Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení I

Transkript

1 Kolektiv Lékařská chemie, biochemie a molekulární biologie Praktická cvičení I Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Ústav biochemie a experimentální onkologie Vedoucí ústavu: Prof. MUDr. Aleksi Šedo, Dr.Sc.

2 Autorský kolektiv: Editor: Doc. MUDr. Jaromír Křemen, CSc. MUDr. Jana Stříbrná, CSc. RNDr. Eva Bubnová, CSc. RNDr. Alena Buděšínská, CSc. Doc. MUDr. Zdeněk Kleibl, PhD. MUDr. Michal Zikán, PhD. MUDr. Petr Bušek, PhD. Mgr. Lucie Šromová 2

3 OBSAH Úvod 6 Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři 6 První pomoc v laboratoři 9 Pomůcky pro praktická cvičení 10 Práce s automatickými pipetami a spektrofotometrem 11 Stanovení koncentrace chloridu železitého 14 Základní chemické pojmy a zákony 16 Roztoky - složení, ředění, osmolarita 17 Pufry 19 Závislost ph acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a kyseliny octové 20 Změna ph acetátového pufru po přidání zásady 21 Změna ph acetátového pufru po přidání kyseliny 22 Změna ph pufru v závislosti na jeho ředění 23 Závislost kapacity pufru na látkové koncentraci pufru 24 Příprava fosfátového pufru z jeho složek 25 Výpočet ph kyselin, zásad a pufrů 26 Stechiometrické výpočty, iontový zápis chemických rovnic, iontové rovnice 29 Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin 31 Důkaz vybraných kationtů 33 Důkaz vybraných anionů 37 Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny 39 Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin 42 Oxidace primárních alkoholů 43 Rozpustnost organických kyselin a jejich solí 44 Tvorba komplexních sloučenin 48 Reakce primárních aminů s oxosloučeninami 51 Močovina 52 Aminokyseliny 54 Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě 55 Kyselina glutamová 58 Barevné reakce aminokyselin 59 Reversibilní redox systém cystein-cystin 63 Bílkoviny I 64 Biuretová reakce 65 Emulgační schopnost bílkovin 66 Irreversibilní srážení bílkovin 67 Dialýza 69 Důkaz některých složek bílkovin 71 Bílkoviny II 72 Elektroforéza bílkovin 73 Stanovení koncentrace celkové bílkoviny v séru 76 Stanovení koncentrace albuminu v seru 78 Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu v séru 80 Reversibilní srážení bílkovin - izolace albuminu a globulinů z krevního séra 82 3

4 Nukleové kyseliny I 83 Důkaz složek nukleových kyselin 84 Kyselina močová 86 Stanovení kyseliny močové v krevním séru a v moči 87 Nukleové kyseliny II 89 Izolace genetického materiálu 90 Nukleové kyseliny III 92 Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin 93 Nukleové kyseliny IV 96 Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR a restrikčního štěpení a real-time PCR 108 4

5 ÚVOD Předkládaná skripta pro výuku praktických cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie vycházejí z textu publikovaného v roce Od té doby došlo k řadě různých změn a tak bylo nutno texty upravit pro stávající potřeby. V důsledku inovace ve výuce uvedených oborů byla některá čistě teoretická témata vypuštěna, zejména ta, která budou probírána na seminářích. Naopak jiné kapitoly byly doplněny. Snažili jsme se klást důraz na klinický význam a uplatnění určitých úloh s cílem zvýšení zájmu studentů o obor. Zdá se, že studentům 1. až 3 ročníků chybí informace o důležitosti laboratorních oborů komplementu, kde je nezastupitelná role laboratorně vzdělaného lékaře se základními praktickými návyky. Jejich osvojení je v podstatě propedeutikou pro ostatní laboratorní obory. V molekulárně biologickém oddílu jsme u průkazu genových polymorfismů ApoE prokazovaných PCR a restrikčním štěpením spolu s gelovou elektroforézou, které v současné době v rutinní diagnostice ustupují do pozadí, doplnili moderní přístup průkazu polymorfismů pomocí real-time PCR se specifickou hybridizační FRET sondou. Studenti pracují s vlastním biologickým materiálem získaným bukáním stěrem a mohou tak porovnat náročnost obou přístupů. Praktická cvičení umožňují studentům jednak procvičit teoretické vědomosti, ale i aplikovat teoretické poznatky do praxe. V úvodních kapitolách se studenti seznámí s používáním odměrných zařízení, automatickými pipetami a dávkovači, dále se základním přístrojovým vybavením jako jsou spektrofotometry, elektroforetická zařízení. Současně se také seznámí s používáním základních přístrojů POCT - Point of Care Testing, což znamená provádění měření a testů in vitro v místě péče o pacienta diagnostickými přístroji s jednoduchým ovládáním. Měření a testy provádějí často pracovníci bez specializovaného laboratorního vzdělání na klinických odděleních jako součást péče o pacienta, ale jsou kontrolovány lékařem - klinickým biochemikem. POCT zahrnuje používání techniky u lůžka pacienta včetně přenosných analyzátorů, v praktických a odborných ambulancích (primární péče) nebo techniky vlastněné pacientem (např. sebetestování diabetiků). Analytické postupy, které využívají přístroje a zařízení POCT, jsou používány také při analýze patologických součástí moče nebo důkazu toxických látek v séru, slinách i v moči. Dále jsou zařazeny úlohy, které umožňují provést vyšetření séra a moče simulovaného pacienta a tím snadněji pochopit biochemické podklady závažných onemocnění. Byla zvolena témata týkající se zdravotních problémů velké části populace (např. diabetes mellitus, infarkt myokardu, aterosklerosa). Studentům doporučujeme, aby si před praktickým cvičením pečlivě prostudovali příslušný text cvičení a znalosti doplnili navazujícím textem z učebnice. Praktická cvičení z lékařské chemie, molekulární biologie a biochemie budou publikována v elektronické formě, což studentovi umožní vytisknout příslušnou kapitolu, respektive úlohu, a pracovat s nimi jako s pracovními listy. Závěrem dovolte vyslovit přání, aby praktická výuka i tyto texty, včetně seminářů, vám pomohly nejen ve studiu biochemie, ale i k získáni laboratorní zručnosti a zájmu o obor se stále narůstajícím významem nejen ve vědě, ale i ve všech oblastech klinické medicíny. Nezapomínejte, že se snižují počty lékařů vedoucích laboratorní oddělení a mnozí z vás je budou muset nahradit. Uvědomte si také, že v postgraduálním studiu se základní informace již získávají obtížněji. V Praze 2011 Autoři 5

