu obhospodařování půdy, zarůstání lokalit dřevinami, meliorace, tedy odvodňování mokřadů a podmáčených stanovišť, používání pesticidů a tím vyhubení možných opylovačů, stejně jako zavlečení nepůvodních druhů. Ke snižování počtu lokalit orchidejí v České republice dochází i přes ochranu stanovenou zákonem č.114/1992 Sb., o ochraně přírody a krajiny a vyhlášky Ministerstva životního prostředí č. 395/1992 Sb. Zástupci této čeledi odjakživa upoutávají pozornost díky svému vzhledu, rozmanité velikosti tvarům, barevným variacím a v neposlední řadě i často velmi neobvyklou stavbu květů, které jsou výrazně přizpůsobeny pro opylování hmyzími opylovači (Smith et Read 1997). Výrazné odlišnosti mají i v nárocích na prostředí, ve kterém rostou. Některé orchideje rostou terestricky (v půdě), epifyticky (na stromech), jiné lithofyticky (na skalách). Mohou se vyskytovat též jako liány, jako například Vanilla. Za nejmenší orchidej je považována Rhizanthella spp., kterou zařazujeme mezi podzemní druhy (Smith et Read 1997). Mezi základní charakteristiky této čeledi zajisté patří spojení s houbovými symbionty orchideoidní mykorhiza (OM), známa již od 19. století (Smith et Douglas 1987). Tato 1

9 ÚVOD asociace hraje významnou roli při klíčení semene a následném růstu orchidejí. Hyfy specifických půdních hub prorůstají do klíčícího semene a poté poskytují rostlině uhlíkaté látky, vitamíny, aminokyseliny a jiné živiny (Arditti et al. 1990). Tuto skutečnost potvrzuje fakt, že všechny orchideje mají plody s velkým množstvím prachových semen malých rozměrů o hmotnosti 0,3 14 μg, která obsahují minimální množství zásobních lipidů, proteinů a škrobových zrn (Taylor et al. 2004; Arditi et Ghani 2000; Smith et Read 1997). Počet u jednoho jedince může překročit během vegetačního období sto tisíc (Moles et Westoby 2004; Vallius 2001; Arditti el at. 1990). Následný vývoj semen je proces natolik složitý, že jen nepatrné množství z nich vyklíčí a doroste v dospělého jedince. Většina druhů dospělých orchidejí je na přísunu uhlíkatých látek z houbového partnera více či méně nezávislá, neboť patří mezi fotosynteticky aktivní rostliny. Na druhé straně se však na celé Zemi vyskytuje přibližně 200 druhů 45 rodů orchidejí, které jsou nezelené, představují tedy zcela mykoheterotrofní organismy. Tento fakt můžeme shrnout s tím, že orchideoidní mykorhiza se vyskytuje všude tam, kde jsou klíčící orchideje a v dospělosti má tato asociace s houbovým symbiontem schopnost plně nebo alespoň částečně nahradit fotosyntézu (Rasmussen 2002). Chceme-li nejen na našem území zachovat stávající počet těchto již tak vzácných rostlinných druhů, je třeba věnovat zvláštní pozornost jednak orchidejím jako takovým a zároveň jejich stanovištím, stejně jako se pokusit lépe porozumět fungování OM. Jedním z omezení našeho poznání je naše neznalost účinných metod, které by vedly k potlačení mykorhizní asociace orchidejí kultivovaných ex vitro. Jako nejvhodnější metoda k potlačení rozvoje OM se jeví aplikace fungicidů. Přestože v minulosti na půdě Masarykovy univerzity experimenty využívající fungicidy proběhly, je podle některých dosažených výsledků zřejmé, že tyto pokusy nebyly dostatečné (Baláž, osobní sdělení). Z tohoto důvodu se ve své diplomové práci k problematice aplikace fungicidů vracím. Cílem mé magisterské diplomové práce bylo zrealizovat a následně odpovídajícím způsobem vyhodnotit 1) experiment s využitím rhizoboxového systému., s jehož pomocí byla testována schopnost šesti fungicidních látek (iprodione, thiabendazole, propiconazole, fosetyl- Al, carbendazim, captan) potlačit růst mimokořenového mycelia OM hub 2) experiment, ve kterém byla testována schopnost výše uvedených fungicidů, stejně jako fungicidu benomyl, potlačit rozvoj OM asociace při aplikaci přímo do rhizosféry hostitelských rostlin. Snahou mé práce bylo nalezení takového fungicidu, který by asociaci mezi zástupci čeledi Orchidaceae a mykorhizní houbou prokazatelně potlačil, a zároveň měl minimální 2

10 ÚVOD fytotoxický vliv na hostitelskou rostlinu a minimálně ovlivňoval její kultivační prostředí (ph, vodivost). 3

11 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2. Literární přehled 2.1 Mykorhizní interakce Přítomnost hub schopných vytvářet mykorhizní asociace patří mezi základní charakteristiky všech ekosystémů i agroekosystémů. Uvádí se, že v mykorhizním vztahu žije okolo % všech cévnatých rostlin. Termínem mykorhiza, který vznikl spojením řeckých slov mycés (houba) a rhizó (kořen), je označována symbiotická asociace mezi kořeny rostlin a specifickou skupinou půdních hub (Smith et Douglas 1987). Termín symbióza byl poprvé použit de Barym (1897), který tímto označil vzájemné soužití dvou organismů. Důsledky tohoto soužití však blíže nedefinoval a zahrnoval pod něj soužití v celém spektru možností od mutualistické symbiózy po symbiózu parazitickou. Přes tuto variabilitu symbiotických interakcí lze nalézt jejich několik společných znaků (Smith et Douglas 1987). Prvním z nich je rozdílná velikost hostitele (orchidej), který je vždy větší než tzv. symbiont (mykorhizní houba); funkce dárce však s velikostí nijak nesouvisí, hostitel může být poskytovatel i příjemce např. nějaké živiny. Fyzický kontakt obou partnerů této asociace lze považovat za druhý společný znak. Podle postavení symbionta rozlišujeme ektosymbiózy (symbionti jsou zevně hostitele; ektomykorhiza) a endosymbiózy (symbionti jsou uvnitř hostitele). Mezi endomykorhizy zařazujeme arbuskulární, erikoidní, monotropoidní a orchideoidní mykorhizu. Endosymbionti se mohou nacházet buď vně buněk hostitele (intercelulární endosymbionti), nebo uvnitř buněk hostitele (intracelulární endosymbionti), jako je tomu u mykorhizy orchideoidní. 2.2 Orchideoidní mykorhiza Čeleď Orchidaceae zahrnuje více než 10 % všech rostlinných druhů, je tedy největší rostlinnou čeledí na Zemi. Pouze u zástupců této čeledi najdeme OM asociaci, není tedy znám její výskyt u jiné skupiny rostlin. Tento vysoce specifický endomykorhizní vztah charakterizovaný extenzivním intracelulárním růstem mycelia, lze oprávněně považovat za vývojově nejmladší. Závislost orchidejí na mykorhizních houbách, alespoň v určité části jejich vývojového cyklu byla poprvé potvrzena před více než sto lety. Noël Bernard v roce 1909 identifikoval Rhizoctonia jako orchideoidního symbionta a prokázal důležitost role této houby při klíčení extrémně malých a endosperm postrádajících semen orchidejí (Gebauer et Meyer 2003). Obrovské množství zástupců a skutečnost, že tato čeleď obsahuje druhy epifytické, lithofytické i terestrické, dále druhy stále zelené, stejně jako druhy po celý život nezelené, vysvětluje, proč nelze orchideje považovat za homogenní skupinu, pro kterou by byl 4

