DIPLOMOVÁ PRÁCE. Stanovení pefloxacinu technikou sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí

Transkript

1 DIPLOMOVÁ PRÁCE Stanovení pefloxacinu technikou sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2012 Hradec Králové 2012 Jan Šimura

2 Úvodem bych chtěl poděkovat Doc. RNDr. Miroslavu Poláškovi, CSc. a členům katedry analytické chemie, včetně postgraduálních studentů, za odborné vedení a pomoc při vypracování této diplomové práce. Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Literatura a další zdroje, ze kterých jsem čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury Jan Šimura 2

3 OBSAH 1. SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK SEZNAM ZKRATEK ÚVOD Úvod a cíl práce TEORETICKÁ ČÁST Sekvenční injekční analýza (SIA) Princip FIA a SIA Přístrojové vybavení a konfigurace SIA systému Porovnání metod SIA a FIA Využití metody SIA Chemiluminiscence Mechanismus chemiluminiscence Požadavky na CL emisi Faktory ovlivňující CL emisi Využití chemiluminiscence v analytické chemii Použitý systém CL Pefloxacin (Pefloxacini mesilas dihydricus) Farmakologické vlastnosti Chemické vlastnosti Metody stanovení EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Použité chemikálie Použité přístroje Příprava roztoků Optimalizace metody Optimalizace objemů činidel a průtokové rychlosti Kalibrační závislosti Opakovatelnost měření LOD, LOQ Vliv pomocných látek Stanovení obsahu pefloxacin-mesylát dihydrátu VÝSLEDKY A DISKUZE

4 6.1. Optimalizace koncentrace Ce (IV) Vliv koncentrace H 2 SO 4 na intenzitu CL Optimalizace koncentrace Ru(bipy) Optimalizace koncentrace CH 3 COONa Vliv obsahu methanolu a ethanolu na intenzitu CL Vliv zvyšující se koncentrace methanolu jako rozpouštědla vzorku Vliv zvyšující se koncentrace ethanolu jako rozpouštědla vzorku Optimalizace objemů a průtokové rychlosti Kalibrační závislosti Opakovatelnost měření LOD, LOQ Vliv pomocných látek Vliv Chelatonu 3 (EDTA) na intenzitu CL Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL Stanovení obsahu pefloxacin-mesylát dihydrátu Stanoveni PEF v injekcích pomocí rovnice regrese Stanovení obsahu PEF metodou standardního přídavku ZÁVĚR Závěr Abstrakt Abstract LITERATURA

5 1. SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK Obr.č.1: Schéma jednoduché FIA techniky Obr.č.2: Princip FIA techniky Obr.č.3: Princip SIA techniky Obr.č.4: Schéma SIA techniky Obr.č.5: Typy a průběh CL Obr.č.6: Závislost intenzity CL na reakčním čase a koncentraci analytu Obr.č.7: PEF Obr.č.8: Nastavení sekvence programu pro optimalizaci Obr.č.9: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) Obr.č.10: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO Obr.č.11: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) Obr.č.12: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa Obr.č.13: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu Obr.č.14: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu Obr.č.15: Lineární část kalibrační křivky včetně signálu slepého vzorku Obr.č.16: Detailní kalibrační křivka včetně signálu slepého vzorku Obr.č.17: Vliv EDTA na intenzitu CL Obr.č.18: Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL Obr.č.19: Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL Obr.č.20: Stanovení obsahu-první série Tab.č.1: Příklady využití chemiluminiscence Tab.č.2: Měřící cyklus Tab.č.3: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) Tab.č.4: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) slepý pokus Tab.č.5: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) výsledné hodnoty Tab.č.6: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO Tab.č.7: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 slepý pokus Tab.č.8: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 výsledné hodnoty Tab.č.9: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) Tab.č.10: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 2+ 3 slepý pokus

6 2+ Tab.č.11: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 3 výsledné hodnoty Tab.č.12: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa Tab.č.13: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa slepý pokus Tab.č.14: Závislost intenzity CL na koncentraci CH3COONa výsledné hodnoty Tab.č.15: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu Tab.č.16: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu slepý pokus Tab.č.17: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu výsledné hodnoty Tab.č.18: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu Tab.č.19: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu slepý pokus Tab.č.20: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu výsledné hodnoty Tab.č.21: Optimalizace objemů činidel a průtokové rychlosti Tab.č.22: Lineární část kalibrační křivky včetně signálu slepého vzorku Tab.č.23: Detailní kalibrační křivka včetně signálu slepého vzorku Tab.č.24: Opakovatelnost Tab.č.25: Hodnoty slepého pokusu Tab.č.26: LOD, LOQ Tab.č.27: Vliv EDTA na intenzitu CL Tab.č.28: Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL Tab.č.29: Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL Tab.č.30: Pracovní roztok přípravku ABAKTAL 0,080 ml Tab.č.31: Pracovní roztok přípravku ABAKTAL 0,100 ml Tab.č.32: Pracovní roztok přípravku ABAKTAL 0,120 ml Tab.č.33: Metoda standardního přídavku- pracovní roztok VZOREK + PŘÍDAVEK Tab.č.34: Metoda standardního přídavku- pracovní roztok VZOREK Tab.č.35: Výsledné hodnoty stanovení obsahu metodou standardního přídavku

7 2. SEZNAM ZKRATEK SIA sekvenční injekční analýza FIA průtoková injekční analýza CL chemiluminiscence I intenzita chemiluminiscence PEF pefloxacin-mesylát dihydrát ATB antibiotikum LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace DO (%) deklarovaný obsah (%) SD směrodatná odchylka (standard deviation) RSD relativní směrodatná odchylka (relative standard deviation) (%) SP slepý pokus INJ injekce Ce (IV) /Ce síran amonnoceričitý Ru(bipy) 2+ 3 /Ru tris(2,2 -bipyridyl)ruthenium(ii)chlorid hexahydrát VZ vzorek PŘ přídavek FQ fluorochinolon SPE extrakce na tuhé fázi MS hmotnostní spektrometr LC kapalinová chromatografie PEN penicilinové ATB 7

8 3. ÚVOD 8

9 3.1. Úvod a cíl práce Cílem této práce je optimalizace metody pro stanovení látky pefloxacin-mesylát dihydrátu, antibiotika fluorochinolonové řady, pomocí sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí. Na základě redoxní reakce s komplexem tris(2,2 -bipyridyl)ruthenia (II). Záměrem projektu bylo též ověřit možnost využití této metody ke stanovení obsahu pefloxacinu v injekčním roztoku. 9

10 4. TEORETICKÁ ČÁST 10

11 4.1. Sekvenční injekční analýza (SIA) Sekvenční injekční analýza (Sequential Injection Analysis, SIA) patří do skupiny průtokových analytických technik. Představuje metodu umožňující automatizaci a racionalizaci práce při analýze velkých sérií vzorků a tím i její urychlení. SIA byla vyvinuta při zdokonalování techniky průtokové injekční analýzy (FIA). (1) První článek definující koncepci SIA, byl uveřejněn v roce 1990 Růžičkou a Marshallem. (2) Princip FIA a SIA Základním principem obou metod je chemická reakce vzorku a činidel v průtokovém systému, která vede ke vzniku produktu o určitých vlastnostech. Tyto vlastnosti jsou detekovány vhodným detektorem. Princip FIA systému spočívá v dávkování vzorku dávkovacím kohoutem do kontinuálního nosného proudu, kde se mísí s činidlem za vzniku produktu reakce a při plynulém průtoku jednotlivých zón vícekanálovým systémem je tento produkt unášen směrem k průtokovému detektoru. (1) Obr.č.1: Schéma jednoduché FIA techniky (1) V: vzorek, NP: nosný proud, Č: činidlo, PČ: peristaltické čerpadlo, DV: dávkovací ventil, MC: mísící cívka, D: detektor 11

