Zhodnocení výsledků inseminace koní na vybraných inseminačních stanicích Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Zhodnocení výsledků inseminace koní na vybraných inseminačních stanicích Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: doc. Ing. Iva Jiskrová, Ph.D. Vypracovala: Bc.Vlasta Novohradská Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Zhodnocení výsledků inseminace koní na vybraných inseminačních stanicích vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické university v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Doudlebách nad Orlicí dne. Podpis diplomanta

3 PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat doc. Ing. Ivě Jiskrové Ph. D. za odborné vedení, metodickou pomoc a konzultace při zpracování této diplomové práce, Ing. Josefu Müllerovi (ERC Pardubice Mnětice) a paní Janě Kleszczové (Stáj MUSTANG s.r.o.) za poskytnutou plemenářskou dokumentaci. Dále bych chtěla poděkovat svým rodičům za trpělivost a podporu během studia.

4 ABSTRAKT Cílem práce bylo objasnění problematiky moderní biotechnologické metody umělé inseminace koní a srovnaní výsledků inseminace čerstvým spermatem Reprodukčního centra Stáj Mustang (RC Stáj Mustang) a Equinního reprodukčního centra v Pardubicích Mněticích (ERC Mnětice). V rámci ERC Mnětice byl hodnocen počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny za období sedmi připouštěcích sezón. Na základě vyhodnocení výsledků inseminace čerstvým spermatem za období je patrné, že ERC Mnětice dosáhuje lepších výsledků, než RC Stáj Mustang. Za sledované období zapustli hřebci ERC Mnětice o klisen více a úroveň březosti po inseminaci čerstvým seprmatem je vyšší o 11 % než po hřebcích RC Stáj Mustang. Přesto, že za námi sledované období ERC vyexpedovalo o ID více než RC Stáj Mustang, počet spotřebovaných ID na jednu březí klisnu je o 1 ID nižší. V rámci ERC Mnětice byl hodnocen počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny za období Získané hodnoty byly zpracovány metodou GLM. Na základě této metody jsme stanovili rozdíly mezi inseminací čerstvým a zmrazeným spermatem, při zohlednění efektů plemenná příslušnost hřebce, věk hřebce, připouštěcí sezóna a hřebec. Statisticky průkazně lepší je způsob inseminace zmrazeným spermatem, kdy za sledované období bylo zapotřebí 1,2 inseminací na zabřeznutí klisny, kdežto při inseminaci čerstvým spermatem bylo třeba 1,6 inseminací. Z výsledků vyplývá statisticky průkazný rozdíl mezi počtem inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a připouštěcí sezónou, kde nejvyšších hodnot dosahuje rok 2002 (1,7525) a naopak nejnižších rok 2006 (1,4573). Dále jsme zjistili statisticky průkazné rozdíly mezi holštýnským koněm a oldenburský koněm, haflingem, selle francais a westfálským koněm. Počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny statisticky průkazně ovlivňuje stáří hřebce (při inseminaci čerstvým spermatem), kdy se zvyšujícím se věkem hřebce stoupá počet inseminací potřebných na zabřeznutí. Klíčová slova: klisna, hřebec, plodnost, březost, inseminace, čerstvé sperma, zmrazené sperma, inseminační dávka

5 ABSTRACT The aim of my study was to demonstrate the problems concerning biotechnological insemination s method of horses and compare its results with inseminations by fresh sperm in the reproduction centre Mustang (RC Mustang) and the Equine reproduction centre in Pardubice-Mnětice (ERC Mnětice). In the ERC Mnětice was analysed the number of inseminations neccessary to fertilize a mare in seasons from 2002 to RC Mustang and ERC Mnětice were analysed from 2004 to ERC Mnětice has better results than RC Mustang in the insemination by fresh sperm. During the time of analyses the stallions of ERC Mnětice mated mares more than in RC Mustang and the stage of gravidity is higher by 11 % after insemination by fresh sperm, than the one achieved by stallions of RC Mustang. Althought the ERC expeditioned about ID more than RC Mustang during the time of analyses, the number of ID actually used to fertilize one mare is one ID less for each mare. In the ERC Mnětice was analysed the number of inseminations neccessary to fertilize a mare in seasons from 2002 to The data obtained was analysed by GLM. The differences were established between the insemination by fresh sperm and insemination by frozen sperm, breed, age of stallions, mating seasons and the individual stallions by the method of multiplicity s calibration. The number of inseminations needed to obtain gravidity and the influence of the mating season are statistically significant, the highest were reached in year 2002 (1,7525) and the lowest on the other hand in 2006 (1,4576). The statistically significant differences were found between the breeds: Holstein warmblood horse and Oldenburg warmblood horse, Hafling, Selle Francois and Westfalen horses. The frozen sperm insemination (1,2 ID/gravidity/mare) proved to be more successful method, than the one using fresh sperm insemination (1,6 ID/gravidity/mare). The age of stallion has a significant influence on the number of inseminations needed for gravidity of the mare (inseminations by fresh sperm). When the age of stalion increases, the number of inseminations neccessary to fertilit a mare increases too. Keywords: mare, stallion, gravidity, pregnancy, insemination, fresh sperm, frozen sperm, insemination s dosage

6 OBSAH 1. ÚVOD 9 2. CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Plodnost (fertilita) Plodnost klisen Plodnost hřebců Faktory ovlivňující plodnost Faktory vnitřního prostředí Dědičnost Druh, plemeno Stáří Faktory vnějšího prostředí Ekologické a klimatické podmínky Výživa Způsob chovu Management reprodukčního procesu Ostatní vlivy vnějšího prostředí Fáze estrálního cyklu Detekce říje Vyšetření zevních pohlavních orgánů Zkoušení hřebcem Vyšetření estrálního cyklu na základě hormonálních změn v krvi Vyšetření vnitřních pohlavních orgánů Rektální vyšetření vnitřních pohlavních orgánů Vyšetření pomocí sonografu Způsoby využití sonografu v reprodukci koní Plemenitba koní Plemenářský zákon v chovu koní 22

7 3.3.2 Metody plemenitby Čistokrevná plemenitba Křížení Technika plemenitby Způsoby plemenitby Umělá inseminace koní Historie inseminace Význam inseminace Výběr hřebců pro inseminaci Metoda inseminace Odběr spermatu hřebce Vlastnosti spermatu hřebce Vlastnosti a funkce spermie Rozměry spermie Zpracování hřebčího spermatu Čerstvé sperma Krátkodobá konzervace spermatu Postup při ředění spermatu Ředidla pro krátkodobou konzervaci Přeprava čerstvého spermatu Dlouhodobá konzervace spermatu Zmrazování spermatu Ředidla pro dlouhodobou konzervaci Rozmrazování spermatu Kvalita spermatu Stanovení doby inseminace Inseminace klisny Postup při inseminaci klisny MATERIÁL A METODIKA Charakteristika sledovaných reprodukčních center Equinní reprodukční centrum Pardubice Mnětice Zvířata Odběr a hodnocení spermatu Ředění spermatu 38

8 Expedice spermatu Inseminace klisen Služby poskytované ERC Mnětice Sledované ukazatelé Reprodukční centrum - Stáj Mustang s.r.o Zvířata Odběr a hodnocení spermatu Ředění spermatu Expedice spermatu Inseminace klisen Služby poskytované RC Stáj Mustang Sledované ukazatelé Statistické zpracování dat VÝSLEDKY A DISKUZE Hřebci zařazeni do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem Výsledky inseminace čerstvým spermatem za období 2004 až Úroveň březosti klisen po jednotlivých hřebcích 2004 až Výsledky inseminace zmrazeným spermatem 2004 až Výsledky inseminace ve sledu 1. až 3. říjového cyklu Počet inseminačních dávek za období 2004 až Zhodnocení inseminace čerstvým a zmrazeným spermatem Zhodnocení inseminace čerstvým spermatem Zhodnocení inseminace zmrazeným spermatem ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK A GRAFŮ PŘÍLOHY 77

9 1. ÚVOD Chov koní byl ještě počátkem minulého století jedním z důležitých činitelů v hospodářském životě, neboť použití koně bylo velmi rozsáhlé a nenahraditelné na důležitých výrobních úsecích. V 50. letech, kdy proběhla modernizace a technický rozvoj v průmyslu, zemědělství a zároveň i v celé společnosti, se používání koní snížilo. Význam chovu koní přetrvává a dále se rozvíjí ve sportovních aktivitách, agroturistice a v zájmové činnosti z hlediska využití volného času. V současné době, kdy jsou koně využíváni hlavně ve sportovních činnostech, je nutno zaměřit plemenářskou práci na vyšlechtění kvalitních výkonných koní specializovaných na jednotlivé sportovní disciplíny, z nichž nejlepší budou schopni úspěšně obstát v mezinárodní konkurenci. V posledních několika letech je do České republiky dováženo mnoho zahraničních hřebců, kteří by zde měli působit jako zlepšovatelé a postupně pozdvihnout kvalitu našeho chovu na evropskou úroveň. Jednou z možností, jak přispět k produkci kvalitních koní se stala umělá inseminace, která se řadí mezi moderní biotechnologické metody, využívané v reprodukci a šlechtění koní. V dnešní době se inseminace stala nedílnou součástí plemenářské práce v chovu koní, kde se využívá imigrace genů a zvýšení genetického pokroku v chovu špičkových sportovních koní. Účelem naší práce, je přiblížit metodu inseminace koní a zhodnotit její výsledky na vybraných inseminačních stanicích. 9

10 2. CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je: - objasnit problematiku metody umělé inseminace koní - porovnat výsledky inseminace koní na vybraných inseminačních stanicích - posoudit efekty, které ovlivňují počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny. 10

11 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Plodnost (fertilita) Podle VOHRADSKÉHO (1980) je plodnost základní biologická vlastnost živých organismů, umožňující jejich rozmnožování a tak zachování jejich druhu. Je určována dědičným založením a působením faktorů zevního prostředí. Určit však přesně podíl dědičnosti a zevního prostředí na formování plodnosti u jednotlivých druhů zvířat je velmi obtížné. Ukazuje se, že plodnost a zejména pak stupeň plodnosti jsou z 80 % určovány existenčními podmínkami zvířat, tj. působením činitelů vnějšího prostředí (LOUDA a kol., 2001) Plodnost klisen Plodnost klisen je třeba posuzovat jako schopnost produkovat oplozeni schopná vajíčka, pravidelně zabřezávat a rodit normálně vyvinutá životaschopná hříbata do co nejvyššího věku. DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) rozlišují plodnost potencionální a plodnost reálnou. Potencionální plodnost je schopnost samice vytvářet gamety schopné oplození bez ohledu na jejich další osud. Reálná plodnost je pak skutečný výsledek a porod zdravých mláďat za určitou dobu. Je vždy nižší než plodnost potencionální v důsledku zániku gamet vlivem nepříznivého působení faktorů vnějšího prostředí. U klisen je výrazem dobré plodnosti pravidelné zabřezávání a porod jednoho zdravého mláděte každým rokem (KOPECKÝ a kol., 1997). V chovu se rodí 1% dvojčat, která nejsou žádoucí. DUŠEK (1999) plodnost klisen hodnotí počtem hříbat ve vztahu k délce jejího působení v chovu a vyjadřuje ji v procentech. Při hodnocení plodnosti klisen v hřebčinském chovu v celém období jejich chovného využití se považuje hodnota 66 % za přijatelnou, hodnoty v rozsahu % za příznivé a hodnoty vyšší nad 74 % za velmi příznivé, hodnoty přesahující 80 % jsou pak vynikající. Klisny, které ve svém dlouholetém chovném využití (např. 15letém i vyšším) daly každým rokem hříbě, jsou zcela výjimečné a staly se v chovu legendami (DUŠEK, 1999). 11

12 3.1.2 Plodnost hřebců Plodnost hřebce je podle VOHRADSKÉHO (1980) schopnost páření a produkce oplození schopného semene do vysokého stáří. DUŠEK (1999) plodnost hřebce posuzuje podle počtu zapuštěných a gravidních klisen a uvádí ji v procentech. Při hodnocení plodnosti hřebců působících v zemském chovu je nutné přihlédnout ke kvalitě klisen v příslušné oblasti. Stejně jako u klisen je i plodnost hřebců ovlivňována mnoha činiteli, jako jsou plemenná příslušnost, výživa, stáří, pohyb, klima a roční doba. Důležitou úlohu v plodnosti hřebců má i jejich individualita daná dědičným založením (KOPECKÝ a kol., 1977) Faktory ovlivňující plodnost Aby bylo v chovu koní dosahováno vysoké plodnosti klisen a vysoké oplozovací schopnosti spermií hřebce, je třeba brát v úvahu všechny faktory, které mohou ovlivnit reprodukční funkce. Plodnost stejně jako každá užitková vlastnost je v pozitivním i negativním smyslu ovlivňována genetickým základem, nebo-li činiteli vnitřního prostředí a existenčními podmínkami tzv. činiteli vnějšího prostředí. Opakem plodnosti je snížená plodnost (subfertilita) a nebo úplná neplodnost (infertilita) (GAMČÍK a KOZUMPLÍK, 1984) Faktory vnitřního prostředí Dědičnost Plodnosti je vlastnost polygenně založená a nelze ji oddělovat od dědičnosti konstituce. Ta je ve své podstatě zděděnou vlastností organismu přizpůsobovat se podmínkám zevního prostředí. Fyziologický průběh celkové sexuální aktivity je podmíněn a určován reaktivností, přizpůsobivostí a výkonností nervového systému, žláz s vnitřní sekrecí a stabilitou jejich produktů, které kontrolují a udržují vnitřní rovnováhu organismu, včetně pohlavních funkcí (KOPECKÝ a kol., 1977). DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) uvádějí, že u jedinců konstitučně pevných, tj. se stabilním neuroendokrinním systémem lze očekávat vysokou schopnost vypořádat se i s nepříznivými podmínkami a udržet si sexuální funkce na normální úrovni. Naopak u jedinců konstitučně slabých, s labilním neuroendokrinním systémem a nedostatečnou přizpůsobivostí dochází snadněji a dříve k poruchám sexuální aktivity a snížení plodnosti. 12

13 Podle dosavadních šetření je dědivost plodnosti poměrně nízká a kolísá od 10 do 20 %. Z toho vyplývá, že o plodnosti rozhodují především činitelé vnějšího prostředí. Ukazuje se, že dědivost všech složek ovlivňujících plodnost není stejná a zvláštní postavení zaujímají dědičné poruchy plodnosti, způsobující subfertilitu nebo úplnou sterilitu (KLIMENT a kol., 1983). Při nesprávné organizaci reprodukčního procesu koní by mohlo dojít k jejich značnému rozšíření a vážnému ohrožení výsledků chovu (KOPECKÝ a kol.,1977) Druh, plemeno Druh představuje základní určité formy pohlavní aktivity. Skutečný výraz pohlavní aktivity je však výsledkem interakce s řadou faktorů vnějšího prostředí. V rámci druhu je pohlavní aktivita nejvýrazněji ovlivňována plemennou příslušností. Podle PYTLOUNA (1994) je plodnost plemennou vlastností, u primitivních plemen koní je vyšší než u plemen kulturních. Obecně lze říci, že příznaky říje u klisen teplokrevných jsou zpravidla výraznější než u klisen chladnokrevných (KUDLÁČ, 1987), přičemž u klisen lehkých plemen bývá říje kratší než u plemen těžších (DUŠEK, 1992). Od hřebců chladnokrevných plemen je získáván větší objem ejakulátu než od hřebců teplokrevných plemen a to zhruba o jednu třetinu (MÁCHAL, 2009) Stáří Pohlavní dospělost koní (puberta), charakterizuje začátek činnosti pohlavních žláz tzn. varlata tvoří spermie, vaječníky tvoří vajíčka a objevují se pohlavní reflexy. Nástup puberty je vysokou mírou ovlivněn výživou i jinými vlivy vnějšího prostředí. Podle mnoha autorů (DUŠEK, 1999; ROB a HERČÍK, 1987; MÜLLER, 1999) v pohlavní dospělosti koně nelze zařazovat do plemenitby, protože nejsou tělesně vyspěli. Pohlavní dospělosti jak uvádí DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) klisny dosahují v měsících věku, ale podle BUITENA a WESTERSE (2003) jsou klisny pohlavně dospělé v měsících. Hřebci pohlavní dospělosti dosahují dříve než klisny, podle MAJZLÍKA (2004) v měsících, ale MÜLLER (1999) uvádí, že pohlavní dospělost u hřebců nastává v měsících věku. V chovatelské dospělosti tj. klisny v měsících, hřebci v měsících se zařazují do plemenitby kde zůstávají klisny do let a hřebci do 30. let, což je horní hranice jejich plodnosti (MÜLLER, 1999). 13