12 LITERÁRNÍ PŘEHLED jediný charakteristický způsob získávání uhlíkatých látek z prostředí. I když semena, stejně jako klíčící orchideje jsou zcela odkázána na živiny dodávané houbovým symbiontem, je závislost orchidejí na houbě v pozdějších stádiích velmi variabilní (Smith et Read, 1997). Zatímco některé tropické, zejména epifytické orchideje jsou v dospělosti pouze zřídka kolonizovány OM houbami (Bayman et al. 2002; Hadley et Williamson 1971), jiné druhy zůstávají po celý život plně mykoheterotrofní (Leake 2004; Burgeff 1932;). Můžeme říci, že dospělé orchideje získávají uhlíkaté látky třemi odlišnými způsoby, přičemž jedním z nich je mykoheterotrofie, dále mixotrofie a v poslední době potvrzena i plně autotrofní výživa orchidejí prostřednictvím fotosyntetické asimilace CO2. Vezmeme-li v úvahu způsoby získávání minerálních látek, lze tuto čeleď oprávněně za homogenní považovat. Na velký význam mykorhizní asociace ukazuje nevětvený nebo pouze řídce větvený kořenový systém, který je společným znakem všech orchidejí (Brundrett 2002; Smith et Read 1997). Houbový symbiont přes své mycelium zajišťuje orchidejím získávání a následný transfer anorganických a/nebo organických sloučenin dusíku a fosforu z půdy do buněk kořene. Bylo prokázáno, že buňky kořene orchidejí stravují houbové mycelium a tím včleňují sloučeniny do vlastní biomasy (Smith et Read 1997; Burgeff 1932), kvantifikace tohoto jevu však ještě nebyla zcela dokončena. Mykorhizní asociace poskytuje rostlinám lepší zásobení nejen co se týče minerálních živin, ale rovněž vody. U terestrické orchideje Platanthera integrilabia a rovněž u epifytického druhu Epidendrum conopseum byl obsah vody u mykorhizních rostlin prokazatelně vyšší než u nemykorhizních kontrol (Yoder et al. 2000). Rovněž bylo prokázána účast na přenosu uhlíkatých látek mezi houbou a pletivy hostitelských rostlin (viz následující kapitola) Mykoheterotrofie Závislost orchidejí na mykoheterotrofii se vyskytuje u všech zástupců této čeledi, a to v jejich raných vývojových stádiích, přestože v dospělosti mohou přecházet na autotrofní nebo mixotrofní způsob výživy (Hadley 1969). Pro všechny zástupce čeledi Orchidaceae jsou typická extrémně malá semena s nedostatečným množstvím zásobních látek, což tuto závislost protokormu na přítomnosti mykorhizní houby jen potvrzuje. Mykoheterotrofie raných vývojových stádií byla potvrzena i experimentálně, na druhu Dactylorhiza purpurella (Smith 1967) Autorka využívala přenosu radioaktivně značených sacharidů, glukózy, fruktózy a sacharózy z agarového média do dosud fotosynteticky neaktivních protokormů tohoto druhu. Mycelium třech mykorhizních hub izolovaných z této orchideje obsahovalo glukózu a trehalózu. Prokázán byl u dvou hub rovněž mannitol. V rámci 5

13 LITERÁRNÍ PŘEHLED tohoto experimentu byla aplikována [ 14 C]glukóza do hyf mykorhizní houby v určité vzdálenosti od rostlin. Následně byl prokázán obsah 14 C v orchideji asociované s touto houbou. Začleňování 14 C do rozpustného i nerozpustného materiálu pokračovalo během celého sedmidenního testu. Následně byly výsledky porovnány s hypotézami, které se zaměřují na translokaci uhlíkatých látek, zejména trehalózy, houbovými hyfami do orchidejí. Stopy radioaktivity se objevily nejdříve u trehalózy. Podíl radioaktivního 14 C klesal, jakmile byl začleňován do jiných sacharidů, zejména sacharózy. Z důvodu nepřítomnosti sacharózy v houbovém myceliu lze předpokládat pohyb 14 C sloučenin z vnitřních houbových hyf do buněk orchideje (Smith 1967). Mimo zástupců autotrofních se v rámci skupiny orchidejí vyskytuje množství nezelených druhů. Pro tyto druhy je typická výrazně zmenšená listová plocha a proto zástupci této skupiny částečně či zcela ztratily schopnost fotosyntézy (Guidot et al. 2002). Tyto druhy nazýváme (obligátně) mykoheterotrofní. V dřívější literatuře se setkáme s nesprávným označením druhy saprotrofní (Trudell et al. 2003; Smith et Read 1997). Celkově se na Zemi vyskytuje přibližně 200 druhů nezelených mykotrofních orchidejí (Leake 2004), v rámci naší republiky máme možnost se setkat se čtyřmi zástupci, Limodorum abortivum (hněděnec zvrhlý), Corallorhiza trifida (korálice trojklanná), Epipogium aphyllum (sklenobýl bezlistý) a Neottia nidus avis (hlístník hnízdák). V literatuře se můžeme setkat s řadou důkazů, které potvrzují existenci a fungování tohoto způsobu získávání uhlíkatých látek. Prvním principem mykoheterotrofie je nutnost pevného spojení mezi houbami a kořeny nezelených orchidejí, a zároveň nepřítomnost přímého spojení mezi kořeny těchto orchidejí s okolními, fotosynteticky aktivními druhy. Za druhé je nezbytné spojení mezi fotosynteticky aktivní rostlinou a mykobiontem. Touto problematikou se zabýval polní experiment využívající mykoheterotrofní druh Monotropa hypopitys (č. Monotropaceae) v roce Bylo zřejmé, že se rostliny, od kterých byl mykobiont oddělen se vyvíjely o poznání hůře než jedinci kontrolní, u kterých byla asociace zachována (Björkaman 1960). Rovněž byly provedeny radioizotopové polní studie dokazující translokaci 14 C a 32 P ze stromů do M. hypopitys a Sarcodes sanguinea (č. Monotropaceae) (Trudell et. al 2003; Vreeland et. al 1981; Björkman 1960). Z daných experimentů vyplynulo, že do okolních fotosyntetizujících rostlin bylo přemístěno velmi malé nebo dokonce nulové množství radioaktivního uhlíku a fosforu. Izotop 14 C využívaly i laboratorní izotopové studie, které potvrdily přenos uhlíku z asociované houby do mykoheterotrofní hostitelské rostliny Dactylorchis purpurella (Smith 1966) a z fotosynteticky aktivního hostitele 6