6 Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři 1. V laboratoři se pracuje v předepsaném pracovním ochranném oděvu: bílý laboratorní plášť by měl být celý zapnutý. Dlouhé vlasy je nutno mít sepnuté. V případě potřeby se doporučuje používat další ochranné pomůcky: gumové rukavice, brýle, ochranný štít nebo roušku. 2. Při práci s biologickým materiálem (krev, sérum, plazma, moč) je nutno vždy používat gumové rukavice. 3. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit. Před odchodem z laboratoře je nutno vždy si umýt ruce mýdlem. 4. Při práci musí být zachován klid a udržována maximální čistota. Pracuje se s maximální pozorností a rozmyslem. 5. Každá kádinka,zkumavka,láhev na pracovním stole musí být čitelně a srozumitelně popsána ( obsah - signatura). 6. S pevnými chemikáliemi se nikdy nemanipuluje rukou, neodsypávají se do dlaně apod. Používá se čistých laboratorních lžiček nebo špachtlí. V případě znečištění chemickou látkou se ruce ihned opláchnou a umyjí mýdlem a vodou. 7. Malé zátky se při práci přidržují v ruce a neodkládají se na pracovní stůl. Zátky větších lahví je nutno položit tak, aby obsah lahve na nich ulpělý nekontaminoval pracovní plochu. Láhve a jiné obaly je po odebrání potřebného množství chemikálie třeba ihned uzavřít. 8. Reagenční roztoky se odlévají z reagenčních lahví na straně odvrácené od signatury tak, aby se nepoškodil štítek na lahvi. Nečitelný nápis a s tím spojená případná záměna může mít nebezpečné následky. 9. Pipetování jedovatých, leptavých, dráždivých a potenciálně infekčních (biologických) kapalin je nutno provádět bezpečnostními pipetami nebo pomocí balonku. Nikdy ne přímo ústy! 10. Při manipulacích s látkami ve zkumavkách a jiných nádobách musí ústí nádoby vždy směřovat od vlastní osoby i od jiných pracovníků. 11. Tekutiny ve zkumavce při zahřívání na otevřeném ohni se zahřívají opatrně a pomalu od hladiny ke dnu. Zkumavkou se přitom pohybuje, aby se obsah rovnoměrně prohříval a nedošlo k náhlému varu a vystříknutí vroucí kapaliny. 12. Pachy látek se nezjišťují přímým přičicháváním; výpary se přivanou mávnutím dlaně. Chemikálie se nikdy nesmí ochutnávat! 13. Koncentrované kyseliny, zvláště kyselina sírová, se ředí vléváním kyseliny do vody. Kyselina se přilévá tenkým proudem, po částech a za stálého promíchávání roztoku skleněnou tyčinkou. Obrácený postup, tj. přilévání vody do kyseliny je nepřípustný. 14. Při rozpouštění pevného hydroxidu sodného nebo draselného se sype hydroxid po malých částech za stálého míchání do vody; vždy se vyčká, až je předchozí podíl rozpuštěn.pokud se roztok více ohřívá, ochladí se nádoba vodou ve větší nádobě. 6

7 15. Rozlité koncentrované kyseliny se nejprve ředí opatrně vodou a pak neutralizují zředěným roztokem sody nebo alkalického hydroxidu. Rozlité roztoky louhů se ředí vodou. Kontaminované plochy se pak omyjí vodou. Tyto operace se provádějí v ochranných rukavicích. Drobné kapky kyselin, louhů a jiných nebezpečných látek se nasají do filtračního papíru a potřísněné místo se pak omyje vodou. 16. Roztoky chemikálií se vylévají do odpadu jen za současného ředění nadbytkem vody z vodovodu. 17. Je třeba se vyhnout vdechnutí i minimálních kvant chemických látek. Některé látky, např. kyanovodík, sirovodík, chlor, fosgen aj. mohou usmrtit už po jediném nadechnutí. Jiné, např. rtuť, benzen, tetrachlormethan a 2-naftylamin, mohou způsobit těžká poškození zdraví až po delší době. Pro možnost infekce je třeba dbát úzkostlivé čistoty při práci s biologickým materiálem. 18. S látkami dráždivými, páchnoucími a jedovatými, např. s chlorem, fosgenem, chloroformem, tetrachlormethanem, sirouhlíkem aj., a s látkami snadno vznětlivými, např. s petroletherem, diethyletherem, benzinem, sirouhlíkem, benzenem, acetonem aj. se musí pracovat v dobře odsávané a zapojené digestoři. Při práci s hořlavinami se dbá na to, aby nemohlo dojít ke vznícení par od otevřeného ohně, tj. zejména od blízkých kahanů, ale i elektrických spotřebičů. V jedné digestoři nelze např. pracovat s hořlavým rozpouštědlem a zahřívat cokoli plynovým kahanem. Nebezpečným zdrojem par mohou být i chromatografické vany. Nebezpečnou věcí je postřik chromatogramů, kdy vzniká jemný aerosol činidla; detekci lze provádět jen v dobře odsávané digestoři nebo odsávaném boxu. Také žíhání, spalování a mineralizace látek se provádějí v digestoři. 19. Při rozlití hořlaviny se ihned zhasnou kahany a vypojí elektrické spotřebiče. Při rozlití velkého množství hořlavin se ihned zhasnou všechny hořáky a vypnou elektrické spotřebiče v místnosti, intenzivně se vyvětrá a nezapínají se žádné elektrické spotřebiče, ani světlo. Nejvyšší přípustné množství hořlavin v laboratoři je stanoveno předpisy. Je třeba mít na paměti, že hoří všechny organické látky, které obsahují méně než 70 % halogenu. 20. Při nasazování hadiček na skleněné trubice a zasunování skleněných trubiček, kohoutů a teploměrů do zátek se postupuje opatrně a bez násilí, nejlépe v ochranných rukavicích nebo rukou chráněnou čistou utěrkou; sklo se drží u otvoru, do něhož se vsunuje. Vsunutí skleněných předmětů do otvorů v pryži se usnadní jejich potřením glycerolem. 21. Chemické sklo a skleněné součásti chemických aparatur je třeba před prací prohlédnout; i nepatrná prasklina může mít velmi vážné následky. Poškozené sklo je třeba ihned vyřadit, dát do opravy nebo uložit do zvláštní nádoby na skleněný odpad. Poškozené sklo nesmí přijít do umývárny s ostatním sklem. Střepy skla i drobné střípky na stolech je nutno opatrně a pečlivě odstranit. 22. Při zahřívání, např. destilaci kapalin s teplotou varu pod 100 C, se užívají elektricky vyhřívané vodní lázně, elektricky vyhřívaná topná hnízda a infrazářiče. Pokud k ohřevu slouží zahřívané olejové lázně, nesmí do oleje vniknout voda. 23. Utajenému varu, např. při destilaci, lze zabránit varnými kaménky nebo skleněnými kuličkami, vloženými do nádoby před začátkem zahřívání. Při podezření na utajený var se vypne zdroj tepla a kapalina se nechá bez otřesů zchladnout. 24. Tenkostěnné nádoby s plochým dnem nesmějí být vakuovány, hrozí exploze. Pro vakuovou destilaci se používají výlučně silnostěnné baňky s kulatým nebo oblým dnem. 7

8 25. Ramena odstředivek musí být stejnoměrně zatížena. Odstředivky musí být během centrifugace uzavřeny, víko nesmí být otevřeno, dokud přístroj není opět v klidu. Většina centrifug je chráněna proti předčasnému otevření pojistkou. 8