14 Vliv stáří se u klisen projevuje rovněž v obnovení pohlavní aktivity po porodu. U mladších klisen probíhá poporodní regenerace pohlavních orgánů rychleji než u klisen starších Faktory vnějšího prostředí Faktory vnějšího prostředí a celkové existenční podmínky mají rozhodující úlohu a plodnost ovlivňují minimálně z 80 %. Jedná se o soubor faktorů, ze kterých se skládá vnější prostředí, které neustále ovlivňuje každého jedince a jimž se musí neustále přizpůsobovat. Na sexuální aktivitu a plodnost působí prostřednictvím smyslových orgánů a přes kůru mozku ovlivňují hypotalamo-hypofyzárněovariální systém. Výsledný efekt vlivů zevního prostředí na pohlavní aktivitu koní je vždy dán jejich intenzitou, délkou působení faktorů a přizpůsobivostí (konstitucí) organismu (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1997) Ekologické a klimatické podmínky Z klimatických činitelů má vztah k plodnosti především podnebí a roční období, světlo, teplota, tlak vzduchu, vlhkost, proudění vzduchu ale i znečištění ovzduší. Světlo je nejvýznamnějším faktorem zevního prostředí, které působí regulačně na pohlavní činnost zvířat. Ovlivňuje funkci gonád prostřednictvím hypotalamo-hypofyzárního systému. Především se uplatňuje intenzita a délka doby působení světla. Zásluhou zlepšené a rovnoměrné výživy v průběhu celého roku u většiny druhů plemenic se stal vliv světla na pohlavní činnost méně významným. Přesto však můžeme pozorovat, že u klisen se říje dostavuje v pozdní zimě nebo časně na jaře s prodlužujícím se dnem. Přibližný termín nástupu a ukončení sezóny kolísá podle vzdálenosti od rovníku (zeměpisná šířka) a v důsledku toho i rozdílností fotoperiody. Denní délka (fotoperioda) je na rovníku přibližně 12 hodin po celý rok. Čím dále na sever či na jih od rovníku, tím výraznější je zimní anestrus. Například klisnám importovaným z Evropy a chovaným v severní Africe již chybí zřetelná anestrální perioda. Naopak, u arabských klisen chovaných v Evropě se může vyvinout sezónní anestrie (WINTZER, 1999). Podle DÖCKEHO (1982) a KUDLÁČE (1987) fotoperiodismus vyjádřený délkou světelného dne působí na hypotalamo-hypofyzární systém a vyvolává pulsativní sekreci gonadotropních hormonů, které stimulují růst folikulů. Sezónní vlivy v souvislosti s délkou dne se zabývali např. BILAŇSKÝ (1972) a ASBURY (1982). 14

15 Zjistili, že největší procento výrazných říjí provázených ovulací (více jak 90 %) lze zaznamenat v polovině července, tj. v období nejdelších světelných dní v roce, zatímco v prosinci až únoru ovulovalo pouze 10 až 20 % klisen. Teplota je v průběhu ročního období v závislosti na zeměpisné šířce velmi proměnlivý faktor. Obecně se má za to, že stálé horké léto působí na fertilitu nepříznivěji než intermitující vysoké a nízké teploty. Rovněž extrémně nízké teploty vedou ke snížení pohlavních funkcí a plodnosti zvířat. Roční doba ovlivňuje plodnost zvířat především prostřednictvím periodicky se opakujících změn v délce dne, teploty a úrovně výživy. Mikroklima stájí rovněž významně ovlivňuje plodnost zvířat. Vysoká relativní vlhkost ve stáji, vysoká teplota a silné proudění vzduchu působí na plodnost nepříznivě. Jako optimální hodnota pro teplotu ve stáji se zřetelem na plodnost je udáváno +12 C, pro relativní vlhkost méně než 75 % (KUDLÁČ a ELEČKO, 1987). Barometrický tlak vzduchu a vliv některých meteorologických faktorů v závislosti na plodnost zvířat se dosud nijak nehodnotil a k dispozici je málo exaktních pozorování. Nižší barometrický tlak, časté dešťové srážky a některé faktory počasí mohou do jisté míry reprodukční funkce ovlivňovat. Dnes se ví málo o účinku znečištění ovzduší na reprodukci. Známe jsou vlivy oxidu uhličitého na sníženou kvalitu ejakulátu. Nahromadění insekticidů, herbicidů a dezinfekčních přípravků v půdě může být také potencionálním nebezpečím na reprodukční funkce zvířat (GAMČÍK a KOZUMPLÍK, 1984) Výživa Výživa významně ovlivňuje sexuální aktivitu a plodnost koní, uplatňuje se ve všech fázích reprodukčního cyklu. Nedostatečná a nesprávná výživa zhoršuje plodnost, popřípadě způsobuje sterilitu. U březích klisen způsobuje nedostatečná a biologicky neplnohodnotná výživa vyšší embryonální úmrtnost a sníženou životnost narozených hříbat. Z hlavních organických živin jsou pro udržení dobré plodnosti důležité plnohodnotné stravitelné bílkoviny. Bílkoviny jsou důležité i pro produkci semene, které je v podstatě tvořeno dusíkatými látkami. Vyrovnaný obsah bílkovin zlepšuje kvalitu semene, především jeho koncentraci a rezistenci spermií (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1987). Překrmování bílkovinami může snížit pohlavní aktivitu, množství ejakulátu, úroveň zabřezávání a zvýšit embryonální mortalitu. Poruchy plodnosti může zapříčinit i nevyrovnanost mezi bílkovinami a sacharidy. Pokud jde o glycidy má být jejich množství v krmné dávce přiměřené a v odpovídajícím poměru k obsahu stravitelných dusíkatých látek. 15

16 Naproti tomu po ohřebení je třeba klisnám zajistit přísun pohotové energie, aby vyrovnaly poporodní úbytek na živé hmotnosti a mohly znovu úspěšně zabřeznout (ZEMAN a kol., 2006). Vliv na hormonální produkci a plodnost byl rovněž prokázán u řady minerálních látek. Z minerálních látek jsou důležitý vápník a fosfor u nichž kromě množství je důležitý zvláště poměr. Z ostatních minerálních látek mají pro plodnost význam sodík, draslík, železo a ze stopových prvků kobalt, měď, mangan a jód. Z vitamínů působí na plodnost vitamín A a jeho provitamín karoten i vitamín D, vitamín E a ostatní vitamíny mají u koní vliv podružný. Obecným požadavkem na krmnou dávku, pro plemenné jedince všech druhů hospodářských zvířat, který uvádí mnoho autorů se zřetelem na dobrou pohlavní aktivitu je, aby krmná dávka byla dostatečně velká, obsahovala všechny potřebné živiny ve správném poměru, byla biologicky plnohodnotná a přirozeně pestrá a chutná. Vedle kvalitativních chyb v krmení se na činnosti pohlavního ústrojí negativně uplatňují i kvantitativní nedostatky ve výživě na čemž se shoduje MÜLLER (1999) i DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997). Výživa ve vysoké míře ovlivňuje i dobu pohlavní dospělosti v období odchovu, čím je výživa intenzivnější, tím dříve zvířata pohlavně dospívají. Při chudší nebo nedostatečné výživě není pohlavní dospívání zastaveno, ale pouze zpomaleno. Předpokládá se negativní vliv výživy, který se projevuje až v extrémních podmínkách nevyvážené stavy zapříčiňující kachexii nebo obezitu. Průběh březosti u všech samic hospodářských zvířat je úrovní výživy ovlivněn až za extrémních podmínek nedostatečné dotace živin. Úroveň výživy spolehlivě ukazuje tělesná kondice a zvlášť vrstva podkožního tuku Způsob chovu VOHRADSKÝ (1980) uvádí, že způsob chovu ovlivňuje reprodukci v těsné interakci s dalšími faktory jako je roční období a výživa. Spolupůsobícím faktorem je možnost pohybu. U všech hospodářských zvířat možnost přiměřeného a pravidelného pohybu příznivě ovlivňuje pohlavní aktivitu a snižuje výskyt reprodukčních poruch. Jde především o rychlejší průběh rekonvalescence po porodu, časnější nástup pohlavního cyklu a jeho standardnější průběh. Pravidelný pohyb působí u plemenných hřebců příznivě na pohlavní aktivitu a produkci semene, dále též na udržení chovné kondice (KOPECKÝ a kol., 1977). Ideální pro chované klisny je pobyt s ostatními klisnami nebo valachy ve stádě na pastvě. Toto prostředí nejlépe stimuluje přirozené prostředí, ve kterém se koně vyvíjeli. Je li klisna v izolaci vnější projevy říje jsou jen obtížně pozorovatelné a tím se snižuje úspěšnost inseminace v terénu a zvyšují se náklady. 16

17 Dalším spolupůsobícím faktorem v rámci způsobu chovu je přítomnost hřebce ve stáji, která pozitivně působí na pohlavní aktivitu klisen. Pozitivní účinek však vykazuje časově ohraničený kontakt. Nepřetržitá přítomnost hřebce může naopak aktivitu klisen snížit (LOUDA a kol., 2001). Koncentrace zvířat, možnost vzájemného kontaktu a sociální postavení také ovlivňují pohlavní aktivitu. U společně žijících zvířat lze zaznamenat synchronizaci nástupu říje. Blízkost říjící se klisny indukuje říji i u neříjících se klisen. Za toto ovlivnění jsou pravděpodobně zodpovědné feromony. Způsob odchovu mláďat představuje další faktor podílející se v rámci způsobu chovu na ovlivňování pohlavní aktivity (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1997) Management reprodukčního procesu Člověk a jeho zásahy do organizace a realizace reprodukčního procesu mohou být závažným faktorem ovlivňující rozpoznání říje, určení vhodné doby inseminace a úrovně koncepční schopnosti (VOHRADSKÝ, 1980). Nejlépe to dokládají odlišné výsledky v zabřezávání klisen při různém způsobu jejich zapouštění. V podmínkách umělé inseminace je březost po první inseminaci cca o 1/3 menší než při volném páření (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1997). Je to důsledkem toho, že člověk se dopouští chyb při určování a výběru říjících se klisen a vlastní inseminace se provádí v nevhodnou dobu. Negativně se uplatňují i nedostatky v evidenci zvířat a zejména v evidence jejich pohlavní aktivity Ostatní vlivy vnějšího prostředí Reprodukční funkce jsou dále ovlivňovány celou řadou dalších faktorů vnějšího prostředí, zejména transportem, změnou místa, aklimatizací a složením ustájených zvířat, velikostí stáda, vzrušením a vůbec nepříznivými psychickými vjemy. Zejména hrubé zacházení s následnými bolestivými vjemy vyvolávají stresovou situaci a negativně ovlivňují pohlavní aktivitu a následně i plodnost. Neméně významný je i požadavek hygienických zásad chovu. Nezbytné je ošetření klisny po porodu a důkladná dezinfekce. Zavlečení mikroorganismů do pohlavního ústrojí umožňuje vznik zánětu pohlavních cest a ohrožuje další plodnost, každé narušení zdravotního stavu může negativně ovlivnit pohlavní aktivitu (GAMČÍK a KOZUMPLÍK, 1975). V případě provádění inseminace, zabřezávání klisen ovlivňuje kvalita inseminační dávky a zkušenost inseminačního technika. 17

18 Inseminační dávka by měla být odpovídající a od prověřeného dodavatele nebo v případě zmrazených inseminačních dávek od akreditované firmy. U inseminačního technika je rozhodující jeho zkušenost a vybavenost sonografem. Je průkazné, že s použitím sonografu se zvyšuje úspěšnost inseminace a ekonomika procesu zabřezávání (GRYGAR a KUDLÁČ, 1997). 3.2 Fáze estrálního cyklu klisny DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) a ASBURY (1982) sexuální aktivitu nebřezích klisen rozdělují na tři základní stádia: estrus, diestrus a anestrus. Estrus, neboli vlastní říje, je charakterizována dozráváním jednoho nebo více folikulů na vaječnících a následnou ovulací. V ovulační jamce na místě prasklého folikulu se začíná vytvářet žluté tělísko produkující progesteron. Prudký pokles hladiny estrogenů, spolu s začínajícím vzestupem progesteronu vyvolává prudké změny v sexuálním chování. V průběhu jedné říje dozrává a ovuluje zpravidla jeden folikul. Podle LOUDY a kolektivu (2001) dochází k ovulaci hodin před vymizením zevních příznaků říje. ASBURY (1982) uvádí, že doba ovulace je ve vztahu k estru proměnlivá a je praktiky nemožné odhadnout dobu ovulace pouze z průběhu říje. Diestrus, čili období mezi dvěma říjemi, je charakterizováno dorůstáním žlutého tělíska a dokončením změn na endometriu k eventuálnímu přijetí a výživě oplozeného vajíčka. Diestrus trvá normálně v průběhu 15. dnů (12 16). Anestrus, (fáze klidu) je obdobím sexuální inaktivity. V našich podmínkách jej zjišťujeme téměř u všech klisen v zimních měsících. Za patologických podmínek může být anestrus navozen při poruchách zdravotního stavu a při působení nepříznivých podmínek vnějšího prostředí (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1997) Detekce říje Z biologického hlediska je klisna schopná porodit hříbě každý rok. A však při délce gravidity v průměru 333 dní jsou požadavky chovatele na narození hříběte v časných jarních měsících a s ohledem na ekonomiku chovu je zřejmé, že tento náročný požadavek lze splnit jedině připouštěním klisen v co nejvhodnější době pro zabřeznutí, 18

19 to znamená krátce před ovulací, což předpokládá správnou detekci říje a současného posouzení její fáze a kvality, tj. detekce a predikace ovulace (VOHRADSKÝ, 1980) Vyšetření zevních pohlavních orgánů Nejstarší, nejznámější a v široké míře dosud využívanou metodou detekce říje je sledování jejich zevních příznaků, které zahrnují změny v chování a změny na zevních pohlavních orgánech. V průběhu diestru se klisna k hřebci chová odmítavě. Tato neochota k páření se u jednotlivých klisen projevuje s různou intenzitou. Některé klisny se stávají až agresivními, jiné jeví nezájem či mírný zájem. V říji klisna často močí, stojí rozkročená s podsazenými zadními končetinami a zvednutým ocasem a blýská. Klisna rovněž často řehtá, projevuje neochotu k práci. Ve výběhu nebo při volném ustájení vyhledává druhé koně, tlačí se na ně zádí a někdy na ně i skáče. Při čištění nebo doteku na slabiny se tiskne na ošetřovatele. Stydké pysky jsou zduřelé, vestibulární sliznice je vlhká a silně prokrvená. Někdy lze pozorovat výtok menšího množství táhlého hlenu z vulvy. Rovněž tělesná teplota klisny v estru je vyšší než u diestrálních a březích klisen (KUDLÁČ, 1987) Zkoušení hřebcem Změny v sexuálním chování se projevují nejvýrazněji v přítomnosti jiných koní, zejména v přítomnosti hřebce. Klasickou metodou, založenou na této zkušenosti je tzv. zkoušení, neboli zjišťování říje u zkušební stěny. Na základě chování klisny při kontaktu s hřebcem je možno odlišit 4 stádia říje: 1. stádium - příznaky říje jsou nevýrazné klisna je neklidná a odbíjí hřebce 2. stádium - příznaky říje jsou zřetelnější, klisna stojí klidně a objevuje se blýskání 3. stádium - klisny se tlačí na zkušební stěnu a příznaky říje jsou výrazné 4. stádium - klisna se tlačí na zkušební stěnu, příznaky říje jsou velmi zřetelné a je obtížné klisnu odvést od hřebce (BÍLEK, 1955) Vyšetření fáze estrálního cyklu na základě hormonálních změn v krvi K přesnějšímu určení stádia reprodukčního cyklu klisen slouží monitorování hormonálních změn v krvi (eventuelně i v moči), které jsou přímým odrazem ovariálního cyklu. Progesteron vykazuje výrazný vzestup ode dne ovulace a své maximální koncentrace (6-15 ng/ml plasmy) dosahuje den po ovulaci. 19

20 Výrazný pokles (na úrovni nižší než 1 ng/ml plasmy) nastává pak na počátku říje a trvá až do ovulace. Pokud klisna zabřezla zvýšená hladina progesteronu je udržována po celou dobu březosti. Z uvedeného vyplývá, že sledování koncentrace progesteronu lze s úspěchem využít k detekci říje a gravidity, ale pro určení doby ovulace velký význam nemá (DOLEŽEL a KUDLÁČ, 1997) Vyšetření vnitřních pohlavních orgánů Tato skupina vzájemně se doplňujících se metod zahrnuje adspekci a palpaci vaječníků, dělohy, děložního krčku, pochvy a vyšetření vaginálního a cervikálního hlenu. Vaginoskopie je prováděna pomocí spekulu, které umožňuje roztažení a osvětlení vaginy. Toto vyšetření má dvojí význam: - přispívá k určení fáze pohlavního cyklu - lze při něm snadno zaznamenat anatomické a traumatické abnormality (SCHULZ, 1988). Sledujeme zejména barvu, lesk a povrch vaginální sliznice, nastříknutí cév, množství a charakter sekretu, uložení zevní děložní branky, velikost a uspořádání řas a výtok z děložního krčku. Vaginoskopie je jednou ze základních metod vyšetření reprodukčních funkcí. Avšak při častém vystavení sliznice atmosférickému vzduchu dochází ke zvýšenému dráždění a zápalu sliznice. To má velký význam zvláště u starších klisen, které mají sníženou rezistenci vůči patogenům (ASBURY, 1982) Rektální vyšetření vnitřních pohlavních orgánů Cenné a značně objektivní informace lze získat rektální palpací vnitřních pohlavních orgánů. Toto vyšetření poskytuje přesný obraz o jejich stavu a umožňuje přímo zaznamenat morfologické změny, které kladně korelují s fází cyklu nebo jsou odrazem patologických procesů. Vyšetření se provádí rukou zavedenou přes rektum do tlustého střeva klisny. Přes stěnu střeva je pak možné palpovat jednotlivé pohlavní orgány (KUDLÁČ a ELEČKO, 1987). Podle BILAŇSKÉHO (1972) z hlediska určení optimální doby pro zapuštění má největší význam vyšetření vaječníků, neboť výrazné palpovatelné změny jejich tvaru, velikosti a konzistence nejvíce korelují s fází říjového cyklu. 20

