transgenoze a klonování živočichů

Transkript

1 transgenoze a klonování živočichů

2 základní metody transformace živočišných buněk Mikroinjekce cizorodá DNA se přenáší do oplodněného vajíčka pomocí tenké skleněné kapiláry pod mikroskopem mikroinjekce transformovaných spermatidů Injekce rekombinantními kmenovými buňkami Lipofekce Elektroporace Retrovirální infekce viz přednáška genové terapie

3 lipofekce DNA se zabalí umělými lipidovými vezikuly (lipozomy) a přirozenou cestou je dopravená až do jádra DNA je záporně nabitá lipidové monomery jsou nabité kladně 3-dimethylamino-1,2-propanediol oleyl-toluensulfonát dioleyloxy(propyl)-n,n,n- trimetylamonium chlorid

4 lipofekce

5 lipofekce (snímky z elektronového mikroskopu) DNA liposom komplex

6 liposomy mohou sloužit jako tkáňově (tumor) specifické transportery DNA nové přístupy: zacílení na specifické buňky, do struktury liposomů se zabudují protilátky specifické na dané buňky

7 mikroinjekce

8 mikroinjekce transgen je vložen do vhodného vektoru a) rekombinační vektor (virový vektor) b) transgen je vyštěpen oplozené vajíčko před splynutím pronukleů je vybráno ze samice a centrifugováno (cytoplasma se nahromadí v jedné části a samičí pronucleus je lépe viditelný). mikroinjekce DNA kapilárou do pronucleu jednoho vajíčka pod mikroskopem implantace vajíčka do náhradní matky. embryo se dále vyvíjí normálně a proběhne řádný porod. detekce potomka vykazující fenotyp transgenu stále nejpoužívanější metoda, účinnost 1-5% elektroporace vajíčko ve stavu pronukleů se v roztoku s DNA elektroporuje, jediná metoda fungující u spermatozoidů

9 mikroinjekce aaa aaa

10 modelový organismus Xenopus laevis (drápatka vodní) obrovská vajíčka umožňují velice snadnou mikroinjekci zárodky (pulci) se vyvíjejí mimo tělo matky velice snadné pozorování a manipulace studium vývoje zárodku a zakládání orgánů (embryogeneze) nevýhody: pomalý životní cyklus, tetraploidní genom druh X. laevis X. tropicalis ploidie allotetraploidní diploidní N 18 chromozomů 10 chromozomů velikost genomu 3.1 x 10 9 bp 1.7 x 10 9 bp teplotní optimum o C o C velikost dospělce 10 cm 4-5 cm velikost vajíčka mm mm počet vajíček životní cyklus 1-2 roky 4 měsíce

11 metallothionein promoter regulovaný těžkými kovy příklad mikroinjekce krysí gen pro růstový hormon (somatotropin) byl mikroinjekcí vpraven do myši pod myším promotorem pro metallothionein, který je aktivován těžkými kovy homozygotní linie byla vyselektována na potravě bohaté na těžké kovy 10 týdnů staří sourozenci laboratorní myši (49 versus 29 gramů živé váhy)

12 příklad mikroinjekce transgenní losos gen pro růstový hormon z většího lososa královského byl pod specifickým antifreeze promotorem vložen do menšího lososa obecného fenotyp ryba roste daleko rychleji a dosahuje dospělosti za polovinu doby než wild-typová ryba. nebezpečí: transgenní ryba unikne ze sádek do volné přírody? transgenní ryby mají výhodu při páření ale jsou méně zdatnější evolučně velice nebezpečné může zdecimovat veškerou populaci řešení: sterilní ryby, nebo pěstování ve vnitrozemských sádkách

13 Transgenní komáři v boji proti malárii a horečce dengue Aedes aegypti vector AeAct4 exprese pouze ve svalech samičích larev V samečcích díky AS předčasné ukončení translace genu AeAct4-tTA tetracyklin represivní transaktivátor tre::dsred a tre::nipp1dm inhibitor jaderných fosfatas

14 injekce kmenových buněk kmenové buňky nediferenciované buňky, které se mohou diferenciovat v jakoukoliv jinou buňku (totipotentní) - mohou se kultivovat in vitro v nediferenciovaném stavu a snadno geneticky manipulovat, mají obrovskou dělící schopnost EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY odvozeny z vnitřních buněk embrya ve stavu blastocysty - jsou pluripotentní multipotentní