12 Obr.č.2: Princip FIA techniky (3) Technika SIA používá odlišný princip, jehož charakteristickým rysem jsou oddělené měřící cykly. Nejprve jsou zóny nosného média, vzorku a činidel postupně (jednorázově) aspirovány do jednokanálového systému s využitím selekčního ventilu a pístového čerpadla a poté je pohyb čerpadla obrácen, čímž dojde k promísení zóny vzorku a činidla a vzniklý produkt je dopraven do detektoru. Výsledný analytický signál je zaznamenán ve formě píku. Jedná se o záznam změny koncentračního gradientu reakčního produktu při průchodu jeho zóny detektorem. Celý proces je řízen počítačem podle nastavení programu. (1) Přístrojová konfigurace viz dále. Obr.č.3: Princip SIA techniky (3) Průtokové rychlosti v SIA se prakticky neliší od FIA a pohybují se obvykle okolo 1 ml/min a doba trvání jednoho měřícího cyklu v SIA většinou nepřesahuje 30 s, což je v mnoha případech srovnatelné s frekvencí dávkování vzorku ve FIA. (1) 12

13 Přístrojové vybavení a konfigurace SIA systému Základ SIA systému tvoří jednokanálové dvousměrné čerpadlo, vícecestný selekční ventil, detektor, mísící cívka a spojovací materiál. Čerpadlo zajišťuje aspiraci činidel a vzorku a taktéž je hnací silou systému, zajišťuje tok látek směrem k detektoru. Objemy aspirovaných činidel stejně jako průtoková rychlost musí být přesně regulovatelné a opakovatelné s maximální přesností. Systém SIA používaný pro vypracování této práce měl zabudovanou pumpu pístového typu. Činnost tohoto čerpadla je řízená počítačem. Selekční ventil, obvykle 6, 8 nebo 10-ti cestný, umožňuje nasávání roztoků činidel a vzorků ze zvolených pozic. Důležitými parametry ventilu jsou malý mrtvý prostor a nulová kontaminace mezi jednotlivými porty. Činnost selekčního portu je řízená počítačem. (4) Mísící cívka, která je umístěna mezi čerpadlem a selekčním ventilem, slouží k promísení aspirovaných reagens a taktéž jako pojistka před znečištěním čerpadla roztoky vzorků a činidel. Spojovacím materiálem umožňujícím spojení jednotlivých součástí jsou obvykle plastikové hadičky o vnitřním průměru 0,7 až 0,8 mm. (4) Detektory v SIA jsou voleny dle použité analytické reakce a charakteru produktu reakce. Využívají se zejména spektrofotometrické, fluorescenční a elektrochemické detektory s příslušnými průtokovými celami. (1)(4) Počítač, jak už bylo zmíněno, řídí činnost selekčního ventilu a čerpadla a taktéž za pomocí kvalitního softwaru převádí signál z detektoru do grafické podoby a prezentuje tak výsledky měření. V rámci tohoto softwaru bývá běžný automatický výpočet parametrů píku (výška, šířka, plocha atd.) 13

14 Obr.č.4: Schéma SIA techniky C: nosič, SP: pístové čerpadlo, HC: zadržovací cívka, PC: počítač, MPV: vícecestný selekční ventil, R1-3: činidla, S: vzorek, MC: mísící cívka, D: detektor, W: odpad 14

15 Porovnání metod SIA a FIA Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá ve způsobu toku nosného proudu. Metoda FIA využívá přímý konstantní tok, zatímco metoda SIA změny směru toku nosného proudu. Nevýhodou metody SIA proti FIA je snížená frekvence dávkování vzorku způsobená časovou prodlevou při změně toku a nutnost používat poměrně složité řídící programy. SIA metoda poskytuje řadu výhod. Pracuje s malými objemy vzorků a činidel, a tak je jejich spotřeba oproti FIA nižší. U FIA jsou čerpány kontinuálně. Další výhodou SIA je možnost změnit parametry měření prostřednictvím počítače, bez zásahu do konfigurace SIA systému, což u metody FIA není možné. (1)(4) Využití metody SIA Vzhledem k rychlosti, flexibilitě a plné automatizaci je možno metodu SIA využít v případech analýzy velkých sérií vzorků a to s vysokou produktivitou a dostatečnou spolehlivostí. Ve farmacii umožňuje nejen kontrolu kvality a účinnosti léčiv, ale také hodnocení déle trvajících stabilitních studií. V technologii se používá k zjištění stejnoměrnosti obsahu účinné látky v různých farmaceutických přípravcích a rychlosti jejího uvolňování z lékové formy, ale též při monitorování hladin léčiv nebo jejich metabolitů v tělních tekutinách. Další uplatnění nachází metoda SIA v analýze složek životního prostředí. (Stanovení některých iontů ve vodě za účelem kontroly kvality). Na základě imunoanalytických reakcí a za přítomnosti speciálních detekčních cel umožňuje tato metoda stanovení protilátek, antigenů, inzulínu, teofylinu a dalších látek. (1)(4) 15

16 4.2. Chemiluminiscence Chemiluminiscence (CL) patří mezi luminiscenční jevy a je definovaná jako emise elektromagnetického záření produkovaného chemickou reakcí. K emisi dochází při přechodu látky z elektronově excitovaného stavu do stavu základního. Přebytečná energie se vyzáří ve formě fotonů. Míra emise závisí na koncentraci látek schopných chemiluminiscence. (5) Mechanismus chemiluminiscence Chemiluminiscenční reakce může vznikat v podstatě dvěma způsoby. Přímou reakcí dvou reaktantů, obvykle substrátu a oxidačního činidla v prostředí kofaktorů, která vede ke vzniku produktu nebo meziproduktu v energeticky nestabilním excitovaném stavu, který se po čase vrátí do stavu základního za současné emise energie ve formě fotonu. Substrátem je prekurzor CL, jehož molekula může být takto excitována, a tak je přímo odpovědná za vznik CL anebo funguje jako prostředník v přenosu energie, zde hovoříme o chemiluminiscenci nepřímé. Nepřímá CL je tedy založena na přenosu energie z excitované molekuly substrátu na fluorofor, který po přechodu z takto vzniklého energeticky excitovaného stavu na stav základní uvolní detekovatelné záření. Toto umožňuje analýzu i těch látek, které nejsou své vlastní emise fotonu při návratu z excitovaného stavu schopny. (5) Obr.č.5: Typy a průběh CL (5) 16

