KURZ ZÁKLADNÍCH METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Transkript

1 EKOTECH KURZ ZÁKLADNÍCH METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Biologické centrum AV ČR, České Budějovice Lektoři: Radmila Čapková Frydrychová Miroslava Sýkorová Jindra Šíchová Václav Brož

2 OBSAH STR. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ. 1 ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE DNA... 4 SPEKTROFOTOMETRICKÉ VYHODNOCENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN 7 IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN. 8 PRECIPITACE A ZAHUŠŤOVÁNÍ DNA. 14 ŠTĚPEDNÍ DNA: RESTRIKTÁZY 15 SYNTÉZA cdna 17 KLONOVÁNÍ 19 PCR.. 27 SOUTHERNOVA HYBRIDIZACE.. 33 WESTERN BLOT. 39 SEZNAM A PŘÍPRAVA CHEMIKÁLIÍ 41

3 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků PŘÍPRAVA ROZTOKŮ Příprava roztoků patří k nejzákladnější činnosti v laboratoři, od které se odvíjí všechny následné experimenty. Z toho důvodu je třeba přípravě roztoků věnovat velkou pozornost a preciznost. Při přípravě roztoků dbáme na několik základních kroků: 1. Výpočet: stanovení množství látky a vody 2. Rozpuštění látky: Pro přípravu roztoků zpravidla využíváme destilovanou vodu, pro speciální roztoky tzv. miliq vodu. Rozpouštění urychlujeme magnetickými míchadélky. Pro zdárné rozpuštění některých roztoků je nutné zásadité ph, takže např. EDTA se rozpouští za přítomnosti NaOH. 3. Úprava ph: ph je upravováno jen u některých roztoků. Pro úpravu ph používáme nejčastěji ph metr, případně ph papírky. ph upravujeme pomocí 1M NaOH nebo 1M HCl. ph se upravuje v přibližně 80 procentech výsledného objemu. Tzn., pokud máme připravit 1l roztoku, chemikálii nejprve rozpustíme v takovém množství vody, aby objem měl 0,8l. Upravíme ph na požadovanou hodnotu a roztok doplníme na 1l. 3. Filtrace: ve většině případů se neprovádí 4. Sterilizace: Sterilizaci nejčastěji provádíme autoklávováním a výjimečně filtrací (např. roztok BSA by se autoklávováním zničil). Láhev s roztokem může být opatřena sterilizační páskou, která indikuje, že roztok byl vysterilizován autoklávem. 5. Štítek: Láhev s roztokem se řádně označí štítkem, který uvádí název roztoku, koncentraci, datum a případně jméno toho, kdo roztok připravil. Množství látky v roztoku může být charakterizováno: 1. Molaritou (např. 1M NaCl) Využíváme údaj o molární hmotnosti, který zpravidla bývá uveden na obalu chemikálie. Příklad 1: molární hmotnost (Mr) NaCl je M roztok NaCl tedy získáme rozpuštěním g v 1l výsledného objemu. Tzn., g NaCl doplníme vodou tak, aby výsledný objem roztoku i s naváženou solí byl 1l. Příklad 2: 5M roztok NaCl získáme rozpuštěním 292g NaCl v takovém objemu vody, aby výsledný roztok měl 1l. Příklad 3: Roztoky většinou připravujeme v menších objemech než 1l. Většinou se jedná o 100ml. Tedy 100ml 1M roztok NaCl připravíme z 5,8 g NaCl, které doplníme vodou na 100ml. 1

4 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků Příklad 4: Máme připravit 100 ml roztok, který obsahuje 0,5M NaOH a 1M NaCl. Mr NaOH je 40, Mr NaCl je Použijeme tedy 2g NaOH a 5,8 g NaCl. Soli smícháme a doplníme do 100 ml. 2. Procentuelním zastoupením (10% SDS) Jako 1% roztok je udáván roztok, který vznikne rozpuštěním 1g dané chemikálie ve vodě, tak aby výsledný objem roztoku byl 100ml. 3. Hmotností látky rozpuštěné v určitém objemu (např. mg/ml) Tento způsob se většinou využívá u enzymů, např. Proteinázy K. 4. Počtem jednotek (U) v určitém objemu (v případě enzymů) Zásobní roztoky Z praktického hlediska je v laboratoři výhodné mít sérii základních tzv. zásobních roztoků. K těmto roztokům patří především 1M HCl, 1M NaOH, 1M (příp. 5M) NaCl, 1M Tris-HCl (ph7), 1M Tris-HCl (ph8), 0,5M EDTA (ph8), 3M Na-acetát, 100xTE pufr, 50xTAE pufr, 20xSSC. Zásobní roztoky se využívají k přípravě jiných (tzv. pracovních) roztoků či roztoků o daleko nižší koncentraci. Příklad 1: Máme připravit 10ml roztoku (100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 50mM EDTA) a přitom máme k dispozici tyto zásobní roztoky 2,5M NaCl, 1M Tris-HCl, 0,5M EDTA. Pro náš roztok tedy použijeme 0,4ml 1M NaCl, 0,1ml Tris-HCl a 1ml 0,5M EDTA. Příklad 2: Máme 50xTAE zásobního (velice koncentrovaného) roztoku, ze kterého máme vyrobit 2l 1xTAE roztoku. Smícháme tedy 40 ml 50X TAE s 1960 ml vody. Uchovávání chemikálií Zakoupené chemikálie je třeba uchovávat dle pokynů uvedených na obalu. Většina chemikálií (organické a anorganické látky) a většina připravených roztoky se uchovávají v pokojové teplotě (v angličtině označováno jako RT room temperature ). Některé roztoky či chemikálie vyžadují teplotu okolo 4 o C, tedy uskladnění v ledničce, velká část chemikálií a roztoků (většinou enzymy, protilátky)se skladuje v -20 o C, tedy mrazničce. Ve speciálních případech, jako jsou kompetentní buňky či dlouhodobé skladování RNA, se vyžaduje teplota okolo -80 o C. Při uchovávání chemikálií je rovněž třeba brát zřetel na bezpečnost, tj. nikdy neskladovat např. žíravé či jinak nebezpečné chemikálie nad výškou našich očí, ale preferenčně vždy co nejníže. 2

5 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků Sterilita a čistota prostředí U velké části experimentů je vyžadováno sterilní prostředí, čehož je získáváno používáním jednorázového laboratorního plastu, jako např. pipetovacích špiček a zkumavek. Laboratorní plast je vždy sterilizován autoklávováním. V některých případech se sterilizuje i laboratorní sklo. Při experimentech se zásadně nosí laboratorní rukavice, vhodný je i laboratorní oděv, nejlépe plášť. Nošením rukavic a laboratorního oděvu nechráníme jen naše experimenty, ale v mnoha případech také naše zdraví! V laboratoři zachováváme čistotu a řád laboratoře, pravidelně laboratoř uklízíme a stíráme laboratorní stoly. Zanedbaná a špinavá laboratoř představuje výrazné ohrožení jak našich experimentů, tak našeho zdraví. Přednostně vždy dbáme na naší vlastní bezpečnost a bezpečnost našich kolegů. 3