15 injekce kmenových buněk 1998 zjištěno, jak se dají nekonečně dlouho množit in vitro a získat z abortovaných lidských embryí při umělém oplodnění (aktivní telomerasy) velice citlivé na vnější podměty, při sebemenší změně se začínají diferenciovat in vitro již byly připravena většina ze zhruba 250 typů savčích buněk (neurony, ganglia etc.) pro speciální účely mohou být kmenové buňky odvozeny i z dospělého jedince např. kmenové buňky z lidské kostní dřeně lze diferenciovat in vitro na prekurzorové buňky mozkové, jaterní či svalové), lze je však velmi těžce vyselektovat (u 40-letého jedince je to jedna buňka z 10 miliard) 2002 kmenové buňky byly získány z odsátého tuku po liposukci, za 1500 dolarů navíc, je lze najít a uchovat do budoucna byly připraveny pluripotentní buňky ze zubní dřeně mléčných zubů 2005 in vitro množené buňky obsahují množství letálních mutací signál

16 transformace selekce injekce kmenových buněk -vznik chimerické myši

17 injekce kmenových buněk -vznik chimerické myši normální blastocysta ICM (inner cell mass) injekce embryonální kmenové buňky vzniká chimerická myš tzn. že má část těla z buněk svých a část těla z buněk kmenových

18 mikrochimerismus u člověka

19 transformace kmenových buněk inserční vektor substituční vektor pozitivní selekce na neomycin (gen M)

20 Křížení selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) A dominantní pro agouti srst chimerický myšák ES blast X normální myška barva srsti: genotyp: agouti black black AABB aabb aabb tm/+ ES + B6 /+ B6 + B6 /+ B6 gamety: tm a + ES + B6 + B6 AB ab ab potomstvo F1: pokud je recesivní bez projevu pokud je dominantní část potomstva s projevem agouti black AaBB aabb + ES /+ B6 + B6 /+ B6 agouti AaBB tm/+ B6

21 Křížení selekce transgenní myši tm = mutace (nebo nový gen) potomstvo F2: X tm/+ B6 tm/+ B6 tm/tm tm/+ B6 + B6 /+ B6 25% 50% 25% transgenní homozygot

22 knockoutovaná myš gen jehož expresi chceme potlačit vyizolujeme a naklonujeme do inzertního vektoru a linearizujeme přerušením jeho sekvence gen inaktivujeme naklonováním selekčního markeru (gen rezistence k neomycinu) do jeho ORF v případě substitučního vektoru transformujeme embryonální kmenové buňky a vyselektujeme je na neomycinu vyselektované buňky implantujeme do blastocysty a tu vložíme do hostitelské matky selektujeme potomstvo pomocí fenotypu (ztráta aktivity genu) inzerční vektor gen v genomu EKB homologní rekombinace a přerušení genu

23 knockoutovaná myš PROBLÉM TÉTO METODY JE VELKÁ FREKVENCE NÁHODNÁ INTEGRACE (antibiotikum vyselektuje i tyto linie, které nemají přerušený gen) možnost: SUBSTITUČNÍ VEKTOR s negativní selekci do vektoru je vložená sekvence genu HSVtk (herpes simplex virus thymidin kinasa) mimo rekombinantní místa, pokud dojde k náhodné integraci, přenese se do genomu EKB také tento gen selekce GANCICLOVIRem prekursor buněčného jedu, který vzniká aktivitou HSVtk náhodně rekombinované buňky po přídavku gancicloviru umírají homologní rekombinace linearizovaný substituční vektor náhodná integrace Neo R HSVtk Neo R Neo R+ / HSVtk - Neo R+ / HSVtk +

24 knockoutovaná myš -důležitý model pro testování funkce jednotlivých genů u obratlovců PROBLÉMY: knockout zabíjí časné fáze embrya i když by neměl letální vliv na dospělého jedince. ŘEŠENÍ: PODMÍNĚNÝ KNOCKOUT Nobelova cena za medicínu nebo fyziologii 2007