17 Požadavky na CL emisi 1) reakce musí být exotermická, při přechodu do základního stavu se energie uvolňuje 2) přijatá energie musí být molekulou využita převážně ke vzniku elektricky excitovaného stavu, pokud by byla energie spotřebována například ve formě tepla (vibračně-rotační energie), k CL by nedošlo 3) hlavní cestou jakou se molekula zbavuje excitační energie, musí být emise fotonu 4) v případě nepřímé CL je důležitá účinnost přenosu excitační energie na fluorofor (5) Faktory ovlivňující CL emisi Intenzita chemiluminiscenční reakce je závislá na mnoha parametrech, jež ovlivňují také její rychlost, případně výtěžek. 1) důležitá je stavba chemické struktury prekurzorů CL a to nejen centrální části molekuly podléhající excitaci, ale také stavba a složení bočních řetězců 2) povaha a množství (koncentrace) ostatních substrátů, které se CL reakce účastní, CL může být snížená interakcemi s ostatními složkami systému (tzv. statické a dynamické zhášení) (4) 3) vybraný katalyzátor 4) přítomnost kovových iontů, které se zapojují do redoxních procesů (hlavně ionty tzv. přechodných kovů) 5) teplota, ph a iontová síla 6) polarita rozpouštědla 7) přítomnost fluoroforů (5) 17

18 Využití chemiluminiscence v analytické chemii Tab.č.1: Příklady využití chemiluminiscence (5)(7) SKUPENSTVÍ ČINIDLO ANALYT Plynné ethylen O 3 Plynné O 3 uhlovodíky, NO Plynné O 3 po přeměně analytu na NO nitrosaminy, celkový dusík Plynné H 2 sloučeniny síry Kapalné luminol a jeho deriváty Ionty kovů a komplexy (Co (II), Cu (II), Fe (III),Zn (II), Cd (II), Mn (II), Cr (III), Cr (IV), Pt (IV), ClO -,Fe(CN) 3-6 ), sloučeniny hemu, peroxidázy, oxidační činidla (H 2 O 2, O 2, I 2 ), inhibitory (Ag (I), Ce (IV), Ti (IV), V (V) ), snadno oxidovatelné sloučeniny, stanovené nepřímo (kyselina askorbová, karboxylové kyseliny, aminy ), Kapalné estery akridin-9-karboxylové kyseliny sloučeniny převedené na H 2 O 2 (glukóza ), látky označené luminolem a jeho deriváty látky označené estery akridin-9- karboxylové kyseliny, ionty (Ag (I), Bi (III), Pb (II), Co (II), Cr (III), Cu (II), Fe (III), Mn (II) ), oxidanty (H 2 O 2, O 2 ), látky převedené na H 2 O 2, redukující látky (Cr (II), Fe (II), Mo (V), askorbová kyselina, tetracykliny, cukry...) 18

19 Kapalné peroxyláty oxidační činidla fluorofory (polycyklické aromatické uhlovodíky) a od nich odvozené deriváty (steroidy, katecholaminy ) Kapalné Ru(bipy) 3 3+ Kapalné přímá oxidace pomocí MnO 4 -, ClO -, Ce (IV), IO - alifatické aminy, org. kyseliny, aminokyseliny, proteiny molekuly obvyklé ve farmaceutické praxi (anestetika, morfin, paracetamol ) Pevné O 2 plus teplo polymery K chemiluminiscenci často dochází při oxidační reakci mnoha organických sloučenin, měření této světelné emise lze využít jako indikátoru změn v materiálech z těchto sloučenin vlivem tepla, ionizujícího záření nebo zvětráváním. Příkladem takovýchto sloučenin jsou polymery. Dalším využitím CL je kontrola v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, kde lze sledovat tyto degradační reakce u jednotlivých produktů v závislosti na čase. (5) 19

20 Použitý systém CL V této práci byl použit CL systém založený na reakci komplexu tris(2,2 -bipyridin)ruthenia (II) (Ru(bipy) 2+ 3 ) s oxidačním činidlem a analytem. Vzniká Ru(bipy) Jedná se o nestabilní molekulu, proto byla připravována in situ, k oxidaci bylo použito Ce (IV) v kyselém prostředí. Látky, které se v tomto systému stanovují, obsahují ve své struktuře typicky dusík (heterocyklické sloučeniny, primární, sekundární, terciární aminy). (6) K CL dochází při reakci s redukovanou formou analytu (6) : oxidace Ru(bipy) 3 2+ Ru(bipy) X red [Ru(bipy) 3 2+ ] * Ru(bipy) e - [Ru(bipy) 3 2+ ] * + X ox Ru(bipy) hv (záření) Množství emitovaného světla (I max ) je přímo úměrné koncentraci reagujících látek, proto s poklesem koncentrace reagujících složek klesá intenzita CL (I cl ). Časový průběh světelného záření závisí na konkrétní CL reakci, od krátkého záblesku až po déle (několik minut) trvající záření. (6) Obr.č.6: Závislost intenzity CL na reakčním čase a koncentraci analytu (5) 20

21 4.3. Pefloxacin (Pefloxacini mesilas dihydricus) Farmakologické vlastnosti Farmakodynamické vlastnosti (8) Pefloxacin je látka s antimikrobiálními účinky ze skupiny syntetických fluorochinolonů. Mechanismus účinku je založen na inhibici replikace bakteriální DNA. Pefloxacin inhibuje replikaci bakteriální DNA prostřednictvím inhibice topoisomerázy II (DNA gyrázy), která je zodpovědná za degradaci DNA Farmakokinetické vlastnosti pefloxacinu (8) Eliminační poločas je 11 hodin, po opakované aplikaci se prodlužuje na 15 hodin. Jak při perorální, tak při intravenózní aplikaci byla pozorována určitá kumulace pefloxacinu. Pefloxacin je spolu s jeho metabolity z % vylučován ledvinami a je částečně reabsorbován v renálních tubulech. Renální clearance je celkově nízká a závislá na dávce. Pohybuje se od 1,25 do 3,65 ml za vteřinu. Pefloxacin a jeho metabolity jsou vylučovány během 48 hodin po aplikaci. Přibližně % pefloxacinu a jeho metabolitů je vylučováno žlučí. Vazba na plazmatické bílkoviny se pohybuje od 20 do 30 %. Distribuční objem je 1,7 l/kg. Pefloxacin velmi dobře proniká do tkání a tělesných tekutin. 21

22 Chemické vlastnosti Pefloxacini mesilas dihydricus (9) Obr.č.7: PEF (9) Je to dihydrát 4-(1-ethyl-6-fluor-3-karboxy-4-oxo-1,4-dihydrochinolin-7-yl)-1- methylpiperazinium methansulfonátu. CAS Relativní molekulová hmotnost je Mr= 465,50 u bezvodého Mr= 429,47. Jedná se o jemný bílý nebo téměř bílý prášek. Je snadno rozpustný ve vodě, těžce rozpustný v lihu 96 %, velmi těžce rozpustný v dichlormethanu. 22