21 Vyšetření pomocí sonografu Sonografie je moderní diagnostická metoda, která využívá vysokofrekvenční zvukové vlny k mapování orgánů a tkání. Umožňuje pohled do nitra těla bez použití chirurgických nástrojů. Podle MÜLLERA (2006) lze touto metodou vyšetřovat přesně anatomickou strukturu reprodukčních orgánů a zhodnotit jejich reprodukční funkci. Jedinečnost metody sonografie spočívá rovněž ve skutečnosti, že výsledky jsou známy okamžitě, jsou objektivní a mohou být dokumentovány jak staticky (fotografie), tak dynamicky (videozáznam). Sonografie pracuje na principu vysílání a příjmu ultrazvukového vlnění. To je na obrazovce znázorněno jako obraz vyšetřované tkáně nebo orgánu. Echosturktura vyjádřena v různé škále odstínů šedi od bílé po černou. Tekutiny ultrazvukové vlny neodrážejí, jsou anechogenní a jsou znázorněny černě. Naopak tkáně ultrazvukové vlny odrážejí a jsou echogenní. Echogenita tkání je různého stupně. Hypoechogenita je vyjádřena škálou šedé barvy, hyperechogenita bílou barvou např. kost (GRYGAR a KUDLÁČ, 1997) Způsoby využití sonografu v reprodukci klisen Diagnostika rané gravidity sonografií je možné zjistit výsledky inseminace nebo připuštění podstatně dříve než rektální palpací. Předností je rovněž skutečnost, že při určení jalovosti lze vyšetřit další vnitřní reprodukční orgány, zejména vaječníky a usoudit tak na některé možné příčiny neplodnosti. Ovariální diagnostika u klisen má praktický význam, poskytuje objektivní obraz o stádiu estrálního cyklu, umožňuje přesně zjistit růst folikulu až do předovulačního stádia. Tato skutečnost je velmi důležitá z hlediska správného načasování doby inseminace. Vyšetření dělohy podle sonografického obrazu dělohy lze určit stádium estrálního cyklu klisny. Důležitá je i involuce dělohy, ke které dochází 23. den po ohřebení. Sonograficky lze bezpečně zjistit záněty dělohy, dále tzv. uterinní cysty, které se tvoří hlavně u starších klisen. Sonograficky se mohou zjistit v děloze výrazné echogenní struktury. Jedná se velmi často o zbytky mumifikovaných plodu (PYCOCK, 2002). Určení pohlaví plodů březích klisen určení pohlaví se provádí vyšetřením genitálních hrbolů. Spolehlivost výsledků je téměř 100 %. 21

22 Studium pohlavních funkcí a poruch plodnosti u samců stále častěji se sonografie používá k vyšetření poruch spermiogeneze samců. Jedná se především o vyšetření varlat a přídatných pohlavních žláz. Výzkum řízení pohlavních funkcí stále častěji se ultrasonografie objevuje v metodikách výzkumných úkolů z biotechnologie reprodukce. Umožní zachytit změny, k nimž dochází na pohlavních orgánech. Z tohoto hlediska se jedná o zefektivnění výzkumu reprodukce (GRYGAR a KUDLÁČ, 1997). 3.3 Plemenitba koní Plemenitba je záměrné rozmnožování hospodářských zvířat podle specifických chovných záměrů, podmíněných jejich využitím v hospodářské či společenské sféře (MISAŘ a JISKROVÁ, 2001). Podle DUŠKA (1999) je cílem plemenářské práce udržení a zlepšení chovných populací plemen. Výběrová kritéria jsou zaměřena na užitkovost a exteriér. Význam obou vyplývá z chovného cíle, který je definován ve šlechtitelském programu, který určuje metodické zaměření chovu. Zatímco dříve byla dlouhodobě u četných plemen základem chovu selekce podle exteriéru, v poválečné době se hlavní těžiště selekce posunulo na užitkové vlastnosti, tedy na výkonnost. Ostatní užitkovost v našich podmínkách prakticky nepřipadá v úvahu Plemenářský zákon a chov koní Účelem plemenářského zákona č. 154/2000 Sb. vyhlášky č. 357/2001 Sb. je mimo jiné stanovit jasná pravidla pro uznávání chovatelských sdružení, která šlechtí jednotlivé populace plemen hospodářských zvířat včetně vedení plemenných knih. Dále zákon stanovuje pravidla pro udělování souhlasu k výkonu některých činností z oblasti šlechtění a plemenitby hospodářských zvířat. Jedná se o kontrolu užitkovosti, výkonnostní zkoušky, výkonnostní testy a posuzování, ověřování a osvědčování původu a stanovování genetického typu plemenných zvířat, provozování inseminačních stanic a stanovování středisek pro přenos embryí (MACHEK, 2002) Metody plemenitby MISAŘ a JISKROVÁ, (2001) uvádí, že nejčastější metodou plemenitby v chovu koní jsou různé formy čistokrevné plemenitby a v menším rozsahu modifikace křížení. 22

23 Čistokrevná plemenitba Čistokrevná plemenitba představuje připařování klisen a hřebců stejného plemene. Jejim cílem je homogenizovat plemeno v rozhodujících morfologických a fyziologických vlastnostech a dosáhnout jejích dědičného ustálení natolik, aby rodiče předávaly své vlastnosti potomstvu. Nejtypičtější čistokrevná plemenitba je používána u plemen s uzavřenou plemennou knihou (anglický plnokrevník, arabský kůň) Křížení V zootechnickém pojetí představuje křížení páření jedinců pocházejících z různých populací. V chovu koní má dvojí podobu: - meziplemenné křížení kombinují se vlastnosti dvou, případně více rozdílných plemen, - mezidruhové křížení (bastardizace) zahrnuje páření různých druhů equidů Technika plemenitby Páření je realizováno komplexem podmíněných a nepodmíněných pohlavních reflexů, při kterém dochází ke spojení samce se samicí a deponaci semene do pohlavního ústrojí samice. Páření je u hospodářských zvířat ze strany samce označováno jako připouštění a ze strany samice jako zapouštění (HROUZ a ŠUBRT, 2000) Způsoby plemenitby V chovu koní jsou povoleny následující způsoby plemenitby: - přirozená plemenitba (připouštění z ruky ) - inseminace čerstvým spermatem - inseminace zchlazeným spermatem - inseminace zmrazeným spermatem - embryotransfer. V chovu anglického plnokrevníka je ze všech uvedených způsobů povolena pouze přirozená plemenitba. Ostatní způsoby jsou zakázány. Chovatelé, reprodukční centra i zemské hřebčince jsou povinni vést příslušnou prvotní evidenci o realizaci plemenitby a podávat hlášení o jejich výsledcích na příslušných tiskopisech Ústřední evidenci chovu koní (MISAŘ a JISKROVÁ, 2001). 23

24 3.3.5 Umělá inseminace koní Historie umělé inseminace Nejstarší prameny ve formě vyprávění a obrazových materiálů o umělé inseminaci sahají až do doby 800 let před naším letopočtem. V arabském písemnictví se poprvé hovoří o přenosu semene u koní v roce Inseminace koní má tedy nejdelší tradici, první inseminace klisen na území bývalého Československa byly provedeny již koncem 19. století a na počátku 20. století. Inseminace koní sloužila jako model a vzor při rozvoji inseminace jiných druhů hospodářských zvířat. K největšímu rozvoji v inseminaci koní došlo v bývalém Sovětském svazu, ve stření Evropě a v balkánských zemích, kde bylo inseminace využito v boji na vymýcení hřebčí nákazy (duriny), dále se rozšířila pouze do Číny a do Japonska. Nejvýznamnější osobností v oblasti inseminace se stal Ilja Ivanovič Ivanov, který se stal průkopníkem myšlenky využití umělé inseminace za účelem zlepšení chovu hospodářských zvířat. Ivanov byl jedním z prvních, kdo se pokusili sperma ředit a převážet je na větší vzdálenosti. Chovatelskými svazy chovu koní nebyla umělá inseminace jako forma rozmnožování akceptována. Zájem o inseminaci se zvýšil když se prokázalo, že umělou inseminací lze dosáhnout srovnatelných výsledků koncepce jako u přirozeného páření. V roce 1964 byly publikovány první práce, které prokázaly, že semeno hřebců lze úspěšně zmrazovat. Od této doby se zájem o výzkum v oblasti reprodukce koní zvýšil v USA, v severní Africe a v dalších zemích světa (ROB a STEHLÍK, 1982). Umělá inseminace je osemenění klisny čerstvým nebo krátkodobě i dlouhodobě konzervovaným spermatem. Inseminace klisen je tedy reprodukční metoda a jako taková vyžaduje, má-li být úspěšná, určité podmínky a to zejména kvalitní sperma, určení vhodné doby k inseminaci a správné provedení inseminace (MÜLLER, 2006) Význam umělé inseminace Umělá inseminace klisen není metoda samoúčelná. Je to metoda, která nám nabízí možnosti v podmínkách přirozené plemenitby nemožné. V současné době jde hlavně o podstatně vyšší využití kvalitních importovaných hřebců osvědčeného a ve světě prověřeného genofondu prostřednictvím inseminace čerstvým spermatem a importu genofondu nejkvalitnějších světových plemeníků prostřednictvím importu dávek zmrazeného spermatu. 24

25 Dále má inseminace velký význam v: 1. Efektivním využití nejcennějších hřebců pro rozmnožování i na velké vzdálenosti od místa ustájení hřebce. 2. Snížení rizika poranění klisen nebo hřebců při transportech často na velké vzdálenosti, snížení rizika stresu. 3. Snížení rizika poranění při přirozeném páření. 4. Možnosti prodeje spermatu do zahraničí. 5. Omezení možností šíření pohlavních nákaz a jiných infekčních onemocnění (durina, infekční virová metritis, infekční respiratorní onemocnění, aj.). 6. Pravidelnou kontrolou spermatu lze jednak včas odhalit subfertilní nebo infertilní hřebce a vyloučit z inseminace nekvalitní semeno hřebců při dočasných poruchách spermiogeneze, které jsou u hřebců časté (VĚŽNÍK a kol., 2000). 7. Použití kvalitního spermatu pro inseminaci v kombinaci s dobrou hygienou, kvalitní výživou a použití moderních biotechnologických metod v reprodukci umožňuje podstatné zvýšení zabřezávání klisen zejména v chovech, kde jsou nízké výsledky březosti. 8. Při umělé inseminaci značně klesají náklady na zabřeznutí jedné klisny. 9. Možnosti vytvoření banky mraženého semene. 10. Využití špičkových hřebců v mezinárodním měřítku nebo použití mraženého spermatu od hřebců, kteří už nežijí (MÜLLER, 2006; LOUDA a kol., 2001). Z těchto důvodů v některých zemích používání inseminačních dávek k zapouštění klisen nahradilo přirozené páření (KUISMA a ANDERSSON, 2006). V ČR je využívání inseminace u klisen podstatně méně frekventováno než u dalších hospodářských zvířat. V současné době je inseminace využívána u % z počtu připouštěných klisen Výběr hřebců pro inseminaci Při výběru hřebců pro umělou inseminaci se přihlíží k těmto aspektům: - základním kritériem jsou chovatelské aspekty a požadavky, hlavně výkonnost hřebce, - vybraný hřebec musí být zdravý, je podroben komplexu klinických a laboratorních vyšetření, - hřebec musí mít dobře vyvinuté pohlavní orgány, nesmí vykazovat žádné vrozené ani získané změny zejména na varlatech, šourku, penisu a na předkožce, - musí vykazovat dobré sexuální libido a normální průběh pohlavních reflexů po 25

26 nácviku odběru na umělou vaginu, - musí vykazovat dobrou kvalitu spermatu po odběru, naředění a konzervaci pro krátkodobé i dlouhodobé uchování, - musí být dobře ovladatelný, nesmí být agresivní Metoda umělé inseminace Je nutné připomenou, že metoda umělé inseminace je pouze technický postup, kterým je možné více využít fyziologických možností organizmu. Metoda má význam a efekt pouze jako součást šlechtitelského procesu přičemž mu dává novou dimenzi a nové možnosti. Metodu umělé inseminace MÜLLER (2006) rozděluje do 3 fází - odběr spermatu - zpracování spermatu - inseminace klisny Odběr spermatu hřebce Odběr spermatu se provádí převážně pomocí umělé vagíny různého typu i konstrukce a umělého fantomu nebo říjící se klisny. Po vzeskoku hřebce na fantom se pyj zavede do předehřáté (40 45 ºC) umělé vaginy, kam hřebec odsemení (MÁCHAL, 2009). Zachycené sperma se laboratorně hodnotí. Je známo mnoho způsobů vyšetření ejakulátu např. mikroskopické, biologické, chemické či fyzikální (MAMICA a MÁCHAL, 2009). Hodnotí se především množství spermatu, jeho koncentrace a dále pohyblivost spermií udaná procentickým vyjádřením množství spermií s progresivním pohybem vpřed za hlavičkou. Pokud se sperma přímo nepoužije k inseminaci, ředí se speciálním ředidlem (MÜLLER, 2006). Před vlastním odběrem se penis hřebce omyje dezinfekčním roztokem. Dezinfekce se provádí asi dvě hodiny před odběrem. Tato doba je nutná k tomu, aby byla vyloučena možnost přechodu zbytků dezinfekčního prostředku do ejakulátu. Po odběru se penis omyje a penis znovu dezinfikuje. Ejakulace následuje po několika frikčních pohybech a trvá 5 35 sekund, v průměru 16 sekund (LOUDA a kol., 2001). Na vyvolání ejakulace je nutný přiměřený tlak na bázi pyje. Nejlepších výsledků je dosahováno v přítomnosti říjící se klisny. K reflexu erekce dochází u mladých hřebců asi za 3 minuty, u starších přibližně za 2 minuty. Poté by měl do 5 10 vteřin následovat reflex vzeskoku. Hřebec by měl ejakulovat při prvním vzeskoku. Celý pohlavní akt má být uskutečněn během 2 5 minut, což je normální projev libida a pohlavních funkcí (VĚŽNÍK a kol., 2009). 26

27 VĚŽNÍK (2004) uvádí rozdílnou úroveň pohlavních funkcí u sledované skupiny teplokrevných a chladnokrevných hřebců viz. Tabulka č. 1. Tabulka č. 1 Úroveň pohlavních funkcí u teplokrevných a chladnokrevných hřebců Hřebci Pohlavní funkce teplokrevní chladnokrevní Velmi dobré ukazatelé pohlavních funkcí 10,2 % 2,7 % Vyhovující ukazatelé pohlavních funkcí 68,4 % 62,2 % Nižší úroveň pohlavních funkcí 18,4 % 29,7 % Nedostatečná úroveň pohlavních funkcí (nedoporučen k zařazení do plemenitby) 3, 0 % 5,4 % K ejakulaci u hřebce dochází ve 3 základních fázích. První fázi tvoří výměšky uretrálních a Cowperových žlách a k tomuto vyměšování dochází již během vzeskoku a při vyhledávacím reflexu. Druhá fáze je tvořena výměšky ampule chámovodu, ocasu nadvarlete a prostaty. Třetí fáze je tvořena převážně sekretem semenných váčků. Průběh pohlavní reflexů u hřebce je ovlivňován velmi intenzivně zejména zrakovými, čichovými, sluchovými a dotykovými podněty, jejichž zdrojem je říjící se klisna. Stupeň erotizace jednotlivých hřebců je velmi odlišný a na tom závisí pohlavní aktivita i ovladatelnost při odběru spermatu (ROB a HERČÍK, 1987) Vlastnosti spermatu hřebce V průběhu odběrové sezóny se kvalita ejakulátu hřebců působících v inseminaci mění. Může to být dáno ročním obdobím, vytížením hřebce v inseminaci, fyzickou zátěží hřebce např. účastí na závodech. Z tohoto důvodu je nutné ejakulát využívaných hřebců průběžně sledovat a hodnotit jeho základní kvalitativní ukazatele. Objem celého ejakulátu se pohybuje mezi 20 až 200 ml, pokud je objem nižší než 20 ml, nelze sperma použít pro účely inseminace (MAMICA a MÁCHAL, 2009). Největší objem je u těžkých plemen (kolem 150 ml), u středně těžkých se pohybuje kolem 60 ml a u lehkých plemen kolem 45 ml. ale i mezi hřebci stejných plemen jsou velké rozdíly (ROB a HERČÍK, 1987). Barva spermatu závisí na koncentraci spermií a bývá mléčně bílá až šedobílá. 27

28 Konzistence spermatu je vodnatá a závisí na množství přítomnosti hlenovité substance. ph se pohybuje v rozmezí 6,7 až 7,8, většinou je mírně alkalické, celková hodnota ph je závislá na podílu první vodnaté frakce, její ph se pohybuje nad 8,1. Při frakcionovaném odběru se tato frakce do ejakulátu nezachytává. Koncentrace spermií závisí na podílu semenné plazmy a pohybuje se většinou mezi 100 až mm 3 závislosti na frekvenci odběrů. (MAMICA a MÁCHAL, 2009). Koncentrace spermií je v Aktivita spermií je procentický podíl spermií s progresivním pohybem vpřed za hlavičkou. Aktivita spermií je do jisté míry závislá na sezónnosti. V nejteplejších měsících je nejnižší. U jednotlivých hřebců kolísá motilita spermií mezi %, sperma s nižší motilitou než 60 % by nemělo být použito. Frekvence výskytu patologických spermií nesmí překročit %, z toho s primárními změnami (změny vznikající v průběhu spermiogeneze) do 10 % (LOUDA a kol., 2001). Tabulka č. 2 Základní ukazatelé nativního ejakulátu hřebce podle VĚŽNÍKA (2004). Objem v ml > 20 3 > Koncentrace spermií v mm ph 7.2 Procento pohyblivých spermií > 60 Rychlost pohybu spermií v µm/s 50 Procento patologických spermií celkem < 40 Procento primárních změn < Vlastnosti a funkce spermie Spermie hřebce se podobá spermiím ostatních savců. Skládá se z hlavičky, střední (spojovací) části bičíku a vlastního bičíku s terminálním úsekem viz. Obrázek č. 1. Hlavní obsah hlavičky tvoří jádro s obsahem dědičné hmoty (chromatinu). Hlavička je zevně porytá blánou akrozomem. To je útvar, který obsahuje látky enzymatické povahy, které se zúčastňují oplozovacího procesu při pronikání spermie obaly vajíčka. Střední část bičíku je centrum pro látkovou výměnu a pro produkci energie, která se 28