14 LITERÁRNÍ PŘEHLED do mykoheterotrofní rostliny Tipularia discolor prostřednictvím houby (McCornick et.al 2004) Zelené fotosyntetizující orchideje Poprvé se o opačném toku asimilátů, tedy ve směru od orchideje k houbě, začalo uvažovat v 70. letech 20. století, nicméně pro nedostatečné důkazy se tato možnost po dlouhou dobu zavrhovala a tím se i oddalovalo lepší pochopení situace u zelených orchidejí (Alexander et Halley 1985; Hadley et Purves 1974; Smith 1967). Jak již bylo uvedeno, všechny orchideje jsou na přítomnosti houbového symbionta závislé v raných vývojových stádiích, nicméně tento vztah, tedy využívání houby jako jediného zdroje uhlíkatých látek, se výrazně mění ve chvíli, kdy zelená orchidej dospěje do fotosynteticky aktivního stádia. Bylo prokázáno, že alespoň část uhlíkatých látek je získána vlastní fotosyntézou zelené orchideje (Rasmussen et Whigham 2002). Epifytní druhy zelených orchidejí lze charakterizovat nevýraznou kolonizací mykorhizními houbami (Hadley et Williamson 1971), oproti tomu temperátní i tropické orchideje mají své kořeny kolonizovány výrazně (Hadley 1982). V roce 1985 se na skupinu fotosynteticky aktivních orchidejí zaměřila Alexander se svými kolegy. Jejich studie, ve které věnovali pozornost druhu smrkovník plazivý (Goodyera repens), srovnávaly přenos uhlíkatých látek u jedinců získaných jako rostliny přírodně mykorhizní s jedinci vypěstovanými ze semen. Druhá varianta rostlin byla asociovaná s jejich přirozeným mykorhizním endofytem Ceratobasidium cornigerum. Nerozpustný [ 14 C] sacharid byl jako výhradní zdroj uhlíku poskytnut mimokořenovému myceliu asociovanému s protokormu a dospělými rostlinami. Do protokormů byl přes mimokořenové mycelium translokován 14 C, na druhou stranu dospělé orchideje tento zdroj nevyužily, a to ani po přesunutí těchto rostlin do tmy pro navození deficience uhlíkatých látek. U dospělých rostlin G. repens byla z hlediska uhlíkatých látek zjištěna jejich nezávislost na mykorhizní asociaci (Alexander et Hadley 1985). Snahy odhalit směr pohybu u zelených fotosyntetizujících orchidejí se objevovaly i později. V jedné ze studií byl použitý druh G. repens vystavován 14 CO 2. Cílem bylo srovnání nemykorhizních klíčících rostlin s klíčícími rostlinami asociovanými s endofytem Rhizoctonia goodyerae repensis. Jak autoři uvádějí, podařilo se zaznamenat pohyb pouze velmi malého množství (přesný údaj autoři neuvádějí) fotosynteticky asimilovaného uhlíku směrem do kořenů. Žádné stopy radioaktivity v ERM nebyly zaznamenány po aplikaci 14 CO 2 k nadzemním částem mykorhizních rostlin. Oproti tomu po expozici po samotných oddenků 14 CO 2 bylo prokázáno malé množství radioaktivního uhlíku v myceliu (Hadley et Purves 7

15 LITERÁRNÍ PŘEHLED 1974). Je tedy zřejmé, že pohyb uhlíku probíhá ve směru z houby do orchideje a že tento pohyb ustává, dosáhne li orchidej jistého vývojového stádia. Otázka existence toku uhlíkatých látek v opačném směru, z fotosynteticky aktivní zelené orchideje do houbového partnera, zůstávala po dlouhou dobu nevyřešena. Jedním z důvodu je bezesporu výrazná metodická náročnost při realizaci takových experimentů. Výsledky výše zmíněného experimentu se smrkovníkem plazivým (Hadley et Purves 1974) jsou zkresleny neadekvátní distribuci fotosyntátů v rostlině. V případě tohoto experimentu byl fotosyntézou zafixovaný 14 CO 2 využit téměř výhradně pro růst nadzemních částí Goodyera repens, na druhou stranu v kořenech se objevily jen stopy radioaktivního 14 C. Hypotézy o existenci toku uhlíkatých látek ve směru ze zelené fotosyntetizující orchideje do mykorhizní houby a o existenci plné autotrofie orchidejí se podařilo potvrdit pomocí experimentu, který byl proveden na půdě Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity. Byly srovnávány izotopové podpisy hyf orchideoidní mykorhizní houby rhizoktoniového typu, asociované s mediteránní hlíznatou orchidejí Serapias lingua. Tyto houby měly k dispozici pro vlastní růst pouze uhlíkaté látky poskytované jí biotrofně orchidejí, popřípadě mohla houba navíc využít i uhlíkaté látky z rozkládajících se kořenů dekapitovaných kukuřic (Zea mays), které byly touto orchideoidní mykorhizní houbou intenzivně kolonizované. S. lingua patří mezi C 3 rostliny s izotopovým podpisem δ13c přibližně 28. V prvním případě odpovídal izotopový podpis ERM tomuto zdroji uhlíkatých látek (δ 13 C přibližně 26 ). V případě druhém, za přítomnosti kořenů C 4 rostliny kukuřice s izotopovým podpisem δ13c přibližně 15, odrážel izotopový podpis ERM δ13c (přibližně 21 ) oba zmíněné způsoby výživy, tedy jak výživu saprotrofní, tak i biotrofní. Izotopový podpis pletiv kořenů orchideje však zůstal stejný ( δ13 C 28 ), z čehož plyne, že orchideoidní houby nezískávaly prostřednictvím OM žádné uhlíkaté látky a byly tedy plně autotrofní (Baláž, osobní sdělení). Jedna z novodobých studií na prokázání toku uhlíku a dusíku ve směru z houby do orchideje je z roku 2006 (Cameron et. al 2007). Autoři ve svém experimentu používali druh zelené terestrické orchideje G. repens. Z povrchu kořenů izolovali intracelulární hyfové pelotony a sterilně je přenesli do Petriho misek rozdělených bariérou na dvě části, obě obsahující 1% agar. Prýt rostliny byl upevněn na okraj hodní poloviny misky pomocí kousku sterilní bavlny tak, že přečníval přes boční stěny. Během dvou týdnů se extenzivní mycelium houbového symbionta, pomocí molekulárních metod určeného jako druh Rhizoctonia goodyerea-repensis, rozrostlo po vrchním kompartmentu a zároveň se dostalo přes bariéru ve spodní části. Autoři uvádějí, že v tomto okamžiku z agaru ve spodní části vyřízli kolečko 8