23 4.4. Metody stanovení V posledních letech bylo navrhnuto a optimalizováno mnoho metod a přístupů k determinaci a separaci jednotlivých FQ ATB, ať už z vodných roztoků nebo moči, mléka či masa různých živočichů (ryb, drůbeže, prasat). Pro separaci bylo nejčastěji využíváno LC metod, ale i metod využívajících monoklonálních protilátek (10) a SPE. LC metody byly v kombinaci s různými detekčními metodami jako hmotnostní spektrometrie (11)(12), chemiluminiscence, využití UV, fluorescence. Pro detekci bylo použito i spektrofotometrických a elektroanalytických metod. V této kapitole uvádím přehled několika těchto metod, které se zabývaly stanovením PEF a jejich využití. Detekční metody ve spojení s HPLC Yongbo Li, Zhujun Zhang, Jinsong Li, Hongguang Li, Yan Chen, Zhaohui Liu (13) vyvinuli jednoduchou, citlivou metodu s využitím HPLC a detekce (ECL) pro stanovení residuí PEF v mléce. Metoda byla založena na ukotvení komplexu tris(2,2- bipyridyl)ruthenia(ii) na povrch platinového drátku (elektroda) a vložení tohoto drátku do kapiláry s dalším platinovým drátkem (2. elektroda). Důvodem zakotvení byla obnovitelnost tris(2,2-bipyridyl)ruthenia(ii) jako činidla, a tak byla minimalizována jeho spotřeba. Tato průtoková cela byla použita v kombinaci s HPLC. Kalibrační přímka pro PEF byla získána v rozmezí 0,05 10,0 µg/ml, LOD byl 0,02 µg/ml. Santoro M.I.R.M., Kassab N.M., Singh A.K., Kedor-Hackmam E.R.M. (14) vyvinuli a optimalizovali metodu s užitím HPLC pro stanovení čtyř typů fluorochinolonů a to gatifloxacinu (GAT), levofloxacinu (LEV), lomefloxacinu (LOM) a pefloxacinu (PEF). Byla použita kolona LiChrospher 100 RP-18, mobilní fáze se skládala z acetonitrilu a vody poměrem 20:80, v/v a s obsahem 0,3% triethylaminu, ph bylo upraveno na 3,3 kyselinou fosforečnou. Průtoková rychlost byla 1 ml/min. UV detekce byla provedena v rozpětí vlnových délek od 279 do 295 nm. Separační čas byl 5 minut. Lineární závislost byla v rozmezí 4,0 až 24,0 µg/ml. Relativní odchylka byla pod 1,0 % a průměrná výtěžnost byla nad 99,54%. 23

24 Shahnaz Gauhar, Syed Ayub Ali, Harris Shoaib, Syed Baqir Shyum Naqvi, Iyad Naeem Muhammad (15) vyvinuli a optimalizovali HPLC metodu pro stanovení a rozlišení PEF od acetaminofenu. Byla použita kolona shim-pack CLC-ODS a mobilní fáze se skládala z acetonitrilu a vodného roztoku kyseliny fosforečné (13: 87 v/v, ph 2,9 - upraveno pomocí KOH). Průtoková rychlost byla 1 ml/min. UV detekce při vlnové délce 275 nm. Acetaminofenon byl použit jako vnitřní standard. LOD byl 0,03125 µg/ml a LOQ 0,125 µg/ml. Lineární závislost v rozmezí 0,125 μg/ml-12 μg/ml, R 2 = 0,9987. Yang G, Lin B, Zeng Z, Chen Z, Huang X (16) vyvinuli chromatografickou metodu s fluorescenční detekci pro současné stanovení jedenácti fluorochinolonů (včetně PEF) v mléce. Vzorky byly nejprve extrahovány pomocí 10% trichloroctové kyseliny/acetonitrilu (9 + 1, v/v) a přečištěny (Strata-X reversed-phase solid-phase extraction). Pro rozdělení FQ byla použita kolona Hypersil BDS-C18 (reverzní fáze). U mobilní fáze byl použit systém gradientové eluce. Byla použita fluorescenční detekce. Limit detekce byl 23 μg/l pro enrofloxacin a 1-9 μg/l pro ostatních 10 FQ. Oscar J. Pozo, Carlos Guerrero, Juan V. Sancho, Maria Ibanez, Elena Pitarch, Elbert Hogendoorn, Felix Hernandez (17) vyvinuli metodu pro stanovení šestnácti ATB ve vodě (10FQ a 6 PEN) založenou na kombinaci SPE-LC-ESI-MS/MS systému. Tzn. využití extrakce na tuhé fázi, chromatografické separace a detekce pomocí hmotnostního spektrometru. LOD byly od 0,4 4,3 ng/l. 4,3 ng/l pro PEF. Spektrofotometrické metody Predrag Djurdjevič, Milena Jelikič-Stankov a Zoran Miličevič (18) vyvinuli metodu na stanovení PEF v séru a ve farmaceutických přípravcích (tablety a ampule), založenou na derivační spektrofotometrii, bylo použito záření o vlnových délkách nm. Lineární závislost byla zjišťována v rozmezí 2,0-30,0 μg/ml (tablety a ampule) a 0,12-5 μg/ml (sérum). LOD pro sérum byl roven 15 ng/ml. 24

25 Kanakapura Basavaiah a Hullikal Chandrashekar Prameela (19) popsali dvě metody založené na zpětné fotometrické titraci přebytku NaOH, pomocí HCl za použití barevných indikátorů fenolová červeň a bromthymolová modř. Byly měřeny změny absorbance při 560 nm. Tato metoda umožňuje stanovení PEF v rozmezí 5-40 μg/ml. Kanakapura Basavaiah, Hullikal Chandrashekar Prameela, Bankavadi Chikkaswamy Somashekar (20) vyvinuli metodu na stanovení obsahu PEF, založenou na spektrofotometrické detekci uvolněného barviva (bromfenolová modř) z vazby PEF-barvivo. PEF tvoří s barvivem při ph 3,0 iontový pár, ten byl poté vytřepán do chloroformu. Organická vrstva byla oddělena a vysušena, poté byl přidán vodný roztok o ph 5,2, došlo k rozpadu iontového páru a přechodu uvolněného barviva do vodné fáze za současné změny barvy. Byla měřena absorbance vodné fáze při 590 nm. Kalibrační křivka byla lineární v oblasti 0,15 1,25 μg/ml. LOD byl roven 0,03 μg/ml a LOQ 0,1 μg/ml. Yongnian Ni, Yong Wang a Serge Kokot (21) vyvinuli spektrofotometrickou metodu pro stanovení PEF a norfloxacinu (NOR) založenou na sledování průběhu reakce těchto dvou analytů s manganistanem draselným jako oxidantem. Byl měřen úbytek absorbance KMnO 4 při 526 nm a vzrůstající absorbance produktu K 2 MnO 4 při 608 nm. Kalibrační křivka pro PEF byla v rozmezí 1,0 11,5 mg/l a 0,15 1,8 mg/l pro NOR. LOD byly pro PEF byl 0,36 mg/l a pro NOR 0,06 mg/l. Spektrofluorometrické stanovení Anargiros I Drakopoulos, Pinelopi C Ioannou (22) vyvinuli spekrofluorometrickou metodu pro stanovení ofloxacinu (OF), norfloxacinu (NOR), ciprofloxacinu (CIP) a pefloxaciun (PEF), založenou na schopnosti FQ tvořit fluoreskující komplexy s Sc 3+ v mírně kyselém prostředí. Kalibrační křivka byla lineární pro všechna čtyři ATB do hodnoty 1,0 μm. LOD pro PEF byl 1,0 nm. 25