29 odtud přenáší na kontraktilní vlákna bičíku (fibrily), které představují periodickým smršťováním a uvolňováním pohybový orgán spermie. Na rozhraní spojovací části a dalším pokračováním bičíku se často nachází zbytek původní protoplazmy ve formě tzv. protoplazmatické kapky. Celá spermie je krytá povrchovou membránou, která chrání spermii proti nepříznivým vnějším podmínkám prostředí po ejakulaci (ŘÍHA a kol., 2003). Obrázek č. 1 Spermie - popis (ŘÍHA a kol., 2003) Rozměry spermií hřebce v µm Hlavička spermie Délka 6,27 Šířka 3,21 Bičík spermie Spojovací část 8,6 Hlavní část 43,7 Délka celé spermie 57,55 59,7 (VĚŽNÍK, 2004). 29

30 Zpracováni hřebčího spermatu Důležitou otázkou rozvoje umělé inseminace je problém uchování oplozovací schopnosti a životnosti spermií mimo organismus po dlouhou dobu. Účelem je především vytvoření vhodného prostředí pro spermie a zvětšení objemu semene pro osemenění velkého počtu klisen, zvláště od vysoce hodnotných plemeníků. V současné době jde o zajištění podmínek pro přežívání spermií in vitro. Nedílnou součástí konzervace spermatu je jeho ředění. Způsob ředění a způsob konzervace se vzájemně podmiňují a do určité míry ovlivňují i použitou metodu vlastního úkonu inseminace klisen. Jednotlivé technologické postupy při inseminaci vyplývají z toho, používá-li se čerstvé sperma nebo dlouhodobě konzervované (MÜLLER, 2006). Aby konzervace splnila účel, musí zachovat charakteristické vlastnosti spermií a při všech probíhajících změnách zajistit takovou funkci semene, jakou mělo v okamžiku odběru. Účelem konzervace je dále omezit metabolické pochody v co nejkratší době na co nejnižší stupeň, zachovat energetický potenciál spermií a jejich elektrický náboj (LOUDA a kol., 2001) Čerstvé sperma Čerstvé sperma je neředěné sperma získané pomocí umělé vagíny a použité ihned k inseminaci klisny (MÜLLER, 1999) Krátkodobá konzervace spermatu Pro ochranu spermií a zachování oplozovací schopnosti se sperma ředí většinou roztokem obsahující cukernou složku, pufrovací látky a specifické ochranné látky. Takto ošetřené sperma zchlazené na 4 C si zachovává dobrou oplozovací schopnost 12 až 48 hodin po jeho odběru podle typu použitého ředidla, se může převážet a krátkodobě skladovat. Používají se ředidla na mléčné nebo žloutkové bázi, která chrání především povrchové membrány. Ředidla dále obsahují energetické a pufrovací látky. Ředěné sperma se pozvolna chladí na teplotu 4ºC. Kritickým faktorem pro konzervaci hřebčích spermií, jeho přípravu a uchování fertility je patrně rychlost ochlazování. Hřebčí sperma může být rychle ochlazeno z 37ºC na 20ºC, ale mělo by být pomalu ochlazováno z 20ºC na 5ºC a to maximální rychlostí 0,1ºC za minutu. Pro krátkodobou konzervaci se připravuje inseminační dávka v objemu 10 ml, aktivita spermií a další kritéria kvalitativních ukazatelů musí odpovídat hodnotám nativního semene (VĚŽNÍK a kol., 2000). 30

31 LOUDA a kolektiv (2001) uvádí, že počet aktivních spermií v inseminační dávce pro klisnu by neměl klesnout pod 100 milionů. Inseminační dávka musí být zřetelně označena jménem a státním registrem hřebce, označením inseminační stanice a datem odběru Postup při ředění spermatu - ejakulát se podle koncentrace ředí 1 : 3 4, - ředění musí začít do 10 minut po odběru, - teplota ředidla musí odpovídat teplotě spermatu a je udržována ve vodní lázni kolem 35 º C, - ředění musí být pozvolné po dobu 5 10 minut, - naředěné sperma se uloží do lednice, přibližně na ½ hodiny, kde se zchladí na teplotu 3 4 º C, pak se inseminační dávka v podobě injekční stříkačky se spermatem hřebce a sterilním zavaděčem odesílá ve speciálním kontejneru chovateli Ředidla pro krátkodobou konzervaci Ředidlo dle Keneyho Složení : ml bidestilované vody - 24, 5 g glukózy - 49,0 g sušeného odtučněného mléka - příměs antibiotik 250 mg gentamycinu. Ředidlo žloutkové Složení: ml bidestilované vody - 30 g glukózy - 20 g laktózy g vinanu sodnodraselného ml žloutku - 60 ml 10 % kyseliny paraaminobenzoové - příměs antibiotik penicilin, streptomycin, gentamycin (VĚŽNÍK a kol., 2000). Equinní praxe vyžaduje ředidlo, které zachovává vysokou motilitu a fertilitu spermií, dovoluje zřetelné mikroskopické hodnocení motility ředěného spermatu, jehož příprava je snadná a ne příliš ekonomicky nákladná. 31

32 Přeprava čerstvého spermatu Po zachlazení je sperma naplněno do injekční stříkačky a vloženo do keramické trubice. Vnitřní průměr a délka trubice odpovídá rozměrům injekční stříkačky, síla stěny je 10 mm. Trubice je vyrobena ze speciální keramiky s vysokou akumulační schopností a slouží jako tepelný respektive chladový akumulátor. Keramická trubice se umístí do speciálně tvarovaného polystyrénového pouzdra, ve kterém se přepravuje (LOUDA a kol., 2001) Dlouhodobá konzervace spermatu Zmrazování spermatu V posledních 20 letech byla vypracována řada postupů při hlubokém mrazení spermatu. Rozdíly v těchto technologiích byly v podstatě v tom, zda byl zmrazován celý ejakulát nebo jen určitá frakce, velké rozdíly byly ve složení ředidel, ve stupni ředění, v době a technice ekvilibrace a postupného ochlazování a v technologii zmrazování (ROB a HERČÍK, 1987). Zmrazovací techniku lze rozdělit : - zmrazování do formy pelet různé velikosti, - zmrazování do formy pejet různé velikosti, - zmrazování v ampulkách, - zmrazování v aluminiových tubách. Nejprve se vyvíjela metoda do formy pelet. Pelety byly zmrazovány na suchém ledu a pak ukládány do tekutého dusíku. Při této technologii přežívalo více než 50 % spermií a zabřezávání bylo kolem 50 %. Pejety různé velikosti od 1 ml až do trubiček o velikosti 12 ml byly zmrazovány v párách tekutého dusíku. Při zmrazování do ampule se používají páry tekutého dusíku. Zabřezávání při této technologii nepřekročilo 50 %. Jako perspektivní metoda se ukázalo zmrazování spermatu hřebců do hliníkových tub. Tato metoda byla ještě zdokonalena Müllerem (1984), který vyvinul speciální zmrazovací zařízení z měděného plechu a sperma v aluminiových tubách zmrazuje přímo v tekutém dusíku (ROB a HERČÍK, 1987). Ředidlo pro zmrazení spermatu se od ředidla pro krátkodobé uchování spermatu liší především obsahem kryoprotektivních látek, to jsou látky, které chrání spermie v procesu zmrazení a rozmrazení. Pro zmrazení spermatu hřebce se jako kryoprotektivum používá glycerín. Po ředění se sperma ochladí a potom se zmrazuje většinou v pejetách o obsahu 0,5 4 ml nebo v hliníkových tubách 32

33 o obsahu 7 ml. Po zmrazení se inseminační dávky uchovávají v kontejnerech s kapalným dusíkem pří teplotě Při této teplotě jsou téměř úplně zastaveny všechny metabolické procesy spermií. V praxi to znamená, že zmrazené sperma je možné v kapalném dusíku uchovávat po desítky let bez ztráty oplozovací schopnosti (MÜLLER, 2006). Při použití zmrazené inseminační dávky LOUDA a kol. (2001) doporučuje, aby obsahovala minimálně 250 milionů aktivních spermií, ale VĚŽNÍK a kol., (2000) uvádí jako minimální obsah 100 milionů aktivních spermií v inseminační dávce Ředidla pro dlouhodobou konzervaci Laktózo žloutkové ředidlo Složení: ml bidestilované vody - 110,0 g laktózy - 1,0 chelatonu - 2 ml 4,2 % roztoku kyselého uhličitanu sodného - 2,5 ml 35,7 % roztoku citronanu sodného - 54,0 g glycerinu g vaječného žloutku - příměs antibiotik 1,6 g lincospectinu. Francouzské ředidlo Složení: ml bidestilované vody s nízkotučným mlékem - 50,0 g glukózy - 3,0 g laktózy - 3,0 g rafinózy - 0,6 g citrátu sodného - 0,82 g citrátu draselného - 14,2 g pufru HEPES - 20,0 g vaječného žloutku - 25 g glycerinu (VĚŽNÍK a kol., 2000). 33

34 Rozmrazování spermatu Aktivita spermií po rozmrazení musí být minimálně 30 %. Rozmrazení inseminační dávky se provádí ve vodní lázni o teplotě 40 až 45 C teplé. Po rozmrazení oplozovací schopnost spermií klesá, proto je třeba inseminační dávku rozmrazit těsně před inseminací klisny. Předpokládá se, že životnost rozmrazených spermií oproti čerstvým je snížená. Z tohoto důvodu je nutné provést inseminaci klisny co nejblíže k době ovulace folikulu a v případě potřeby provést reinseminaci po 24 hodinách (KUISMA a ANDERSSON, 2006) Kvalita spermatu Výsledek inseminace nejvíce ovlivňuje kvalita inseminační dávky, která je dána kvalitou získaného ejakulátu, metodou a kvalitou jeho zpracování, způsobem uskladnění inseminačních dávek, přípravou inseminační dávky k inseminaci a záleží také na odborné způsobilosti pracovníka, který inseminaci provede (KUISMA a ANDERSSON, 2006). Základním předpokladem kvalitní inseminační dávky je získání kvalitního ejakulátu, zejména vysoké biologické hodnoty ejakulátu, vysoké koncentrace spermií v ejakulátu a jeho minimálním mikrobiálním znečištění. Biologická kvalita ejakulátu z hlediska jeho oplozovací schopnosti má zásadní význam a je daná genetickou dispozicí jedince a do jisté míry vnějšími vlivy (VĚŽNÍK a kol., 2004). Koncentrace spermií a bakteriální znečištění spermatu je v některých technologiích řešeno již způsobem odběru ejakulátu, jiní řeší tento problém centrifugací, cezením a přídavkem antibiotik. I zde mají tyto metody svá negativa i pozitiva, která určitým způsobem ovlivní celkovou kvalitu inseminační dávky. Velmi důležitá je přitom úroveň zpracování spermatu, použití kvalitních komponentů, přesné dodržení metodiky a standardní práce. Můžeme říci, že kvalita inseminačních dávek je záležitostí pracoviště, které tyto dávky produkuje. Předpokládá se, že kvalitní sperma si zachovává v pohlavních orgánech klisny oplozovací schopnost po hodin, zmrazené sperma pak hodin po inseminaci. Tyto odhady jsou pouze hrubým odhadem a kolísají s individualitou hřebce, tak i s individualitou klisny. Mohou být nižší, ale i vyšší (MÜLLER, 1999). Kvalita spermatu je na inseminačních stanicích průběžně kontrolována u každého odebraného ejakulátu. Tyto stanice podléhají zvláštním předpisům a jsou pod veterinární kontrolou (LOUDA a kol., 2001). 34

35 Stanovení doby inseminace Doba připuštění vzhledem k době ovulace je jednou z nejdůležitějších otázek, a to zejména u umělé inseminace zmrazeným spermatem, kde se předpokládá snížení oplozovací schopnosti spermií. Při stanovení vhodné doby inseminace se většina autorů shoduje v tom, že u klisen je pro zdárný výsledek nezbytné kontrolovat a sledovat vnější i vnitřní příznaky říje. Pro zdárný výsledek inseminace je nutné provést inseminaci těsně před ovulací. Pro předpověď doby ovulace je v současné době nejvhodnější prakticky využitelnou metodou rektální sledování vnitřních příznaků říje, zejména Gráfova folikulu. K ovulaci dochází v druhé polovině říje se značnými individuálními rozdíly mezi klisnami. Z hlediska velké individuální rozdílnosti je pří inseminaci nezbytná kontrola folikulu tak, aby se doba inseminace přiblížila co nejvíce době ovulace (GAMČÍK a KOZUMPLÍK, 1984) Inseminace klisny Správné připuštění klisny je pro následnou graviditu rozhodujícím momentem. Největší důraz je proto kladen na kvalitu spermatu, správnou techniku a vhodnou dobu připouštění a důslednou hygienu (MÜLLER, 2006). Podle DOLEŽELA a KUDLÁČE (1997) se hygiena připouštění může velmi významně promítnout na jeho výsledku. V plnohodnotné říji, zejména na jejím vrcholu, jsou pohlavní orgány klisny poměrně odolné k mikrobiální infekci, přesto existuje reálné nebezpečí endometritid, jako následku infekce při připuštění, a to zejména u klisen se sníženou obranyschopností. Inseminace se provádí, jsou-li u klisny zjištěny tři příznaky: vnější projevy, otevření děložního krčku a velikost folikulu (LOUDA a kol., 2001) Postup při inseminaci klisny U klisen se prakticky výhradně provádí vaginální způsob inseminace. - Před inseminací je nutné opakované omytí vulvy klisny vhodným dezinfekčním prostředkem. K mytí je potřeba používat jednorázových pomůcek a ostřiků vodou tak, aby byl znemožněn přenos infekce z jedné klisny na druhou (MÜLLER, 1999). - Technik si navlékne jednorázovou rukavici, jejíž kluzkost zvýší rozetřením sterilního parafinového oleje. - Ruku zasune do pochvy, vyšetří otvor děložního krčku, je-li krček otevřen na více než jeden až dva prsty je možné inseminovat. Je-li krček uzavřen, klisna se neinseminuje. - Po vyšetření krčku vysune ruku na okraj pochvy tak, aby dlaň chránila zakončení 35

36 pipety. - Pod ochranou ruky se pipeta přiblíží ke krčku, prst se zavede do krčku a pipeta se zasune podél prstu asi 10 až 15 cm od zevní branky krčku děložního, kam deponujeme sperma. - Po deponaci spermatu přidržíme zevní branku krčku a simulujeme frikční pohyby hřebce tak, aby došlo k navození děložních kontrakcí. - Po inseminaci je vhodné klisnu provádět, aby nedošlo k vytlačení spermatu. - Inseminace se opakuje po 48 hodinách dokud neodezní příznaky říje (MÜLLER, 1999; MÁCHAL, 2009; LOUDA a kol., 2001; KLIMENT a kol., 1983). 36

37 4. MATERIÁL A METODIKA Práce vychází z výsledků Equinního reprodukčního centra v Pardubicích Mněticích za období sedmi připouštěcích sezón od února 2002 do srpna 2008 a reprodukčního centra Stáj Mustang s.r.o. za období pěti připouštěcích sezón od února 2004 do srpna Charakteristika sledovaných reprodukčních center Equinní reprodukční centrum Pardubice - Mnětice Equinní reprodukční centrum Pardubice - Mnětice, dále jen ERC Mnětice leží jihovýchodním směrem od Pardubic v nadmořské výšce asi 210 metrů nad mořem. Kapacita střediska skýtá 30 boxových míst, volnou stáj pro hříbata a pastevní areál s výměrou asi 7 hektarů. Ze zdravotních a zoohygienických důvodů je dodržován systém uzavřeného obratu stáda. V připouštěcí sezóně tj. od 15. února do 15. srpna zde bylo trvale ustájeno v průměru 13 plemenných hřebců. Problematikou inseminace koní se stanice zabývá již řadu let a v posledních 10 sezónách se zde inseminace čerstvým i zmrazeným spermatem stala rutinně používanou technologií nabízenou chovatelům klisen. Vlastní inseminace klisen byla prováděna ve 3 km vzdáleném objektu Nemošice, kde je nově vybudované středisko s kapacitou asi 30 boxů pro klisny, vyšetřovací halou a samostatnou laboratoří Zvířata Ve sledovaném období byl soubor hřebců prezentován zástupci teplokrevných plemen německého, francouzského, českého a slovenského chovu, slezského norika, haflinga, new forest pony a welsh pony. Věk hřebců se pohyboval v rozmezí od 3 do 27 let. Hřebci byli ustájeni v samostatných boxech, pravidelně se pohybovali (na kolotoči, pod sedlem, ve výběhu ) s přihlédnutím k individuálním potřebám, věku a sportovnímu využití jedince. Krmná dávka byla rozdělena do 3 částí a skládala se z kvalitních objemných krmiv, jádra a vitaminózně-minerálních premixů. Zvláštní důraz byl kladen na složky výživy přímo ovlivňující kvalitu a množství spermatu. Hřebci byli v pravidelných intervalech podrobeni bakteriologickému vyšetření stěrů z uretry, sérologickému vyšetření krve a metabolickým testům. 37