16 LITERÁRNÍ PŘEHLED o průměru 1.5 cm a nahradili jej stejně velkým diskem obsahujícím 99% glycin, značený pomocí izotopů 13 C a 15 N. Aplikovaný glycin zaručil 10 mm koncentraci aminových sloučen. Jako kontrolní rostliny byly použity vzorky bez glycinového disku. Po aplikaci glycinu byly kontrolní vzorky a vzorky obsahující glycin spárovány, obaleny aluminiovou fólií a vloženy do polyetylenového sáčku tak, aby měly prýty rostlin zaručený kontakt se světlem a vzduchem. Po 14 dnech aplikace bylo zjištěno, že přes bariéru Petriho misek bylo transferováno signifikantní množství izotopů 13 C a 15 N a v hyfách hub, kořenech i nadzemních částech rostlin bylo zaznamenáno množství těchto látek vyšší než je běžné za přírodních podmínek. Celkové množství dusíku zjištěné v rostlinné a houbové biomase bylo dvakrát vyšší než množství uhlíku, navzdory tomu, že glycin obsahoval více než 3 x více izotopů 13 C než 15 N. Množství se výrazně snižovalo od houby (78%) směrem ke kořenům (20%) a nadzemním částem (méně než 3%). Co se týče uhlíku, bylo v rostlinných tkáních prokázáno více než 50% z celkového množství (Cameron et. al 2006). Pro některé zelené orchideje je charakteristické získávat uhlíkaté látky jednak pomocí mykorhizní asociace a zároveň vlastní fotosyntetickou aktivitou. Tento způsob získávání uhlíkatých látek, označovaný jako mixotrofie, považujeme za evoluční krok vedoucí k plně mykoheterotrofním rostlinám, zcela závislým na mykorhizní houbě (Julou et. al 2005; Gebauer et Meyer 2003). V rámci České republiky se můžeme setkat se následujícími zástupci výrazně mixotrofních orchidejí, což jsou bez výjimky stínomilné druhy s redukovanou listovou plochou: okrotice bílá (Cephalanthera damasonium), okrotice červená (C. rubra), kruštík malolistý (Epipactis microphylla), kruštík polabský (E. albensis) nebo kruštík modrofialový (E. purpurata). Ve studii zaměřené na tuto problematiku byly srovnávány fotosynteticky neaktivní jedinci, tedy albinotické formy, s normálními zelenými rostlinami druhu Cephalanthera damasonium. Pomocí izotopu 13 C bylo dokázáno, že houba poskytuje tomuto mixotrofnímu druhu téměř 50 % z celkového množství uhlíku (Julou et. al 2005). Přechod k mykoheterotrofii může v evoluci zahrnovat několik současných adaptací. Ztráta chlorofylu v listech albinotických forem je bezesporu jedna z nich. Procento poskytovaného uhlíku je do dnešní doby údajem ne zcela vyjasněným, zejména z důvodu minimálního množství experimentů na tuto problematiku. Kromě výše zmíněné studie (Julou et. al 2005) byly poměry v mixotrofii druhu C. damasonium kvantifikovány Gebauerem a Meyerem (2003). Ke kvantifikaci mixotrofie využili přirozené izotopové podpisy δ 13 C a δ 15 N. Podle této studie jsou mykoheterotrofní orchideje výrazně obohacené o 13 C i 13 N a izotopový podpis autotrofních a mixotrofních 9

17 LITERÁRNÍ PŘEHLED orchidejí je v rozmezí od hodnot charakteristických pro jiné druhy rostlin než jsou orchideje (např. Juniperus comunnis měl dokonce hodnoty δ 13 C listů vyšší něž orchideje druhů Ophrys insectifera, Listera ovata či Platanthera bifolia) po hodnoty připisované zástupcům plně mykoheterotrofním. Toto zjištění se týká druhu Cephalanthera damasonium, který dle této studie získává většinu dusíku i uhlíku prostřednictvím své mykorhizní houby Houby vytvářející orchideoidní mykorhizu Houby tvořící mykorhizní asociaci s orchidejemi patří většinou do třídy Basidiomycetes, ale jak ukazují výzkumy posledních let, existují orchideje tvořící mykorhizní vztah s houbami z třídy Ascomycetes. K tomuto zjištění bezesporu přispěla aplikace molekulárně biologických metod v jejich determinaci (Girlanda et. al 2006; Bidartondo et. al 2004; Sen et. al 1999). U orchidejí se nejčastěji setkáváme s mykorhizními houbami rodu Rhizoctonia, u kterých byla po dlouhou dobu známa pouze jejich anamorfní stádia, tj. stádia rozmnožující se nepohlavně, což znemožňovalo jejich determinaci, zejména z důvodu morfologické podobnosti těchto stádií (Shan et. al 2002; Marchisio et. al 1985,). Jako první izoloval čistou kulturu z kořenového kortexu Noël Bernard v roce 1904 a následně roku 1909 popsal tři druhu tohoto rodu - Rhizoctonia mucotroides, R. repens a R. lanuginosa (Bernard 1909). Na základě morfologických znaků vegetativního mycelia byl druh Rhizoctonia rozdělen do několika opět anamorfních rodů, například Epulorhiza, Ceratorhiza nebo Moniliopsis. Významný zlom nastal koncem 60. let, kdy nově objevená metoda umožnila u některých izolátů indukovat tvorbu teleomorfních stádií a tím i determinaci houby s ohledem na morfologii jejich reprodukčních orgánů (Milligan et Williams 1988; Hadley 1982; Warcup et Talbot 1971, 1967; Smith 1967). K jednotlivým anamorfním rodům tak byla přiřazena tato jména podle jejich teleomorfních neboli pohlavních perfektních stádií: (podle Andersen et Rasmussen 1996) Tulasnella (anamorfní stádium = Epulorhiza) Sebacina (anamorfní stdium = Epulorhiza) Ceratobasidium (anamorfní stádium = Ceratorhiza) Thanatephorus (anamorfní stádium = Moniliopsis) Waitea (anamorfní stádium = Moniliopsis) Zřejmě nejvíce rozšířeným kořenovým endofytem orchidejí je Rhizoctonia repens (syn. Tulasnella calospora, anamorfní stádium Epulorhiza repens), kterou považujeme za univerzálního orchideoidního symbionta a která byla z kořenů orchidejí izolována již 10

