Instrumentální metody biochemie a biofyziky

Transkript

1 Instrumentální metody biochemie a biofyziky Bezpečnost práce v laboratoři Strategie izolace, příprava vzorků Chromatografické metody Elektromigrační metody Imunochemické metody Centrifugační metody Spektroskopické metody Hmotnostní spektroskopie Zjišťování struktury látek

2 Bezpečnost práce v laboratoři Obecné doporučení a zásady práce v laboratoři: Nošení ochranných pomůcek (laboratorní plášť, ochrana očí, kontaktní čočky) V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit Experimentátor se musí seznámit s vlastnostmi látek, které používá při své práci Je zakázáno pipetování ústy Během nebezpečných experimentů nepracujeme v laboratoři sami Neprovádíme nedovolené experimenty V laboratoři by se neměly bez dozoru pohybovat nepoučené osoby

3

4 Linec JKU 2010 Katedra organické chemie

5 Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty

7 Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty Autorizace není potřeba pokud množství manipulované látky nepřekročí 1 t za kalendářní rok ( 18 čl.2, zákon 157/1998 Sb)

12 Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty Bezpečnostní list ( 23 zákona 356/2003 Sb.) Příloha k vyhlášce č. 231/2004 Sb. Podrobný obsah bezpečnostního listu Na první straně bezpečnostního listu se uvede datum jeho vydání. 1. Identifikace látky nebo přípravku a výrobce nebo dovozce 2. Informace o složení přípravku 3. Údaje o nebezpečnosti látky nebo přípravku 4. Pokyny pro první pomoc 5. Opatření pro hasební zásah 6. Opatření v případě náhodného úniku látky nebo přípravku 7. Pokyny pro zacházení s látkou nebo přípravkem a skladování látky nebo přípravku 8. Omezování expozice látkou nebo přípravkem a ochrana osob 9. Informace o fyzikálních a chemických vlastnostech látky nebo přípravku 10. Informace o stabilitě a reaktivitě látky nebo přípravku 11. Informace o toxikologických vlastnostech látky nebo přípravku 12. Ekologické informace o látce nebo přípravku 13. Pokyny pro odstraňování látky nebo přípravku 14. Informace pro přepravu látky nebo přípravku 15. Informace o právních předpisech vztahujících se k látce nebo přípravku 16. Další informace vztahující se k látce nebo přípravku

13

14 Strategie izolace (biologických) látek Strategie a plánování Předem nutné znát k čemu bude izolovaná látka používána co je jejím nejvhodnějším zdrojem k izolaci začít přípravu v knihovně nebo na internetu izolace a přečištění biologické látky většinou není konečným cílem práce analytické účely - menšího množství látky strukturní studie - množství větší látky výsledná cena produktu - faktor rychlosti x faktor ekonomický zdroj - látka stabilní, ve velkém množství, bez vedlejších produktů izolace látek z geneticky manipulovaných organizmů Znalosti základních chemických a fyzikálních vlastností Každá látka má svou jedinečnou kombinaci vlastností, kterou lze využít k její izolaci a charakterizaci

15 Postup izolací desintegrace materiálu extrakce hrubá separace jemná separace zahuštění skladování

16 Kritéria výběru izolačních a purifikačních metod Kapacita množství vzorku, které lze zpracovat Rozlišení schopnost rozdělení látek s velmi podobnými vlastnostmi Výtěžek poměr množství izolované látky ve směsi před a po izolaci Cena finanční náročnost

17 Extrakce Prvním krokem - příprava hrubého extraktu Extrakt látek vylučovaných do mimobuněčného prostoru K extrakci vnitrobuněčných látek - nutné buňky rozbít Volba vhodného extrakčního roztoku ph (nejčastěji ph 7 8 s použitím pufrů jako je Tris nebo fosfátový pufr) iontová síla (přidání anorganických solí) osmotický tlak (vyrovnání tlaku přidáním různých solí nebo cukrů o koncentraci 0,2 0,4 M)