6 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: elektroforéza ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN POMOCÍ HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZY Elektroforéza je soubor separačních metod, které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly (ionty). DNA nese díky záporně nabitým fosfátů záporný náboj, proto se pohybuje od záporného pólu ke kladnému. Při elektroforéze se separují molekuly nukleových kyselin na základě své délky. Dlouhé fragmenty migrují pomaleji než kratší, stejně tak jako cirkulární DNA než lineární. Při horizontální elektroforéze se molekuly DNA a RNA separují v agarózovém gelu, který je ponořen do elektroforetického pufru. Koncentrace agarozy je důležitým faktorem pro mobilitu DNA. Čím koncentrovanější je agarozový gel, tím separace je pomalejší, z čehož vyplývá, že vyšší koncentrace agarozy zajistí lepší separaci krátkých fragmenů. Pro přípravu elektroforetického gelu a samotnou separaci se používají ve většině případů TBE pufr nebo (častěji) TAE pufr. Tyto pufry se uchovávají jako 50x koncentrované a pro elektroforetickou separaci (ELFO) se ředí na pracovní roztoky o koncentraci 1x. Vzhledem k vysoké spotřebě ELFO pufru v laboratoři je výhodné si připravit do zásoby větší množství pracovního roztoku. Tedy např. připravujeme 2l 1xTAE pufru smícháním 1960ml vody s 40 ml 50xTAE pufru. Příprava gelu a elektroforetické vaničky Množství připravovaného gelu závisí na počtu vzorků a tedy velikosti ELFO vaničky. Nejčastěji se používá 40ml vanička, a to pro separaci 8 nebo 12 (v závislosti na velikosti hřebene) vzorků. Koncentrace gelu závisí na typu fragmentů DNA, které chceme separovat. Vyšší koncentrace agarozy zajistí lepší separaci krátkých fragmentů. Koncentrovanější gely umožňují jemnější rozlišení velikosti kratších fragmentů. Pro dlouhé fragmenty okolo 1000bp postačí gely s koncentrací nižší než 1%. Pro krátké fragmenty můžeme při použití speciální agarózy o nízkém bodu tání připravit až 4% gel, který umožní rozlišení fragmentů o velikosti okolo 200bp, lišící se 15 páry bází. Pokud vyžadujeme ještě jemnější rozlišení, musíme použít polyakrylamidový gel a vertikální elektroforézu. Takže např. pro 40 ml 1% agarozového gelu použijeme 40 ml 1X TAE pufru a 0,4g agarozy. Agarozu smícháme s pufrem nejlépe v lahvi se šroubovacím víčkem, lahev uzavřeme tak, že je víčko částečně povolené. Agarozu rozpustíme v mikrovlnné troubě, obvykle stačí 1-1,5 min. V průběhu rozehřívání můžeme 1-2x roztokem zamíchat. Agaroza musí být dokonale rozpuštěna, tzn. nesmí být patrná 4

7 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: elektroforéza žádná zrnka tající agarózy. Připravený gel necháme zchladnout tak, aby již nebyl vařící, ale přesto dostatečně horký na to, aby nezačal tuhnout. Pokud nám gel nedopatřením ztuhne, můžeme ho opětovně rozpustit. Připravíme si ELFO vaničku, jejíž čela jsme předtím důkladně oblepili lepící páskou či izolepou (v některých případech jsou vaničky dodávány s kovovými pásky, kterými vaničku utěsníme).do vaničky vložíme ELFO hřeben a vlijeme agarozový gel, který poté necháme dokonale ztuhnout. Pozn. V některých laboratořích se přidává do gelu etidium bromid, který nám v závěrečné fázi umožní vizualizaci DNA či RNA. Nicméně jelikož je etidium bromid silný mutagen, z bezpečnostního hlediska (kvůli odpařování a kontaminaci laboratorního prostředí) je doporučováno gel barvit až po elektroforéze.rovněž etidium bromid nepatrně ovlivňuje mobilitu DNA, což v některých případech experimentů není žádoucí. Příprava vzorků Ke vzorkům přidáme 10xnanášecí pufr ( loading buffer ). Nanášecí pufr obsahuje bromfenol ovou modř, která roztok s DNA obarví, což umožní lepší nanášení vzorku na gel a sledování vzorku při separaci. Nanášecí pufr také obsahuje glycerol, který způsobí usazení vzorku na dno jamky gelu. Někdy nanášecí pufr obsahuje i EDTA, která umožní zastavení případné např. restrikční reakce. Nanášecí pufr je obvykle v koncentraci 10x, tzn., pufr s roztokem DNA mícháme v poměru 1:9. Kapacita jamky závisí na velikosti hřebene. U hřebenů s jemnými zuby je objem jamky cca 10 µl, u středních zubů to je cca 20 µl. Nanášení vzorků 1kb ladder plus Vaničku usadíme do elektroforetické vany, tak aby jamky byly u záporného pólu. Gel s vaničkou zalijeme 1x ELFO roztokem. Hladina ELFO roztoku by měla být těsně (1-2 mm) nad gelem. S vyšší vrstvou pufru nad gelem stoupá při elektroforéze odpor a separace je pomalejší. Vzorky naneseme do jamek, díky přítomnosti glycerolu, vzorky klesnou na dno jamky. Pro nanášení používáme 1-20µl pipetu. Do jedné z jamek rovněž naneseme hmotnostní marker ( size marker nebo také ladder ), obvykle kolem 5µl. Marker obsahuje soubor velikostně definovaných fragmentů, které nám po separaci umožní identifikaci velikostí molekul testované DNA (viz. obr.). Separace vzorků 5

8 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: elektroforéza ELFO vanu přikryjeme víkem a zapneme ELFO zdroj. Nastavíme napětí, tak aby bylo 5-8V/cm mezi elektrodami. Tzn. u malé až střední elektroforetické vany to je 60-90V. Vyšší napětí nám umožní rychlejší separaci vzorku, ale pokud je příliš vysoké, dochází k přehřívání, deformaci gelu a nestejnoměrné separaci vzorků. Elektroforézu necháme běžet maximálně tak dlouho až je bromfenolová modř ve 2/3 až ¾ délky vaničky. Barvení vzorků Gel vyjmeme z vaničky a ponoříme ho na min do vodného roztoku etidium bromidu *(20µl 1%EtBr/100ml H 2 O), případně GelRed či případně SyberGreenu. Jsou to látky, které se váží na DNA a v UV spektru září modrým fluorescenčním zářením. To nám tedy umožní vizualizaci nukleové kyseliny. Během barvení roztokem protřepáváme. Po obarvení opatrně gel y barvícího roztoku vyjmeme, opláchneme vodou a vizualizujeme pod UV světlem. *Zásobní roztok etidium bromidu bývá 1%, tj. 10mg/ml. Pracovní roztok skladujeme ve tmě a lze jej využívat opakovaně, EXTRAKCE DNA Z GELU K určitým účelům můžeme DNA z gelu extrahovat, např. pro klonování. Z gelu pod UV světlem vyřízneme daný proužek DNA. Pro excizi používáme skalpel případně kopistku a dbáme na dvě věci: jednak máme ochranný štít či brýle proti UV (zánět spojivek by byl jinak jistý) a za druhé pracujeme urychleně, protože UV na DNA vytváří tyminové dimery, které by mohly způsobovat problémy v následných experimentech. DNA z vyříznutého gelu následně extrahujeme pomocí komerčně dostupných kitů (firma Qiagen, Macherez Nagel, Invitrogen, Promega, aj.). 6