25 podmíněný knockout využívá rekombinasový systém P1 fága Cre lox, Cre-rekombinasa je specificky fungující enzym pro lox sekvence (34bp, sekvence mezi je tzv. floxovaná) standardně jsou připraveny dvě linie transgenní myši pomocí kmenových buněk první je připravená homologní rekombinaci tak že má do sebe vložený požadovaný transgen (je stále funkční) floxovaný lox místy a geny pro selekci druhá je připravená náhodnou rekombinací a je do ní vložen gen pro Cre rekombinasu pod specifickým promotorem a) tkáňově specifický b) indukovatelný tetracyklinem z obou linií se vyselektují homozygoti ti se zkříží gen je knockoutován pouze ve specifické tkáni (místně) nebo časově po indukci tetracyklinem

26 problémy práce s lidskými embryonálními kmenovými buňkami etické v některých zemích je zákaz odvozovat a pracovat s EKB úplný zákaz: Německo, Rakousko, Francie, Švýcarsko, Norsko, Irsko, Polsko, Brazílie částečný: USA pouze linie odvozené do roku 2001, nesmí se derivovat nové volná manipulace: Japonsko, Kanada, Španělsko, Itálie, Finsko, Švédsko, Izrael, Singapur, Austrálie, ČR imunologická inkompatibilita vytvořené linie nejsou imunologicky kompatibilní s většinou pacientů kteří potřebují transplantaci teratomy nediferenciované EKB tvoří často po implantaci do těla pacienta teratomy, pokusy s diferenciaci in vitro a až poté implantace kmenové buňky dospělé špatná diferenciace, ale 100% imunologická kompatibilita pokud jsou ze stejného jedince

27 využití kmenových buňek kmenové buňky odvozené z kostní dřeně pacienta implantovány do postižené tkáně (např. infarkt myokardu) pokusy na myši u které byl uměle vyvolán infarkt prokazovaly, že kmenové buňky nejsou schopny diferenciovat po implantaci v srdeční buňky. u některých myši se však funkce srdce zlepšila kmenové buňky byly označeny GFP a sledovány po implantaci do myšího srdce, bylo zjištěno, že u některých myší se transformují v nové cévy a zlepšují tak prokrvení nemocného srdce v Praze první pacient, kterému byly po těžkém infarktu myokardu implantovány vlastní kmenové buňky z kostní dřeně po zlepšení následovali další pacienti, u člověka se zlepšení projevovalo daleko výrazněji než u myší. zatím však lidské kmenové buňky nemohou být nijak upravovány či značeny a tak se neví zda regenerace srdečního svalu pomocí kmenových buněk u lidí funguje jinak než u myší podobné pokusy probíhají v Německu a Holandsku

28 Rekonstrukce srdce

29 About 3,000 individuals in the United States are awaiting a donor heart; worldwide, 22 million individuals are living with heart failure. A bioartificial heart is a theoretical alternative to transplantation. We decellularized hearts by coronary perfusion with detergents, preserved the underlying extracellular matrix, perfusable vascular architecture. To mimic cardiac cell composition, we reseeded these constructs with ESC to produce cardiac or endothelial cells. To establish function, we maintained construct for up to 28 d by coronary perfusion in a bioreactor that simulated cardiac physiology. By day 4, we observed macroscopic contractions. By day 8, under physiological load and electrical stimulation, constructs could generate pump function.

30 využití transgenních zvířat jako bioreaktory: domácí zvířata produkující mléko, do kterého je vylučován produkt transgenu. gen je včleněn do genomu zvířete pod specifickým promotorem β- laktoglobulínu exprimujícím se v prsních žlázách produkt transgenu neovlivňuje život transgenního zvířete produkce lidských proteinu: erytropoetin, antithrombin III atd. pavoučí mléko: fa NEXIA začala produkovat transgenní kozy exprimující geny pro produkci pavoučího proteinu, ze kterého pavouk vyrábí sítě do mléka pavoučí vlákno je odolnější než ocel a používá se na výrobu neprůstřelných vest SPIDER WEB SILK IN THE GOAT MILK

31

32 využití transgenních zvířat produkce zdravých zvířat: produkce drůbeže z masem, které má nižší obsah tuku produkce vajec se sníženým obsahem cholesterolu atd. zvyšování odolnosti hospodářských zvířat proti nemocem