18 LITERÁRNÍ PŘEHLED Bernardem (1909). T. calospora byla dále izolována z Dactylorhiza purpurella a jiných terestrických a epifytických druhů (Rasmussen 1995). Další druhy téhož rodu, T. asymmetrica, T. allantospora, T. cruciata, T. irregularis a T. violacea, byly zjištěny u několika druhů australských orchidejí (Warcup et Talbot in Rasmussen 1995). Jiným obvyklým endofytem orchidejí je Certobasidium cornigerum, který byl izolován z Goodyera repens, Dactylohiza purpurella a Orchis laxiflora. Je prokázáno, že druhy jako Rhizoctonia repens mají celosvětové rozšíření. Po izolaci a provedení testů klíčivosti se semeny orchidejí, které nemají tak univerzální rozšíření bylo přistoupeno k závěru, že vztah mezi houbou a orchidejí vedoucí k vytvoření mykorhizní asociace je spíše nespecifický (Smith et Read 1997). Toto tvrzení potvrdily i výzkumy prováděné v terénu za použití Rhizoctonia goodyerae repensis. Zjistilo se, že rozšíření houby bylo mnohonásobně větší než rozšíření orchideje. Celkově můžeme říct, že orchideje jsou většinou schopny růstu v přítomnosti několika houbových endofytů, zatímco ojedinělé druhy vyžadují jeden specifický druh houby. U nezelených orchidejí se setkáváme s basidiomycetami vytvářejícími spřežky, zařazovanými do rodů Marasmius, Xerotus, Hymenochaete nebo Armillaria. Jak poprvé prokázali Zelmer a Currah (1997), jsou tyto druhy schopny vytvářet ektomykorhizní asociaci se stromy, v jejichž těsné blízkosti se tyto nezelené druhy orchidejí vždy vyskytují. Tyto závěry byly v posledních letech potvrzeny v řadě terénních studií (Currah et al. 1997), z nichž některé k potvrzení funkčního spojení mezi ektomykorhizní dřevinou a orchidejí prostřednictvím mycelia společné mykorhizní houby využily radioaktivně značené sloučeniny (McKendrick et al. 2000). Oba typy mykorhiz, které jsou tvořeny stejnou houbou, totiž umožňují transport látek z autotrofní ektomykorhizní rostliny do orchideje. Za mykorhizní houby považujeme i parazitické druhy hub, jako například rozšířený patogen rostlinných čeledí Solanaceae a Cucurbitaceae získaný z kořenů Dactylorhiza purpurella, houbu Rhizoctonia solani (Downie 1957). Identifikace hub na základě charakteristiky jejich hyf, které se vyznačují např. barvitelností, výskytem přepážek a relativně širokých hyf, je velmi obtížné. Hlavním problémem je náročnost správného přiřazení sterilního mycelia k odpovídajícím reprodukčním myceliem, na kterém je založena většina tradičních mykologických klasifikací. To je důvodem proč je k jednomu anamorfnímu stádiu Rhizoctonia přiřazeno tolik označení pro stádia teleomorfní, Tulasnella, Sebacina, Ceratobasidium a Thanatephorusn (Rasmussen 1997). Diagnostické znaky a klíč k určování jednotlivých zástupců je podán v publikaci 11

19 LITERÁRNÍ PŘEHLED Currah et Zelmer (1992). Spolehlivější, nicméně o nic méně pracnou metodou se jeví právě použití molekulárně biologických metod. Je známo, že hlavními mykobionty orchidejí jsou basidiomycety (Rasmussen 2002). Poněkud překvapující bylo prokázání přítomnosti druhu Epipactis, jakožto houbového symbionta zelených i nezelených zástupců druhu Epipactis microphylla (Selosse et al. 2004). Rovněž uvádí, že 74 % povrchu kořenů obsahovalo mykobionta Tuber spp., další zástupce askomycet. Využití molekulárně biologických metod (Dearnaley 2007) v posledních několika letech vedlo ke zjištění, že mixotrofní a plně mykoheterotrofní druhy orchidejí hostí jako mykorhizní houby bazidiomycety a askomycety, které běžně vytvářejí ektomykorhizy se stromy (Otero et al. 2004; McCormick et al. 2004; Taylor et al. 2003; Selosse 2002; Sen et al. 1999;). Zejména prokázání, že zástupci rodů Wilcoxina a Tuber vystupují jako symbionti u mixotrofních druhů orchidejí (Epipactis helleborine, E. atrorubens), bylo z hlediska taxonomického rozpětí houbových endofytů orchidejí velmi podstatné, neboť vedlo k rozšíření spektra OM hub o třídu Ascomycetes (Bidartondo et al. 2004). V mykorhizní ekologii se v poslední době s úspěchem používají metod terminální restrikce fragmentů délky polymorfismu (ang. terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP). Celé spektrum metod podali ve své práci autoři Dickie a FitzJohn. Rozlišují dva základní přístupy k těmto metodám: peak- profile methods T-RFLP a databáze metody T-RFLP. Pomocí této databáze je možné identifikovat jednotlivé druhy srovnáním neznámých druhů s druhy v databázi známých T-RFLP vzorků. Metoda je s úspěchem používána k aplikaci polyfyletických skupin hub, mezi které lze zařadit například ektomykorhizní houby (Dickie et FitzJohn 2007). 2.3 Mimokořenové mycelium U všech typů mykorhizních asociací, tedy i u OM, je možné rozlišit kořenové a mimokořenové mycelium (ERM). První typ mycelia, související s kolonizací kořenů mykorhizními houbami, byl v minulosti dostatečně probádán. Naproti tomu ERM bylo po dlouhou dobu, a to nejen u OM, opomíjeno. Zlomem ve studiu ERM zejména arbuskulární a ektomykorhizní mykorhizy byla 80. a 90. léta 20. století (Smith et Read 1997). Mimokořenové mycelium hraje v případě všech typů mykorhiz nezastupitelnou roli. U arbuskulární mykorhizy se ERM podílí zejména na sorpci fosforu ve formě fosfátových iontů. Fosfor je dále jako polyfosfát translokován do vnitřních mykorhizních struktur (Stribley 1987). Díky délce hyf, která je o dva (George et al. 1995) až tři (Cui et Caldwell 1996) řády 12