26 Kapilární elektroforéza Antonio V. Herrera-Herrera, Lidia M. Ravelo-Pérez, Javier Hernández-Borges, María M. Afonso, J. Antonio Palenzuela, Miguel Ángel Rodríguez-Delgado (23) vyvinuli metodu pro stanovení jedenácti FQ (včetně PEF) v různých vodných vzorcích založenou na extrakci na disperzní tuhé fázi (dspe) a s využitím kapilární elektroforézy (65 mm fosfátový pufr, ph= 8,5). LOD byly v rozmezí ng/l. Elektroanalytické metody A.M. Beltagi (24). Byla vyvinuta a optimalizována elektroanalytická metoda na stanovení PEF, založená na elektrochemické redukci PEF na rtuťové elektrodě. LOD byl 4,5 * M, tohoto limitu bylo dosaženo při stanovení PEF v lidském séru. Bengi Uslu, Burcu Dogan Topal, Sibel A. Otkán (25). V jejich práci bylo studováno anodické chování a stanovení PEF na diamantové elektrodě dopované borem a elektrodě ze skelného uhlíku. Linearita kalibrace byla v rozsahu koncentrací od 2,0 * do 2,0 * M. LOD byl pro standardní roztok při užití diferenční pulzní voltametrie roven 4,12 * M a LOQ byl roven 1,37 * M. Pří použití square wave voltametrie byl LOD 1,54 * M a LOQ 5,12 * M. PEF byl touto metodou stanovován i v séru. Využití chemiluminiscence Hanwen Sun, Liqing Li a Yuanyuan Wu (26). Byla vyvinuta a optimalizována metoda průtokové injekční analýzy pro stanovení čtyř typů FQ. Metoda byla založena na chemiluminiscenční reakci potencované ionty dysprosia (Dy PEF - S 2 O 3 - MnO HCl). LOD pro PEF byl 6,0 * M. 26

27 Lékopisná metoda stanovení PEF (9) Stanovení obsahu 0,200 g se rozpustí v 15,0 ml kyseliny octové bezvodé R, přidá se 75,0 ml acetanhydridu R a titruje se kyselinou chloristou 0,1 mol/l VS za potenciometrické indikace bodu ekvivalence. 1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l VS odpovídá 21,48 mg C 18 H 24 FN 3 O 6 S. Zkoušky totožnosti A) Odděleně se rozpustí 0,1 g zkoušené látky a 0,1 g dihydrátu pefloxaciniummesilatu CRL v 10 ml vody R. Přidá se 5 ml hydroxidu sodného 1 mol/l RS, ph roztoku se upraví kyselinou fosforečnou R na hodnotu 7,4 ± 0,1 a protřepe se dvakrát 30 ml dichlormethanu R. Organické vrstvy se spojí, vysuší se nad síranem sodným bezvodým R a odpaří se do sucha. Infračervené absorpční spektrum zbytku zkoušené látky se shoduje se spektrem zbytku dihydrátu pefloxaciniummesilatu CRL. Měří se tablety připravené ze zbytků po odpaření za použití bromidu draselného R. B) Provede se tenkovrstvá chromatografie za použití desky s vrstvou silikagelu pro TLC R. Zkoušený roztok: 40 mg se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 1 ml. Porovnávací roztok: 60 mg kyseliny methansulfonové R se rozpustí ve vodě R a zředí se jí na 10 ml. Na vrstvu se nanese po 10 μl každého roztoku a vyvíjí se směsí objemových dílů vody R, amoniaku 17,5% RS, 1-butanolu R a acetonu R ( ) po dráze 15 cm. Vrstva se usuší na vzduchu, pak se postříká roztokem červeně bromkresolové R (0,4 gn) v lihu R (50% V/V), jehož ph bylo upraveno hydroxidem sodným 1 mol/l RS na hodnotu 10. Skvrna na chromatogramu zkoušeného roztoku odpovídá polohou, zbarvením a velikostí skvrně na chromatogramu porovnávacího roztoku. 27

28 5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 28

29 5.1. Použité chemikálie Síran amonnoceričitý Pefloxacin-mesylát dihydrát Tris(2,2 -bipyridin)dichlororuthenium(ii) hexahydrát Octan sodný Methanol Ethanol denaturovaný methanolem 96% Kyselina sírová 96% p.a. Infuzní roztok ABAKTAL 400 mg/5 ml Chelaton 3 Disiřičitan sodný Kyselina askorbová Ultračistá voda vyrobená v zařízení Milli-Q Millipore FLUKA AG SIGMA ALDRICH LACHEMA NERATOVICE SIGMA-ALDRICH BIOFERM LIHOVAR KOLÍN PENTA SANDOZ LACHEMA NERATOVICE LACHEMA NERATOVICE LACHEMA NERATOVICE 5.2. Použité přístroje Pro vážení byly použity analytické váhy SARTORIUS ANALYTIC A200S. SIA systém se skládal z pístového čerpadla CAVRO XL 3000 o objemu 2,5 ml (Cavro scientific Instruments, Inc., USA), selekčního ventilu s 10 porty Vici-Valco (Valco Instruments, Co., Inc., USA), průtokového detektoru model FS970D-A0 (Schoeffel Instrument- Corp., USA) s chemiluminiscenčním modulem vyrobeným na FaF. Spojovacím materiálem byly hadičky z teflonu (PTFE) o vnitřním průměru 0,75mm, Watrex, Praha. 29

30 5.3. Příprava roztoků Síran amonnoceričitý (M= 632,55 g/mol), základní roztok o koncentraci 0,1 M byl připraven převedením 6,3250 g do 100 ml odměrné baňky a doplněn po značku 0,5 M H 2 SO 4. Tris(2,2 -bipyridin)dichlororuthenium(ii) hexahydrát (M= 748,63 g/mol), základní roztok o koncentraci 5,0 mm byl připraven převedením 0,3743 g do 100 ml odměrné baňky a doplněn po značku 0,05 M H 2 SO 4. Octan sodný (M= 136,08 g/mol), základní roztok o koncentraci 1,0 M byl připraven převedením 13,608 g do 100 ml odměrné baňky a doplněn po značku ultračistou vodou. Pracovní roztoky činidel byly připraveny, v čas potřeby, naředěním jejich základních roztoků do 10 ml odměrných baněk. Pefloxacin-mesylát dihydrát (M= 465,5 g/mol), základní roztok o koncentraci 1,0 * M byl připraven převedením 0,0233 g do 50 ml odměrné baňky a doplněn po značku ultračistou vodou. Pro optimalizaci koncentrací a objemů byl použit roztok o koncentraci 1,0 * M. Byl připraven naředěním 0,5 ml základního roztoku PEF do 50 ml odměrné baňky a doplněn po značku ultračistou vodou. Roztoky PEF určené pro tvorbu kalibrační křivky byly připraveny naředěním základního roztoku o koncentraci 1,2889 * M, tento základní roztok byl připraven převedením přesně 0,0300g PEF do 50ml odměrné baňky a doplněn po značku ultračistou vodou. Výchozí pracovní roztok PEF byl připraven převedením 0,5 ml základního roztoku PEF do 50 ml odměrné baňky a doplněn po značku ultračistou vodou (1,2889 * M). Při měření opakovatelnosti a stanovení obsahu byly příslušné základní roztoky PEF (1,2889 * M) a ABAKTALu (2,21 * M) v čas potřeby naředěny do 25 ml odměrných baněk. 30