33 zaškrcení embrya buněčné klonování nejstarší metoda klonování i přirozeně (jednovaječná dvojčata, normální způsob u pásovců, vždy vznikají 4 stejné klony) u člověka docházelo k deformaci jednoho embrya partenogeneze zárodek se vyvíjí z neoplodněného vajíčka vzniká pouze samičí potomstvo (haploidní jedinec) zdařilé pokusy (i přirozeně u nižších živočichů, typické pro mravence) u savců se zatím nezdařila bez deformací embrya transplantace jádra hlavní technika v současnosti používaná polyembryonie

34 transplantace jádra jádro z jedince který je klonován do bezjaderného vajíčka 1. denukleace hostitelské buňky chromozomy jsou jemně nasáty ostrou mikropipetou ze zralého neoplodněného vajíčka v metafázi II oocyt 2. přenos jádra denukleace cytoplast A. elektrofokusace celá donorová (somatická) buňka dárce je elektroporována za zónu peliculu (vnější membrána oocytu) a fúzována s cytoplasmou hostitelského denukleovaného oocytu B. jaderná injekce jádro somatické donorové buňky je mikroinjektováno do cytoplastu (honolulská metoda)

35 transplantace jádra elekroporace somatická buňka (kmenová buňka, tuková buňka, buňky pohlavních žláz, fibroblast, neuron) cytoplast

36 transplantace jádra tuková buňka z vaječníku cytoplast jaderná injekce a) disperzované tukové buňky b) jádra (šipky) nasáté do mikropipety c) propíchnutí zóny pelikuly d) zasunutí mikropipety až k oolemě e) aplikace piezo impulsu, který prolomí oolemu f) injekce jádra tukové buňky do ooplastu

37 transplantace jádra genetické přeprogramování je nutné pokud je jádro klonu vzato ze somatické buňky dospělého jedince přeprogramování aktivace genomu dárcovské buňky k obnovení jeho totipotence tak, aby mohla nově vzniklá buňka se dělit a diferenciovat ve všechny další typy buněk celého organismu nejlépe k němu dochází právě v cytoplasmě denukleovaného oocytu přeprogramování

38 transplantace jádra vývoj embrya z buňky obsahující cizí jádro buňky po transformaci jsou pěstovány v médiu indukce embryogeneze chemicky: chlorid strontnatý implantace embrya embryo je ze živného roztoku chirurgicky přeneseno do dělohy vhodné náhradní matky vždy je vloženo několik embryí současně (malá pravděpodobnost uchycení)

39 buněčné klonování 1958 první pokusy o klonování, vědci dokázali poprvé totipotenci živočišných buněk

40 1986 první klonovaný savec kráva byla naklonována z buněk časného stádia embryogeneze (nemá svůj jinak starý klon!) 1993 telata byla získána jaderným přenosem z embryonálních kmenových buněk pěstovaných in vitro 1995 dvě ovce Megan & Morag byly naklonovány z embryonálních buněk buněčné klonování

41 příběh ovečky Dolly první savec naklonovaný ze somatické buňky. byly odebrány somatické buňky z prsní žlázy (vemeno) 6-leté ovce (genetická matka Dolly, plemeno Finn Dorset) buňky byly přeneseny na vhodné médium in vitro a pěstovány buňky pak byly na 5 dní přeneseny na médium bez živin aby přestaly růst (dostaly se do G0 fáze a zbavily se naprogramování na prsní žlázu) každá z buněk pak byla elektroporačně zfúzována s denukleovaným ovčím oocytem ve stádiu metafáze II zfúzovaná buňka byla přenesená zpět do živného média a chemicky bylo indukováno dělení a embryogeneze (SrCl 2 ) v 16-buněčném stádiu bylo embryo chirurgicky přeneseno do dělohy náhradní matky (plemeno Scotish blackface, skotská černohubka). Dolly se narodila v Roslinově institutu ve Skotsku Dolly má v podstatě tři matky genetickou, tu co poskytla denukleované vajíčko a tu co ji donosila.