38 Odběr a hodnocení spermatu Sperma bylo odebíráno 4 krát týdně (pondělí, středa, pátek, neděle) a to na umělém fantomu při stimulaci hřebce říjící se klisnou. Byl používán otevřený typ umělé vagíny tzv. Krakowský model umožňující záchyt pouze spermatických frakcí. Prvé 2 až 4 ejakulační výstřiky byly zachycovány pomocí plastové nálevky přes sterilní gázu do skleněné nádoby, vytemperované na 37 stupňů Celsia a tepelně izolované od okolního prostředí. Bezprostředně po odběru bylo semeno posouzeno makroskopicky, koncentrace spermií byla stanovena fotometrem. Pohybová aktivita spermií byla hodnocena mikroskopicky odhadem při teplotě 38 až 39 stupňů Celsia a zvětšení 300 x za použití fázového kontrastu. Množství spermatu bylo váženo s přesností na 1 g a přepočtem na ml. Nejméně jednou měsíčně bylo prováděno sledování procenta morfologicky změněných spermií. K dalšímu zpracování byly použity pouze ejakuláty normální barvy a konzistence bez zápachu a cizích přimíšenin, o minimálním množství 15 ml, minimální motility po odběru 60 procent, minimální koncentrace 160 milionů spermií v 1 ml, neobsahující více jak 30 % morfologicky změněných spermií Ředění spermatu K ředění ejakulátu bylo použito mléčné ředidlo dle Kenneyho a laktozochelatožloutkové ředidlo. Sperma bylo ředěno v poměru 1:4 až 1:20 tak, aby jedna inseminační dávka obsahovala 500 mil. spermií. Poměr ředění byl ovlivněn také počtem objednávek. Následně byla hodnocena motilita naředěného spermatu a dále se pracovalo pouze s ejakulátem obsahujícím minimálně 60 procent pohyblivých spermií. Poté bylo ředěné sperma nasáto do injekční stříkačky o objemu 20 ml a v průběhu 30 minut v chladničce zchlazeno na teplotu 4-8 C. Každá naplněná stříkačka představovala jednu inseminační dávku a byla označena jménem hřebce, datem odběru a kódem inseminační stanice Expedice spermatu Semeno bylo odebíráno ve dnech: pondělí, středa, pátek, neděle, distribuováno do 10 hodin a na místě určení bylo v odpoledních až večerních hodinách. Pro přepravu byla inseminační dávka umístěna do speciálního polystyrénového boxu s chladicí vložkou systému minitub, který zabezpečoval uchování teploty uvnitř boxu okolo 4 6 C po dobu nutnou k přepravě, to je 6 až 12 hodin. 38

39 Inseminace klisen Inseminaci prováděli veterinární lékaři, inseminační technici skotu vyškolení v inseminaci klisen a rovněž chovatelé, kteří absolvovali školení v inseminaci klisen. Tito pracovníci měli v oblasti inseminace klisen jak několikaleté tak i krátkodobé zkušenosti. Klisny byly inseminovány pomocí sterilního plastového katetru s olivkou na konci, který byl spolu se sterilní rukavicí součástí každé odeslané inseminační dávky. Inseminace byla prováděna vaginálně přímo do dělohy nebo do 3. třetiny děložního krčku. Pokud klisna po 36 hodinách po inseminaci stále vykazovala vnější příznaky říje a přivolaný inseminační technik na základě sonografického vyšetření diagnostikoval přetrvávající říji byla objednána další inseminační dávka. Reinseminace se prováděla za 48 hodin po první inseminaci. Vyšetření gravidity klisen prováděli veterinární lékaři a specializovaní inseminační technici v převážné většině případů sonograficky. Vedle terénního způsobu inseminace byly klisny inseminovány rovněž ve specializovaném reprodukčním středisku v Nemošicích za zvýšené reprodukční péče, která představovala zejména sonografickou diagnostiku a sledování průběhu říje, hormonální ovlivnění pohlavního cyklu a v nutných případech možnost léčebné intervence Služby poskytované ERC Mnětice - inseminace klisen čerstvým spermatem - inseminace klisen zmrazeným spermatem - prodej inseminačních dávek čerstvého i zmrazeného spermatu - léčba dlouhodobě neplodných klisen - zmrazování spermatu plemenných hřebců jiných chovatelů - transfer koňských embryí - poradenská služba na základě sonografického vyšetření pohlavního ústrojí klisen - prodej krmiv firmy Höveler - prodej sportovních a chovných koní Sledované ukazatele V letech 2004 až 2008 byly sledovány tyto ukazatelé: 1. Počet hřebců zařazených do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem 2. Výsledky inseminace čerstvým spermatem 3. Výsledky inseminace zmrazeným spermatem 4. Výsledky inseminace čerstvým spermatem ve sledu prvního až třetího říjového cyklu 39

40 5. Počet spotřebovaných inseminačních dávek na jednu inseminovanou klisnu 6. Počet spotřebovaných inseminačních dávek na jednu březí klisnu. V letech 2002 až 2008 byl sledován počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny, při zohlednění efektů způsob inseminace, plemenná příslušnost hřebce, věk hřebce, připouštěcí sezóna a hřebec Reprodukční centrum Stáj Mustang s.r.o Společnost Stáj MUSTANG s.r.o., dále jen RC Stáj Mustang má své sídlo v Moravskoslezském kraji v obci Lučina u Žermanické přehrady, okres Frýdek Místek v nadmořské výšce asi 312 metrů nad mořem. Sportovní areál se nachází na pravém břehu Žermanické přehrady, asi 100 m od hráze v klidné krajině na úpatí Beskyd. Stáj se specializuje na skokové ježdění a chov koní, zejména německého původu. Kapacita střediska skýtá 60 boxových míst, volnou stáj pro hříbata a pastevní areál. V připouštěcí sezóně tj. od 15. února do 31. srpna zde bylo trvale ustájeno v průměru 13 plemenných hřebců. Ne všichni hřebci působili v plemenitě celou připouštěcí sezónu z důvodů jejich sportovní kariéry. Problematikou inseminace koní se RC- Stáj Mustang zabývá již řadu let Zvířata Ve sledovaném období byl soubor hřebců prezentován zástupci teplokrevných plemen německého chovu, zejména hannoverského plemene. Věk hřebců se pohyboval v rozmezí od 4 do 13 let. Hřebci byli ustájeni v samostatných boxech, pravidelně se pohybovali na kolotoči a každý den byli ježděni profesionálními jezdci, což představovalo přípravu na skokové soutěže. Někteří hřebci se pravidelně zúčastňovali soutěží stupně S, ST, T a úspěšně se pohybovali v poli parkurového ježdění. V roce 2005 a 2008 zvítězil v prestižní anketě jezdeckého sportu Kůň roku hřebec 2743 Pinot Grigio, v roce 2007 toto ocenění získal hřebec Cartouches. Hřebci byli krmeni 3x denně (ráno poledne večer), krmná dávka se skládala z kvalitních objemných a jadrných krmiv s přídavkem vitaminózně-minerálních premixů. Zvláštní důraz byl kladen na složky výživy přímo ovlivňující kvalitu spermatu a sportovní výkonnost hřebce. 40

41 Odběr a hodnocení spermatu Sperma bylo odebíráno 4 krát týdně (pondělí, středa, pátek, neděle) a to na umělém fantomu při stimulaci hřebce říjící se klisnou. Bezprostředně po odběru bylo semeno posouzeno makroskopicky. Pohybová aktivita spermií byla hodnocena mikroskopicky odhadem. Množství spermatu bylo váženo s přesností na 1 g a přepočtem na ml. Nejméně jednou měsíčně bylo prováděno sledování procenta morfologicky změněných spermií. K dalšímu zpracování byly použity pouze ejakuláty normální barvy a konzistence bez zápachu a cizích přimísenin Ředění spermatu K ředění ejakulátu byla použita dostupná komerční ředidla. Poměr ředění byl ovlivněn počtem objednávek. Následně byla hodnocena motilita naředěného spermatu a dále se pracovalo pouze s ejakulátem obsahujícím minimálně 60 procent pohyblivých spermií. Poté bylo ředěné sperma nasáto do injekční stříkačky o objemu 20 ml a v průběhu 30 minut v chladničce zchlazeno na teplotu 4-8 C. Každá naplněná stříkačka představovala jednu inseminační dávku, která byla označena jménem hřebce, datem odběru a kódem inseminační stanice Expedice spermatu Semeno bylo odebíráno ve dnech: pondělí, středa, pátek, neděle a zasíláno vlakem, expresní službou KURÝR ze železniční stanice Havířov a Frýdek - Místek, na místě určení bylo v odpoledních až večerních hodinách. Pro přepravu byla inseminační dávka umístěna do speciálního polystyrénového boxu, který zabezpečoval uchování teploty uvnitř boxu okolo 4 6 C po dobu nutnou k přepravě Inseminace klisen Inseminaci prováděli veterinární lékaři, inseminační technici skotu vyškolení v inseminaci klisen a rovněž chovatelé, kteří absolvovali školení v inseminaci klisen. Tito pracovníci měli v oblasti inseminace klisen jak několikaleté tak i krátkodobé zkušenosti. Klisny byly inseminovány pomocí sterilního plastového katetru s olivkou na konci, který byl součástí každé odeslané inseminační dávky. Inseminace byla prováděna vaginálně přímo do dělohy nebo do 3. třetiny děložního krčku. Pokud klisna po 36 hodinách po inseminaci stále vykazovala vnější příznaky říje a přivolaný inseminační 41

42 technik na základě sonografického vyšetření diagnostikoval přetrvávající říji byla objednána další inseminační dávka. Reinseminace se prováděla za 48 hodin po první inseminaci. Vyšetření gravidity klisen prováděli veterinární lékaři a specializovaní inseminační technici v převážné většině případů sonograficky Služby poskytované RC Stáj Mustang - inseminace klisen čerstvým spermatem - prodej inseminačních dávek čerstvého spermatu - poradenská služba - prodej sportovních a chovných koní - pronájem moderní jezdecké haly Sledované ukazatele V letech 2004 až 2008 byly sledovány tyto ukazatele: 1. Počet hřebců zařazených do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem 2. Výsledky inseminace čerstvým spermatem 3. Výsledky inseminace čerstvým spermatem ve sledu prvního až třetího říjového cyklu 4. Počet spotřebovaných inseminačních dávek na jednu inseminovanou klisnu 5. Počet spotřebovaných inseminačních dávek na jednu březí klisnu. 4.2 Statistické zpracování dat Databáze ERC Mnětice a RC Stáje Mustang za období připouštěcích sezón byla zpracována a vyhodnocena v programu Microsoft Office Excel. Data ERC Mnětice za období připouštěcích sezón byla zpracována za použití obecného lineárního modelu (GLM), vycházejícího z metody nejmenších čtverců, ve statistickém programu UNISTAT verze 5.1 Srovnávací základna zohledňovala tyto efekty: - plemenná příslušnost hřebce - připouštěcí sezóna - způsob inseminace (inseminace čerstvým spermatem nebo zmrazeným spermatem) - hřebec - věk hřebce 42

43 Třídění do skupin dle plemenné příslušnosti: AnPl anglický plnokrevník AR arabský kůň CS slovenský teplokrevník CT český teplokrevník Hafl hafling Hann hannoverský kůň Holst holštýnský kůň Hucul huculský kůň CHL chladnokrevná plemena KWPN holandský královský jezdecký kůň NFP new forest pony Old oldenburský kůň SF selle francais Trak trakénský kůň Wels B welsh pony - B Westf westfálský sportovní kůň Z zangersheide Třídění do skupin dle připouštěcí sezóny: Připouštěcí sezóna 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007,2008. Třídění do skupin dle způsobu inseminace : Inseminace klisen čerstvým nebo zmrazeným spermatem. Třídění do skupin dle hřebce: Hřebci byli do databáze zařazeni podle jména, pod kterým působili v plemenitbě. Třídění do skupin dle věku hřebce: Hřebci působili v rámci inseminace čerstvým spermatem ve věku 3 roky, 4, 5, 7, 8, 9, 10, let 43

44 U databáze byl hodnocen: 1 - Počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny při inseminaci čerstvým spermatem a počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny při inseminaci zmrazeným spermatem. Databázi jsme vytvořili podle plemenářské dokumentace ERC Mnětice za období sedmi připouštěcích sezón Databáze obsahovala klisen, které byly inseminovány čerstvým nebo zmrazeným spermatem. O každé klisně jsme zaznamenali následující údaje: registrační číslo, jméno hřebce, kterým byla klisna inseminována, počet inseminací, na kolikáté říji klisna zabřezla. Data byla vyhodnocena lineárním modelem (GLM) při zohlednění těchto efektů: y ijkl = µ + a i + b j + c k + e ijkl Kde: µ = celkový průměr a i = efekt plemenná příslušnost hřebce (i = 1, 2..17) b j = efekt způsobu inseminace (j= 1,2) c k = efekt připouštěcí sezóna (k= 1,2...7) e ijkl = reziduální efekt V případě, že jsme statisticky prokázali metodou GLM vliv sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny, dále jsme mnohonásobným porovnáváním dle Tukey B nebo Sheffeho metodou posoudili průkaznost vzájemných rozdílů mezi jednotlivými sledovanými skupinami. 2 - Počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny při použití metody inseminace čerstvým spermatem. Databázi jsme vytvořili podle plemenářské dokumentace ERC Mnětice za období sedmi připouštěcích sezón Databáze obsahovala klisen, které byly inseminovány čerstvým spermatem. O každé klisně jsme zaznamenali následující údaje: registrační číslo, jméno hřebce, kterým byla klisna inseminována, počet inseminací, na kolikáté říji klisna zabřezla. 44

45 Data byla vyhodnocena lineárním modelem (GLM) při zohlednění těchto efektů: y ijkl = µ + a i + b j + c k + d l +e ijkl Kde: µ = celkový průměr a i = efekt plemenná příslušnost hřebce (i = 1, 2..17) b j = efekt hřebec (j= 1,..121) c k = efekt věk hřebce (k= 3, 4, 5, 7..27) d l = efekt připouštěcí sezóna (l= 1,2...7) e ijkl = reziduální efekt V případě, že jsme statisticky prokázali metodou GLM vliv sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny, dále jsme mnohonásobným porovnáváním dle Tukey B nebo Sheffeho metodou posoudili průkaznost vzájemných rozdílů mezi jednotlivými sledovanými skupinami. 3 - Počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny při použití metody inseminace zmrazeným spermatem. Databázi jsme vytvořili podle plemenářské dokumentace ERC Mnětice za období sedmi připouštěcích sezón Databáze obsahovala 274 klisen, které byly inseminovány zmrazeným spermatem. O každé klisně jsme zaznamenali následující údaje: registrační číslo, jméno hřebce, kterým byla klisna inseminována, počet inseminací, na kolikáté říji klisna zabřezla. Data byla vyhodnocena lineárním modelem (GLM) při zohlednění těchto efektů: y ijkl = µ + a i + b j + c k + e ijkl Kde: µ = celkový průměr a i = efekt plemenná příslušnost hřebce (i = 1, 2..17) b j = efekt hřebec (j= 1,..121) c k = efekt připouštěcí sezóna (k= 1,2...7) e ijkl = reziduální efekt 45

46 V případě, že jsme statisticky prokázali metodou GLM vliv sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny, dále jsme mnohonásobným porovnáváním dle Tukey B nebo Sheffeho metodou posoudili průkaznost vzájemných rozdílů mezi jednotlivými sledovanými skupinami. 46

47 5. VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Hřebci zařazeni do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem V období připouštěcí sezóny bylo v ERC Mnětice ustájeno v průměru 13 plemenných hřebců, kteří byli zástupci teplokrevných plemen německého, francouzského, českého a slovenského chovu, chladnokrevných plemen a plemen pony. Nejvíce hřebců bylo k plemenitbě využíváno v roce 2007 (15 hřebců) a nejméně v roce 2004 (11 hřebců). V RC Stáj Mustang bylo v období v průměru ustájeno 13 plemenných hřebců převážně hannoverského plemene, což je stejný počet hřebců jako v ERC Mnětice. Nejvíce hřebců bylo využíváno v roce 2008 (16 hřebců) a nejméně v roce 2007 a 2008 (11 hřebců). Jak vyplývá z grafu č. 1 rozdíl v počtu hřebců působících v plemenitbě v rámci čerstvého spermatu na ERC Mnětice a RC Stáj Mustang je nepatrný a to v roce 2005, kdy působilo v ERC Mnětice 13 hřebců a v RC Stáj Mustang 11 hřebců. V roce 2008 v RC Stáj Mustang působilo 16 hřebců a v ERC Mnětice 13 hřebců. Stejného počtu hřebců dosáhla obě reprodukční centra v roce 2004 (11 hřebců). Domníváme se, že v případě RC Stáj Mustang je do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem zařazeno více hřebců téhož plemene, než je poptávka chovatelů po jejich inseminačních dávkách a z tohoto důvodu jsou hřebci v rámci plemenitby nedostatečně využíváni. Například v připouštěcí sezóně 2006 hřebec Anchorage a Satisfaction II zapustili pouze 1 klisnu. V případě ERC Mnětice je počet hřebců zařazených do plemenitby v rámci inseminace čerstvým spermatem optimální. Nejméně klisen zapustil chladnokrevný hřebec Baluf (14 klisen), což je pravděpodobně způsobeno snižující se tendencí využívání koní pro práci v lese. 47