9 První pomoc v laboratoři 1. Vnikne-li chemická látka do úst, je třeba zamezit jejímu spolknutí; vyplivne se a ústa vyplachují vodou. Při požití jedovaté látky nebo roztoku se ústa opakovaně vypláchnou vodou, po vypití asi půl litru tekutiny se vyvolá zvracení (dráždění hrdla prstem) a vyhledá se lékařská pomoc. 2. Při poleptání kůže kyselinami a louhy se postižené místo ihned dostatečně opláchne proudem studené vody. Při větším potřísnění se pak vyhledá lékařská pomoc. Zvlášť nebezpečná poleptání způsobují kyselina fluorovodíková, kyselina dusičná, kyselina sírová, alkalické hydroxidy, peroxid vodíku a fenol. 3. Zasažené oko se ihned vypláchne proudem studené vody, přiloží se sterilní obvaz a ihned se vyhledá lékařská pomoc. 4. Při popálení ohněm nebo horkými předměty je třeba postižená místa ihned ochladit ledovou vodou nebo přikládáním igelitových sáčků s vodou a ledem (ne samotný led). Části oděvu stmelené s popáleninami se zásadně neodstraňují. Při opaření je nutno co nejrychleji stáhnout nasáklý oděv, popálené plochy se kryjí jen sterilním obvazem (žádné masti nebo zásypy). Při těžších popáleninách nebo popálení většího rozsahu je třeba vyhledat lékařskou pomoc. 5. Při úrazu elektrickým proudem, je-li postižený pod napětím, je nutno nejprve přerušit přívod proudu nebo postiženého vyprostit tak, že je zachránce dostatečně izolován od země suchou dřevěnou, gumovou nebo skleněnou podložkou. Zabezpečí se dýchání, srdeční činnost a přivolá se lékařská pomoc. 6. Při vzniku řezných ran, např. laboratorním sklem, se krvácející rána omyje proudem vody, případně desinfikuje. K dezinfekci menších ran je možno použít Ajatin, Famosept, Septonex nebo roztok manganistanu draselného. Rána se přelepí rychloobvazem nebo ováže. Jsou-li v ráně cizí tělesa, např. střepiny skla, musí je vyjmout lékař. Při rozsáhlejším krvácení se přiloží kompresní obvaz a vyhledá lékařské ošetření. 7. Před zahájením praktik jsou studenti povinni se seznámit s teorií používané laboratorní metody a s postupem práce daného experimentu. Před začátkem každé úlohy je třeba se předem zamyslet nad možnými pracovními riziky. PŘI JAKÉKOLI POCHYBNOSTI NEBO PODEZŘENÍ NA RIZIKO NEBEZPEČÍ SE NIKDY NEROZPAKUJTE DOTÁZAT ASISTENTA. 9

10 Pomůcky na praktika 1. Identifikační karta studenta 2. Přezutí 3. Bílý laboratorní plášť 4. Lihový popisovač na sklo 5. Návody na prakt. cvičení 6. Psací potřeby včetně sešitu 7. Kalkulačka 8. Zámeček na skříňku v šatně 9. Rukavice nesterilní nepudrované (bez talku) 10

11 PRÁCE S AUTOMATICKÝMI PIPETAMI A SPEKTROFOTOMETREM Práce s automatickými pipetami Klíčová slova: převod mililitry,mikrolitry, látková koncentrace, komplexní sloučeniny, spektrofotometrie, transmitance, absorbance, molární absorpční koeficient, měřený vzorek, standardní vzorek, slepý vzorek. Reagencie: 1. roztok thiokyanatanu draselného 1 mol/l 2. roztok chloridu železitého 400 µmol/l 3. standardní roztok chloridu železitého 200 µmol/l 4. roztok kyseliny sírové 1 mol/l!žíravina! Pokyny pro práci s automatickými pipetami: 1. Před pipetováním nasaďte na pipetu špičku, jejíž barva obvykle odpovídá barvě tlačítka pístu. 2. PIPETU DRŽTE VŽDY ŠPIČKOU DOLŮ!!! 3. Při pipetování stlačte píst k první zarážce, ponořte pipetu do roztoku a pomalým uvolňováním stlačeného pístu nasajte kapalinu (pozor na vzduchové bubliny). Pomalým stlačením pístu k druhé zarážce vypusťte obsah špičky (špička nesmí být ponořena do kapaliny) do zkumavky.. Špička se při tom dotýká stěny zkumavky. 4. Pro pipetování nového roztoku použijte vždy novou špičku. 5. Pipety odkládejte svisle do stojánku a nepokládejte je na pracovní desku stolu. Nastavení zvoleného objemu: 1. Podle požadovaného objemu roztoku zvolte pipetu s vhodným rozsahem uvedeným na barevném tlačítku pístu pipety! 2. Požadovaný objem nastavte na stupnici pipety otáčením šroubu. 11

12 Příklady: rozsah pipety 200/1000 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 200 µ1 největší objem µl µl µl µl rozsah pipety 20/200 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 20 µl největší objem 200 µl µl µl 2 20 µl rozsah pipety 2/20 (údaj na barevném pístu): nejmenší objem 2 µl největší objem 20 µl µl µl 2 2 µl Spektrofotometrie: Závislost absorbance roztoku na koncentraci rozpuštěné látky podle Lambertova- Beerova zákona umožňuje stanovit neznámou koncentraci látky z naměřené hodnoty absorbance příslušného roztoku: A = log T= ε c l A = absorbance při zvolené vlnové délce T = transmitace při zvolené vlnové délce ε = molární absorbční koeficient při zvolené vlnové délce c = látková koncentrace měřeného roztoku (mol/l) l = tloušťka měřené vrstvy = 1 cm 12

13 Hodnotu koncentrace lze získat těmito způsoby: a) výpočtem z Lambertova-Beerova zákona, známe-li molární absorbční koeficient b) odečtením z kalibračního grafu c) výpočtem pomocí kalibračního faktoru d) změřením absorbance standardního roztoku o známé koncentraci, absorbance roztoku vzorku a následným výpočtem ze vztahu: A st /A vz = c st /c Pokyny pro práci se spektrofotometrem Spekol 11: A st = absorbance standardu A vz = absorbance vzorku c st = látková koncentrace standardu c vz = látková koncentrace vzorku 1. Přístroj zapněte 5 min. před měřením. 2. Na spektrofotometru nastavte požadovanou vlnovou délku. 3. Kyvety uchopte vždy za matné stěny. 4. Minimální objem měřeného roztoku je na kyvetě vyznačen ryskou, maximální objem roztoku by měl dosahovat 0,5 cm pod horní okraj. 5. Kyvetu se slepým vzorkem vložte do jezdce měřícího nástavce přístroje tak, aby paprsek světla procházel průhlednými stěnami kyvety. Jezdcem pohybujte pomalu a opatrně. 6. Přístroj vynulujte tlačítkem R. 7. Roztok měřeného vzorku nalijte do druhé kyvety a změřte jeho absorbanci. 8. Roztok změřeného vzorku vylijte do kádinky na odpad. Zbytek kapaliny odstraňte postavením kyvety na buničinu dnem vzhůru. 9. Před měřením dalšího vzorku přístroj znovu vynulujte na slepý vzorek. 10. Po ukončení měření obě kyvety několikrát vypláchněte destilovanou vodou a postavte na buničinu dnem vzhůru. 13