9 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Spektrofotometrické vyhodnocení nukleových kyselin SPEKTROFOTOMETRICKÉ VYHODNOCENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN Roztok DNA se spektrofotometricky vyhodnocuje při vlnové délce 260nm a 280nm. Absorbance při 260 nm odráží koncentraci DNA, absorbance při 280 nm odráží čistotu DNA, tj. míru přítomnosti proteinů. Pro výpočet koncentrace se vychází z následujících vztahů: Při vlnové délce 260 nm je absorbance roztoku rovna 1, pokud je v měřeném roztoku: - dvouřetězcová DNA o koncentraci 50 µg/ml - jednořetězcové DNA o koncentraci 37 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1 - RNA o koncentraci 40 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1 Obvyklý postup při spektrofotometrickém vyhodnocení dsdna: 1. Roztok DNA se naředí. Obvykle je to buď 50x nebo 100x nebo 1000x. Protože přesnější měření získáme při vyšší koncentraci DNA, je ředění DNA kompromisem mezi přesností měření a množstvím DNA, které kvůli měření ztratíme. Směrodatným faktorem je rovněž typ a velikost spektrofotometrické kyvety a typ spektrofotometru (tj. především výška probíhajícího paprsku). Roztok DNA tedy naředíme např. 100x, tj. 1:100. Roztok důkladně promícháme. 2. Nejprve spektrofotometr vynulujeme oproti slepému vzorku ( blank ), kterým je obvykle voda, která byla použita pro ředění roztoku DNA. 3. Změříme absorbanci roztoku DNA při 260 nm a poté při 280nm. Výsledná hodnota je např. A260=0,02, A280=0, Vypočteme poměr A260/A280, který nám poskytuje informaci o čistotě DNA. Ćistá DNA obvykle vykazuje hodnotu tohoto poměru okolo 1,8, u RNA je to okolo2. Pokud hodnota poměru je výrazně nižší, je DNA kontaminována proteiny či fenolem. V našem případě je A260/A280=2,2. 5. Vypočteme koncentraci DNA dle A260 a vztahu uvedeného v textu výše a míře naředění roztoku DNA. V našem případě tedy 50 x 0,02 x 100 = 100 µg/ml = 100ng/µl Obecně pro ds DNA: 50 x A x ředění = ng/µl Obr. Spektrofotometrické kyvety Obecně pro ss DNA: 37 x A x ředění = ng/µl Obecně pro RNA: 40 x A x ředění = ng/µl Při měření více vzorků a také po skončení měření dbáme na důkladné vypláchnutí spektrofotometrické kyvety. 7

10 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin Izolace DNA V současné době existuje několik různých způsobů jak izolovat DNA. 1. Klasickým způsobem je izolace pomocí fenol-chloroformu. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA. 2. Druhým způsobem je izolace pomocí kolonek (např. od firem Qiagen, Invitroge nebo, Macherey Nagel). Izolace pomocí kolonek je rychlá, elegantní a většinou odpadá práce s tekutým dusíkem. Tkáň pomocí tloučku rozdrtíme v extrakčním pufru. Tento roztok naneseme do speciální kolonky, kterou centrifugujeme. V kolonce je přítomna matrix, na kterou se DNA navazuje. DNA se promyje centrifugací se speciálními roztoky. Po promytí se DNA vyváže centrifugací s vodou, která DNA z matrix odplaví. Při tomto způsobu ovšem není možné získat velké množství DNA a DNA není prý tak čistá. 3. Kompromisním řešením mezi fenolovou extrakcí a kolonkami jsou nejrůznější produkty dostupné od řady firem (např. DNazol od firmy MRC), které pracují na podobné bázi jako je izolace fenolem, ale poskytují daleko větší jednoduchost a rychlost. 4. Speciální izolací DNA je izolace pomocí Chelexu. Chelex poskytuje extrakci DNA z velmi malého množství materiálu, jakým je např. lidský vlas. Čistota DNA je velmi nízká, ale je dostatečná pro PCR. Tato metoda se využívá ve forenzní genetice. Izolace kolonkami a způsobem popsaným v bodě 2 se vždy striktně odvíjí od návodu výrobce. Proto si zde uvádíme podrobný popis izolace DNA pouze fenol-chloroformovou extrakcí a Chelexem. Izolace DNA fenol-chloroformem Přípravné práce: 1. Sterilizace keramických třecích misek, tloučků a kopistek (zabalit do alobalu) v autoklávu. 2. Předchlazení keramických třecích misek, tloučků a kopistek uložením do mrazáku 3. Příprava 10 ml extrakčního pufru: Finální koncentrace Základní roztok Množství 100 mm NaCl 1 M NaCl (14,61 g ve 100 ml s miliq H 2 O) 1 ml 10 mm Tris-HCl, ph 8,0 1 M Tris-HCl, ph 8,0 100 µl 50 mm EDTA, ph 8,0* 0,5 M EDTA (18,61 g ve 100 ml s mq H 2 O) 1 ml 0,5% Sarkosyl 10% (1g sarkosylu + 9 ml miliq H 2 O) 0,5 ml 100 µg/ml Proteináza K** 20 mg/ml (-20 C) 50 µl miliq H 2 O 7,35 ml 8

11 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin * Koncentrace EDTA závisí na množství endogenních nukleáz ve vzorku či tkáni (používané finální koncentrace: mm EDTA). Základní roztok: 18,61 g + 80 ml H 2 O + 2 g NaOH, po rozpouštìní dotitrovat na ph 8,0 (NaOH/HCl) a doplnit na 100 ml. ** Proteinázu přidat ze základního roztoku do extrakčního pufru až před použitím! Vlastní izolace genomové DNA Uvedený protocol je pro izolaci většího množství tkáně v 10 ml extrakčního pufru. Množství tkáně a extrakčního pufru lze snížit a izolaci provádět v 1,5ml zkumavkách. Rozmělnění tkáně v extrakčním pufru a inkubace v extrakčním pufru 1. Zchlazení třecích misek a tloučků pomocí tekutého N 2 : dusík nalejme do misky a postupně ho přiléváme až do řádného zchlazení misky, při kterém již nebude docházet k výraznému odpařování dusíku. 2. K dusíku v misce přidáme studovanou tkáň a pomocí tloučku ji rozmělníme na jemný prášek. Přidáme několik kapek extrakčního pufru a znovu rozmělníme. Získaný prášek kopistkou přeneseme do zkumavky s extrakčním pufrem (0,1-0,2 g tkáně na 10ml extrakčního pufru). 3. Přidáme proteinázu K (pokud není již v extrakčním pufru) a zkumavku, jejíž uzávěr jsme předtím utěsnili parafilmem, vložíme v horizontální poloze do vodní lázně a zvolna promícháváme (37 C, 3-12 hod.). Fenolová extrakce 4. Roztok necháme zchladnout na pokojovou teplotu, přidáme stejný objem fenolu (bez vrchní krycí vrstvy TE pufru!) a zvolna promícháváme na třepačce (RT, 30 min.). Přidáním fenolu se vytvoří dvě faze. Horní je roztok s DNA, spodní je vrstva fenolu. Po 30 minutách přeneseme obě faze do 15 ml Corex zkumavky. ph použitého fenolu musí být 8. Fenol vhodný určený pro izolaci DNA lze již přím koupit nebo si ho lze v laboratoři připravit. Způsob přípravy je uveden dale v textu. 5. Centrifugací (5000 g, 15 min., RT) oddělíme tři vrstvy - DNA, bílkoviny a fenol. Vrchní viskózní vodnou fázi, jež obsahuje DNA, opatrně a velmi zvolna odsajeme a přeneseme do nové falconky. Pro nasávání DNA používáme vždy špičky s ustřihlým koncem (průměr otvoru 3 mm)! Při centrifugaci dbáme na nízkou akceleraci a deceleraci centrifugy! 6. Fenolovou extrakci, tj. body 4,5, opakujeme 1-2x. Mezitím si připravíme směs fenol-chloroformizoamylalkohol (25:24:1). Směs musí být průhledná, pokud není - centrifugace (5000 g, 6 min., RT). 9