18 Dále mohou extrakční pufry obsahovat jiné důležité látky: antioxidanty EDTA inhibitory enzymů enzymové substráty a kofaktory polyvinilpyrrolidone (PVP), hovězí serumalbumin (BSA) azid sodný

19 Desintegrace materiálu - homogenizace Živočišné buňky - plasmatická membrána, cytoskelet - relativně křehké Rostlinné buňky - buněčná stěna - dosti pevná, lze snadno narušit Gram pozitivní i Gram negativní baktérie - peptidoglykanová buněčná stěna stěna Gram negativních bakterií - lipopolysacharidová vrstva

20 Desintegrace materiálu - homogenizace Mixování mixéry, blendery Tření s abrazivy válec s pístem, bead beater Rychlá dekomprese - French Press Ultrazvuk (sonikace) Opakované zmražení a rozmražení Použití enzymů lysozym u baktérií, chitinasa u hub Osmotický šok Použití alkálií látka je stabilní při vysokém ph

21 Desintegrace materiálu - mixéry

22 Desintegrace materiálu - dekomprese

23 Desintegrace materiálu - sonikátor

24 Srážení metoda, která se nejčastěji používá k hrubému přečištění a zahuštění biologických látek, hlavně proteinů. Princip vysolování a hydratace bílkovin Srážení solemi - vysolování, vsolování (NH 4 ) 2 SO 4 Srážení organickými látkami, (aceton, PEG)

25 Ultrafiltrace Ultrafiltrace se může použít nejenom k zahušťování nebo filtraci vzorků, ale i k výměně pufrů nebo odstranění detergentů. NMWC (nominal molecular weight cut-off) pro proteiny NCO (nucleotide cut-off) pro nukleové kyseliny hodnota NMWC/NCO - o 20% menší než je velikost požadovaného proteinu Membrány se musí skladovat ve roztoku, aby nedošlo k jejich vyschnutí a popraskání. Do skladovacího roztoku je vhodné přidat látky zabraňující růstu mikroorganismů jako např. 10% ethanol nebo 0,1% azid sodný.

26 OBRÁZKY ULTRAFILTRAČNÍ MEMBRÁNY A) Řez ultrafiltrační membránou. V horní části je tenká část ultrafiltrační membrány, ve spodní části je vysoce propustný podpůrný nosič. Elektonový mikroskop, zvětšení 650 x. B) Schematické znázornění ultrafiltrační membrány s filtrovanými částicemi.

27 Ultrafiltrační zařízení pod tlakem inertního plynu nebo pomocí centrifugační síly Ultrafiltrace za pomoci stlačeného plynu. Ultrafiltrace za pomoci odstředivé síly.

28

29

30 Dialýza roztok směsi - oddělen polopropustnou membránou od čistého pufru

31 Dialýza Velikost pórů je určena stejně jako u ultrafiltračních membrán hodnotou NMWC. dialyzační membrány - tvar střívka Použitím dialyzační membrány lze vzorky i zahušťovat střívko se vzorkem se vloží do vysušeného práškového hydrofilního polymeru (např. vysokomolekulární polyethylen glykol, plyvinilpyrolidon nebo třeba Sephagex)

32

33 Detergenty povrchově aktivní organické sloučeniny skládají se z hydrofobní a hydrofilní části

34 Detergenty se mohou dělit podle i) náboje a charakteru části hydrofilní a ii) chemické podstaty části hydrofobní. Hydrofilní část Aniontové - negativně nabité karboxylové, sulfátové nebo sulfonátové skupiny Kationtové - pozitivně nabité části nejčastěji kvartérně vázaný dusík Amfolitické (Zwitteriontové) - nesou jak negativní tak pozitivní náboj Neiontové - nenesou žádný náboj, přítomnost hydroxylových skupin - cukry a polyoxyethyleny. Hydrofobní část jednoduchý uhlovodíkový řetězec rozvětvený uhlovodíkový řetězec steroidní skupina