14 ÚLOHA 1. Stanovení koncentrace roztoku chloridu železitého Při spektrofotometrickém stanovení koncentrace Fe 3+ se využívá intenzívně červeně zbarveného komplexu [Fe(SCN)] 2+, který vzniká reakcí Fe 3+ s thiokyanatanovými anionty v kyselém prostředí (viz. Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků, (úloha 1.3.). Složení zadaných vzorků: vzorek A B C D slepý vzorek Fe µmol/l (µl) destilovaná voda (µl) Každý student připravuje jeden ze vzorků A D podle zadání. Připravte a očíslujte sedm zkumavek. Do zkumavek 1 3 připravte vždy 1 ml zadaného vzorku. Tímto způsobem připravíte tři identické vzorky (triplet). Do zkumavek 4 6 napipetujte vždy 1000 µl standardního roztoku chloridu železitého 200 µmol/l. Do sedmé zkumavky připravte slepý vzorek (1000 µl destilované vody). Do všech sedmi zkumavek odměřte dávkovačem 0,5 ml roztoku kyseliny sírové (1 mol/l), protřepejte a přidejte 0,5 ml roztoku thiokyanatanu draselného (celkový objem v každé zkumavce bude 2 ml). Obsah zkumavek dobře promíchejte. Po 10 min změřte absorbanci vzorku (A vz ) i standardu (A st ) při 530 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zaznamenejte do tabulky 1. a 2. 14

15 Tabulka 1. vzorek: absorbance průměr standard vzorek Z průměrné hodnoty absorbance vzorku a z průměrné hodnoty absorbance standardu vypočítejte koncentraci Fe 3+ (exp.). Ze zadaného složení vzorku (A-D) spočítejte teoretickou koncentraci a porovnejte obě hodnoty. Všechny údaje zapište do tabulky 2. Tabulka 2. vzorek Fe 3+ (µl) voda (µl) průměr A st průměr A vz cfe 3+ (µmol/l) teoret. cfe 3+ (µmol/l) exp. Poznámky: 15

16 ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY Klíčová slova: relativní atomová hmotnost (A r ), relativní molekulová hmotnost (M r ), Avogadrova konstanta (N A ), látkové množství (n, mol), molární hmotnost (M, g/mol), molární objem (V m, dm 3 /mol), hmotnostní zlomek prvku ve sloučenině (w). Příklady na procvičování: 1. Jakou molární hmotnost má: a) oxid uhličitý, b) ethanol, c) glukosa, d) alanin? 2. Jaké látkové množství představuje: a) 90 g vody, b) 6 g kyseliny octové, c) 2,9 g chloridu sodného, d) 4,86 g hydrogenuhličitanu vápenatého? 3. Jaký je za normálních podmínek objem: a) 7 g dusíku, b) 2,2 g oxidu uhličitého? 4. Jakou hmotnost má za normálních podmínek: a) 1 l amoniaku, b) 10 l kyslíku? 5. Kolik molů Fe 2+ obsahuje 77,5 g jodidu železnatého? 6. Kolik mmolů Na + obsahuje 0,67 g oxalátu sodného? 7. Kolik % dusíku obsahuje močovina? 8. Kolik g dusíku vyloučil pacient za den, když v celkovém objemu moči bylo nalezeno 500 mmol močoviny? 9. Bílkoviny obsahují v průměru 16 % dusíku. Kolik g bílkovin musíme podat pacientovi, když mu potřebujeme dodat 5 g dusíku? 10. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní při dekarboxylaci 25,5 mg kyseliny acetoctové? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (A r ) vybraných prvků: Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S = 32, Fe=56, Cl = 35, I = 127 Klíč: 1. a) 44 g/mol, b) 46 g/mgl, c) 180 g/mol, d) 89 g/mol 2. a) 5 mol, b) 0,1 mol, c) 0,05 mol, d) 0,03 mol 3. a) 5,61, b) 1, a) 0,76 g, b) 14,28 g 5. 0,25 mol mmol % g 9. 31,25 g 10. 5,6 ml Poznámky: 16

17 ROZTOKY - SLOŽENÍ, ŘEDĚNÍ, OSMOLARITA Klíčová slova: koncentrace látková = molární (mol/l roztoku), koncentrace hmotnostní (g/l roztoku, g/100 ml roztoku = g %), směšovací rovnice, křížové pravidlo, osmotický tlak, osmolarita (látková koncentrace osmoticky aktivních částic), izotonické roztoky. Příklady k procvičovaní: 1. Vypočítejte látkovou koncentraci roztoků o tomto složení: a) 17,4 g chloridu sodného / 300 ml, b) 2,49 mg jodidu draselného / 15 ml c) 385 mg chloridu vápenatého / 0,007 l d) 4.2 g hydrogenuhličitanu sodného / 20 ml e) 4,5 g glukosy / 2.5 l 2. Kolik g kyseliny šťavelové bude obsaženo ve 250 ml roztoku o látkové koncentraci 0,1 mol/l? 3. Roztok glycinu má látkovou koncentraci 3 mmol/l. Kolik mg glycinu bude rozpuštěno v 0,1 1 tohoto roztoku? 4. Kolik g chloridu sodného musíte navážit pro přípravu 350 m1 fyziologického roztoku chloridu sodného (c = l50 mmol/l)? 5. Kolik mmol Fe 2+ bude obsaženo v 10 ml roztoku jodidu železnatého o látkové koncentraci 0,5 mol/l? 6. V jakém objemu roztoku chloridu vápenatého o látkové koncentraci 0.1 mol/l budou obsaženy 4 mmol chloridových iontů? 7. Kolik mmol hořečnatých kationtů bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l? 8. Kolik mmol chloridových ionty bude obsaženo ve 100 ml roztoku chloridu hořečnatého o hmotnostní koncentraci 0,94 g/l? 9. Koncentrace draselných iontů v infúzi nesmí přesáhnout 40 mmol/l. Kolik m1 roztoku chloridu draselného o hmotnostní koncentrace 148 g/1 smíme dát do jedné infúzní láhve o objemu 300 ml? 10. Kolik vody musíme přidat ke 2 ml roztoku, chceme-li jej zředit a) 2x, b) 3x, c) 5x, d) 10x, e) 20x? 11. Kolik ml vody musíme přidat k 10 ml 8% (g/100 ml) roztoku glukosy, aby výsledný roztok byl 2%? 12. K 5 ml roztoku močoviny o látkové koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká bude látková koncentrace výsledného roztoku? 13. K 5 m1 roztoku chloridu vápenatého o koncentraci 0,01 mol/l přidáme 20 ml vody. Jaká bude hmotnostní koncentrace výsledného roztoku? 14. Kolikrát musíme zředit roztok chloridu draselného o látkové koncentraci 0,24 mmol/l, když výsledný roztok má mít hmotnostní koncentraci 5,92 mg/l? 15. Jakou osmolaritu má roztok o látkové koncentraci 0,15 mol/l? a) chloridu sodného, b) chloridu hořečnatého c) hydrogenfosforečnanu sodného d) glukosy e) močoviny 17