48 Graf č. 1 Počet hřebců působících v rámci inseminace čerstvým spermatem ERC - Mnětice RC - Stáj Mustang s.r.o. Počet hřebců Rok 5.2 Výsledky inseminace čerstvým spermatem za období 2004 až 2008 V období let 2004 až 2008 bylo inseminováno celkem klisen v rámci RC Stáj Mustang, z nichž zabřezlo 742 klisen, což představuje 56,95 % úroveň březosti. Nejméně klisen bylo inseminováno v roce 2004 (129 klisen), z nichž zabřezlo 83, což představuje 64,34 % úroveň březosti (RC Stáj Mustang). V rámci ERC Mnětice bylo inseminováno klisen a zabřezlo 2568 klisen, což představuje 69,74 % úroveň březosti. Nejmenší počet inseminovaných klisen v rámci ERC Mnětice bylo v roce klisen, z nichž zabřezlo 449 klisen, což představuje 67,72 % úroveň březosti. V ERC Mnětice počet inseminovaných klisen zaznamenal dvě vlny nárůstu, první v roce 2005 (804 klisen), druhou v roce 2007 (794 klisen). Nárůst počtu inseminovaných klisen v každé připouštěcí sezóně je patrný v RC Stáj Mustang. Hranice 500 inseminovaných klisen za jednu sezónu byla překročena v případě ERC Mnětice v každém sledovaném roce, v případě RC Stáj Mustang nebylo této hranice dosud dosaženo i přes každoroční nárůst počtu inseminovaných klisen. Za období 2004 až 2008 bylo dosažena průměrná úroveň březosti 69,74 % (ERC Mnětice) a 56,95 % (RC Stáj Mustang). Od roku 2004 až do roku 2006 bylo v ERC Mnětice stabilně dosahováno výsledků nad tímto průměrem, nejlepší výsledek byl zaznamenán v roce 2004 (72,43 % březost), nejhorší byl v roce 2007 (65,99 % březost). 48

49 V RC Stáj Mustang bylo dosaženo lepšího výsledku než je průměrná úroveň březosti v roce 2004 a 2005, nejlepší výsledek byl zaznamenán v roce 2004 (64,34% březost), nejhorší byl v roce 2006 (54,19% březost). Výsledky jsou patrné z tabulky č.2 a č. 3. v příloze a z grafu č. 2. Za sledované období z celkového počtu inseminovaných klisen hřebci RC Stáj Mustang (1 303 klisen) nezabřezlo 468 to je 35,9 % a u 93 klisen, 7,1 % chovatelů nezaslalo zprávu o výsledku inseminace. Z celkového počtu inseminovaných klisen hřebci ERC Mnětice (3 681 klisen) nezabřezlo klisen to je 27,5 % a u 3,2 % (118 klisen) nebyla doručena správa o výsledku inseminace. Přesto, že po inseminaci hřebci ERC Mnětice nezabřezlo o 545 klisen více než po inseminaci hřebci RC Stáj Mustang, procento nezabřezlých klisen je o 8,4 % nižší než u inseminace hřebci RC Stáj Mustang. Hřebci ERC Mnětice za sledované období zapustili o klisen více, než hřebci RC Stáj Mustang. Domníváme se, že tento rozdíl je způsoben tím, že pro některé hřebce RC Stáj Mustang byly zkráceny připouštěcí sezóny z důvodů jejich sportovní kariéry. Dále RC Mustang nabízí chovatelů převážně hannoverské hřebce, naopak ERC Mnětice nabízí francouzské, holštýnské, hannoverské, oldenburské, westfálské, KWPN, chladnokrevné a pony hřebce, takže chovatelé mají možnost většího výběru plemene. Graf. č. 2 Úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem 80,0% 60,0% Úroveň březosti 40,0% 20,0% 0,0% Rok ERC - Mnětice RC - Stáj Mustang s.r.o. 49

50 5.3 Úroveň březosti klisen po jednotlivých hřebcích za období 2004 až 2008 Do hodnocení celkové březosti klisen byli zařazeni jen ti hřebci, kteří za sledované období zapustili alespoň 10 klisen. Za období nejvíce klisen zapustil hannoverský hřebec Le Patron v roce 2007 (143 klisen), z nichž zabřezlo 93 klisen, což představuje úroveň březosti 65,03% (RC Stáj Mustang). Nejméně zapuštěných klisen měl v roce 2008 a 2006 hannoverský hřebec Ligoretto (10 klisen), z nichž zabřezlo v roce 2008, 6 klisen a v roce 2006, 4 klisny, což představuje úroveň březosti 60 % a 40 % a v roce 2007 Carducci (10 klisen), z nichž zabřezly 3 klisny, což představuje 30 % úroveň březosti (RC Stáj Mustang). V ERC Mnětice nejvíce klisen zapustil v roce 2007 hannoverský hřebec Carismo 186 a 149 jich zabřezlo, což představuje 80,11 % úroveň březosti. Nejméně klisen zapustil angloarab Favory v roce 2007, 13 klisen a zabřezlo jich 7, což přestavuje 53,85 % úroveň březosti. Výsledky jsou patrné z tabulky č.5 a č.6. v příloze a z grafu č.3 a č.4. Graf č. 3 Zapuštěné a březí klisny žebříček nejlepších hřebců P očet k lis e n Počet zapuštěnžch klisen Počet březích klisen P in o t G rig io C e s a n o I I L e P a t ro n C. C o s m o s E ib is c h I I L o rd a n o F a ra d a y C a ris m o L e P a t ro n E d m in t o n Jména hřebců Pozn.: RC Stáj Mustang: Pinot Grigio, Le Patron, Eibisch II, Faraday, Le Patron ERC Mnětice: Casano II, Con Cosmos, Lordano, Carismo, Edminton 50

51 Graf č. 4 Zapuštěné a březí klisny žebříček nejhorších hřebců L ig o re tt o B a lu f C a rd u c c i F a v o ry L ig o re tt o P a lis c o S e c u rity Q u id a m d e R e v u e e N im ro d C a la n t h a n o P oče t k lise n Počet zapuštěnžch klisen Počet březích klisen Jména hřebců Pozn.: RC Stáj Mustang: Ligoretto, Cadrducci, Ligoretto, Security, Calanthano ERC Mnětice: Baluf, Favory, Palisco, Quidam de Revue, Nimrod 5.4 Výsledky inseminace zmrazeným spermatem za období Do hodnocení výsledků inseminace zmrazeným spermatem byli zařazeni pouze hřebci z ERC Mnětice, protože RC Stáj Mustang se zmrazováním inseminačních dávek hřebců komerčně nezabývá a zmrazené inseminační dávky produkuje jen pro vlastní potřebu. V ERC Mnětice bylo za sledované období inseminováno zmrazeným spermatem 245 klisen, z nichž bylo 185 klisen březích, což představuje 75,51 % úroveň březosti. Tato hodnota je o 5,77 % (ERC Mnětice) a o 18,56 % (RC Stáj Mustang) vyšší než je úrovně březosti klisen po inseminaci čerstvým spermatem. Hodnota 75,51 % úroveň březosti po inseminaci zmrazeným spermatem neodpovídá závěrům VIDAMENTA (2005), který uvádí 45 až 48 % úroveň březosti; LOOMISE a SQUIRESE (2005), kteří zaznamenali 47,3 až 48,1 %, KATILA (2003), 33,1 %. Pouze FRANKLIN (2001), udává a 73 % březost po inseminaci zmrazeným spermatem, tato hodnota přibližně odpovídá námi zjištěné hodnotě. Nejvíce klisen bylo inseminováno v roce 2006 (64 klisen) a nejméně v roce 2005 (35 klisen), přesto tento rok je nejlepší v úrovni dosažené březosti (88,57 %). Nejnižší úroveň březosti byla dosažena v roce 2008 (68,33 %), což je o 4 % vyšší hodnota, než je nejvyšší hodnota (64,34 %) dosažená inseminací čerstvým spermatem v RC Stáj Mustang. Výsledky jsou patrné z tabulky č. 4 v příloze a 51

52 grafu č. 5. Tento rozdíl může být způsoben mnoha faktory např. chybou chovatelů při určování a výběru říjících se klisen nebo zdravotním stavem zapouštěných klisen. Nezanedbatelný vliv na úroveň dosažené březosti má podle MÜLLERA (2006), KUISMA a ANDERSSONA (2002) zkušenost a odborné znalosti inseminačního technika. Graf č. 5 Úroveň březosti klisen po inseminaci zmrazeným spermatem Úroveň březosti 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% Rok ERC - Mnětice čerstvé sperma RC - Stáj Mustang - čerstvé sperma ERC - Mnětice mrazené sperma 5.5 Výsledky inseminace ve sledu prvního až třetího říjového cyklu během,,, připouštěcí sezóny za období Za období 2004 až 2008 bylo čerstvým spermatem inseminováno klisen, z nichž do konce sezóny zabřezlo 742 klisen, to je 56,95 % (RC Stáj Mustang). V ERC Mnětice bylo inseminováno klisen, z nichž do konce sezóny zabřezlo klisen to je 69,74 %. Byla sledována úroveň březosti po prvním až třetím říjovém cyklu. U některých nezabřezlých klisen bylo z různých důvodů upuštěno od další inseminace v dané sezoně. Proto se počty klisen inseminovaných v po sobě jdoucích říjových cyklech postupně snižují. Průměrná úroveň březosti vzhledem k celkovému počtu inseminovaných klisen byla po první říji 36,5 %, po druhé říji 16,6 %, po třetí říji 3,9 % (RC Stáj Mustang) a 54,1 %, 11,2 %, 3,4 % (ERC Mnětice). Nadprůměrné úrovně březosti po první říji bylo dosaženo v roce 2004, 2005 (RC Stáj Mustang). Nejlepší výsledek byl zaznamenán v roce 2004 (44,2 %) a nejhorší v roce 2008 a 2006 (shodně 34,1 %), (RC Stáj Mustang). ERC Mnětice nadprůměrné úrovně březosti po 52

53 první říji dosáhlo v roce 2004, 2005, Nejlepší výsledek byl zaznamenán v roce 2005 (58,6 %) a nejhorší v roce 2008 (46,4 %). V průběhu let 2004 až 2008 došlo k nárůstu počtů inseminovaných klisen hřebci RC Stáj Mustang. Důvodem pro zvyšující se počet inseminovaných klisen jsou zřejmé organizační, zdravotní a ekonomické výhody inseminace oproti přirozené plemenitbě. Zvyšující se podíl klisen inseminovaných čerstvým spermatem poskytuje vyšší procento zabřezlých klisen. Díky zvyšujícím se početním stavům koní v ČR jsou přestárlé klisny a klisny s malou šancí na zabřeznutí z chovu vyřazovány a nahrazovány mladými klisnami od tří let věku. Tento postup je podporován snahou o zkrácení generačního intervalu, zkvalitnění genofondu sportovních koní a rychlejší testování mladých koní. S tímto záměrem jsou také chovatelům poskytovány státní dotace. Dalším faktorem ovlivňujícím úroveň březosti po inseminaci je kvalita používaných inseminačních dávek. Hřebci jsou do inseminačních stanic vybíráni mimo jiné podle kvality spermatu. Dále v souvislosti s prohlubujícími se odbornými znalostmi chovatelů dochází ke zlepšování úrovně výživy koní a chovatelských podmínek obecně. V neposlední řadě mají vliv na zabřezávání zkušenost a odborné znalosti inseminačního technika. V ERC v letech 2004 až 2005 počet inseminovaných klisen stoupal. V posledních třech sledovaných letech (2006, 2007 a 2008) došlo k poklesu počtů inseminovaných klisen. Tento pokles je způsoben přesycením trhu s koňmi, kdy prodejní ceny hříbat neodpovídají vynaloženým nákladům. Průměrná úroveň březosti dosažená po první říji a inseminaci zmrazeným spermatem ERC Mnětice je 69 %, po druhé říji 4,9 % a po třetí říji 1,2 %. Podprůměrné úrovně březosti bylo dosaženo v roce 2004 (58,3 %), 2007 (68,4 %) a v roce 2008 (60 %). V roce 2005, 2006 bylo dosaženo hodnot nadprůměrných (88,6 %, 75 %). Mírný pokles úrovně březosti po první říji je pozorován od roku 2006 do roku 2008 viz. tabulka č. 7 v příloze a graf č. 6 kde první tři sloupce zachycují úroveň březosti po první říji, další tří sloupce úroveň březosti po druhé říji a poslední tři úroveň březosti po třetí a další říji. Tento vývoj lze vysvětlit zejména zájmem chovatelů o stále širší nabídku vynikajících importovaných hřebců působících v inseminaci čerstvým spermatem za cenově výhodných podmínek, podpořených státními dotacemi na plemenitbu koní. Výhodami inseminace čerstvým spermatem jsou jednak stabilně dosahované vysoké procento březích klisen, které je srovnatelné s přirozenou plemenitbou i přesto, že jak uvádějí DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) březost po inseminaci čerstvým spermatem je o 1/3 nižší než při přirozeném páření. Výsledky inseminace a přirozené plemenitby lze 53

54 porovnávat, jen pokud jsou prováděny za srovnatelných podmínek. V přirozené plemenitbě, kdy je klisna bez předchozího vyšetření připouštěna hřebcem jen podle vnějších příznaků říje, je dosahováno úrovně březosti zpravidla do 60 %. VIDAMENT, (2005) uvádí 57 %. Pokud je ale reprodukční cyklus klisny plně kontrolován opakovaným sonografickým vyšetřením, může být v přirozené plemenitbě dosažen výsledek ještě lepší než v inseminaci čerstvým spermatem, například DOLEŽEL a KUDLÁČ (1997) uvádí 88,8 až 92,2 %. Další výhodou inseminace čerstvým spermatem je dobře propracovaná organizace odběrů a doručování spermatu. V posledních letech je u některých inseminačních stanic čerstvé sperma k disposici každý den. V případě, že si inseminační dávku inseminační technik na stanici osobně vyzvedne, je dopravena ke klisně v co možná nejkratším časovém intervalu, což výrazně zvyšuje naději na úspěšné zabřeznutí. Díky dobře zvládnuté organizaci se dnes rozvíjí i mezinárodní obchod s čerstvým spermatem. Kromě organizačních výhod je důležité také ekonomické hledisko. Připouštěcí poplatky za čerstvé sperma hřebců jsou realizovány převážně formou doplatku za březí klisnu, kdežto při inseminaci zmrazeným spermatem musí chovatel předem zakoupit několik inseminačních dávek. Další nevýhodou inseminace zmrazeným spermatem je nevhodnost jejího využití u klisen s nepříznivou reprodukční anamnézou. Graf č. 6 Úroveň březosti klisen ve sledu 1.až 3. říjového cyklu v období Úroveň březosti 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Rok RC - Stáj Mustang - čerstvé sperma ERC - Mnětice - čerstvé sperma ERC - Mnětice Mrazené sperma 54

55 5.6 Počty inseminačních dávek za období Za sledované období bylo RC Stáj Mustang vyexpedováno inseminačních dávek (ID) čerstvého spermatu. Na jednu inseminovanou klisnu (n = 1303) bylo spotřebováno průměrně 2,3 dávky. Na jednu březí klisnu (n = 742) bylo zapotřebí průměrně 4,1 dávky. Počet vyexpedovaných ID v jednotlivých letech kolísal, nejvíce jich bylo spotřebováno v roce 2007 (1 054 ID) a nejméně v roce 2004 (249 ID). Tento počet v časové řadě kopíroval vývoj počtu inseminovaných klisen. Nejvíce ID na inseminovanou i březí klisnu bylo spotřebováno v roce 2008 (2,52 a 4,61 ID). Nejméně ID na inseminovanou i březí klisnu bylo spotřebováno v roce 2005 (2,16 a 3,47). ERC Mnětice celkem vyexpedovalo inseminačních dávek z toho 297 ID zmrazeného spermatu a ID čerstvého spermatu. Na jednu inseminovanou klisnu (n = 3 682) čerstvým spermatem bylo spotřebováno 2,1 dávky. Na jednu březí klisnu (n = 2 568) bylo zapotřebí průměrně 2,9 dávky. Počet vyexpedovaných ID čerstvého spermatu kopíroval počet inseminovaných klisen. Stejně jako u RC Stáj Mustang počet vyexpedovaných ID v jednotlivých letech kolísal, nejvíce jich bylo spotřebováno v roce 2007 (1 636 ID) a nejméně v roce 2006 (1 308 ID). Nejvíce ID na inseminovanou i březí klisnu bylo spotřebováno v roce 2008 (2,2 a 3,2 ID). Nejméně ID na inseminovanou i březí klisnu bylo spotřebováno v roce 2006 (1,9 a 2,8). Na jednu inseminovanou klisnu zmrazeným spermatem (n = 245) bylo spotřebováno průměrně 1,2 dávky. Na jednu březí klisnu (n = 185) bylo zapotřebí průměrně 1,6 dávky, což je o 2,5 ID méně než RC Stáj Mustang při inseminaci čerstvým spermatem. Přesto, že za sledované období ERC Mnětice vyexpedovalo o ID více než RC Stáj Mustang, počet spotřebovaných ID na jednu březí klisnu je o 1 ID nižší. Výsledky jsou patrné z tabulky č. 2, č. 3, č. 4 v příloze a grafu č. 7, 8, 9. 55

56 Graf č. 7 Počet vyexpedovaných ID za období Počet ID Rok ERC - Mnětice čerstvé sperma RC - Stáj Mustang - čerstvé sperma ERC - Mnětice mrazené sperma Graf č. 8 Spotřebované ID na 1 inseminovanou klisnu za období ,5 2,0 1,5 Počet ID 1,0 0,5 ERC - Mnětice - čerstvé sperma RC - Stáj Mustang - čerstvé sperma ERC - Mnětice - mrazené sperma 0, Rok Graf č. 9 Spotřebované ID na 1 březí klisnu za období ,0 4,5 4,0 3,5 3,0 Počet ID 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Rok ERC - Mnětice - čerstvé sperma RC - Stáj Mustang - čerstvé sperma ERC - Mnětice Mrazené sperma 56