12 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin Fenol-chloroformová extrakce 7. Přidáme stejný objem fenol-chloroform-izoamylalkoholu a v horizontálním směru zvolna promícháváme na třepačce (RT, 15 min.). 8. Přeneseme do 15 ml Corex zkumavky a centrifugujeme (5000 g, 15 min., RT) a horní fázi přeneseme do nové falconky (velice opatrně a zvolna). Chloroformová extrakce 9. Přidáme stejný objem chloroform-izoamylalkoholu (24:1) a horizontálně zvolna promícháváme na třepačce (RT, 15 min.). 10. Centrifugujeme (5000 g, 15 min., RT), horní fázi přeneseme do zkumavky. Precipitace DNA a její rozpuštění 11. Přidáme 0,1 objemu 3M Na-acetátu (ph 5,2) a promícháme jemným pohybováním falconky v horizontálním směru, dokud obsah není homogenní. Přidáme 2x objem 100% etanolu a opět opatrně promícháme: - pokud se DNA zformuje v klubko vláken, vytáhneme ji háčkem vyrobeným ohnutím špičky sterilní pasterky a přeneseme do falconky se 70% etanolem (na 2 min.); - pokud nejsou DNA vlákna dostatečně zformována, shlukneme je centrifugací zkumavce (3000 g, 10 min., RT). Opatrněodlejeme etanol. Klubko či pellet DNA 2x promyjeme přidáním 70% etanolu a zcentrifugováním (3000 g, 10 min., RT). Etanol odlejeme, krátce (5 min.) necháme vyschnout (kapky etanolu usazené po stěnách můžeme případnězcentrifugovat a odsát pipetou). DNA nesmí úplně vyschnout, jinak se špatně rozpustí! Přidáme takové množství TE pufru (ph 8,0) nebo autoklávované miliq H 2 O, aby přibližná koncentrace DNA byla 500 ng - 1 µg DNA/µl. DNA resuspendujeme jemným pohybováním zkumavky v horizontálním směru a umístíme na noc do 4 C. Genomová DNA je velmi křehká a náchylná k mechanickému poškoyení. Proto s ní musíme nakládat velmi jemně. Nejčastější příčiny degradace vysokomolekulární DNA: 1. Nedostatečná inhbice DNáz 10

13 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin 2. Prudké míchání či třepání 3. Pipetování 4. Vysoká akcelerace či decelerace centrifugy Izolovanou DNA vyhodnotíme spektrofotometricky a elektroforeticky. Spektrofotometricky vyhodnotíme jak koncentraci DNA pomocí absorbance při 260nm, tak čistotu DNA pomocí poměru A260/A280 (viz. kapitola Spektrofotometrické vyhodnocení nukleových kyselin). Elektrofoteticky vyhodnotíme integritu DNA. DNA by měla být patrná jako celistvý vysokomolekulární proužek. Úprava ph fenolu: (a) K fenolu přidáme stejný objem 1 M TRIZMA BASE (60,55 g doplnit na 500 ml miliq H 2 O; ph 12); protřepáním oddělíme dvěfáze, z nichž vrchní odstraníme. (b) Přidáme stejný objem 1 M Tris-HCl (ph 8,0); protřepáním oddělíme dvě fáze, z nichž vrchní odstraníme. Poté zkontrolujeme ph a případně zopakujeme tento krok. Příprava 500 ml 1 M Tris-HCl: 26,5 g TRIZMA BASE + 44,4 g TRIZMA HCl, rozpustit ve 400 ml miliq H 2 O a doplnit na 500 ml. (c) Přidáme 10mM Tris-HCl (ph 8,0), protřepeme, necháme sednout a oddìlíme vrchní fázi. (d) Krok (c) opakujeme 3x kvůli odstranění solí a zkontrolujeme ph pomocí papírku. Po titraci slejeme a zalejeme 1x TE pufrem (ph 8,0). Takto upravený fenol vydrží při 4 C 2-3 mìsíce (skladujeme nejlépe v 50ml falconkách). Pozor!!! Časem u takto uskladněného fenolu může dojít k jeho znehodnocení oxidací (žlutá barva se mění v červenou). 11

14 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin Izolace DNA pomocí Chelexu Extrakce DNA pomocí Chelexu 100 (Bio-Rad Laboratories) je velmi populární metodou ve forenzní genetice, kde se používá k izolaci DNA ze zaschlých krevních vzorků, tkáně, vlasů a kostí. Tato metoda je velmi rychlá a poměrně levná. Velkou výhodou je minimální riziko kontaminace vzorku, díky tomu, že je celý proces extrakce prováděn pouze v jedné zkumavce. Chelex je pryskyřice složená ze styren divinylbenzen kopolyméru (makromolekulární látka, jejíž molekuly jsou tvořeny nejméně ze dvou různých monomérů) s párovými iminodiacetátovými ionty. Tyto ionty působí jako chelátory, které vážou polyvalentní kovové ionty. Za alkalických podmínek zvyšuje Chelex afinitu ke kationtům těžkým kovům (Ca 2+, Mn 2+, and Mg 2+ ), což má v extrakci velký význam, jelikož tyto dvojmocné ionty mohou při vysoké teplotě ( C) způsobit poškození DNA. Kromě toho chelatace Mg 2+ iontů způsobuje inaktivaci nukleáz (např. DNáz degradujících DNA), což je při izolaci DNA nezbytné, jelikož jsou Mg 2+ ionty nezbytné pro jejich enzymatickou aktivitu. Principem izolace je fyzická homogenizace a následná destrukce a degradace buněčných membrán, proteinů a denaturace DNA z alkalických podmínek a vysoké teploty ( C). Dále se provede centrifugace suspenze, tak aby se oddělila pryskyřice a zbytky buněčných komponentů od supernatantu obsahujícího DNA. DNA se může přímo používat pro PCR amplifikaci, avšak je třeba zamezit kontaktu pryskyřice s PCR reakcí, jelikož Chelex samotný je inhibitor PCR. Postup: Potřebujeme: 10% chelex ve sterilní H 2 O, sterilní H 2 O, Proteinázu K (c = 20 mg/ml), tloučky, 1,5 ml zkumavky, 2 termobloky, pinzetu, kahan, nůžky, TAE, agarózu, loading buffer 1) Připravíme 10% roztok chelexu (1 g chelexu do 9 ml miliq H 2 O), řádně promícháme. 2) Termoblok nahřejeme na 56 C. 3) Do označené mikrozkumavky (1,5 ml) odpipetujeme 50 μl roztoku. Doplníme 50 μl miliq H 2 O, výsledná koncentrace chelexu je tak 5%. 4) Pinzetou (sterilizovanou nebo předem namočenou do etanolu a opálenou, pak musí na vzduchu trochu vychladnout) vyškubneme asi 3-5 vlasů i s kořínky (kořínky jsou u vlasů nejlepším zdrojem DNA, protože pouze ony obsahují živé buňky) a přeneseme do mikrozkumavky s chelexem. 5) Zvortexujeme a stočíme, aby se vlasy dostaly do tekutiny. Provedeme homogenizaci zeleným tloučkem. 6) Přidáme 2,5 μl Proteinázy K (koncentrace 20 mg/ml). 7) Znovu zvortexujeme. 8) Inkubujeme 10 min při 56 C. 12