18 16. Které z uvedených roztoků jsou izotonické s fyziologickým roztokem chloridu sodného (c = 150 mmol/l)? a) glukosy c = 300 mmol/l b) chloridu vápenatého c = 50 mmol/l c) chloridu draselného c = 300 mmol/l d) dihydrogenfosforečnanu sodného c = 0,15 mol/l 17. Kolik ml vody musíme přidat ke 100 ml roztoku, ve kterém je rozpuštěno 14,2 g hydrogentosforečnanu sodného, abychom získali roztok izotonický s fyziologickým roztokem chloridu sodného? 18. Jakou osmolaritu má roztok připravený smícháním 100 ml roztoku chloridu sodného o hmotnostní koncentraci 5,8 g/l a l00 ml roztoku chloridu vápenatého o hmotnostní koncentraci 11 g/l? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (A r ) vybraných prvků: Na = 23, K = 39, Mg = 24, Ca = 40, P = 31, S=32, Fe = 56, Cl = 35, I = 127 Klíč: 1. a) 1 mol/l, b) 0,001 mol/l, c) 0,5 mol/l. d) 2,5 mol/l, e) 0,01 mol/l 2. 2,25 g 3. 22,5 mg 4. 3,045 g 5. 5 mmol ml 7. 1 mmol 8. 2 mmol 9. 6 ml 10. a) 2 ml, b) 4 ml, c) 8 ml, d) 18 ml, e) 38 ml ml 12. 0,002 mol/l 13. 0,22 g/l 14. 3x 15. a) 0,3 mol/l, b) 0,45 mol/l, c) 0,45 mol/l, d) 0,15 mol/l, e) 0,15 mol/l 16. a) ano, b) ne, c) ne, d) ano ml ,25 mol/l Poznámky: 18

19 PUFRY Klíčová slova: Hendersonova - Hasselbalchova rovnice, ph pufru, funkce pufru, koncentrace pufru, kapacita pufru, aktuální a titrační acidita. Reagencie: 1. roztok kyseliny octové 1 mol/l (úloha 1.) 2. roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l 3. roztok hydroxidu sodného 1 mol/l (úloha l.) 4. roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/l (úloha 2.) 5. roztok hydrogenfosforečnanu sodného 0,1 mol/l 6. roztok dihydrogenfosforečnanu sodného 0,1 mol/l 19

20 ÚLOHA 1. Závislost ph acetátového pufru na poměru látkové koncentrace acetátu a kyseliny octové Acetátový pufr je tvořen slabou kyselinou octovou (pk A = 4,75) a její silnou konjugovanou bází, tj. acetátovým aniontem. Podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice je ph pufru závislé na poměru látkových koncentrací obou složek konjugovaného páru. Příslušné hodnoty poměru [A ]/[HA] získáte různým přídavkem roztoku hydroxidu sodného k roztoku kyseliny octové. Do kádinek napipetujte roztoky kyseliny octové 1 mol/l, hydroxidu sodného 1 mol/l a destilovanou vodu podle tabulky 1. Tabulka 1. kádinka [A ]/[HA] 1:3 1:1 3:1 CH 3 COOH 1 mol/l (ml) NaOH 1 mol/l (ml) 2,5 5 7,5 destilovaná voda (ml) 7,5 5 2,5 ZACHOVAT ph naměřené ph vypočtené [pufr] (mol/l) Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou. ph-metrem změřte ph připravených pufrů. Naměřené hodnoty porovnejte s vypočítanými hodnotami ph. Vypočítejte látkovou koncentraci připravených pufrů. Výsledky zapište do tabulky 1.!POZOR! Pufr připravený v kádince 2 (poměr složek 1:1) budete používat v dalších úlohách. Poznámky: 20

21 ÚLOHA 2. Změna ph acetátového pufru po přidání zásady Nedisociované molekuly kyseliny octové přítomné v acetátovém pufru jsou rezervou, která brání větší změně ph po přidání malého množství silné báze. Do kádinek napipetujte acetátový pufr z kádinky 2 připravený v úloze 1., (poměr složek 1:1), destilovanou vodu a z byrety přidejte roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/l podle tabulky 2. Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte ph. Vypočítejte ph připravených roztoků. Porovnejte naměřenou hodnotu ph s hodnotou vypočítanou. Zjistěte, o kolik jednotek se změnilo ph po přidání zásady k acetátovému pufru a k destilované vodě. Výsledky zapište do tabulky 2. Tabulka 2. kádinka 1 2 acetátový pufr (ml) 5 destilovaná voda (ml) 5 NaOH 0,1 mol/l (ml) 5 5 ph naměřené rozdíl ph (naměřených) ph vypočítané rozdíl ph (vypočítaných) Poznámky: 21

22 ÚLOHA 3. Změna ph acetátového pufru po přidání kyseliny Při přidání malého množství silné kyseliny se ph pufru změní jenom málo, díky rezervě, kterou v acetátovém pufru představují acetátové anionty. Do kádinek napipetujte připravený acetátový pufr (poměr složek 1:1), destilovanou vodu a z byrety přidejte roztok kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l podle tabulky 3. Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte ph. Porovnejte naměřenou hodnotu ph s hodnotou vypočítanou. Zjistěte, o kolik jednotek se změnilo ph po přidání kyseliny k acetátovému pufru a k destilované vodě. Výsledky zapište do tabulky 3. Tabulka 3. kádinka 1 2 acetátový pufr (ml) 5 destílovaná voda (ml) 5 HCl 0,1 mol/l (ml) 5 5 ph naměřené rozdíl ph (naměřených) ph vypočítané rozdíl ph (vypočítaných). Poznámky: 22

23 ÚLOHA 4. Změna ph pufru v závislosti na jeho ředění Do dvou kádinek napipetujte připravený acetátový pufr (poměr složek 1:1) a destilovanou vodu podle tabulky 4. Tabulka 4. kádinka 1 2 acetátový pufr (ml) 5 2,.5 destilovaná voda (ml) 2,5 [pufr] (mol/l) ph naměřené ph vypočítané ZACHOVAT ZACHOVAT Roztoky zamíchejte skleněnou tyčinkou a změřte ph pufru v obou kádinkách. Vypočítejte látkovou koncentraci zředěného pufru v kádince 2. Vypočítejte ph obou pufrů. Výsledky zapište do tabulky 4. Poznámky: 23

24 ÚLOHA 5. Závislost kapacity pufru na látkové koncentraci pufru Kapacita pufru udává, jaká změna látkové koncentrace H + nebo OH vyvolá změnu ph pufru o jednotku. Závisí na celkové koncentraci pufru a na poměru látkových koncentrací obou složek. Pufr o určité celkové koncentraci má největší kapacitu při poměru [A ] / [HA] = 1:1. Do kádinek 1 a 2 z předcházející úlohy 4. napipetujte 5 ml kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l. Změřte a vypočítejte ph obou pufrů. Porovnejte změny ph původních a okyselených pufrů. Získané hodnoty zapište do tabulky 5. Tabulka 5. ph naměřené změna ph ph vypočítané změna ph kádinka 1 2 Poznámky: 24