42 rodokmen Dollyiny rodiny

43 z Dollyina fotoalba Dolly a její otec Ian Wilmut Dolly a její náhradní matka manžel Dolly beran David plemeno velšské horské Dolly s prvorozeným jehnětem Bonnie ( ) Dolly s třemi dalšími jehňaty (2xM a 1xŽ) )

44 příběh ovečky Dolly úspěšnost klonování: na přípravu Dolly bylo zfúzováno 277 denukleovaných jader s 277 somatickými buňkami 29 embryí přežilo 13 se úspěšně usadilo v dělohách náhradních matek pouze jedna donosila živé jehně vědci se přou o to zda Dolly vznikla opravdu ze somatické buňky nebo pouze z kmenové buňky přítomné ve vemeni Dolly zemřela 13.února 2003 na progresivní plicní rozedmu ve věku 6 let (průměrný věk ovce je 12) problém: ZKRÁCENÉ TELOMERY - bylo statisticky potvrzeno u Dolly mitochondriální DNA: obsahuje 37 genů většinou odpovědných za regulaci energetického metabolismu (dědí se v mateřské linii). Dolly mtdna zdědila od druhé matky, která darovala vajíčko při přenosu somatické buňky dochází i k přenosu mtdna první matky, ta je však ve vajíčku zničena, stejně jako mtdna spermií

45 příběh ovečky Polly 1997 první klonovaná ovce nesoucí lidský gen narodila se také v Roslinově institutu ve Skotsku byla naklonována z fibroblastu ovčího plodu, který byl in vitro geneticky modifikován byl do něj vložen lidský gen pro alpha-1-antitrypsin pod promotorem s expresí do mléka je to protein používaný pro terapii cystické fibrózy ovce produkující další terapeuticky významné proteiny jsou na světě - produkce až do 1mg na 1mL mléka, náročná purifikace - od roku 2006 první průmyslová výroba antitrombinu z kozího mléka - profylaktické využití u dědičných onemocnění srážlivosti krve

46 myš Cumulina a její sestry 1998 první klonovaná myš z dospělé buňky na Honolulské Univerzitě na Hawaii z několika náhradních matek vzniklo 22 samičích klonů první generace, první myš byla pojmenována Cumulina z myší první generace byly odebrány somatické buňky a bylo vytvořeno 28 klonů druhé generace myši byly klonovány z tukové buňky vaječníku buňky nebyly fúzovány elektroporačně ale tzv. honolulskou technikou pomocí speciální mikropipety úspěšnost 2-4% tým se také pokoušel o naklonování myši z neuronu a poprvé se také pokusily vytvořit mužské klony ze Sertoliho buněk varlat - neúspěšně

47 řešení vlastní embryonální buňky terapeutické klonování aneb přenos jader somatických buněk květen 2005 SCIENCE první úspěšné terapeutické klonování člověka?? Woo-suk HWANG leden skandál

48 ipgs induced pluripotent stem cell z lidských fibroblastů připraveny pluripotentní kmenové buňky integrací čtyř genů 2007 Shinya Yamanaka Oct4 octamer-binding transcription factor 4 Sox2 sex determining region Y Klf4 Krüppel-like family of transcription factor C-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog 2014 Haruko Obokata

49 využití transgenních zvířat xenotransplantace: prasata jsou nejvhodnější dárce, podobná velikost, podobný imunitní systém v současné době se vyvíjejí prasata, která mají pozměněný imunitní systém, nebo modifikované povrchové proteiny buňky, tak aby je neodmítal lidský imunitní systém např. inaktivace 1,3-galaktosyl transferasy, která přenáší galaktosu na povrch prasečích buněk a kterou rozpoznává lidský imunitní systém jako antigen odstranění receptorů, které jsou důležité pro imunitní odpověď z prasečích buněk první nezdařené pokusy s transplantací srdce a ledvin pocházející z prasete první úspěšný pokus: transplantace prasečích ostrůvkovitých buněk slinivky břišní, produkující lidský inzulín diabetikovi PROBLÉMY: etické, přenos prasečích virových onemocnění na lidi (endogenní retroviry), spousta odpadních selat při selekci vhodného dárce

50 XENA první klonované sele 2000 v Roslinově ústavu se narodilo černé sele Xena bílé prasnici metoda použitá při klonování Dolly selhala a sele bylo získáno honolulskou technikou z buňky odebrané z měsíčního plodu úspěšnost: Xena vzešla ze 110 klonovaných vajíček, které byly implantovány do 4 náhradních matek Embryos clonally derived by microinjecting the nuclei of Meishan x Meishan breed (black coat) fetal fibroblasts into Landrace breed (white coat) enucleated oocytes. These embryos are at the four-cell stage after 40 hours of culture in vitro.