35 Fyzikálně-chemické vlastnosti detergentů Kritická micelární koncentrace (CMC) - koncentrace, při které se začínají vytvářet micely detergentu Agregační číslo N - počet molekul tvořících jednu micelu detergentu. Kritická micelární teplota (CMT) - přechod mezi krystalickou a micelární nebo monomerní fází Kraftův bod - průsečíkem křivky CMC a CMT. Cloud point - teplota při které dochází k vytváření superagregátů detergentů (typická pro polyethoxylované neiontové detergenty, např. Triton)

36

37 Faktory ovlivňující účinek detergentů Nejvýznamnějšími faktory ovlivňující účinek detergentů jsou: teplota ph iontová síla koncentrace detergentu přítomnost bivalentních iontů přítomnost nečistot

38 Použití detergentů v biochemickém výzkumu izolace integrálních membránových proteinů rekonstituce membránových proteinů příprava liposonů všude tam, kde se pracuje s membránovými proteiny Mechanismus účinku detergentů 1. Při nízkých koncentracích detergentu 2. Zvyšující se poměr detergent : lipid 3. Vysoké koncentrace detergentu

39 Příklady odstranění nebo výměny detergentu Precipitace proteinu acetonem, toluenem, polyethylen glykolem. Precipitace detergentu výměnou iontů Na+ za K+ u dodecylsulfátu sodného, precipitace detergentů na bázi karboxylové skupiny bivalentními ionty. Chromatografické metody vazba detergentu nebo proteinu na kolonu za použití např. Bio-Beads. Centrifugace v sacharozovém gradientu. Dialýza u detergentů s vyšší hodnotou CMC a menší velikostí micel. Detergent může být také postupně odstraňován z dializačního pufru pomocí adsorpce na chromatografické nosiče. Ultrafiltrace roztoků které jsou před ultrafiltrací zředěným pufrem tak, aby koncentrace detergentu byla nižší než je jeho CMC

40 Princip tvorby bublin detergentem

41

42 Měření ph Kyselost vodných roztoků je dána přítomností hydroxoniových iontů H 3 O + a je úměrná koncentraci těchto iontů H 2 O + H 2 O = H 3 O + + OH - Součin koncentrací iontů (iontový součin vody) K v = [H 3 O + ] [OH - ] v závislosti na teplotě je roven přibližně koncentrace hydroxylových a hydroxonioných iontů je tedy rovna [H3O + ] = [OH - ] = ph je v praxi definováno jako ph = -log [H 3 O + ] ph vody je ~ 7 (Sorensen Dánský biochemik)

43 Měření ph ph se měří skleněnou elektrodou a referenční elektrodou, které jsou obvykle spojené v jeden kus skleněné nebo plastové ph elektrody ph elektroda je tvořena 1) tuhou skleněnou membránou o tloušťce přibližně 5 μm 2) vnitřním elektrolytem nejčastěji 0,1 M HCl 3) elektrolytem referenční elektrody nejčastěji nasycený roztok KCl 4) vnitřní argentchloriodovou Ag/AgCl nebo kalomelovou Hg/Hg 2 Cl 2 elektrodou 5) nevodivým tělem elektrody 6) referenční elektrodou nejčastěji stejného typu jako je vnitřní elektroda 7) vodivým spojením mezi roztokem a referenční elektrodou

44 Měření ph

45 Měření ph volt metr Na tenké skleněné stěně elektrody dochází k iontové výměně Na + a Li + iontů ze skla za H + ionty z roztoku a vzniká tak elektrický potenciál na této skleněné membráně V E konst 2,303RT F ph

46 ph se v laboratoři měří pomocí ph metru jako rozdíl mezi napětím standardu a měřeného rozroku Standardy jsou většinou komerční pufry o známém ph při dané teplotě Může se jednat o: Měření ph i) primární standardní roztoky podle normy NIST DIN o hodnotě ph (25 o C) 4,005; 6,865; 7,413; 9,180 a 10,012 nebo o ii) sekundární standardní roztoky u nichž je hodnota ph již upravena a zkalibrována vzhledem k primárním standardům ph (?) ph S E (? S ) F 2,303RT ph S - je hodnota ph standardu u něhož je přesně známa hodnota ph při určité teplotě NIST National Institute of Standards and Technology