15 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin 9) Mezitím nahřejeme druhý termoblok na C. 10) Po inkubaci vzorky vortexujeme s. 11) Inkubujeme (respektive povaříme) 10 min. při C. 13) Znovu zvortexujeme s. 14 Vzorky zcentrifugujeme 5 min při maximální rychlosti. Poté vzorky vyhodnocujeme pomocí PCR. Do PCR reakce dáme přímo 2 μl supernatantu. PCR přečistíme pomocí komerčně dostupných kolonek na přečišťování PCR produktů (např. Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System od firmy Promega). IZOLACE RNA Podobně jako u izolace DNA, RNA může být izolovaná několika způsoby - používají se speciální kolonky, jejichž matrix na sebe z roztoku navazuje RNA, dále to je metoda pomocí fenol-chloroformu a konečně je to celá řada různých komerčně dostupných produktů, jako např. velmi používaný Trizol nebo RNazol. Obecná zásada při práci s RNA je dodržování čistoty, striktní používání rukavic, špiček s filtrem, speciálně ošetřené vody (např. tzv. DEPC vody), která neobsahuje RNázy. RNA je velice náchylná na působení RNáz. Kontaminace RNázami vede k degradaci vzorku RNA, což se projeví při elektroforetické separaci v podobě smearu. Správně izolovaná totální RNA je se jeví jako dva celistvé proužky (horní proužek je 28S RNA, dolní je tvořen 18S RNA).Nejčastějším způsobem je izolace totální, tj. celkovou RNA. V určitých případech (výroba sond pro array analýzu, detekci extrémně vzácné mrna nebo konstrukce random-primed cdna knihoven), kdy by totální RNA byla na obtíž, izolujeme jen poly(a), tj. mrna, která tvoří 1-5 % totální RNA). Pro izolaci mrna existují komerčně dostupné kity, jako Oligotex mrna od firmy Qiagen nebo Poly(A)Purist Kit od Ambionu. 13

16 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Precipitace a zahušťování DNA PRECIPITACE A ZAHUŠŤOVÁNÍ DNA Nízkou koncentraci DNA můžeme zvýšit v podstatě dvěmi způsoby. Jedním je centrifugace roztoku DNA v komerčně dostupných kolonkách, které po přidání speciálního pufru o určitém objemu k roztoku DNA, vyvazují DNA na speciální matrix. DNA je poté odplavena z této matrix centrifugací vody nebo elučního pufru (obvykle se minimum vody či elučního pufru pohybuje od µl, což může být pro náš účel limitujícím faktorem). Druhým způsobem je precipitace DNA pomocí Na-acetátu a etanolu. Pro tento způsob uvádíme přesný postup. K roztoku DNA je přidán 3M Na-acetát(pH 5.2) a to o objemu, který je roven 1/10 finálního objemu. Tedy pokud máme roztok DNA o objemu 300 µl, přidáme 33 µl 3M Na-acetátu. Pokud máme velmi malé množství DNA, k vzorku přidáme glykogen nebo trna, které usnadní zviditelnění peletu DNA po centrifugaci. Do roztoku přidáme 2-2,5x objemu 100% etanolu. Precipitace je zvýšena, pokud je etanol vychlazen na -20 o C. Vzorek se řádně promíchá vortexem, v případě že se jedná o genomovou DNA, promícháme vzorek velmi zlehka pipetováním (genomová DNA je citlivá na mechanické poškození). Vzorek uložíme na 30 min do -20 o C (eventuálně přes noc) nebo na min do -80 o C. V případě nízkého množství DNA je lepší delší inkubace buď v -20 o C nebo 1 hodinu v -80 o C. Vzorek centrifugujeme v předchlazené centrifuze (4 o C), rpm, 20min. DNA formuje pelet na dně zkumavky, supernatant opatrně odstraníme. A přidáme stejný objem 70% etanolu. Vzorek centrifugujeme při rpm, 10 min, 4 o C. Dokonale odstraníme supernatant. Počkáme až se odpaří všechny zbytky etanolu a přidáme vodu či TE pufr a necháme DNA rozpustit. Pokud DNA není genomová, můžeme rozpouštění usnadnit vertexem či pipetou. 14

17 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Štěpení DNA: restriktázy ŠTĚPENÍ DNA: RESTRIKTÁZY DNA lze štěpit mechanicky pomocí sonikace nebo enzymaticky. Sonikace je štěpení DNA pomocí ultrazvuku, který rozkmitá dlouhé molekuly. Ty se pak v místech největšího mechanického namáhání v průběhu kmitání lámou. Velikost získaných fragmentů lze ovlivnit výkonem ultrazvuku a dobou působení - čím větší výkon a delší působení, tím kratší fragmenty. Místa zlomu jsou ovšem zcela nezávislá na konkrétní sekvenci DNA a jsou tedy náhodná. Restrikční endonukleázy (taky též restriktázy) Štěpení DNA lze provádět pomocí enzymů tzv. nukleáz. Existuje celá řada nukleáz, které štípou DNA svým specifickým způsobem. Nejvýraznějšího uplatnění ale nachází restrikční endonukleázy. Restrikčních endonukleázy II. typu rozpoznávají v molekule DNA krátké specifické sekvence a v místě výskytu této sekvence molekulu štěpí. Štěpená sekvence je plindromická, tzn. identická v obou řetěcích, pokud ji čteme vždy v jednom směru tj. 5-3 nebo 3-5. Jako příklad můžeme uvést nejznámější restrikční endonukleázu EcoRI (podle zdroje - bakterie Escherichia coli, RI = restriktáza č. 1), která rozpoznává sekvenci 5'-GAATTC-3' a štěpí fosfodiesterovou vazbu v řetězci mezi prvním guanosinem (G) a druhým adenosinem (A). EcoRI patří do podskupiny restrikčních endonukleáz II. typu, které štěpí obráceně opakované sekvence, takže vznikají fragmenty s tzv. kohesivními konci. Jiné restrikční endonukleázy II. typu štěpí fosfodiesterové vazby na stejném místě v obou řetězcích, takže vznikají tzv. tupé konce (viz. obr.). Štěpení restrikčními endonukleázami dovoluje, při určitých podmínkách a přítomnosti enzymu tzv. DNA ligázy, rozštěpené molekuly zase spojit dohromady. Snížením teploty dosáhneme mezi štěpenými konci spojení vodíkovými můstky a pomocí enzymu ligázy můžeme obnovit fosfodiesterové vazby mezi řetězci. 15

18 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Štěpení DNA: restriktázy Komerčně je dostupná celá řada restrikčních enzymů, viz. firma NEB New England Biolabs. Restrikční endonukleázy jsou dodávány s pufrem, ve kterém pracují. Aktivita různých restriktáz se s různými pufry může výrazně lišit. Tak např. od firmy NEB enzym EcoR I pracuje se 100%-ní účinností ve všech čtyřech dodávaných pufrech (1,2,3, a 4). EcoR V pracuje v pufrech 1,2,3 a 4 s účinností 50, 75, 100 a 50. Pokud chceme provádět reakci s např. dvěma enzymy současně, vždy musíme zkontrolovat jejich aktivitu v daných pufrech a použít optimální pufr pro oba enzymy. Pokud se aktivita výrazně liší, buď použijeme univerzální pufr nebo provedeme reakci nejprve s jedním enzymem, DNA přečistíme (buď komerčně dostupnou kolonkou nebo precipitací s Na-acetátem) a provedeme reakci s druhým enzymem. Enzymy jsou dodávany v určitém množství jednotek na určité množství. Výrobce vždy uvádí specifikaci, kolik jednotek nám rozštěpí dané množství DNA za daný čas většinou při 37 0 C. Prakticky se restrikční štěpení ale dělá tak, že se k 1µg DNA přidá 0,5µl restriktázy, což je obvykle množství enzymu, které DNA dokonale naštěpí. Pokud děláme reakci s více enzymy, vždy mějme na paměti, že objem dodaných enzymů nesmí přesáhnout desetinu celkového objemu reakce (glycerol, který nese enzymy by v takovém množství inhiboval reakci). Dodávané pufry jsou většinou 10x koncentrované a reakce se u většiny enzymů (ale neplatí to vždy!) provádí při 37 0 C 1-2 hodiny. Reakční podmínky je vždy třeba zkontrolovat pro daný enzym. K inaktivaci reakce se používá EDTA, která vyvazuje dvojmocné ionty, které jsou potřebné k aktivitě restriktázy (po přídavku EDTA jsou dvojmocnoé ionty pro restriktázu nedostupné) nebo se inaktivace dělá vysokou teplotou dle návodu výrobce. Příklad reakce: Komponenta Množství H2O 10,5 µl plasmidová DNA (1 µg) 10 µl 10x pufr (NEB 3) 2,5 µl EcoR I 1 µl EcoR V 1 µl Celkem 25 µl Reakci promícháme a inkubujeme při 37 0 C 1-2 hodiny. Reakci můžeme inaktivovat inkubací při 65 0 C 20 min. 16