31 5.4. Optimalizace metody Cílem optimalizace bylo zjistit nastavení parametru pro stanovení pefloxacin-mesylát dihydrátu. Optimalizace se týkala koncentrací a objemů reakčních činidel, vzorku a průtokové rychlosti. Dále byl zkoumán vliv metanolu a ethanolu, použitých jako rozpouštědel PEF a vliv H 2 SO 4 na hodnotu získaného signálu. Signál detektoru byl zaznamenáván ve formě píků, jejichž výška byla poté přepočítána na intenzitu chemiluminiscence I (na). Účelem optimalizace bylo dosažení co největšího chemiluminiscenčního signálu. Intenzitu CL, I (na), vypočítáme jako (6) : Hodnoty byly zaznamenány programem FaFSIA. Pro optimalizaci objemů a průtokové rychlosti byl použit automatizovaný měřící cyklus na bázi metody SIMPLEX vytvořený rovněž v programu FaFSIA. Pořadí aspirace jednotlivých činidel bylo použito stejné jako v rigorózní práci (stanovení nefopamu) (6). Tab.č.2: Měřící cyklus Syringe pump Initialize 0 Syringe pump Valve position IN Syringe pump Set flow rate (µl/s) 100 Syringe pump Aspirate (µl) 500 Syringe pump Valve postition OUT Syringe pump Set flow rate (µl/s) 70 Multi-port valve Set valve position 1 Ce(IV) v H 2 SO 4 Syringe pump Aspirate (µl) 40 Multi-port valve Set valve position 2 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 Syringe pump Aspirate (µl) 60 Multi-port valve Set valve position 3 CH3COONa Syringe pump Aspirate (µl) 30 Multi-port valve Set valve position 4 Pefloxacini mesilas dihydricus Syringe pump Aspirate (µl) 60 Multi-port valve Set valve position 8 Detektor Syringe pump Set flow rate (µl/s) 70 Syringe pump Empty syringe 31

32 5.5. Optimalizace objemů činidel a průtokové rychlosti K optimalizaci objemů činidel a průtokové rychlosti při detekci byl použit program OPTIMSIA. Struktura cyklu byla zachována. Jednotlivé parametry byly testovány v těchto mezích: P1 Objem Ce (IV) v H 2 SO 4 : µl výchozí 40 µl P2 2+ Objem Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : µl výchozí 60 µl P3 Objem CH 3 COONa: µl výchozí 30 µl P4 Objem roztoku PEF: µl výchozí 60 µl P5 Průtoková rychlost: µl/s výchozí 70 µl/s Napětí: 240 V Rozsah: 0,5 µa Každý Vertex se skládal z pěti měření. Obr.č.8: Nastavení sekvence programu pro optimalizaci 32

33 5.6. Kalibrační závislosti Byla zjišťována závislost mezi vzrůstající koncentrací PEF a signálem, v rozsahu koncentrací 0,52 µm až 12,9 µm. Detailní kalibrační křivka byla získána měřením koncentrací PEF v rozsahu 0,52 1,29 µm. Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 240 V 80 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 10 mm 40 µl 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : 3,0 mm 68 µl CH 3 COONa: 0,8 M 46 µl PEF v H 2 O 54 µl 5.7. Opakovatelnost měření Byla provedena série 10 měření vzorku o koncentraci 6,44 * a 1,03 * M. Směrodatná odchylka a relativní směrodatná odchylka (variační koeficient, Vx) byly vypočítány dle vzorců (27) : 33

34 5.8. LOD, LOQ Pro výpočet limitu detekce a kvantifikace bylo použito průměrné hodnoty signálu slepého pokusu a směrodatné odchylky deseti po sobě jdoucích měření slepého pokusu. Rozsah při měření slepého pokusu byl 20 na. LOD (limit detekce) byl vypočten jako (28) : LOD= 3 * SD (SP) + Průměr hodnot (SP) LOQ (limit kvantifikace) byl vypočten jako (28) : LOQ= 10 * SD (SP) + Průměr hodnot (SP) Podle uvedených vzorců byly získány limitní hodnoty pro signál/intenzitu CL. Limitní hodnoty pro PEF vyjádřené v µm byly získány dosazením limitních hodnot intenzity do rovnice regrese detailní kalibrační křivky Vliv pomocných látek Injekční přípravek ABAKTAL obsahuje kromě účinné látky PEF také pomocné látky. Seznam pomocných látek (8) : kyselina askorbová, disiřičitan sodný, dihydrát dinatriumedetátu, benzylalkohol, hydrogenuhličitan sodný, voda na injekci. Byl stanovován vliv vzrůstající koncentrace EDTA, disiřičinatu a kyseliny askorbové na velikost signálu CL při zachování konstantní koncentrace PEF. Koncentrace PEF byla 1,03 * M. 34

35 5.10. Stanovení obsahu pefloxacin-mesylát dihydrátu Bylo provedeno stanovení účinné látky pefloxacin-mesylát dihydrátu v injekčním přípravku ABAKTAL. Tento přípravek obsahuje 515,3 mg PEF, což odpovídá 400 mg pefloxacinu v jedné 5 ml ampulce. Základní roztok vzorku přípravku ABAKTAL byl připraven odebráním 0,100 ml roztoku z ampule a naředěn do 100 ml odměrné baňky (C= 2,21 * M, dle deklarovaného obsahu). Pracovní roztoky byly dále připraveny odebráním 0,120 ml, 0,100 ml a 0,080 ml z tohoto zásobního roztoku, převedeny do 25 ml odměrné baňky a doplněny ultračistou vodou po značku. Pro stanovení obsahu byla použita rovnice regrese detailní kalibrační křivky. Stanovení obsahu bylo také provedeno metodou standardního přídavku. Pracovní roztok vzorku byl připraven odebráním 0,100 ml základního roztoku přípravku ABAKTAL a naředěn do 25 ml odměrné baňky ultračistou vodou. Deklarovaný obsah takto připraveného vzorku je 0, mg PEF. Jako standardní přídavek bylo použito množství 0, mg standardu PEF, které odpovídá 2 ml základního roztoku PEF naředěného do 25 ml odměrné baňky. 35

36 6. VÝSLEDKY A DISKUZE 36

37 6.1. Optimalizace koncentrace Ce (IV) Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 260 V 70 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 4-16 mm 40 µl 2+ Ru (bipy) 3 v H 2 SO 4 5,0 mm 60 µl CH 3 COONa: 0,5 M 30 µl PEF v H 2 O: 1,00 * M 60 µl Tab.č.3: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) C (mm) 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 1. 1,974 2,183 2,293 2,343 2,198 1,955 1, ,926 2,138 2,299 2,334 2,205 1,949 1, ,945 2,182 2,272 2,333 2,165 1,958 1, ,934 2,139 2,303 2,340 2,211 1,972 1, ,927 2,168 2,285 2,338 2,188 1,960 1,789 Průměr 1,941 2,162 2,290 2,338 2,193 1,959 1,784 Rozsah (na) I (na) 155,27 172,94 183,23 187,01 175,47 156,71 142,69 Tab.č.4: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) slepý pokus C (mm) 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 1. 1,281 1,479 1,463 1,505 1,460 1,231 1, ,243 1,483 1,484 1,512 1,475 1,236 1, ,276 1,499 1,474 1,510 1,501 1,258 1,115 Průměr 1,267 1,487 1,473 1,509 1,478 1,241 1,137 Rozsah (na) I (na) 10,13 11,90 11,79 12,07 11,83 9,93 9,10 37

38 Tab.č.5: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) výsledné hodnoty C (mm) 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 I (na) 145,14 161,05 171,44 174,94 163,64 146,78 133,59 Obr.č.9: Závislost intenzity CL na koncentraci Ce (IV) Jako optimální byla zvolena koncentrace 10 mm. 38