57 5.7 Zhodnocení inseminace čerstvým a zmrazeným spermatem Tabulka č. 3 zachycuje výsledky GLM modelu zohledňující efekty: plemenná příslušnost hřebce (plemeno), připouštěcí sezóna (rok) a způsob inseminace (inseminace čerstvým nebo zmrazeným spermatem). Všechny sledované efekty vykazují vliv na počet potřebných inseminací na zabřeznutí klisny. Tabulka č. 3 Výsledek analýzy rozptylu obecného lineárního modelu, průkaznost vlivů sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí Zdroj Součet Stupně Průměrný variability čtverců volnosti čtverec Stat F Významnost Konstanta 9795, ,126 4,415 0,0357 Plemeno 21, ,322 2,348 0,0018 Rok 24, ,149 7,370 0,0000 Způsob ins. 53, ,309 94,695 0,0000 Vysvětleno 110, ,807 8,539 0,0000 Chyba 2218, ,563 Celkem 2329, ,588 Mnohonásobným porovnáváním dle Scheffeho jsme zjistili vliv připouštěcí sezóny (rok) na počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny. Tabulka č. 4 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a připouštěcí sezónou Početní Rok zastoupení Průměr ,4573 * ,4827 * ,4911 * ,5710 * , , ,7525 * * * * Pozn.: *..P 0,05 57

58 Na základě statistického zpracování za sledované období jsme zjistili statisticky průkazné rozdíly u 4 hodnot efektu připouštěcí sezóna (rok). Největší rozdíl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny byl zjištěn mezi připouštěcí sezónou 2002 a 2006, který činil 0, Ze získaných údajů v tabulce č. 4 vyplývá, že největší počet inseminací potřebných na zabřeznutí byl v roce 2002 (1,7525) a naopak nejmenší počet inseminačních dávek potřebných na zabřeznutí byl v roce 2006 (1,4573). Tyto statisticky průkazné rozdíly v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny jsou způsobeny klimatickými podmínkami, teplotou a délkou zimního období viz. kapitola 5.8 Zhodnocení inseminace čerstvým spermatem. Na základě mnohonásobného porovnání dle Scheffeho nebyl zjištěn vliv plemenné příslušnosti hřebce na počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny. Proto bylo přihlédnuto k výsledkům následného mnohonásobného porovnávání dle Tukeye B, kde byl vliv plemenné příslušnosti hřebce zjištěn v několika případech viz. tabulka č. 5 a graf č. 10. Tabulka č. 5 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a plemenné příslušnosti hřebce Plemeno Příp. Průměr Huc Z Trak AR Holst NFP Hann CS Wels CT Old KWPN CHL Hafl SF AnPL Westf Hucul 5 1,0000 Z 7 1,0000 Trak 8 1,1250 AR 19 1,3421 Holst ,4642 * * * * NFP 53 1,5377 Hann 411 1,5427 CS 232 1,5582 Wels 137 1,5766 CT 324 1,5995 Old 460 1,6210 * KWPN 212 1,6277 CHL 206 1,6323 Hafl 202 1,6663 * SF 547 1,6668 * AnPL 17 1,8431 Westf 53 1,8491 * Pozn.: *..P 0,05 58

59 Na základě statistického zpracování za sledované období jsme zjistili statisticky průkazné rozdíly u 4 efektů plemene. Statisticky průkazný rozdíl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny byl zjištěn mezi holštýnským koněm oldenburským koněm, holštýnským koněm haflingem, holštýnským koněm selle francais a holštýnským koněm westfálským koněm. Nejmenší rozdíl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny byl mezi oldenburským koněm a holštýnským koněm, který činil 0,1568. Ze získaných údajů v tabulce č. 5 a grafu č. 10 je zřejmé, že největší počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny byl u westfálských koní (1,8491), naopak nejmenší byl u huculů (1) a koní plemene zangersheide (1). Graf č. 10 Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle plemen působících v rámci inseminace čerstvým a mrazeným spermatem 2,00 P rů mě r 1,50 1,00 0,50 0,00 Hucul Z Trak AR Holst NFP Hann CS Wels - B Plemeno CT Old KWPN CHL Hafl SF AnPL Westf PYTLOUN (1994) uvádí, že plodnost primitivních plemen koní např. hucul je vyšší než plodnost plemen kulturních např. anglický plnokrevník, což odpovídá námi zjištěným hodnotám. Jak vyplývá z grafu č. 10, počet inseminací potřebných na zabřeznutí u huculských koní odpovídá hodnotě 1, kdežto u anglických plnokrevníků dosahuje téměř hodnoty 2. Mezi těmito plemeny jsme neprokázali průkazný rozdíl, domníváme se, že je to způsobeno nízkým počtem jedinců zastoupených v rámci plemene. Podle Scheffeho jsme dále porovnávali efekt způsob inseminace viz. Tabulka č

60 Tabulka č. 6 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a způsobu inseminace Způsob inseminace Příp. Průměr Mrazené sperma Čerstvé sperma Mrazené sperma 273 1,1538 * Čerstvé sperma ,6027 * Pozn.: *..P 0,05 (statisticky průkazný rozdíl) Tabulka č. 6 vyjadřuje výsledky mnohonásobného srovnávání způsobu inseminace, který vykazuje statisticky průkazný rozdíl. Statisticky průkazně lepší způsob je inseminace zmrazeným spermatem. Při použití tohoto způsobu bylo zapotřebí 1,1538 inseminací na zabřeznutí klisny. Při inseminaci čerstvým spermatem bylo třeba 1,6027 inseminací na zabřeznutí klisny, což je o 0,4489 inseminací více než bylo zapotřebí na zabřeznutí klisny po inseminaci zmrazeným spermatem. Lepší výsledky v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí vykazuje metoda inseminace zmrazeným spermatem, tento výsledek je pravděpodobně způsoben tím, že většina klisen, byla inseminována pouze jednou v první říji, kdy zabřezlo 69 % viz. kapitola 5.5 Výsledky inseminace ve sledu prvního až třetího říjového cyklu. Jen velmi málo klisen bylo po neúspěchu v první říji nadále inseminováno zmrazeným spermatem a to z důvodů finanční náročnosti této metody. Při inseminaci zmrazeným spermatem musí chovatel předem zakoupit několik inseminačních dávek. Cena zmrazené ID je dána plemennou hodnotou hřebce a pohybuje se od Kč do Kč v některých případech však může přesáhnout i tuto částku. 5.8 Zhodnocení inseminace čerstvým spermatem V tabulce č. 7 uvádíme výsledky lineárního modelu, který v hodnocení počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny zohledňuje efekty plemenná příslušnost hřebce (plemeno), jméno hřebce (hřebec), věk hřebce a připouštěcí sezóna. 60

61 Tabulka č. 7 Výsledek analýzy rozptylu obecného lineárního modelu, průkaznost vlivů sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí Zdroj variability Součet čtverců Stupně Průměrný volnosti čtverec Stat F Významnost Konstanta 9482, ,868 4,468 0,0347 Plemeno 12, ,124 1,920 0,0325 Hřebec 32, ,156 1,975 0,0017 Věk 19, ,979 1,673 0,0305 Rok 13, ,176 3,717 0,0011 Vysvětleno 97, ,507 2,575 0,0000 Chyba 2122, ,585 Celkem 2220, ,602 Ve dvou případech sledované faktory vykazují statisticky vysoce průkazný rozdíl (P 0,01). Faktor připouštěcí sezóny (rok) a plemenné příslušnosti hřebce (plemeno) vykazují statisticky průkazný rozdíl. Mnohonásobným porovnáváním jednotlivých plemen dle Scheffeho jsme zjistili pouze jeden statisticky průkazný rozdíl mezi holštýnským koněm a selle francais, který činil 0,2111. Z údajů v tabulce č. 8 a grafu č. 11 je patrné, že největší počet inseminací potřených na zabřeznutí klisny bylo zapotřebí při inseminaci hřebci plemene westfálský kůň (1,9184) a naopak nejmenšího počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny dosáhli hřebci plemene holštýnský kůň (1,4897). 61

62 Tabulka č. 8 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a plemenné příslušnosti hřebce Plemeno Příp. Průměr Holst NFP Wels B CS Hann CT Old CHL Hafl KWPN SF Westf Holst ,4897 * NFP 53 1,5377 Wels B 129 1,5581 CS 218 1,5940 Hann 357 1,6191 CT 312 1,6194 Old 454 1,6248 CHL 195 1,6517 Hafl 202 1,6663 KWPN 194 1,6808 SF 519 1,7008 * Westf 49 1,9184 Pozn.:*..P 0,05 (statisticky průkazný rozdíl) DUŠEK (1992) a KUDLÁČ (1987) se shodují, že v rámci druhu je pohlavní aktivita, která zahrnuje plodnost, ovlivňována plemennou příslušností viz. kapitola Faktory ovlivňující plodnost. Obecně lze říci, že plodnost chladnokrevných plemen koní je o něco vyšší než u plemen teplokrevných, ale názory na toto téma se mezi jednotlivými autory liší. Porovnat zde uvedené výsledky, kdy je statistický průkazný rozdíl mezi holštýnským koněm a selle francais v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny s výsledky dosaženými dříve je prakticky neproveditelné, protože dosud nebyly srovnatelné výsledky publikovány. Námi zjištěný rozdíl v počtu potřebných inseminací na zabřeznutí klisny mezi holštýnským koněm a selle franscais je s největší pravděpodobností způsoben rozdílným počtem zapuštěných klisen. Holštýnskými hřebci za sledované období bylo zapuštěno klisen a hřebci selle franscais 519 klisen. Jak uvádí KRČOVÁ (2007), v současné době se v českém chovu z hlediska početního zastoupení uplatňují německá plemena koní a to především holštýnský kůň. Holštýnskými hřebci chovatele zapouští své klisny za účelem šlechtění na sportovní výkonnost. 62

63 Graf č. 11 Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle plemen působících v rámci inseminace čerstvým spermatem P rů mě r 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Hucul Z Trak AR Holst NFP Hann CS Wels - CT Old KWPN CHL Hafl SF AnPL Westf B Plemeno Mnohonásobným porovnáním dle Scheffeho nebyly zjištěny žádné vysoce průkazné ani průkazné rozdíly v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a věkem hřebce. Proto bylo přihlédnuto k výsledkům následného mnohonásobného porovnávání dle Tukeye B, kde se vyskytlo několik významně odlišných párů. Tabulka č. 9 ukazuje statisticky průkazný rozdíl mezi jednotlivým kategoriemi věku hřebce v deseti případech, a to mezi 14 letými a 21 letými, 5 letými a 21 letými, 13 letými a 12, 9, 10, 21 letými, 4 letými a 21 letými, 15 letými a 21 letými, 11 letými a 21 letými, a mezi 7 letými a 21 letými hřebci. Největší rozdíl počtu inseminací potřebných na zabřeznutí je mezi 14 letými a 21 letými hřebci (0,4448) a naopak nejmenší rozdíl je mezi 13 letými a 12 letými hřebci (0,2164). 63

64 Tabulka č. 9 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a věkem hřebce Věk Příp. Průměr ,4280 * ,4426 * ,4461 * * * * ,4583 * , ,4889 * , , ,5386 * , , , , ,5968 * , , , ,6625 * , ,6806 * , ,7064 * , ,8728 * * * * * * * Pozn.: *..P 0,05 (statisticky průkazný rozdíl) Statisticky průkazný rozdíl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny je mezi 4, 5, 11, 13, 14, 15 letými a 21 letými hřebci, kdy 5 letí dosahují průměrné hodnoty 1, 44 inseminací potřebných na zabřeznutí a 21 letí dosahují 1,87 inseminací, což odpovídá GAMČÍKOVI a KOZUMPLÍKOVI (1984), kteří uvádějí, že, se zvyšujícím se věkem hřebce se plodnost snižuje. Podle MÜLLERA (1999) je horní hranice plodnosti hřebců let. Hřebci se do plemenitby zařazují až po dosažení chovatelské dospělosti, která nastává mezi 3. a 4. rokem života hřebce, dříve by se v plemenitbě neměli využívat. Jak je uvedeno v tabulce č. 9 a grafu č. 12 v námi sledovaném období v rámci inseminace čerstvým spermatem byli zařazení i 3 letí hřebci, kteří dosahovali průměrného počtu 64

65 inseminací potřebných na zabřeznutí lepší hodnoty než hřebci 7, 8, 9 a 10 letí, tento rozdíl však nebyl statisticky průkazný. Graf č. 12 Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle věku hřebce Průměr 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Věk (roky) Vysoce průkazný rozdíl (P < 0,01), který je patrný z tabulky č. 7 byl zjištěn u faktoru připouštěcí sezóna. Následným mnohonásobným porovnáváním jednotlivých připouštěcích sezón dle Scheffeho jsme zjistili statisticky průkazný rozdíl ve čtyřech případech. Největší rozdíl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny byl zjištěn mezi připouštěcí sezónou 2002 a 2006 (0,2816) a nejmenší rozdíl byl zjištěn mezi rokem 2002 a 2003 (0,1653) viz tabulka č.10 a graf č. 13. Tabulka č. 10 Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a připouštěcí sezónou Rok Příp. Průměr ,5076 * ,5096 * ,5159 * ,6181 * , , ,7892 * * * * Pozn.: *..P 0,05 (statisticky průkazný rozdíl) 65

66 Připouštěcí sezóna nebo-li rok patří mezi faktory vnějšího prostředí společně s ročním obdobím, teplotou, vlhkostí vzduchu a světlem ovlivňující plodnost hřebců i klisen. Největší statisticky průkazný rozdíl jsme zjistili mezi připouštěcí sezónou 2002 a 2006, kdy v roce 2002 bylo potřeba 1,8 inseminací na zabřeznutí klisny a v roce ,5 inseminací. Tento rozdíl si vysvětlujeme délkou zimního období. V roce 2002 bylo 90 zimních dní, kdy průměrná teplota vzduchu dosahoval 4,56 ºC, což bylo nejvíce zimních dní v námi sledovaném období, a naopak v roce 2008 bylo 36 zimních dní s průměrnou teplotou vzduchu 3,30 ºC, což bylo nejméně zimních dní s nejnižší průměrnou teplotou za sledované období. Délka zimního období ovlivňuje plodnost, se kterou souvisí i počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny, především délkou světelného (fotoperiodu) a teplotou tzn., že ovlivňuje délku anestru klisen. Fotoperiodismus je rozhodujícím faktorem olivňující roční rozmnožovací cykly. Přirozené období pohlavní aktivity se objevuje pozdě na jaře nebo v létě, avšak moderní chov koní vyžaduje, aby hříbata byla narozena v lednu. Klisny musí tudíž zabřeznout časně na začátku roku (od 15. února) a tato doba do přirozeného období pohlavní aktivity koní nespadá. KUDLÁČ (1987), BUITEN a WESTERS (2003) shodně uvádějí, že požadavky na to, aby všechna hříbata narozená v daném roce měla jako datum narození 1. ledna, se v praxi projevil na řízení hormonů u samic tak, aby počátek přirozeného reprodukčního období nastal o 3-4 měsíce dříve. Možnost prodloužení či urychlení nástupu pohlavní aktivity uměle kontrolovaným světelným režimem je v chovech klisen často využívána. V průběhu zimního anestru klisny prodlužováním osvětlení s intenzitou nejméně 400 luxů (200 W žárovka pro jeden box) týdně o minut po dosažení hodinového světla za den lze indukovat nástup pohlavních cyklů (MÜLLER, 2006). Teplota je v průběhu ročního období velmi proměnlivý faktor, působí v souboru s dalšími vlivy vnějšího prostředí. Statisticky průkazné rozdíly byly i mezi připouštěcí sezónou 2002 a 2003, 2005, 2007, domníváme se, že i tyto rozdíly jsou způsobeny klimatickými vlivy. Klimatické faktory působí spolu s dalšími faktory vnějšího prostředí a proto je obtížné určit přesný podíl klimatu. 66

67 Graf č. 13 Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle jednotlivých připouštěcích sezón Průměr 1,8 1,75 1,7 1,65 1,6 1,55 1,5 1,45 1,4 1, Rok Vysoce průkazný rozdíl (P < 0,01) byl zjištěn i u faktoru hřebec. Následným mnohonásobným porovnáváním jednotlivých hřebců dle Tukeye B jsme zjistili statisticky průkazný rozdíl v pěti případech, který dokládá graf č.14. A to mezi francouzským hřebcem Palisco a holštýnským hřebcem Con Cosmos, westfálským hřebcem Werbespot a Con Cosmos, Palisco a holštýnským hřebcem Lordáno, Palisco a holštýnským hřebcem Quirado a mezi Palisco a holštýnským hřebcem Corrado II. Největší rozdíl v počtu inseminací potřebných pro zabřeznutí klisny byl zjištěn mezi hřebci Werbespot a Con Cosmos (0,5633). Nejmenší rozdíl byl mezi hřebci Palisco a Con Cosmos (0,2971). U ostatních hřebců nebyl v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny zjištěn průkazný rozdíl. Průkazné rozdíly v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny mezi hřebci jsou zřejmě ovlivněny počtem zapuštěných klisen, s čímž souvisí plemenná příslušnost hřebce, v posledních letech chovatelé upřednostňují k zapouštění svých klisen holštýnské hřebce s cílem odchovat hříbata s vynikajícím sportovním potenciálem. 67

68 Graf č. 14 Statisticky průkazný rozdíl počtu inseminací potřebných na zabřeznutí podle... hřebce za období ,50 2,00 Průměr 1,50 1,00 0,50 0,00 Con Cosm Lordano Quirado Corrado Palisco Werbespo Hřebec 5.9 Zhodnocení inseminace zmrazeným spermatem Tabulka č. 11 zachycuje výsledky analýzy GLM modelu zohledňující efekty jako je plemenná příslušnost hřebce (plemeno), připouštěcí sezóna (rok) a hřebce, kterým byla klisna zapouštěna. Statisticky průkazný rozdíl byl zjištěn u efektu hřebec. U efektu připouštěcí sezóna (rok) a plemenna příslušnost hřebce (plemeno) statistický rozdíl zjištěn nebyl. Tabulka č. 11 Výsledek analýzy rozptylu obecného lineárního modelu, průkaznost vlivů sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí Součet Stupně Průměrný Zdroj variability čtverců volnosti čtverec Stat F Významnost Konstanta 363, ,462 14,511 0,0008 Hřebec 19, ,210 1,422 0,0248 Plemeno 0, ,006 0,039 0,9992 Rok 0, ,107 0,723 0,6313 Vysvětleno 32, ,319 2,166 0,0000 Chyba 25, ,147 Celkem 57, ,212 68