19 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Syntéza cdna SYNTÉZA cdna Syntéza cdna je syntézou DNA podle templátové RNA molekuly. Syntéza je zprostředkována speciálním enzymem RT transkriptázou (tj. reverzní transkriptázou). Syntéza cdna umožňuje manipulaci (klonování a další úpravy) s produkty transkripce a tím vlastně s funkčními součástmi genomu. Syntézou cdna můžeme získat kódující sekvenci celých genů, tj. sekvenci bez intronů. Pro iniciaci syntézy jsou jako primery využívány polydt (komplementární k pola na konci každého genu) nebo se využívá směs náhodných hexanukleotidů, nebo i specifické oligonukleotidy, pokud chceme cdna jen k nějakému konkrétnímu genu a máme nějakou informaci o sekvenci. Syntéza cdna probíhá v těchto krocích: 1. denaturace RNA a primeru při 65 o C tj. odstranění případných sekundárních struktur, které se na RNA formují 2. samotná syntéza DNA řetězce podle řetězce RNA prostřednictvím RT transkriptázy 3. odstranění RNA řetězce pomocí RNasy H 4. syntéza druhého vlákna prostřednictvím PCR. Reakce: 1. Připravte následující směs: Komponenta (koncentrace zásobního roztoku) RNA 10mM dntp 1 µl Oligo (dt) µm 1 µl H 2 O Doplnit do 20 µl Množství 10 pg-5µg totální RNA nebo 10pg-500 ng mrna 17

20 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Syntéza cdna 2. Pro denaturace inkubujte při 65 o C, 5 min. 3. Připravte následující směs, přičemž přidávejte komponenty v určeném pořadí: Komponenta Množství 10X RT pufr 2 µl 25mM MgCl 2 4 µl 0,1M DTT 2 µl RNase OUT inhibitor nebo nahraďte vodou 1 µl Dodejte 9 µl této směsi k RNA a primerům, promíchejte, centrifugujte a inkubujte 2 min v 42 o C. 4. Ke směsi přidejte 1 µl (50U) SuperScript II RT a inkubujte 50 min při 42 o C. 5. Ukončete reakci inkubací v 70 o C, 15 min. Zchlaďte na ledu a centrifugujte. 6. Přidejte 1 µl RNasy H a inkubujte v 37 o C po 20 min. PCR S cdna Nasyntetizované 1. Vlákno cdna můžete použít pro PCR za standardních podmínek. Při PCR se syntetizuje druhé vlákno cdna. Poznámky: 1. Jako templát by měla být používaná RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Při izolaci RNA se proto doporučuje zahrnout krok s působením DNázy. 2. Pro syntézu cdna zahrňte také negativní kontrolu, tzn. vzorek, do nějž nebudete dodávat RT transkriptázu. Pokud vám po PCR v této kontrole vznikne produkt, je to na základě kontaminace, pravděpodobně genomovou DNA. 18

21 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování KLONOVÁNÍ Klon je soubor molekul nebo buněk, které jsou všechny identické s původní molekulou nebo buňkou. Klonování genu znamená vytvoření mnoha jeho kopií např. v populaci baktérií, kvasinek, atd. Technika klonování znamená, že je třeba přimět určité hostitelské buňky, aby kopírovaly cizí vloženou DNA, kterou po namnožení v těchto buňkách z těchto buněk izolujeme. Namnožený úsek lze použít pro různé účely, jako např. pro konstrukci chimérických genů, pro výrobu hybridizační sondy, pro in vitro transkripci, kdy získáváme proteinový produkt kódovaný vloženou molekulou DNA. Kvůli jednoduchosti a levnosti kultivace a velké rychlosti množení se jako hostitelské buňky pro cizí klonovanou DNA používají především bakterie, příp. bakteriofágy. V některých případech, kdy je potřeba množit velké molekuly cizí DNA v celku, se používají také kvasinky. Cizí DNA se vloží do již předem připravené molekuly, která obsahuje všechny sekvence potřebné ke vstupu, přežití a množení v určité hostitelské buňce. Taková molekula, která slouží k přenesení cizí DNA do určité hostitelské buňky, se pak obecně označuje jako vektor. Pokud tento vektor slouží nejen k přenesení do buňky, ale i k zajištění jejího klonování v buňce, jde o tzv. klonovací vektor. Jako klonovací vektory se používají plazmidy, fasmidy, bakteriofágy, kosmidy, umělé bakteriální chromosomy (BAC = bacterial artificial chromosome) a umělé kvasinkové chromosomy (YAC = yeast artificial chromosome). plazmidy jsou malé molekuly kruhové DNA, které se vyskytují přirozeně v bakteriálních buňkách. Ve své přirozené podobě obsahují genetickou informaci, která není nutná pro běžný život hostitelské bakterie, ale může být užitečná v některých životních situacích. Ke klonování se používají plazmidy geneticky upravené, které jsou dokonale přizpůsobeny svému účelu. Do plazmidu lze běžně vložit molekulu cizí DNA, jejíž velikost nepřesahuje kb, v ideálním případě lze vložit i molekuly kolem 22 kb. fasmidy (angl. phagemid) jsou obecně plazmidy vybavené navíc částí genomu některého bakteriofága. Nejčastěji jsou používány fasmidy vybavené replikačním začátkem vláknitého bakteriofága f1, který umožňuje připravit z fasmidu jednovláknovou DNA pro sekvenování. bakteriofágy jsou viry, napadající bakterie. Po genetické manipulaci je lze použít ke klonování větších molekul DNA ( párů bází). Infikujeme-li hostitelský kmen bakterie bakteriofágem s vloženou cizí DNA, dojde v průběhu lytického cyklu k namnožení celé fágové DNA včetně cizí DNA. kosmidy jsou plazmidy se zabudovanými částmi sekvence bakteriofága l (tzv. cos-sekvence), která umožňuje efektivní prostorovou organizaci velkých molekul DNA. Výhodně slučují vlastnosti plazmidů a bakteriofágů - bez zaklonované cizí DNA je lze množit jako plazmidy, pak je lze použít k zaklonování mnoha tzv. konkatemerů, ve kterých se střídají různé úseky cizí DNA a kosmidu, tyto částice lze pomnožit v průběhu infekce bakterií podobně jako u bakteriofágů a pak z lyzátu získat DNA. molekuly cizí DNA větší než párů bází lze zaklonovat do umělých bakteriálních nebo kvasinkových chromosomů. Obsahují sekvence, které zajistí replikaci celého umělého chromosomu v S-fázi buněčného cyklu hostitelské buňky, a dále sekvence, které plní funkci centromery při dělení hostitelských buněk v mitóze. Umělé kvasinkové chromosomy jsou lineární, takže jejich konce musejí být navíc chráněny před degradací telomerami. 19