39 6.2. Vliv koncentrace H 2 SO 4 na intenzitu CL Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 260 V 70 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 10 mm 40 µl 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : 5 mm 60 µl CH 3 COONa: 0,5 M 30 µl PEF v H 2 O: 1,00 * M 60 µl Rozsah koncentrace H 2 SO 4: 0,05 0,9 M Tab.č.6: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 C (M) 0,05 0,1 0,2 0,5 0,7 0,9 1. 1,378 1,474 1,636 2,253 2,270 2, ,363 1,460 1,627 2,249 2,289 2, ,405 1,460 1,657 2,244 2,253 2, ,399 1,435 1,648 2,264 2,262 2, ,416 1,474 1,656 2,256 2,293 2,255 Průměr 1,392 1,460 1,645 2,253 2,273 2,261 Rozsah (na) I (na) 111,36 116,83 131,56 180,25 181,88 180,85 39

40 Tab.č.7: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 slepý pokus C (M) 0,05 0,1 0,2 0,5 0,8 0,9 1. 1,451 1,123 0,996 0,727 0,567 0, ,460 1,065 0,978 0,735 0,571 0, ,441 1,119 0,960 0,724 0,605 0,470 Průměr 1,451 1,102 0,978 0,729 0,581 0,483 Rozsah (na) I (na) 11,61 8,82 7,82 5,83 4,65 3,86 Tab.č.8: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 výsledné hodnoty C (M) 0,05 0,1 0,2 0,5 0,8 0,9 I (na) 99,75 108,02 123,74 174,42 177,23 176,99 Obr.č.10: Závislost intenzity CL na koncentraci H 2 SO 4 Jako optimální byla zvolena koncentrace 0,5 M. 40

41 6.3. Optimalizace koncentrace Ru(bipy) 3 2+ Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 260 V 70 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 10 mm 40 µl 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : 0,5 5,0 mm 60 µl CH 3 COONa: 0,5 M 30 µl PEF v H 2 O: 1,00 * M 60 µl Tab.č.9: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 3 2+ C (mm) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 1. 0,619 1,363 2,192 2,253 2,301 2, ,611 1,399 2,130 2,254 2,286 2, ,695 1,391 2,199 2,263 2,293 2, ,679 1,433 2,213 2,290 2,281 2, ,662 1,379 2,216 2,276 2,296 2,318 Průměr 0,653 1,393 2,190 2,267 2,291 2,320 Rozsah (na) I (na) 52,26 111,44 175,21 181,36 183,32 185,57 Tab.č.10: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 3 2+ slepý pokus C (mm) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 1. 0,422 0,987 1,189 0,884 1,220 1, ,399 0,955 1,163 0,867 1,127 1, ,394 0,945 1,160 0,865 1,155 1,510 Průměr 0,405 0,962 1,171 0,872 1,167 1,509 Rozsah (na) I (na) 1,62 7,70 9,37 6,98 9,34 12,07 41

42 Tab.č.11: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 3 2+ výsledné hodnoty C (mm) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 I (na) 50,64 103,75 165,84 174,38 173,98 173,50 Obr.č.11: Závislost intenzity CL na koncentraci Ru(bipy) 3 2+ Jako optimální byla zvolena koncentrace 3 mm. 42

43 6.4. Optimalizace koncentrace CH 3 COONa Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 260 V 70 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 10 mm 40 µl 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : 3 mm 60 µl CH 3 COONa: 0,5 1,0 M 30 µl PEF v H 2 O 1,00 * M 60 µl Tab.č.12: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa C (M) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1. 2,253 1,010 1,041 1,070 1,070 1, ,254 1,010 1,043 1,071 1,075 1, ,263 1,023 1,035 1,076 1,076 1, ,270 1,016 1,040 1,072 1,080 1, ,256 1,014 1,045 1,080 1,076 1,076 Průměr 2,259 1,014 1,041 1,074 1,075 1,077 Rozsah (na) I (na) 180,72 202,87 208,21 214,77 215,09 215,49 Tab.č.13: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa slepý pokus C (M) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1. 0,884 1,189 1,529 2,213 2,233 2, ,897 1,195 1,528 2,210 2,230 2, ,865 1,707 1,536 2,221 2,231 2,255 Průměr 0,882 1,364 1,531 2,215 2,231 2,239 Rozsah (na) I (na) 7,06 10,91 12,25 17,72 17,85 17,91 43

44 Tab.č.14: Závislost intenzity CL na koncentraci CH3COONa výsledné hodnoty C (M) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 I (na) 173,66 191,96 195,97 197,05 197,24 197,58 Obr.č.12: Závislost intenzity CL na koncentraci CH 3 COONa Jako optimální byla zvolena koncentrace 0,8 M. 44

45 6.5. Vliv obsahu methanolu a ethanolu na intenzitu CL Stanovení pefloxacin-mesylát dihydrátu bylo zkoumáno v prostředí methanolu a ethanolu v rozmezí koncentrací 10-80%. Parametry: Napětí: Průtoková rychlost: 260 V 70 µl/s Koncentrace a objemy činidel: Ce (IV) v H 2 SO 4 : 10,0 mm 40 µl 2+ Ru(bipy) 3 v H 2 SO 4 : 3,0 mm 60 µl CH 3 COONa: 0,8 M 30 µl PEF v H 2 O 1,00 * M 60 µl Vliv zvyšující se koncentrace methanolu jako rozpouštědla vzorku Tab.č.15: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu % ,083 1,048 0,994 1,563 1, ,077 1,050 0,984 1,622 1, ,080 1,040 0,972 1,562 1, ,084 1,045 0,981 1,573 1, ,080 1,045 0,992 1,612 1,435 Průměr 1,081 1,048 0,985 1,587 1,417 Rozsah (na) I (na) 216,15 209,59 196,93 126,92 56,68 45

46 Tab.č.16: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu slepý pokus % ,306 2,091 2,081 2,154 1, ,285 2,002 2,102 2,155 1, ,252 2,068 2,069 2,135 1,508 Průměr 2,281 2,054 2,084 2,148 1,571 Rozsah (na) I (na) 18,25 16,43 16,67 17,18 12,57 Tab.č.17: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu výsledné hodnoty % I (na) 197,91 193,16 180,26 109,74 44,11 Obr.č.13: Závislost intenzity CL na koncentraci methanolu Z grafu je patrné, že zvyšující se koncentrace methanolu má za následek snížení CL. 46

47 Vliv zvyšující se koncentrace ethanolu jako rozpouštědla vzorku Tab.č.18: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu % ,063 1,045 1,012 2,386 2, ,075 1,040 1,032 2,377 2, ,079 1,048 1,037 2,423 2, ,071 1,045 1,027 2,401 2, ,067 1,049 1,018 2,416 2,183 Průměr 1,072 1,044 1,027 2,395 2,214 Rozsah (na) I (na) 214,43 208,84 205,40 191,61 177,14 Tab.č.19: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu slepý pokus % ,209 1,947 1,851 1,801 1, ,123 1,996 1,876 1,799 1, ,058 1,977 1,932 1,779 1,608 Průměr 2,130 1,973 1,886 1,793 1,691 Rozsah (na) I (na) 17,04 15,79 15,09 14,34 13,53 Tab.č.20: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu výsledné hodnoty % I (na) 197,39 193,05 190,31 177,27 163,61 47