51 první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou 2002 opět v Roslinově ústavu ve spolupráci s japonskou firmou PPL Therapeutics se narodilo prvních pět selat s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu (nejsou to klony) 1,3- galaktosa na povrchu prasečích buněk způsobuje hyperacute rejection HAR při xenotransplantacích, což je rychlá humorálně imunitní odpověď lidského těla na prasečí buňky 2003 byly připraveny prasata s knock-outovaným genem pro alfa- 1,3- galaktosyltransferasu a vloženým lidským genem pro alfa- 1,2- fukosyltransferasu, která se podílí na tvorbě univerzálně akceptovaného antigenu HT na povrchu buněk 2005 plánovány první transplantace prasečích srdcí, ledvin, slinivek, jater, kůží a krevních buněk z 1,3-GT knock-out HT transgeních prasat do lidí.

52 první klonované prase s lidskou imunokompaktibilitou standardně byly připraveny selata overexprimující lidský gen pro alfa- 1,2- fukosylosyltransferasu a pomocí PCR byly vyselektováni z vrhu dva heterozygoti (samec a samice) a ti spáření dohromady samice byla ve 30 dnů těhotenství zabita a z jejího těla bylo odebráno 12 plodů, ze všech byla odstraněna hlava, končetiny a vnitřnosti a zbylá tkáň byla rozsekaná a kultivována na jednotlivé buňky buňky byly elektroporovány s linearizovaným vektorem nesoucí knockoutovaný gen pro 1,3 galaktosyl transferasu a dvojitě transgenní linie vyselektovány na neomycinu tyto buňky pak byly použity na přenos do denukleovaných oocytů honolulskou metodou HT + HT -

53 první klonované kotě CC se narodilo 22 prosince 2001 v texaské firmě A&M na získání CC bylo použito 188 embryí CC není stejná jako Rainbow, barva srstí a její textura je částečně ovlivněna prostředím dělohy (fenomén inaktivace X-chromozomu) první pokus: byly použitý kožní buňky, jediná těhotná kočka nesoucí klon potratila ve 44 dnu CC byla připravena nakonec stejně jako Cumulina z tukové buňky vaječníku Rainbow genetická matka náhradní matka CopyCat

54 genetický dárce klony z katalogu firmy: gizmo malý gizmo používají novou metodu klonování: chromatinový transfer tahini baba nanusch a tabouli cena za jeden klon: $ nicky malý nicky cena za uložení buněk z mrtvého či živého zvířete do banky : 850 $ klonování psů komplikovanější: - nepravidelná a velmi řídká ovulace (nutnost udržovat velkou populaci náhradních matek) - vajíčka nedozrávají ve vaječnících ale až ve vejcovodech a proto je nelze jako u jiných savců získávat při sterilizaci zvířat (nutno operativně drahé) - psí vajíčka jsou zakalené spoustou tuku a lze je těžko mikroskopicky denukleovat

55 nedostatky klonování savců velmi malá klonovací úspěšnost, většinou pod 1% vysoká úmrtnost čerstvě narozených klonů oversize offspring syndrome zatím nevysvětlen časté jsou také fyzické deformace narozených plodů časté u metody zaškrcování embrya artritida, srdeční arytmie, respirační problémy či totální selhání imunity klonů problém se stářím klonů - telomery druh počet použitých oocytů počet narozených klonů zemřeli po porodu myš (1.3%) - kráva (1.4%) 2 ovce (3.4%) 11 po 6 měsících prase (0.5%) - koza (1.1%) - počítají se pouze klony vzniknuvší z dospělé somatické buňky, do konce roku 2002

56 první klonovaný primát opice Tetra 2002 byla připravená metodou zaškrcování embrya, která do té doby u primátů, ani u člověka nefungovala z jednoho přirozenou cestou získaného embrya (ve stavu 8-buněk) makaka rhesus byly připraveny in vitro 4 klony (dvoubuněčné embrya) 2 odumřely ještě ve zkumavce, třetí abortoval v děloze náhradní matky. Pouze Tetra se dožila porodu a těší se dobrému zdraví Tetra v podstatě není klon, protože neexistuje jí totožný jedinec pokusy naklonovat makaka metodou jaderného přenosu selhávají všechna embrya získána z cizího jádra abortovala nejpozději ve stádiu blastuly bylo zjištěno že při dělení buněk embrya dochází k náhodným přesunům chromozomů mezi buňkami