22 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování PLASMIDY A KLONOVACÍ VEKTORY Plasmidy jsou cirkulární dsdna přirozeně přítomné v baktériích. Jsou využívány pro experimentální manipulace s geny a jejich klonování jako tzv. klonovací vektory. Plasmidy používané jako klonovací vektory obsahují replikátor (počátek replikace), tj. sekvenci, kterou rozpoznává DNA polymeráza hostitelské buňky. Dále obsahují selekční marker, který zajistí buňkám obsahující vnesený vektor selekční výhodu nad buňkami, které vektor neobsaují. Jako selekční geny se nejčastěji používají geny pro rezistenci k antibiotiku, většinou ampicilinu, méně častěji kanamycinu, tetracyklinu, chloramfenikolu, aj.). Dále je obsaženo klonovací místo (tzv. polylinker nebo MCS- multiple cloning site, tj. místo s velkým množství restrikčních míst, která umožní vložení cizí DNA). Často také obsahují gen LacZ, který umožní tzv. modro-bílou selekci (viz. dále), umožňující rozlišení buněk obsahujících prázdný klonovací vektor od vektoru s vloženým inzertem. Ke klonování je komerčně dostupná celá řada klonovacích vektorů. Klonování genu se děje v několika krocích: 1. LIGACE: Integrace genu do vektoru 2. TRANSFORMACE: Integrace vektoru do baktérií, tzv. transformací kompetentních buněk 3. KULTIVACE: Namnožení baktérií 4. IDENTIFIKACE KLONŮ:Identifikace klonů, které obsahují naši klonovanou DNA 5. IZOLACE PLASMIDOVÉ DNA: Izolace vektoru s naklonovanou DNA z baktérií 6. OVĚŘENÍ SEKVENCE KLONOVANÉ DNA: Restrikční štěpení a sekvenování 20

23 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování INTEGRACE GENU DO VEKTORU Pro vložení cizí DNA (tzv. insertu) do plazmidu nejprve plasmid linearizujeme (tj. rozštěpíme jeho kruhovou molekulu). Pro linearizaci se používají restrikční endonukleázy, které štěpí v polylinkeru vektoru. Tzn., že plasmid rozštěpíme v klonovacím místě některou z restrikčních endonukleáz. Např. na uvedeném obrázku je vektor, jehož klonovací místo obsahuje restrikční místa pro Not I, EcoR I, Bgl II, Kpn I, atd. V závislosti na restriktáze, vzniklé konce mohou být buď tupé ( blunt ends ) nebo kohesivní ( sticky ends ), viz. obr. dole. Konce takto linearizovaného plasmidu spojíme ligací s konci vkládaného inzertu. Spojované konce musejí být kompatibilní, tzn., že v případě kohesivních konců musí být štěpené stejným restrikčním enzymem. Tupé konce se naproti tomu spojují s jakýmikoliv jinými tupými konci. Pro účinnost integrace (tj.ligace) je ale výhodnější mít kohesivní konce. Integrace insertu do vektoru se děje tzv. ligací. Ligace se děje prostřednictvím enzymu T4DNA ligázy, která spojuje volné konce. Pro ligační reakci potřebujeme roztok s rozštěpeným klonovacím vektorem, roztok insertu, který nese konce kompatibilní ke štěpeným koncům klonovacího vektoru, ligační pufr, který obsahuje ATP a potřebné soli. Pro úspěšnou ligaci je třeba do reakce dodat vhodný poměr počtu konců vektoru k počtu konců insertu. Tento poměr zjistíme pomocí tohoto vztahu: Ligaci můžeme provádět v poměru insert : vektor jako 1:1 nebo 2:1 (v tom případě násobíme získanou hodnotu dvěma) nebo jako 3:1 (násobíme získanou hodnotu třema). Ligace se provádí obvykle po dobu 1 hodiny při teplotě 16 0 C nebo přes noc při teplotě 4 0 C. Speciálním, ale hodně používaným postupem ligování je ligování přímo PCR produktů. V současné době se používají dva přístupy, jednak na základě rekombinace jako tzv. Topo cloning (firma 21

24 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování Invitrogen, rychlé, účinné, ale drahé) a jednak je to TA cloning, na základě ligace polyt a polya převisů (např. pgem od firmy Promega, detailní informace v uvedeném protokolu dále v textu). INTEGRACE VEKTORU DO BAKTÉRIÍ Vpravování plasmidů do baktérií se označuje jako transformace. Pro transformaci se používají speciálně upravené bakteriální buňky, označované jako kompetentní buňky, tj. buňky, které jsou schopné přijímat cizí DNA. Bakteriální buňky jsou chráněny cytoplasmatickou membránou a buněčnou stěnou. Speciální kultivace kompetentních buněk umožňuje prostupnost jejich buněčné stěny. Prostupnost cytoplasmatické membrány se zajistí při samotné transformaci, a to nejčastěji mírným teplotním šokem (42 0 C). Transformace se provádí jako inkubace plasmidu s kompetentními buňkami na ledu, která je následována krátkým teplotním šokem (30-90s, 42 0 C), kdy se naruší cytoplasmatická membrána a plasmidy se začínají integrovat dovnitř do buněk. Poté se buňky kultivují v tekutém kultivačním médiu při 37 0 C (obvykle 1 hod), v této fázi dochází k regeneraci cytoplasmatické membrány a množení buněk. Buňky se vysejou na pevné kultivační médium v Petriho misce s daným antibiotikem a inkubují přes noc při 37 0 C. Na Petriho miskách z každé kompetentní buňky vyroste jedna kolonie jeden klon. SELEKCE Selekce klonů, které obsahují klonovací vektor od klonů, které vektor nenesou: Klonovací vektory, tj. plasmidy nesou gen pro rezistenci k danému antibiotiku. Takže na médiu, které obsahuje dané antibiotikum, rostou pouze ty buňky, které tento vektor obsahují. Selekce klonů, které obsahují klonovací vektor s inzertem od klonů, které obsahují prázdný klonovací vektor: Používá se tzv. modro-bílá selekce, kdy se využívá gen LacZ kódující enzym β - galaktosidázu. β-galaktosidáza metabolizuje bezbarvou galaktozu X-Gal na 5-bromo-4-chloro-indoxyl, který dále spontánně oxiduje na modře zbarvený 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo. V klonovacím vektoru, uvnitř genu LacZ je umístěno klonovací místo. Přítomnost klonovacího místa nenarušuje funkčnost genu, nicméně funkčnost genu je narušena integrací insertu do tohoto místa, kdy dochází k porušení čtecího rámce genu LacZ. Pokud tedy pěstujeme bakterie na médiu obsahující X-Gal, modře zbarvené kolonie jsou kolonie buněk, jejich plasmid neobsahuje insert, na rozdíl od bílých kolonií, jejichž plasmid insert obsahuje. Tento systém je ovšem jenom pomocný, protože do určité míry selhává. Pomáhá nám ale zúžit soubor kolonií, které velmi pravděpodobně obsahují plasmid s vloženou DNA. Pro skutečné ověření, že klony obsahují náš inzert, používáme PCR nebo restrikční štěpení (viz. dále). OVĚŘENÍ KLONŮ NESOUCÍCH INZERTNÍ DNA To, jestli klon je specifický, tzn., jestli obsahuje naši DNA, můžeme ověřit třemi způsoby: 1. Nejjednodušším způsobem jí tzv. Clontest, což je PCR s primery, které jsou specifické pro klonovaný úsek DNA. Jako templátovou DNA používáme nepatrné množství testované kolonie, které 22