25 ÚLOHA 6. Příprava fosfátového pufru z jeho složek Fosfátový pufr je tvořen hydrogenfosforečnanovými a dihydrogenfosforečnanovými aníonty. Fosfátový pufr se podílí také na pufrovací schopnosti krve. Jeho příspěvek je však velmi malý vzhledem k nízké koncentraci fosfátů v krvi (0,8 1,5 mmol/l). Významnou roli hraje fosfátový pufr v moči, kde přispívá ke změně jejího ph změnou poměru koncentrace obou iontů. V této úloze připravíte fosfátový pufr smícháním solí jeho složek v různém poměru a budete sledovat změnu ph. Vypočítejte objem roztoku hydrogenfosforečnanu sodného 0,l mol/l a roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného 0,1 mol/l pro přípravu minimálně 10 ml fosfátového pufru pro poměr koncentrací složek 10:1, 5:1, 1:1, 1:5 a 1:10. Výsledky zapište do tabulky 6. Vypočítejte ph pufrů při uvedeném poměru koncentrací složek, výsledky zapište do tabulky 6. Pro výpočet používejte hodnotu pk A = 7,12 (za fyziologických podmínek odpovídá pk A fosfátového pufru hodnotě 6,8). V kádinkách připravte pufry o různém poměru [A ]/[HA] smícháním vypočítaných objemů složek a změřte jejich ph. Výsledky zapište do tabulky 6. Tabulka 6. poměr složek objem A (ml) objem HA (ml) ph vypočítané ph naměřené 10:1 5:1 1:1. 1:5 1:10 Poznámky: 25

26 VÝPOČET ph KYSELIN, ZÁSAD A PUFRŮ Klíčová slova: disociace silných kyselin a zásad, disociace slabých kyselin a zásad, disociace solí, iontový součin vody, disociační konstanty kyselin a zásad, konjugovaný pár, amfolyty, isoelekrický bod, pufr, koncentrace pufru, pufrační kapacita, ph, poh, pkw, pk A, pk B, pi, Henderson-Hasselbalchova rovnice. Příklady k procvičování: 1. Vypočítejte ph vodných roztoků následujících kyselin: a) kyselina octová c =2,5 mmol/l, b) kyselina octová c =0,025 mol/l c) kyselina uhličtá c = 1,2 mmol/l d) kyselina mravenčí c = 44 mmol/l e) fenol c = 0,7 mol/l 2. Vypočítejte ph vodných roztoků následujících bází: a) amoniak c = mol/l, b) amoniak c = 50 mmol/l c) anilin c = 0,01 mol/l d) acetátový anion c = 100 mmol/l 3. Vypočítejte látkovou koncentraci hydroxoniových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové o ph = 2, Vypočítejte látkovou koncentraci kyseliny kyanovodíkové ve vodném roztoku o ph = 5,2. 5. Jakou hodnotu pk A má kyselina mléčná, když její vodný roztok o látkové koncentraci 10 mmol/l má ph = 2,93? 6. Jaká je látková koncentrace hydroxidových iontů ve vodném roztoku kyseliny octové o látkové koncentraci 0,025 mol/l? 7. Jaká je látková koncentrace hydroxoniových iontů ve vodném roztoku pyridinu o látkové koncentraci 100 mmol/l? 8. Vypočítejte ph vodného roztoku dusičnanu amonného o látkové koncentraci 0,05 mol/l. 9. Jaká je látková koncentrace kyanidu draselného ve vodném roztoku o ph = 11,35? 10. Jaké ph bude mít roztok kyseliny mléčné, který získáte tak, že 20x zředíte 10 ml vodného roztoku kyseliny mléčné o látkové koncentraci 100 mmo/l? Kolik ml vody přidáte? 11. Vypočítejte ph roztoku, který obsahuje 25 mmol kyseliny octové a 0,075 mol octanu sodného. 12. V jakém poměru byly smíchány složky acetátového pufru, když hodnota jeho ph je 5,00? 13. Vypočítejte ph roztoku, který vznikne smícháním 500 ml roztoku dihydrogencitrátu sodného a 250 ml roztoku kyseliny citrónové stejné látkové koncentrace. 14. Vypočítejte ph fosforečnanového pufru, který byl připraven smícháním 100 m1 roztoku hydrogenfosforečnanu draselného (c = 0,05 mol/l) a l00 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného (c = 0,025 mol/l). Jaká je látková koncentrace tohoto pufru? 15. Kolik g dihydrogencitrátu draselného použijete pro přípravu 100 ml roztoku, který smícháním se 100 ml roztoku kyseliny citrónové o látkové koncentraci 0,1 mol/l poskytne pufr o ph = 1,94?. Jaká bude látková koncentrace tohoto pufru po přidání 800 ml vody? Jaké ph bude mít takto získaný roztok? 26

27 16. Jaká bude látková koncentrace roztoku hydrogenfosforečnanu sodného a látková koncentrace roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného, když smícháním 500 ml obou roztoků získáme pufr o ph = 7,12, jehož osmolarita je stejná jako osmolarita fyziologického roztoku chloridu sodného (c = 150 µmol/l)? 17. Jaké ph bude mít roztok připravený smícháním 150 ml roztoku kyseliny octové o látkové koncentraci c = 0,2 mol/l a 100 ml roztoku hydroxidu sodného o hmotnostní koncentraci 8 g/l? 18. O kolik jednotek se změní ph acetátového pufru (c = 0,4 mol/l, poměr látkových koncentrací acetátu a kyseliny octové je 4:1), jestliže k 50 m1 pufru přidáte 10 m1 roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 0,4 mol/l)? O kolik jednotek se změní ph, jestliže totéž množství roztoku kyseliny chlorovodíkové přidáte k 50 ml vody? 19. Kolik ml roztoku NaOH o látkové koncentraci 0,2 mol/l musíte přidat k 500 ml fosforečnanového pufru (c = 180 mmol/l) o ph = 7,42, aby se jeho ph změnilo o 0,4? Jaká bude koncentrace vzniklého pufru? O kolik jednotek se změní ph, jestliže totéž množství roztoku NaOH přidáte k 500 ml vody? Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (A r ) vybraných prvků: Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127 Hodnoty pk A (25 C) vybraných kyselin: H 2 CO 3 = 6,52, HCOOH = 3,75 CH 3 COOH = 4,75 NH = 9.25 H 2 PO =7,12 HPO = 12,32 C 6 H 5 OH = 9,89 HCN = 9,40 k. citrónová = 2,94 Hodnoty pk B (25 C) vybraných bází: Klíč: NH 3 = 4,75 CH 3 COO = 9.25 HPO = 6,88 C 6 H 5 NH 2 = 9,38 C 5 H 5 N = 8,82 CN = 4,60 1. a) 3,68, b) 3,18, c) 4,72, d) 2,55, e) 5,45 2. a) 9,97, b) 10.97, c) 8,31, d) 8, ,00135 mol/l 4. 0,1 mol/l 5. 3, , mol/l 7. 8, mol/l 8. 5, ,2 mol/l 10. ph = 3,08, 190 ml 11. 5, , , ph = 7,42, 0,0375 mol/l 15. 0,23 g, 0,011 mol/l, ph =1, mmol/l 17. 5,05 27

28 18. o 0,42 jednotek (ph 1 = 5,35, ph 2 = 4,93), o 5,83 jednotek (ph = 1,17) m1, 0,157 mol/l, o 5,41 jednotek Poznámky: 28