57

58

59 klonování primátu jaderným přenosem 2002 firma CLONAID řízená sektou Reliánů podává spekulativní informace o klonováných lidských embryiích a dokonce i o narození prvních klonovaných dětí. leden 2004 Dr. Zavos v Londýně oznámil, že implantoval 35-leté ženě první naklonované lidské embryo z buńky jejího manžela. U ženy nedošlo k těhotenství. Nepodal žádné bližší informace. únor 2004 tým z národní jihokorejské univerzity poprvé připravil naklonována lidská embrya (do stádia blastuly) jaderným přenosem z dospělé buňky. Pokus o implantaci embrya do náhradní matky neproběhl. prosinec 2004 tým z Pittsburgu ve spolupráci s jihokorejci připravil první nedegenerovaná embrya nukleárním přenosem makaka rhesuse. 188 těchto embryií bylo přeneseno do 25 náhradních matek. Ani u jedné však nebylo zjištěno pokročilé těhotenství. obě skupiny z embryí připravili stabilní linie kmenových buněk úspěchu dosáhli až poté co zdokonalili metodu použitou u Dolly, kdy denukleaci oocytu provedli pomocí pórů v buněčné stěně. neodstranili tak společně s jádrem esenciální bílkoviny z cytoplasmy důležité pro dělení nového jádra.

60 klonování primátu jaderným přenosem VYUŽITÍ KLONOVANÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK TERAPEUTICKÉ KLONOVÁNÍ přenos jader somatických buněk nejsou velké etické zábrany veřejnosti pro výzkum v této oblasti. embryonální kmenové buňky jsou nejvíce prozkoumány a zdají se být na rozdíl od ostatních kmenových buněk nejvhodnější pro terapii. odpadá imunologická inkompatibilita stejné genetické stáři buňky jako buněk jejích příjemce začíná se s prvními výzkumy v oblasti léčby nemocí, kde je specifická tkáň degenerována a může být nahrazena těmito buňkami: diabetes, osteoartritida, Parkinsonova a Altzheimerova choroba. VYUŽITÍ OPIČÍCH KLONů PRO TESTOVÁNÍ NOVÝCH LÉČIV

61 ETIKA a LEGISLATIVA Povoleno terapeutické Klonování: Belgie Jižní Korea Finsko Holandsko UK Švédsko

62 2007 první klonované embryonální kmenové buňky makaka rhesuse

63 2008 první klonovaná lidská blastocysta ze somatické buňky

64

65

66 KONZERVAČNÍ BIOLOGIE se zabývá zachováním ohrožených druhů živočichů na Zemi The Center for Reproduction of Endangered Wilidlife (CREW) v Cincinnati ZOO se začal zabývat klonováním ohrožených druhů prvním klonovaným živočichem byl sameček divokého malajského gaura, kteří žijí již pouze v zajetí v ZOO. Tito živočichové pěstovaní v zajetí se však často odmítají vzájemně pářit. jejich klonování je důležité proto, aby byla zachována genetická diverzita v málo početné populaci. sameček Noah byl také prvním vytvořeným samčím savčím klonem, který se dožil porodu jeho chromatin byl vložen do denukleovaného oocytu krávy plemena Holstein, která ho také porodila Noah bohužel zemřel dva dny po porodu na infekci

67 KONZERVAČNÍ BIOLOGIE dalším ohroženým druhem úspěšně naklonovaným byla antilopa bongo zvažuje se klonování velkých červených pand. Neexistuje však vhodná náhradní matka. Vědci nechtějí použít vlastní samice pand, protože již tak málo jedinců by bylo vystaveno velkému nebezpečí. Nejbližším vhodným příbuzným je mýval. v Austrálii chtějí klonovat Tasmánského tygra, který byl vyhuben v roce (jediný exemplář je mládě ve zkumavce, jeho DNA už však začíná být částečně fragmentovaná) 1999 příběh španělské kozy Celie (bucardo) jak se bude klon rozmnožovat? má smysl tyto živočichy oživovat, když stejně nebudeme schopni jim zaručit genetickou diverzitu v rámci druhu? neandrtálec mitochondriální DNA dinosauři - utopie maximální životnost DNA je let

68 KONZERVAČNÍ BIOLOGIE 1. Šavlozubý tygr př.n.l 2. Medvěd krátkočelý př.n.l 3. Tasmánský tygr 1936 n.l 4. Blboun nejapný 1690 n.l 5. Neandrtálci př.n.l