20 LITERÁRNÍ PŘEHLED vyšší než délka kořenů, má mykorhizní rostlina větší objem půdy na získávání tohoto prvku. Pozitivní vliv mykorhizy na růst rostlin související se zvýšeným příjmem imobilních prvků, zejména fosforu, byl zpracován ve studii, kterou publikoval Bolan (1991). V ní poukazuje na tři možné způsoby, jakými zvýšený příjem fosforu mykorhizními rostlinami probíhá: 1) pomocí hyf ERM je obsazen větší objem půdy, čímž se snižuje vzdálenost, kterou musí ionty fosforu urazit, aby se dostaly ke kořenům rostlin či k hyfám ERM; zároveň je absorpční povrch pro sorpci fosforu zvýšen o povrch hyf, 2) rychlejším transportem fosforu do hyf mycelia, a to jednak potencionálně vyšší afinitou mykorhizních hyf k fosforu oproti kořenům, a zároveň snížením prahové koncentrace potřebné pro danou absorpci, 3) zvyšuje se rozpustnost půdního fosforu pomocí organických kyselin a enzymu fosfatázy, který ERM produkuje (Bolan 1991). Obdobné mechanismy rostlina využívá pro zisk jiných málo mobilních elementů, jako jsou např. Cu, Cd, Zn apod., a dále na jejich translokaci do kořenů hostitelské rostlin (George et al. 1995). V případě OM je mycelium tvořeno víceméně přímými, poměrně často se větvícími a posléze anastomózujícími hyfmi a takzvanými moniliodními buňkami (blastosporami), které vytvářejí nejprve řetízky, jež se posléze větví a anastomózují, čímž vznikají shluky těchto buněk (řídká sklerocia). Zajímavý je rovněž výskyt do sebe spirálovitě stočených koncových hyf, které nacházíme jak u saprotrofních volných kultur mykorhizních hub, tak u mimokořenového mycelia (Gryndler et al. 2004). U OM byl prokázán vliv ERM na přenos sacharidů, fosforu a dusíku do kořenů hostitelských orchidejí. První experimentální práce zabývající se významem ERM pro OM se objevily v 70. letech (Smith 1967), autorka se v nich zaměřuje na přenos radioaktivně značených sacharidů z agarového média do dosud fotosynteticky neaktivních avšak plně mykorhizních protokormů Dactylorhiza purpurella. Experiment prokázal, že sacharidem, který je z houby do hostitele translokován, je trehalóza, což je sacharid vyskytující se pouze u hub. Další studie probíhající v 80. letech byla orientována na translokaci fosforu a dusíkatých látek ze symbionta do G. repens, která vytváří mykorhizní asociaci s endofytem Rhizoctonia goodyerae-repensis (Alexander et Hadley 1984). Ve svém experimentu srovnávali rostliny přirozeně mykorhizní a rostliny s mykorhizou potlačenou fungicidem thiabendazolem (TBZ). Prokázali, že rostliny s mykorhizní asociací měly výrazně vyšší rychlost růstu i hladinu fosforu a dusíku než rostliny ošetřené thiabendazolem. Tato látka zastavila růst ERM a tím i výrazně potlačila rychlost růstu hostitelských orchidejí, stejně jako obsah fosforu a dusíku v jejich pletivech. Ve stejném roce stejní autoři představili výsledky studie využívající radioaktivně značených 13

21 LITERÁRNÍ PŘEHLED látek. Neprokázali transport těchto látek do mycelia symbiotické houby (Alexander et al. 1984; Alexander et Haldey 1984). Prokázali, že mykorhizní rostliny v rozdílných stádiích vývoje měly významně vyšší rychlost růstu a hladinu fosforu a dusíkatých látek než rostliny kontrolní. Na mykorhizní rostliny opět aplikovali fungicid thiabendazole, který byl pro daný experiment rozpuštěn v okyselené vodě (ph 2,2) na koncentraci 1 μg ml -1. Autoři ve svých výsledcích uvádějí, že fungicid zpomalil růst ERM a rovněž způsobil značný pokles rychlosti růstu orchideje. Snížil se i obsah fosforu a dusíkatých látek, velikost kolonizace a také rychlost čisté asimilace (Alexander et Hadley 1984). O rok později Hadley provedl experiment na přenos sacharidů do nezelených protokormů stejného druhu jako v předchozí studii, v symbiotické asociaci s endofytem Ceretobasidium cornigerum (Hadley 1984). Do zelených rostlin však přenos sacharidů prokázán nebyl, dokonce ani po té, co byly rostliny umístěny ve tmě, tedy ve stresových podmínkám vzhledem k asimilátům. Fungicidní přípravek TBZ byl použit i v pozdější studii (Vallius 2001), kdy autorka použila k aplikaci TBZ o koncentraci 1 µg ml -1 injekční stříkačku. Do půdy vpravila roztok v množství 10 ml, a to do okolí kořenů pokusných rostlin prstnatce plamatého (Dactylorhiza maculata), aplikaci fungicidu zopakovala po 2 týdnech. I když výsledky tohoto experimentu postrádají jakoukoli kvantifikaci popisujícím míru účinku fungicidu na rozvoj OM symbiózy, autorka předpokládala, že tento přípravek na OM fungoval, což je zejména z důvodu použití malého množství roztoku fungicidu značně diskutabilní. Je zřejmé, že všechny tyto studie využívaly pro kvantifikaci vlivu ERM na příjem živin u dospělé orchideje kontrolní rostliny, které měly OM do jisté míry potlačenou s pomocí fungicidů Možnosti přípravy semimykorhizních rostlin Pro experimentální studium orchideoidní mykorhizy je většinou nutné připravit rostliny kontrolní, tedy takové, u kterých je mykorhizní vztah buď zcela (nemykorhizní rostliny), nebo z velké části potlačen (semimykorhizní rostliny). Pro studium mykorhizy se použití semimykorhizních rostlin jeví jako vhodnější, protože rostliny s částečně potlačenou mykorhizou se po fyziologické stránce více podobají mykorhizním, tedy reálným rostlinám (např. houba rostlině i nadále odčerpává část fotoasimilátů). Problematika přípravy rostlin zbavených mykorhizy je nejvíce prozkoumaná u arbuskulární mykorhizy a existuje více použitelných metod, jejichž srovnáním se zabývala 14