29 STECHIOMETRICKÉ VÝPOČTY, IONTOVÝ ZÁPIS CHEMICKÝCH ROVNIC, IONTOVÉ ROVNICE Klíčová slova: stechiometrie, iontový zápis, iontová rovnice, součin rozpustnosti, disociace solí, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách. Chemická rovnice: AgNO 3 + NaCl AgCl + NaNO 3 Iontový zápis: Iontová rovnice: Ag + +NO + Na + + Cl AgCl + Na + + NO Ag + + Cl AgCl Příklady na procvičování (chemické rovnice vyjadřujte iontovým zápisem): 1. Smrtelná dávka kyanidu draselného pro člověka je 200 mg. Kolik m1 kyanovodíku se uvolní z tohoto množství působením kyseliny chlorovodíkové v žaludku? 2. Kolik mg oxalátu amonného potřebujete k vysrážení Ca 2+ z 2 ml roztoku o látkové koncentraci Ca 2+ c=0.01 mol/l? 3. Maximální hodnota přípustné koncentrace dusitanů ve vodě je v České republice 0,1 mg/l. Kolik mmolů kyseliny dusité se uvolní z 0,1 mg dusitanu sodného reakcí s kyselinou chlorovodíkovou? 4. Jakou hmotnostní koncentraci má roztok jodidu železnatého, když při titraci 10 ml tohoto roztoku bylo spotřebováno 5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o látkové koncentraci c=0,4 mol/l? 5. Při titraci 10 ml acetátového pufru o ph 5,75 bylo spotřebováno 40 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,25 mol/l). Jaká složka pufru se touto titrací stanoví? Jaká je její koncentrace? Jaká je koncentrace pufru? 6. Koncentrace roztoku hydrogenuhličitanu se stanovuje zpětnou titrací nezreagované kyseliny chlorovodíkové přidané v nadbytku. Jaká bude teoretická spotřeba roztoku hydroxidu sodného (c = 0,4 g/l) použitého při zpětné titraci nezreagované kyseliny chloorovodikové, když k 1 ml roztoku hydrogenuhličitanu sodného (c = 24 mmol/l bylo přidáno 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (c = 10 mmol)? 7. Vypočítejte o kolik jednotek se změní ph roztoku z původní hodnoty ph = 3, když bylo do tohoto roztoku přidáno takové množství amoniaku, že koncentrace vzniklého NH + 4 byla 0,0009 mol/l. 8. Kolik mmolů vápenatých kationtů se uvolní ze 64 mg oxalátu vápenatého po přidání 20 ml kyseliny chlorovodíkové (c = 0,1 mol/l)? 9. Kolik ml oxidu uhličitého se uvolní z 84 mg hydrogenuhličitanu sodného reakcí s 500 ml kyseliny chlorovodíkové o ph = 2? 10. Tableta Superpyrinu obsahuje 400 mg acetylsalicylátu hlinitého. Vypočítejte, kolik mmolů kationtů hlinitých se uvolní v žaludku při podání tří tablet Superpyrinu. 11. Jakou osmolaritu bude mít roztok, který vznikne smícháním 10 ml roztoku rhodanidu (thiokyanátu) draselného o osmolaritě 200 mmol osmoticky aktivních částic/l a 10 ml 29

30 roztoku chloridu železitého o osmolaritě 400 mmol osmoticky aktivních částic/l? Jedním z produktů je chlorid thiokyanátoželezitý. 12. K 100 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l přidáte 25 ml roztoku hydroxidu sodného o látkové koncentraci c = 0,1 mol/l. Vypočítejte hodnoty následujících veličin ve výsledném roztoku: a) látková koncentrace dihydrogenfosforečnanu sodného b) látková koncentrace hydrogenfosforečnanu sodného c) látková koncentrace kationtů sodných d) osmolarita e) ph Dodatky: Relativní atomové hmotnosti (A r ) vybraných prvků: Al = 27 Na = 23 K = 39 Mg = 24 Ca = 40 P = 31 S = 32 Fe = 56 Cl = 35 I = 127 Klíč: 1. 68,9 ml 2. 2,48 mg 3. 0,0015 mmol g/l 5. acetát, 1 mol/l, 1,1 mol/l 6. 2,6 ml 7. 1 jednotku 8. 0,5 mmol 9. 22,4 ml 10. 2,13 mmol mosmol/l 12. 0,06 mol/l, 0,02 mol/l, 0,1 mol/l, 0,18 osmol/l, 6,64 Poznámky: 30

31 VLASTNOSTI A REAKCE BIOLOGICKY A TOXIKOLOGICKY VÝZNAMNÝCH PRVKŮ A JEJICH SLOUČENIN Klíčová slova: periodický systém, toxicita prvků a jejich sloučenin, disociace, kationty, anionty, oxidační číslo, rozpustnost solí ve vodě, rozpustnost solí v kyselinách a zásadách, součin rozpustnosti, iontový zápis, iontová rovnice, názvosloví, kvalitativní analýza, skupinová činidla. Reagencie: 1. zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 2. nasycený vodný roztok sulfanu!jed! 3. nasycený vodný roztok sulfidu amonného 4. roztok uhličitanu amonného 1 mol/l) 5. roztok dusičnanu stříbrného 0,1 mol/l 6. roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/l!jed! 7. zředěná kyselina dusičná 1:1 8. zředěná kyselina sírová 1:1 9. koncentrovaný vodný roztok amoniaku 10. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l!žíravina! 11. roztok chromanu draselného 0,25 mol/l 12. roztok jodidu draselného 0,5 mol/l 13. roztok chloridu amonného 1 mol/l 14. roztok ferrikyanidu draselného 0,01 mol/l 15. roztok thiokyanatanu draselného 0,3 mol/l 16. roztok hydrogenfosforečnanu sodného 0,3 mol/l 17. roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml vody ml kyseliny dusičné 320 g/1) 18. roztok difenylaminu v kyselině sírové 0,06 mol/l 19. roztoky vzorků obsahující zkoumané kationty 20. roztoky vzorků obsahující zkoumané anionty 21. roztoky vzorků neznámých sloučenin 31

32 Kvalitativní analýza: Uvedený postup kvalitativní analýzy je vhodný pro poznání vlastností biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin. Zahrnuje pouze reakce, které jsou potřebné k důkazu vybraných kationtů a aniontů. Vybrané kationty: Ag +, Pb 2+, Hg 2+, 2 Hg2+, Cu 2+, Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+, Ca 2+, Ba 2+, Mg 2+, Na +, K +, NH + 4 Vybrané anionty: HCO 3, CO 2 3, PO 3 4, Cl, I, SO 2 4, NO 3 Kationty a anionty jsou rozděleny do skupin podle reakce s vhodně zvolenou látkou - skupinovým činidlem. Toto činidlo tvoří sraženiny vždy jen s ionty příslušné skupiny. Jednotlivé kationty a anionty ve skupinách se pak dokazují speciálními reakcemi. Základní pravidla pro rozpustnost solí ve vodě: Rozpustné sole: a) obsahují anionty NO 3, Cl (mimo Ag +, Pb 2+, Hg 2+ 2 ), SO 2 (mimo 4 Ba2+, Pb 2+ ). b) obsahuji kationty Na +, K +, NH + 4. Nerozpustné sole: obsahuji anionty S 2, CO 2 3, HPO 2 a PO 3 (mimo 4 4 Na+, K +, NH + ). 4 Sloučeniny obsahující hydrogenanionty jsou rozpustnější. Sole slabých kyselin jsou rozpustné v roztocích silnějších kyselin, uvolní se původní slabá kyselina. Sole slabých bází jsou rozpustné v roztocích silnějších bází, uvolní se původní slabá báze. POZOR! Pro jednotlivé reakce používejte maximálně 1 ml roztoku vzorků i činidel. Protože jde pouze o kvalitativní reakce, není třeba objemy roztoků odměřovat! 32