25 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování se nabere špičkou a přenese přímo do PCR reakce. Pomocí tohoto testu můžeme poměrně rychle a levně identifikovat specifické kolonie, aniž bychom předtím museli pracně izolovat plasmidovou DNA pomocí miniprepů (viz. níže). 2. Pokud již máme izolovanou plasmidovou DNA, specificitu ověřujeme pomocí restrikčního štěpení s vhodnou kombinací restriktáz, které nám po elektroforetické separaci umožní dle velikosti klonovacího vektoru a velikosti inzertu identifikovat, jestli klon obsahuje inzert či nikoliv. 3. Sekvenování: je nejbezpečnějším způsobem ověření identity klonů. V praxi se používají všechny tři způsoby. 1) Pro prvotní identifikaci se na několika koloniích provede Clontest, což nám umožní určit alespoň několik specifických kolonií. 2) U několika z těchto specifických kolonií se izoluje plasmidová DNA pomoci tzv. miniprepu. U této DNA se provede restrikční štěpení. 3) DNA se osekvenuje, a to buď s primery, které jsou specifické k sekvenci klonovacího vektoru, jako např. T3, T7, SP6 nebo s primery, které jsou specifické k inzertní DNA. Sekvenování nám jednak prokáže správnou orientaci insertu (v některých experimentech je nutné mít inzert zaklonovaný v určité orientaci) a také ověří bezchybnou správnost sekvence zaklonovaného inzertu, což je důležité především v případech, kdy klonujeme PCR produkt, v jehož sekvenci vlivem nepřesnosti PCR mohou být záměny nukleotidů. PROTOKOLY LIGACE Budeme využívat pgem vektor od firmy Promega. Tento vektor obsahuje poly-t přesahy v klonovacím místě. Tyto přesahy jsou kompatibilní vůči A- přesahům, které vytváří většina termostabilních polymeráz během PCR. Zvyšuje se tak účinnost ligace PCR produktu do plazmidu a je umožněno klonování PCR produktů. Vlastní pgem- T vektor nese i gen rezistence vůči ampicilinu (Amp) a rovněž umožňuje modro-bílou selekci. Postup: Výpočet: pgem je dodáván v koncentraci 50ng/µl, ale pro úsporu je vhodné si naředit tento vektor 10x tj. na koncentraci 5 ng/µl, která je bohatě dostačující. Množství vektoru a inzertu si vypočítáme ze vztahu: 23

26 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování Velikost pgem je 3kb o námi připravené koncentraci 5 ng/µl. Koncentrace inzertu je např. 8 ng/µl a jeho velikost je 800bp tedy 0,8kb. Z uvedeného vzorce vyplývá, že v našich podmínkách, pokud použijeme 1µl vektoru a připravujeme 10µl reakci, musíme použít 1,3 ng inzertu (při poměru 1:1) nebo 4 (při poměru 1:3). Např. se rozhodneme dělat ligaci v poměru 1:3. Reakce : Komponenta Množství H2O 2,5 µl Insert (8 ng/µl) 0,5 µl Vektor (5 ng/µl) 1 µl 2X ligační pufr 5 µl T4 DNA ligáza 1 µl Celkem 10 µl Směs promícháme a zcentrifugujeme. Inkubujeme buď přes noc při 4 0 C nebo hodinu při 16 0 C. TRANSFORMACE Transformace může být protřednictvím teplotního šoku nebo elektroporací. My uvedeme protokol pro transformaci buněk DH5α teplotním šokem. 1. Kompetentní buňky vyndáme z C. Rozehřejeme buď umístěním na led nebo opatrně v ruce. Buňky se ale nesmí zahřát příliš! Rovněž s buňkami, protože mají poškozenou buněčnou stěnu, zacházíme velmi opatrně netřeseme s nimi, nevortexujeme, necentrifugujeme. Pokud promícháváme, tak špičkou jejím opatrným kroužením. 2. K 50 µl buněk přidáme 2 µl ligační směsi, jemně promícháme (až 25 ng DNA na 50 μl buněk, objem DNA nesmí přesáhnout 5% objemu kompetentních buněk) 4. Inkubujeme 30 minut na ledu 5. Provedeme teplotní šok ( heat shock ) umístěním zkumavky s buňkami na 90 sekund do 42 C 6. Zkumavku rychle přemístíme na led a inkubujeme 1-2 minuty. 7. K buňkám přidáme μl SOC media nebo LB medium 8. Inkubujeme na třepačce minut v 37 C 9. Připravíme kultivační misky s LB/Amp/IPTG/X-Gal: K rozehřátému pevnému LB médiu, jehož teplota není vyšší než 65 C (jinak by degradoval ampicilin), přidáme ze zásobního roztoku ampicilin do finální koncentrace 100 µg/ml kultivačního média. Pokud máme 0,1g/ml zásobní roztok ampicilinu, na jeden mililitr média přidáváme 1 µl ampicilinu. Médium rozlijeme do misek (cca 25 ml do Petriho misky o průměru 8cm). 24

27 Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování V 1,5 ml sterilní zkumavce smísíme 64 ul X-Gal (12,5 mg/ml) a 3,5 µl IPTG (240 mg/ml) ze zásobního roztoku, promícháme a naneseme na povrch pevného média a pomocí sterilní skleněné kultivační kličky rovnoměrně rozetřeme po povrchu média. Sterilitu získáme namočením kličky do etanolu a jejím krátkým vypálením nad plamenem μl buněk rozetřeme sterilní skleněnou kličkou na povrch media. 11. Zbytek buněk centrifugujeme, většinu supernatantu tj. horní fáze odstraníme a ve zbytku supernatantu (cca 100µl) resuspendujeme buňky. V této fázi, buňky již mají obnovenou buněčnou stěnu, takže nejsou náchylné k mechanickému poškození. Buňky naneseme na médium. 12. Inkubujeme misky s buňkami přes noc v 37 0 C. Obvykle je inkubační doba hodin, ne výrazně více, jinak baktérie přerostou. IDENTIFIKACE KLONŮ Bílé kolonie, které nám narostly, přeneseme přečárkujeme na misku s čerstvým médiem a necháme růst alespoň několik hodin nebo lépe přes noc. Provedeme Clontest pro identifikaci specifických kolonií. Tzn. malé, téměř nepatrné množství kolonie přeneseme špičkou do PCR reakce, která obsahuje primery specifické pro náš zaklonovaný fragment. Provedeme PCR za standardních podmínek a vyhodnotíme elektroforeticky. Tento test nám určí, které z bílých kolonií skutečně nesou náš klonovaný fragment. IZOLACE PLASMIDOVÉ DNA Izolaci plasmidové DNA označujeme jako izolaci miniprepů (pokud je izolováno jen malé množství plasmidové DNA), midiprepů (střední množství), maxiprepů (velké množství) a megaprepů (enormně velké množství). V počáteční fázi ale vždy používáme miniprepů, protože větší množství plasmidu izolujeme až ve chvíli, kdy máme bezpečně ověřenou sekvenci zaklonovaného fragmentu a potřebujeme velké množství plasmidu pro uskladnění či další experimenty. Plasmidovou DNA, kterou skladujeme v C můžeme kdykoliv použít pro zpětnou transformaci a izolaci nové plasmidové DNA. Pro izolaci plasmidové DNA používáme komerční kity, kterých je na trhu celá řada. Např. firma Qiagen, Macherey Nagel, Invitrogen. Protože je třeba u těchto kitů dodržovat přesný návod dodávaný výrobcem, nebudeme zde uvádět žádný podrobný protokol. RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ PLASMIDU Restrikční štěpení plasmidové DNA se provádí za standardních podmínek. Pomocí restrikčního štěpení můžeme jednak identifikovat specifické klony nesoucí zaklonovaný inzert, jednak ho používáme pro vyštěpování určitých úseků v zaklonované DNA či vkládání nových úseků do zaklonované DNA, tj. pro konstrukci chimérické DNA. SEKVENOVÁNÍ ZAKLONOVANÉHO ÚSEKU DNA 25