22 LITERÁRNÍ PŘEHLED Kahiluoto se spolupracovníky (2000). V podmínkách běžných kultivačních experimentů je u tohoto typu mykorhizy připravíme pouhým nezainokulováním (nenaočkováním) kultivačního média či substrátu, které samo musí být prosté mykorhizních hub. Sterilní půdu můžeme připravit fumigací, tedy aplikací par formaldehydu, desinfekcí parami chloroformu, působením vyšších teplot nebo gama záření. Experiment využívající pro přípravu kontrolních rostlin chloroform a vyšší teploty pochází z roku Po ošetření chloroformem a teplotou 60 C bylo prokázáno snížení mykorhizní kolonizace jitrocele kopinatého (Plantago lanceolata) na méně než 1% kořenové délky, při vyšších teplotách (80, 100 a 120 C) na méně než 0,2 % (Endlweber et Scheu 2006). Autoři rovněž přiznávají hlavní nevýhodu této metody, tedy neaplikovatelnost v rámci terénních studií. Stejně tak fumigace je pro toxický efekt dané látky omezena pouze na laboratorní účely. Rovněž další metody přinášejí jistá úskalí, a to zejména rozklad organické hmoty při působením tepla a možné uvolňování manganu do půdy při použití gama záření. Obě tyto metody lze ovšem s výhodou použít pro laboratorní účely. Mykorhiza v případě, že rostliny nezainokulujeme, zcela chybí a hovoříme o kontrolních nemykorhizních rostlinách. Semimykorhizní rostliny obecně získáváme použitím fungicidů na již mykorhizní rostliny. Obecně užívaný je v případě arbuskulární mykorhizy fungicid benomyl, popřípadě produkt jeho přirozeného rozkladu carbendazim. Fungicidy lze aplikovat i v terénních studiích, kdy jiný způsob přípravy kontrolních rostlin lze z technických důvodů použít jen stěží. V případě aplikace fungicidů dochází zejména k redukci rozvoje ERM, zatímco vnitrokořenové mycelium nemusí být působením fungicidu výrazněji ovlivněno (Hutson et Miyamoto 1998). Fungicidní přípravek benomyl v koncentraci 0,2 mg l -1 byl použit pro přípravu kontrolních rostlin i v experimentu s australskými terestrickými orchidejemi. Houbový symbiont rhizoktoniového typu izolován z jiných rostlin než orchidejí byl použit k symbiotickým testům klíčivosti orchidejí rodů Microtis, Diurus, Caladenia, Acianthis, Calochilus, Cryptostylis, Prasophyllum, Pterostylis a Therlymitra (Milligan et Williams 1998) Celé spektrum fungicidů využil ve svém experimentu Boogert, který aplikoval na patogenní houbu R. solani hned několik chemických látek - azoxystrobin, chlorothalonil, TBZ, cymoxanil a propamocarb, pencycuron, flutanonil (Boogert et Luttikholt 2004). S aplikací fungicidů u jiného typu mykorhiz než OM, se můžeme setkat v experimentu z roku Autoři použili Douglasku tisolistou (Pseudotsuga menziesii var. glauca), na kterou aplikovali nespecifický fungicid penconazole, pod komerčním názvem Topas (v koncentracích 0.5, 1 a 1.5 g l -1 ) a dále přípravek thiofanát-metyl, pod názvem Senator, který je specifický vůči askomycetám (v koncentraci 0.5, 1 a 1.5 ml l -1 ), jimi nejnižší použitá 15

23 LITERÁRNÍ PŘEHLED koncentrace je doporučována výrobcem. Tyto přípravky aplikovali ve formě zálivky zvlášť i ve vzájemné kombinaci na rostliny rostoucí v nesterilní lesní půdě. Podle jejich výsledků byla aplikace Topasu v koncentraci 0.5 g l -1 účinná natolik, že výrazně redukovala mykorhizní kolonizace z 56% a přípravek Senator o stejné koncentraci z 36%. I přes ne zcela přesvědčivé výsledky je bezesporu použití fungicidů obecně aplikovatelné při terénních studiích. Sami autoři uvádějí, že žádná koncentrace jimi použitých látek neovlivnila množství narostlé biomasy oproti kontrolním rostlinám (Teste et al. 2006). Jiný fungicidní přípravek a to benomyl, obecně nasazovaný proti AM houbám použila ve své práci i Allison (Allison et al. 2006). Téma přípravy semimykorhizních rostlin bylo již v minulosti tématem prací na půdě oddělení fyziologie a anatomie rostlin MU (Kyjovská 2007; Knotová 2003). Pro kvantifikaci rozvoje ERM je nutná jeho extrakce, která byla velmi ulehčena technikou vložené membrány (IMT), popsanou Balážem a Vosátkou (2001). Tato metoda je vhodná pro pozorování mycelia orchideoidních stejně jako arbuskulárních či erikoidních mykorhizních hub. Využívá nitrátcelulózovou nebo acetátcelulózovou membránu, která se vloží do mykorhizosféry hostitelských rostlin. Poskytuje výsledky ve formě délky mimokořenového mycelia na jednotku plochy dané membrány. Touto metodou bylo studováno mimo jiné mimokořenové mycelium mykorhizních hub vytvářející asociaci se dvěma přirozeně mykorhizními druhy Serapias lingua a Ophys vernxia. Značnou výhodou této metody je bezesporu snadná manipulace, kdy vlastním extrakčním a purifikačním krokem je vyjmutí filtru z mykorhizosféry (Gryndler et al. 2004). Po otestování této metody (mezi lety ) bylo cílem experimentů probíhající na OFAR kvantifikovat roli OM v příjmu minerálních živin u dospělých orchidejí. Studia byla zaměřena na kompetiční vztahy k okolní vegetaci a přenosy uhlíku z orchidejí do houby (Baláž, osobní sdělení). Pro možnou kvantifikaci, jak již bylo řečeno, jsou ovšem nutné kontrolní rostliny. Jedinou zmínkou v literatuře byly již výše zmiňované články z 80. let o použití fungicidu thiabendazolu (Alexander et Hadley 1984). Na základě výsledků těchto studií, kdy thiabendazole účinkoval velmi dobře, byl založen experiment, který měl tato tvrzení pouze potvrdit. Aplikován byl tedy thiabendazole a rovněž benomyl, o kterém se uvádí, že většinou nemá negativní vliv na basidiomycety, kam OM houby rhizoktoniového typu patří. Tento fungicid dokonce někdy bývá v nízkých koncentracích přidáván do média při izolaci OM hub. Naopak je často a s velmi dobrými výsledky používán na Glomeromycota tedy na arbuskulární mykorhizní houby. Myšlenka pro použití benomylu byla tedy taková, 16