69 Na základě statisticky průkazného rozdílu u efektu hřebec jsme mnohonásobným testováním dle Tukeye B zjistili statisticky průkazný rozdíl ve sto případech. Statisticky průkazný rozdíl 1,7619 byl mezi Čukar a všemi ostatními hřebci kromě Limbus a Florencio. Dále byl statisticky průkazný rozdíl zaznamenán mezi Colin a Acorado, Aligátor Fontaine, Arras, Carthago, Corsár, Orido, Orlando, Quidam`s Rubin a Rotspon, u těchto hřebců byla hodnota rozdílu (0,875) a u Alaube Z byl rozdíl 0,775, tato hodnota je zároveň nejnižší. Domníváme se, že vlivem nízkého počtu zapuštěných klisen, který byl pravděpodobně způsoben technickou náročností provedení inseminace zmrazeným spermatem a vysokými finančními náklady, nebyl zjištěn žádný průkazný rozdíl u ostatních hřebců. Statisticky průkazné rozdíly v počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny mezi hřebci působící v inseminaci v rámci zmrazeného spermatu jsou ovlivněny počtem zapuštěných klisen, který souvisí s kvalitou hřebce a jeho plemennou příslušností. V posledních letek chovatelé upřednostňují k zapouštění svých klisen holštýnské hřebce s cílem odchovat hříbata s vynikajícím sportovním potenciálem. Jelikož se jedná o organizačně a finančně náročnou metodu, většina klisen byla zapuštěna pouze jednou a v případě neúspěchu nebyly klisny znovu zmrazeným spermatem inseminovány, což nám u některých hřebců objasňuje malý počet zapuštěných klisen. Zmrazené ID chovatelům umožňují využívat špičkové hřebce v mezinárodním měřítku nebo použití mraženého spermatu od hřebců, kteří už nežijí. 69

70 6. ZÁVĚR Diplomová práce se zabývá problematikou moderní biotechnologické metody umělé inseminace koní a srovnává výsledky inseminace čerstvým spermatem Reprodukčního centra Stáj Mustang (RC Stáj Mustang) a Equinního reprodukčního centra v Pardubicích Mněticích (ERC Mnětice) za období pěti připouštěcích sezón V rámci Equinního reprodukčního centra v Pardubicích Mněticích byl dále hodnocen počet inseminací potřebných na zabřeznutí klisny za období při zohlednění efektů plemenná příslušnost hřebce, věk hřebce, připouštěcí sezóna a hřebec. Získané hodnoty byly zpracovány metodou GLM. Na základě vyhodnocení výsledků inseminace čerstvým spermatem za období je patrné, že ERC Mnětice dosáhuje lepších výsledků, než RC Stáj Mustang. Za sledované období zapustli hřebci RC Stáj Mustang klisen, z nichž zabřezlo 742 klisen, to představuje 56,55 % úroveň březosti. Hřebci ERC Mnětice zapustili klisen, z nichž zabřezlo klisen, což přestavuje 67,72 % úroveň březosti. Přesto, že po inseminaci hřebci ERC Mnětice nezabřezlo o 545 klisen více než po inseminaci hřebci RC Stáj Mustang, procento nezabřezlých klisen je 8, 4 % nižší než v případě RC Stáj Mustang. ERC Mnětice se zabývá prodkukcí zmrazených ID, průměrná hodnota úrovně březosti po inseminaci zmrazeným spermatem se pohybovala okolo 75,5 %, což je o 18,6 % vyšší než je úroveň březosti klisen po inseminaci čerstvým spermatem hřebci RC Stáj Mustang. Domníváme se, že tento rozdíl je způsoben tím, že pro některé hřebce RC Stáj Mustang byly zkráceny připouštěcí sezóny z důvodů jejich sportovní kariéry. Co se týká počtu inseminačních dávek (ID), RC Stáj Mustang za sledované období vyexpedovalo ID, což představuje 2,3 ID na jednu inseminovanou klisnu a 4,1 ID na jednu březí klisnu. ERC Mnětice celkem vyexpedovalo ID z toho ID čerstvého spermatu. Na jednu isneminovanou klisnu bylo zpotřebováno 2,1 ID a na jednu březí 2,9 ID. Na jednu inseminovanou klisnu zmrazeným spermatem bylo spotřebováno průměrně 1,2 ID a na jednu březí 1,6 ID, což je o 2,5 ID méně než RC Stáj Mustang při inseminaci čerstvým spermatem. Přesto, že za sledované období ERC vyexpedovalo o ID více než RC Stáj Mustang, počet spotřebovaných ID na jednu březí klisnu je o 1 ID nižší. Těchto výsledků by nemohlo být dosaženo bez využití sonografické techniky. Sonografie je moderní metoda umožňující spolehlivé určení 70

71 optimální doby k inseminaci klisny, rannou diagnostiku březosti (od 12tého dne od posledního připuštění), detekci, případně následnou redukci dvojčat, včasné odhalení patogenních stavů a reprodukčních anomálií pohlavních orgánů klisny - možnost předcházení reprodukčním problémům, případně možnost včasného terapeutického zásahu. Vzhledem k těmto skutečnostem je v dnešní době provádění inseminace klisen bez využití sonografického přístroje prakticky nemyslitelné. Proto tedy doporučuji využití služeb inseminačního technika, který disponuje sonografem. V rámci ERC Mnětice za období sedmi připouštěcích sezón byla hodnocena metoda inseminace čerstvým a mrazeným spermatem. Na základě statistického zpracováni jsme zjistili průkazný rozdíl mezi počtem inseminací a připouštěcí sezónou, tento rozdíl byl největší v roce 2002 (1,7525) a naopak nejmenší v roce 2006 (1,4573). Rozdíl si vysvětlujeme délkou zimního období, která ovlivňuje plodnost, se kterou souvisí i počet inseminací potřebných pro zabřeznutí klisny, především délkou světelného dne (fotoperiodu) a teplotou tzn., že ovlivňuje délku anestru klisen. Fotoperiodismus je rozhodujícím faktorem olivňující roční rozmnožovací cykly. Dále jsme zjistili statisticky průkazné rozdíly mezi plemeny, holštýnský kůň a oldenburský kůň, haflingem, selle francais a westfálským koněm. V současné době se v českém chovu z hlediska početního zastoupení uplatňují německá plemena koní a to především holštýnský kůň. Holštýnskými hřebci chovatele zapouští své klisny za účelem odchovat hříbata s vynikajícím potencionálem a tím šlechtit na sportovní výkonnost. Statisticky průkazně lepší v našem sledování je způsob inseminace zmrazeným spermatem, kdy za sledované období bylo zapotřebí 1,2 inseminací na zabřeznutí klisny, kdežto při inseminaci čerstvým spermatem bylo třeba 1,6 inseminací. Počet inseminací potřebných na zabřeznutí statisticky průkazně ovlivňuje stáří hřebce (při inseminaci čerstvým spermatem), kdy se zvyšujícím se věkem hřebce stoupá počet inseminací potřebných pro zabřeznutí. V praktických podmínkách chovu koní se v současné době nejvíce uplatňuje inseminace krátkodobě konzervovaným spermatem. Tato reprodukční metoda je ve srovnání s přirozenou plemenitbou mnohem náročnější na znalosti a zkušenosti, i když v podmínkách široké praxe přináší dobré výsledky březosti klisen a předčí přirozenou plemenitbu, je třeba hledat zdroje dalšího zlepšení. 71

72 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. Asbury, A. C.: The reproductive systém. Equine Medicine and Surgery., 2, 3, s Bielaňski, W.: Rozród zwierzat. Warszawa: Paňstwowe wydawnictwo rolnicze i lesne, s. 3. Bílek, F.: Speciální zootechnika - Chov koní. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, s. 4. Buiten van A., Westers, P.: Male, female and management risk factors for non return to service in Dutch mares. Preventive Veterinary Medicíně., vol. 61, 2003, s Doležel, R., Kudláč, E.: Veterinární gynekologie. Brno : Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, s.. 6. Dušek, J., a kol.: Chov koní. Praha: Nakladatelství Brázda s. ISBN Dušek, J., a kol.: Chov koní v Československu. Praha: Nakladatelství Brázda s. ISBN X. 8. Döcke, F.: Neurohumorale grundlagen der fortpflanzung beim pferd. Monatshefte fur Veterinarmedizin., 37, 1982, č. 5, s Franklin, F.: Breeding Your mare with frozen/ thawed semen. Veterinary corner, Dostupné z < citováno Gamčík, P., Kozumplík, J.: Andrologie a umělá inseminace hospodářských zvířat. Brno: Vysoká škola veterinární, s. 11. Grygar, I., Kudláček, E.: Ultrasonografie ve veterinárním porodnictví a gynekologii. Hlučín: Slezan s. ISBN Hrouz, J., Šubrt, J.: Obecná zootechnika. Brno, Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2000, 205 s. ISBN Katila, T.: Effects of hormone treatments, season, age and type of mares on ovulation, twinning and pregnancy rates of mares inseminated with fresh and frozen semen, Pferdeheilkunde., 19 (6), Kliment, J. a kol.: Reprodukcia hospodárskych zvierat. Bratislava: Príroda, s. 72

73 15. Kopecký, J. a kol.: Speciální chov hospodářských zvířat I. Praha: Státní zemědělské nakladatelství s. 16. Krčová, S.: Zhodnocení významu hannoverského koně ve šlechtění českého teplokrevníka. Brno: Diplomová práce, Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Kudláč, E.: Některé zvláštnosti pohlavního cyklu a říje u klisen. Veterinářství, 37, 1987, č. 5, s Kudláč, E., Elečko, J.: Veterinární porodnictví a gynekologie. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, s. 19. Kuisma, P., Andersson, M.: Fertility of frozen-thawed stallion semen cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Vet Scand., 48 (1), Loomis, P. R., Squires, E. L.: Frozen semen management in equine breeding programs, Dostupné z < citováno Louda, F., a kol.: Inseminace hospodářských zvířat. Praha: Česká zemědělská univerzita s. ISBN Majzlík, I.: Chov zvířat I. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze s. ISBN X. 23. Máchal, L.: Ústní sdělení Reprodukční biotechnologie v chovu koní, 4/2009, Brno, Česká republika 24. Machek, J.: Plemenářský zákon a chov koní. Náš chov, 2002, č. 9, s Mamica, O., Máchlal, L., Severa, L., Šábová, L.: Konduktivita a viskosita ejakulátu hřebců. Sborník referátů ze semináře: Aktuální problémy chovu a šlechtění koní v ČR. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, NH Kladruby nad Labem hřebčín Slatiňany ISBN Misař, D., Jiskrová, I.: Chov a šlechtění koní. Brno, Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2001, 170 s. ISBN Müller, Z.: Reprodukce koní. In: Dušek, J., a kol.: Chov koní. Praha: Nakladatelství Brázda s. ISBN Müller, Z.: Nové reprodukční metody v Plemenitbě koni. Sborník referátů ze semináře: Chov koní v současných ekonomických podmínkách. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, NH Kladruby nad Labem ISBN

74 29. Pycock, J. F.: Uterine ultrasond characteristics and steroid correlation, Dostupné z < Equine-reproducktion.com>, citováno Pytloun, J. a kol.: Chov hospodářských zvířat I. Praha: Vysoká škola zemědělská, 1994 s ISBN Rob, O., Herčík, J.: Inseminace I, II. Praha: Vysoká škola zemědělská, s. 32. Rob, O., Stehlík, I.: Reprodukce hospodářských zvířat. Praha: Vysoká škola zemědělská v Praze, s. 33. Říha, J. a kol.: Plemenitba hospodářských zvířat. Rapotín: s. ISBN Schulz, J.: Veterinárno chovatelská kontrola reprodukcie koní. Bratislava: Príroda, s. 35. Věžník, Z. a kol.: Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky speratoanalýzy. Brno: Výzkumný ústav veterinárního lékařství, s. ISBN Věžník, Z. a kol.: Současné problémy v reprodukci koní v ČR. Sborník referátů ze semináře: Aktuální problémy chovu a šlechtění koní v ČR. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, NH Kladruby nad Labem hřebčín Slatiňany ISBN Věžník, Z. a kol.: Hodnocení semene pro asistovanou reprodukci a výběr plemeníků. Brno: Výzkumný ústav veterinárního lékařství, s 38. Vidament, M.: French field result ( ) on factors affecting fertility of frozen stallion semen, Dostupné z <http//: citováno Vohradský, F.: Porodnictví a prevence poruch reprodukce. Praha: Vysoká škola zemědělská, s. 40. Wintzer, H. J.: Choroby koní. Bratislava: Nakladatelství Hajko a Hajková s. ISBN Zeman, L. a kol.: Výživa a krmení hospodářských zvířat. Praha: Nakladatelství Profi Press s. r. o ISBN

75 8. SEZNAM TABULEK A GRAFŮ - Tab. č. 1 - Úroveň pohlavních funkcí u teplokrevných a chladnokrevných hřebců - Tab. č. 2 - Základní ukazatelé nativního ejakulátu hřebce - Tab. č. 3 - Výsledek analýzy rozptylu obecného lineárního modelu, průkaznost vlivů sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí - Tab. č. 4 - Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a připouštěcí sezónou - Tab. č. 5 - Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a plemenné příslušnosti hřebce - Tab. č. 6 - Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny a způsobu inseminace - Tab. č. 7 - Výsledek analýzy rozptylu obecného lineárního modelu, průkaznost vlivů sledovaných efektů na počet inseminací potřebných na zabřeznutí - Tab. č. 8 - Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a plemenné příslušnosti hřebce - Tab. č. 9 - Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a věkem hřebce - Tab. č Výsledky následného testování podle počtu inseminací potřebných na zabřeznutí a připouštěcí sezónou - Graf. č. 1 - Počet hřebců působících v rámci inseminace čerstvým spermatem - Graf. č. 2 - Úroveň březosti po inseminaci čerstvým spermatem - Graf č. 3 - Zapuštěné a březí klisny žebříček nejlepších hřebců - Graf č. 4 - Zapuštěné a březí klisny žebříček nejhorších hřebců - Graf č. 5 - Úroveň březosti klisen po inseminaci zmrazeným spermatem - Graf č. 6 - Úroveň březosti klisen ve sledu 1.až 3. říjového cyklu v období Graf č. 7 - Počet vyexpedovaných ID za období Graf č. 8 - Spotřebované ID na 1 inseminovanou klisnu za období Graf č. 9 - Spotřebované ID na 1 březí klisnu za období Graf č Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle plemen působících v rámci inseminace čerstvým a mrazeným spermatem - Graf č Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle plemen působících v rámci inseminace čerstvým spermatem 75

76 - Graf č Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle věku hřebce - Graf č Srovnání počtu inseminací potřebných na zabřeznutí klisny podle jednotlivých připouštěcích sezón - Graf č Statisticky průkazný rozdíl počtu inseminací potřebných na zabřeznutí podle hřebce za období

77 9. PŘÍLOHY 9.1 Seznam příloh Příloha č. 1 : Obrazová příloha - Obr. č. 1 - Spermie hřebce - Obr. č. 2 - Sonograf - Obr. č. 3 Odběr spermatu hřebce - Obr. č. 4 Inseminační brašna - Obr. č. 5 - Sonografické vyšetření klisny - Obr. č. 6 - Inseminace klisny - Obr. č. 7 - Gráfůf folikul těsně před ovulací - Obr. č. 8 - Březost klisny ve stadiu 12. dní - Obr. č. 9 - Březost dvojčat ve stáří 14 dnů - Obr. č Embryo ve stáří 36 dní - Obr. č Zárodek ve stáří 56 dní - Obr. č Hříbě ve věku 3 dny Příloha č. 2 : Tabulky - Tab. č. 1 Počet hřebců působících v rámci inseminace čerstvým spermatem - Tab. č. 2 Výsledky inseminace čerstvým spermatem za období RC Stáj Mustang - Tab. č. 3 Výsledky inseminace čerstvým spermatem za období ERC Mnětice - Tab. č. 4 Výsledky inseminace zmrazeným spermatem za období ERC Mnětice - Tab. č. 5 Úroveň březosti klisen po jednotlivých hřebcích za období RC Stáj Mustang (inseminace čerstvým spermatem) - Tab. č. 6 - Úroveň březosti klisen po jednotlivých hřebcích za období ERC Mnětice (inseminace čerstvým spermatem) - Tab. č 7 Úroveň březosti klisen ve sledu 1.až 3. říjového cyklu v období

78 PŘÍLOHA č. 1 : Obrazová příloha Obrázek č. 1 spermie hřebce (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). Obrázek č. 2 Sonograf (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). 78

79 Obrázek č. 3 Odběr spermatu hřebce (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). Obrázek č. 4 Inseminační brašna (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). 79

80 Obrázek č. 5 Sonografické vyšetření klisny (ZAVADIL, 2006). Obrázek č. 6 Inseminace klisny (LOUDA a kol., 2001). 80

81 Obrázek č. 7 Gráfůf folikul těsně před ovulací (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). Obrázek č. 8 Březost klisny ve stadiu 12. dní (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). 81

82 Obrázek č. 9 Březost dvojčat ve stáří 14 dnů (ZAVADIL, 2006). Obrázek č. 10 Embryo ve stáří 36 dní (MÜLLER, Dostupné z < 82

83 Obrázek č. 11 Zárodek ve stáří 56 dní (MÜLLER, Dostupné z < equine.cz>). Obrázek č. 12 Hříbě ve věku 3 dny (NOVOHRADSKÁ, 2006). 83