48 Obr.č.14: Závislost intenzity CL na koncentraci ethanolu Zvyšující se obsah ethanolu má za následek snížení CL. 48

49 6.6. Optimalizace objemů a průtokové rychlosti Tab.č.21: Optimalizace objemů činidel a průtokové rychlosti Vertex Ce (µl) Ru (µl) Octan (µl) PEF (µl) FR (µl/s) Průměr I (na) RSD , ,82 4, , ,71 2, , ,34 2, ,450 89,97 2, , ,27 2, , ,85 4, , ,97 3, , ,65 0, , ,18 2, , ,31 6, , ,16 0, , ,57 1, , ,33 0, , ,40 2, , ,26 1, , ,71 4, , ,36 1, , ,48 1, , ,77 2, , ,81 1, , ,33 0, , ,07 0,69 Optimální parametry: (koncentrace) a objem, uvedené v pořadí v jakém byly aspirovány: Ce (IV) (10 mm) 40 µl, Ru(bipy) 3 2+ (3,0 mm) 68 µl, CH 3 COONa (0,8 M) 46 µl, PEF 54 µl, optimální průtoková rychlost byla 80 µl/s. Použité napětí bylo 240 V. Tyto parametry byly použity pro měření kalibrační závislosti a stanovení obsahu. 49

50 6.7. Kalibrační závislosti Tab.č.22: Lineární část kalibrační křivky včetně signálu slepého vzorku Koncentrace (µm) 0,52 0,77 1,03 1,29 2, ,532 0,651 0,729 0,831 1, ,536 0,660 0,732 0,835 1, ,553 0,644 0,752 0,836 1, ,532 0,645 0,734 0,836 1, ,562 0,650 0,736 0,831 1,296 Průměr 0,543 0,650 0,737 0,834 1,291 Rozsah (na) I (na) 4,34 5,20 5,89 6,67 25,81 Koncentrace (µm) 5,16 7,73 10,31 12,89 SP 1. 1,590 1,428 2,046 1,059 0, ,663 1,403 2,015 1,065 0, ,675 1,443 2,081 1,063 0, ,689 1,424 2,032 1,054 0, ,661 1,440 2,045 1,064 0,298 Průměr 1,655 1,428 2,044 1,061 0,315 Rozsah (na) I (na) 66,22 114,21 163,50 212,18 2,52 Obr.č.15: Lineární část kalibrační křivky včetně signálu slepého vzorku 50

51 Lineární závislost byla zjištěna v rozsahu koncentrací od 0,52 µm do 12,89 µm, korelační koeficient R 2 = 0,9948, v oblasti 2,58 12,89 µm byl korelační koeficient R 2 =0,998. Tab.č.23: Detailní kalibrační křivka včetně signálu slepého vzorku Koncentrace (µm) 0,52 0,64 0,77 0,90 1,03 1,16 1, ,513 0,591 0,698 0,789 0,855 0,938 1, ,538 0,645 0,682 0,753 0,843 0,936 1, ,532 0,597 0,695 0,764 0,844 0,958 0, ,529 0,618 0,691 0,768 0,853 0,927 0, ,529 0,636 0,689 0,769 0,845 0,932 0,994 Průměr 0,528 0,617 0,691 0,769 0,848 0,938 1,016 Rozsah (na) I (na) 4,23 4,94 5,53 6,15 6,79 7,51 8,13 Obr.č.16: Detailní kalibrační křivka včetně signálu slepého vzorku Byla vytvořena kalibrační křivka vzrůstající koncentrace PEF v rozsahu od 0,52 µm do 1,29µM. Rovnice regrese byla y = 5,0122x + 1,6582, R² = 0,9994. Tato křivka byla získána v den stanovení obsahu PEF v injekčním přípravku a pro toto stanovení byla použita. 51

52 6.8. Opakovatelnost měření Tab.č.24: Opakovatelnost C PEF (M) 6,44 * , , , , , , , , , ,61885 Průměr 0,60969 SD 0, % 2,69 Rozsah (na) 20 I (na) 4,88 C PEF (M) 1,03 * , , , , , , , , , ,85856 Průměr 0,83904 SD 0,01793 % 2,14 Rozsah (na) 20 I (na) 6,71 Variační koeficient byl u vzorku o koncentraci 6,44 * M roven 2,69 % a u vzorku o koncentraci 1,03 * M byl roven 2,14 %. 52

53 6.9. LOD, LOQ Tab.č.25: Hodnoty slepého pokusu SP I (na) 1. 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,57168 Průměr 0, ,57699 SD 0, ,04921 RSD (%) 1,91 Tab.č.26: LOD, LOQ Signál Intenzita (na) Koncentrace (µm) LOD 0,3406 2,7246 0,2128 LOQ 0,3836 3,0691 0,2815 Po dosazení hodnot intenzity LOD a LOQ do rovnice regrese detailní kalibrační přímky, byl LOD stanoven na 0,2128 µm a LOQ na 0,2815 µm. 53

54 6.10. Vliv pomocných látek Vliv Chelatonu 3 (EDTA) na intenzitu CL Tab.č.27: Vliv EDTA na intenzitu CL C standard (M) 1,03 * ,03 * ,03 * ,03 * ,03 * C EDTA (M) 0 6,40 * ,29 * ,58 * ,16* ,877 0,906 1,003 1,173 1, ,836 0,893 0,992 1,172 1, ,852 0,912 0,961 1,141 1, ,832 0,855 0,972 1,156 1, ,847 0,913 0,944 1,141 1,472 Průměr 0,849 0,896 0,975 1,157 1,463 Rozsah (na) I (na) 6,79 7,17 7,80 9,25 11,70 Obr.č.17: Vliv EDTA na intenzitu CL Z grafu vyplývá, že vzrůstající koncentrace EDTA zvyšuje hodnotu signálu CL. 54

55 Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL Tab.č.28: Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL C standard (M) 1,03 * ,03 * ,03 * ,03 * ,03 * C disiřičitan (M) 0 6,39 * ,28 * ,56 * ,12 * ,855 0,756 0,873 0,946 0, ,864 0,772 0,896 0,911 0, ,845 0,732 0,849 0,930 0, ,829 0,763 0,919 0,901 0, ,823 0,748 0,976 0,907 0,927 Průměr 0,843 0,754 0,902 0,919 0,940 Rozsah (na) I (na) 6,75 6,03 7,22 7,35 7,52 Obr.č.18: Vliv disiřičitanu sodného na intenzitu CL Z grafu je patrné, že disiřičitan v nízkých koncentracích, přibližně pod ekvimolární koncentraci s přídavkem PEF, snižuje hodnotu intenzity CL. Nad tuto koncentraci pak signál s dalším přídavkem disiřičitanu nepatrně roste. 55

56 Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL Tab.č.29: Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL C standard (M) 1,03 * ,03 * ,03 * ,03 * ,03 * C kys. askorbová 0 7,22 * ,44 * ,89 * ,78 * ,855 0,914 0,998 1,049 1, ,864 0,900 1,004 1,071 1, ,845 0,900 1,001 1,107 1, ,829 0,882 0,992 1,103 1, ,823 0,882 0,981 1,081 1,306 Průměr 0,843 0,896 0,995 1,082 1,305 Rozsah (na) I (na) 6,75 7,16 7,96 8,66 10,44 Obr.č.19: Vliv kyseliny askorbové na intenzitu CL Vzrůstající koncentrace kyseliny askorbové má zvyšující vliv na hodnotu signálu CL. 56