24 LITERÁRNÍ PŘEHLED že při účinku pouze na AM a zároveň při nedotčení OM dojde k potlačení pouze jednoho typu mykorhizy. Tento fungicid se tedy jevil jako ideální pro terénní kompetiční experimenty. Do živného roztoku byl v jedné variantě přidán i propamocarb (pod komerčním názvem Previcur), který je specifický proti oomycetám. Dalo se tedy předpokládat, že houby vytvářející OM ovlivňovat nebude. Výsledky experimentů však některá z těchto očekávání nepotvrdily. V jednom případě bylo na vyextrahované ERM působeno v Petriho miskách po dobu 24 hodin, poté byla stanovena životaschopnost ERM pomocí vitálního barvení. Testován byl thiabendazole (o koncentraci 10mg ml -1 ), který výrazně snížil životaschopnost ERM. Další testované fungicidy, benomyl a propamocarb, oproti kontrole nezpůsobily žádnou změnu (Knotová 2003). V dalších dvou experimentech, uskutečněných s využitím rhizoboxových systémů, kdy ERM mělo vrůstat do kompartmentů, v nichž byl substrát nasycen roztokem příslušného fungicidu, byly ovšem docíleny výsledky poněkud odlišné. TBZ o koncentraci 10 mg ml -1 vrůstání ERM neinhiboval, naopak benomyl, stejně tak jako TBZ o koncentraci 50 mg ml -1 (testován pouze v jednom experimentu) vrůstání ERM silně omezil; propamocarb dle očekávání neměl negativní účinek na růst ERM (Baláž, osobní sdělení). V době těchto experimentů byl vydán článek (Kahiluoto et Vetberg 2000), který optimalizuje způsoby aplikace benomylu. Tento fungicid se váže na tubulin v cytoskeletu a narušuje tak dělení a růst mycelia, nepůsobí však na již narostlé mycelium. Jako nejvhodnější se tedy uvádějí aplikaci benomylu před nárůstem ERM, tedy před samotným formováním mykorhizní symbiózy. To objasňuje, proč benomyl v experimentech na OFAR při aplikaci na již narostlé mycelium v Petrino miskách nesnižoval jeho životaschopnost, a naopak souhlasí s jeho účinkem v prevenci vrůstání ERM do hyfoboxů (nehledě na fakt, že testovaná OM houba byla rhizoktonie, tedy basidiomyceta). Kahiluoto a Vetberg rovněž zmiňují minimální účinnou dávku aplikované látky (20 mg benomylu na kg půdy) a vhodnou metodu aplikace (zálivka oproti postřiku listů). Po získání opakované výrazné redukce růstu ERM po aplikaci benomylu byly ve sklenících OFAR nastartovány experimenty na (a) výměnu uhlíkatých látek monitorovanou pomocí δ 13 C (Baláž, osobní sdělení), (b) kompetice Serapias lingua a Plantago lanceolata (Kyjovská 2007). V obou experimentech byl použit benomyl (v koncentraci 1g aktivní látky na litr roztoku, jímž byl zcela prosycen pěstební substrát), který byl aplikován nikoli do laterálních hyfoboxů, ale přímo do mykorhizosféry hostitelských orchidejí. V obou případech benomyl OM houbu rhizoktoniového typu ovlivnil z hlediska produkce ERM pouze minimálně. 17

25 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.4 Fungicidy Ochrana rostlin proti napadení patogeny byla již v minulosti tématem řady výzkumů, a to z důvodu velkých ekonomických ztrát při napadení kulturních plodin. Příkladem nám může posloužit plíseň bramborová (Phytophthora infestans) napadající listy a plody rajčete. Významná epidemie byla zaznamenána v letech 1845 a 1846 v Irsku a následně v období 1916 a 1917 v Německu. Od té doby se plíseň bramborová v pravidelných intervalech objevuje na všech územích, kde se rajčata pěstují. Dalším významným rostlinným patogenem je Hemileia vastatrix napadající listy čajovníku a kávovníku (Hutson et Miyamoto 1998). Na regulaci chorob postihující rostliny byly vytvořeny nejrůznější metody. Obecně můžeme říct, že se jedná (1) o legislativní omezení přemisťování napadeného rostlinného materiálu z jednoho regionu na druhý, (2) zavedení takových kultivačních postupů, které by buď zcela zamezily styk rostliny s patogenem nebo by tuto možnost alespoň minimalizovaly, (3) pěstování na daný patogen rezistentních druhů (4) chemické ošetření jako ochrana proti nákaze. Dá se říci, že žádná metoda nenabízí rostlinám stoprocentně spolehlivou ochranu. V minulosti byly provedeny rozsáhlé výzkumy používající právě chemické látky. I když byly chemikálie s úspěchem aplikovány nejen jako ochrana proti houbám, ale i proti bakteriím, hlísticím a virům, jejich použití pro kontrolu chorob způsobených houbovými patogeny se zdá být oproti jiným výhodnější (Nene et Thapliyal 1993). Ačkoli skutečnost, že anorganické látky jako síra, sulfát měďnatý, chlorid rtuťnatý a sloučeniny s obsahem arsenu hrají významnou roli při regulaci chorob rostlin, byla známa již před rokem 1800, jako zemědělské fungicidy se tyto látky začaly používat až v 19. století. V této době byl do praxe uveden přípravek, dodávaný pod názvem bordeauxská směs (ang. Bordeaux mixture), obsahující směs vápna a síranu měďnatého, který se používal proti prachovým plísním hroznů. Zlomové období v této tématice nastalo ve 30. letech 20. století, kdy byly představeny první synteticky připravené organické fungicidy na bázi sloučenin rtuti. Od 60. let 20. století rozvoj fungicidů ještě vzrost a to zejména díky objevení systemických a tedy i více specifických fungicidů (Hutson et Miyamoto 1998). Termín fungicid vznikl spojením latinských slov fungus (houba) a ceado(zabít), doslova by tedy fungicidem bylo jakékoli působení, které by způsobilo smrt houbového patogenu. Podle tohoto pojetí by tedy do skupiny fungicidů náleželo i tepelné ošetření a ultrafialové záření. Nicméně v obecném užití je za fungicid brána chemická látka s touto schopností. Některé chemické látky pouze inhibují růst houby a po zamezení jejich přístupu je růst houby 18