47 Měření ph Kalibrace ph metr musí být zkalibrovaný nutné znát typ ph metru a formy kalibrace Kalibrační křivka 2 bodová kalibruje se buď do kysela nebo do zásadita a je tedy nutné ph metr vždy překalibrovat Kalibrační křivka vícebodová není nutná nová kalibrace při přechodu z kyselé do zásadité oblasti NIST National Institute of Standards and Technology

48 Měření ph Důležité vedlejší efekty, které mohou nastat při měření ph Koncentrační efekt Ovlivnění okolními ionty Teplotní efekt závislost ph na teplotě Sodný efekt interference sodných iontů v roztoku se sodnými ionty skla

49 Kompatibilita, výběr vhodné elektrody Vysoká telpota - Ag/AgCl elektrody Vysoké ph elektrody ze speciálního skla odolného vysokému ph Měření emulzí výběr správného vodivého spojení (junction) Interference chloridových iontů Ag/AgCl elektrod se vzorkem Interference rtuťnatých iontů kalomelových elektrod se vzorkem Vysoká koncentrace solí a iontová síla - výběr správného vodivého spojení (junction) Tris pufry, sulfidy, proteiny, Br -, I - mohou tvořit komplexní sloučeniny s Ag/AgCl elektrodami, které vedou k ucpání vodivého spojení V těchto případech je nutné používat elektrodu kalomelovou Nevýhody Měření ph kalomelové elektrody nemohou být použity při teplotách nad 80 o C tyto elektrody obsahují rtuť, tyto ionty mohou interagovat s měřeným vzorkem a tak mohou nastat problémy s biokompatibilitou

50

51

52 Měření ph a pufry Co je pufr? Pufry jsou látky, které v roztoku tlumí změny ph po přidání kyseliny nebo zásady. Kyselé a zásadité pufrující roztoky Nejčastěji se jedná o směsi slabých kyselin nebo zásad a jejich solí. Silné kyseliny jsou plně disociované, potřebujeme takové prostředí, ve kterém je dostatek iontů ale i dostatek nedisociované kyseliny.

53 Měření ph a pufry Kyselé a zásadité pufrující roztoky Nejčastěji se jedná o směsi slabých kyselin nebo zásad a jejich solí. Jak pufry pracují? Kyselina octová je slabá kyselina a její rovnováha je tudíž ne levé straně reakce: Přidáme-li sůl této kyseliny: zvýší se koncentrace těchto iontů v roztoku a rovnováha se posune ještě dále do leva Roztok bude mít tyto vlastnosti: více molekul nedisociované kyseliny více iontů kyseliny

54 Měření ph a pufry Přidáme-li k této směsi kyselinu H+ ionty H+ ionty budou reagovat s ionty kyseliny octové za vzniky nedisociované kyseliny Z roztoku se odstraní přidane H+ ionty a ph se změní jen minimálně. Přidáme-li k této směsi zásadu OH- ionty Ionty OH- budou reagovat s nedisociovanou kyselinou za vzniku vody a iontů kyseliny octové. Z roztoku se odstraní nadbytečné OH- ionty. ph se změní pouze nepatrně.

55 Titrační křivka Pokud do roztoku pufru přidáváme postupně zásadu, stoupá ph podle závislosti, která se jmenuje titrační křivka. Tato křivka má vodorovnou část v okolí pka kyseliny, kde má pufr největší pufrační kapacitu. Titrační křivka pro acetátový pufr pka 4.76

56 V případě vícesytné kyseliny, např. fosfátového pufru, dochází k pufrování roztoku kolem všech pka.

57 Pufrační kapacita Množství přidané kyseliny nebo báze na jednotkovou změnu ph β = ΔC b / ΔpH Maximální pufrační kapacita je v oblasti, kde se ph rovná pka Příklady pufrační kapacity některých pufrů

58 Příklad některých nejpoužívanějších pufrů v biochemickém výzkumu

59 Měření ph a pufry Tabulka nejběžněji používaných Goodsových pufrů (Zwitteriontové pufry)