33 ÚLOHA 1. Důkaz vybraných kationtů K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný kation. Ke každé reakci použijte nový roztok vzorku Kationty: Ag +, Pb 2+, Hg 2+ 2 Skupinové činidlo je zředěná HCl. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné. Také sulfidy těchto kationtů jsou nerozpustné ve vodě a nerozpouštějí se ani ve zředěných silných kyselinách, protože jejich součiny rozpustnosti jsou extrémně nízké: K s : AgCl = 1, Ag 2 S = 2, Ag 2 CrO 4 = 1, PbCl 2 = 1, PbS = 2, Hg 2 Cl 2 = 1, Hg 2 S ~ Ag + : Ag + + HCl AgCl + H + 2 Ag + + K 2 CrO 4 Ag 2 CrO K + bílá sraženina rozpustná v NH 3 [Ag(NH 3 ) 2 ] + červenohnědá sraženina Pb 2+ : Pb HCl PbCl H + Hg 2+ : 2 Pb 2+ + K 2 CrO 4 PbCrO K + bílá sraženina rozpustná v horké vodě žlutá sraženina Hg HCl Hg 2 2Cl H + bílá sraženina, reakcí s NH 3 černá vyloučeným Hg 2 O 33

34 1.2. Kationty: Hg 2+, Cu 2+ Skupinové činidlo je H 2 S. Chloridy těchto kationtů jsou ve vodě rozpustné. Sulfidy jsou nerozpustné ve vodě i ve zředěných silných kyselinách, protože součiny rozpustnosti těchto sulfidů mají extrémně nízké hodnoty: K s : CuS = 8, HgS = 1, : POZOR! Před přidáváním roztoku H 2 S vzorek okyselte několika kapkami zředěné HCl. Hg 2+ : Cu 2+ : Hg 2+ + H 2 S HgS + 2 H + Hg KI HgI K + Cu 2+ + H 2 S CuS + 2 H + Cu NaOH Cu(OH) Na + černá sraženina nerozpustná v kyselinách oranžovočervená sraženina rozpustná v přebytku KI K 2 [HgI 4 ] hnědočerná sraženina nerozpustná v kyselinách bleděmodrá sraženina rozpustná v NH 3 [Cu(NH 3 ) 4 ] Kationty: Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+ Skupinovým činidlem je (NH 4 ) 2 S. Vzniklé sulfidy jsou ve vodě nerozpustné, ve zředěných silných kyselinách jsou však rozpustné, protože hodnoty jejich součinů rozpustnosti jsou vyšší: K s : ZnS = 6, FeS = 3, POZOR! Před reakcí s (NH 4 ) 2 S zkontrolujte ph vzorku zkoumaného roztoku. V případě kyselé reakce vzorek neutralizujte roztokem NH 3 a průběžně kontrolujte ph (ph nesmí být alkalické). K neutrálnímu roztoku vzorku přidejte 1 ml roztoku NH 4 Cl. Zn 2+ : Zn 2+ + (NH 4 ) 2 S ZnS + 2 NH + 4 bílá sraženina rozpustná v kyselinách 34

35 Fe 2+ : Fe 2+ + (NH 4 ) 2 S FeS + 2 NH + 4 černá sraženina rozpustná v kyselinách Fe NaOH Fe(OH) Na + Fe 2+ + K 3 [Fe(CN) 6 ] "berlínská modř" bílá sraženina, barví se modrozeleně a hnědne oxidací na Fe(OH) 3 Fe 3+ : 2 Fe (NH 4 ) 2 S 2 FeS + S + 6 NH + 4 černá sraženina rozpustná v kyselinách Fe NaOH Fe(OH) Na + hnědá sraženina Fe 3+ + KCNS [Fe(CNS)] 2+ + K Kationty: Ca 2+, Ba 2+ červený komplex Skupinovým činidlem je (NH 4 ) 2 CO 3. Uhličitany těchto kationtů jsou ve vodě nerozpustné, ale rozpouštějí se ve zředěných roztocích silných kyselin. Sulfidy jsou ve vodě rozpustné. Tyto prvky mají schopnost již v nepatrném množství barvit nesvítivý plamen, jsou-li do něj vneseny ve formě těkavých sloučenin. Na tomto principu je založena plamenová fotometrie, umožňující rychlé stanovení některých prvků. POZOR! Před reakcí s (NH 4 ) 3 CO 3 zkontrolujte ph vzorku zkoumaného roztoku. V případě kyselé reakce vzorek neutralizujte roztokem NH 3 a průběžně kontrolujte ph (ph nesmí být alkalické). K neutrálnímu roztoku vzorku přidejte 1 ml roztoku NH 4 Cl. Reakce v plameni: Do zkumavky odlijte malé množství zředěné HCl, ponořte do ní platinový drátek a vyžíhejte jej v nesvítivém plameni. Tento postup několikrát zopakujte, aby samotný drátek plamen nebarvil. Po ochlazení namočte drátek do zkoušeného roztoku, vneste jej do plamene a pozorujte jeho zbarvení. Ca 2+ : Kation vápenatý barví plamen oranžově. Ca 2+ + (NH 4 ) 2 CO 3 CaCO NH + 4 bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách Ca 2+ + Na 2 HPO 4 CaHPO Na + bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách 35

36 Ba 2+ : Kation barnatý barvi plamen světle zeleně. Ba 2+ + (NH 4 ) 2 CO 3 BaCO NH + 4 bílá sraženina rozpustná v zředěných kyselinách Ba 2+ + H 2 SO 4 BaSO 4 + 2H + bílá sraženina nerozpustná v zředěných kyselinách 1.5. Kationty: Mg 2+, Na +, K +, NH + 4 Pro tyto kationty není žádné skupinové činidlo, jednotlivé kationty se dokazují specifickými reakcemi. Mg 2+ : K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte nejprve 1 ml roztoku NH 4 Cl, aby se nesrážel hydroxid hořečnatý. Na + : K + : Mg 2+ + Na 2 HPO 4 + NH 3 MgNH 4 PO Na + Kation sodný barví plamen žlutě. bílá sraženina Katíon draselný barví plamen fialově (zbarveni je výraznější při pozorování přes kobaltové sklo). NH + 4 : NH NaOH NH 3 + Na + + H 2 O navlhčený universální indikátorový papírek zmodrá (papírek držte pouze nad zkumavkou) Poznámky: 36

37 ÚLOHA 2. Důkaz vybraných aniontů K uvedeným reakcím použijte připravené roztoky, které obsahují příslušný anion. Reakce jednotlivých aniontů porovnejte s analogickými reakcemi používanými pro důkaz kationtů v úloze Anionty: HCO, CO 2+, PO Skupinovým činidlem je Ba(NO 3 ) 2, který poskytuje s uvedenými anionty sraženiny, rozpustné ve zředěných silných kyselinách. HCO 3 : CO 2 : 3 Roztok reaguje slabě alkalicky, pk B (HCO 3 ) = 7,48. 2 HCO 3 + Ba(NO 3 ) 2 Ba(HCO 3 ) 2 + 2NO 3 nestálý, přechází na BaCO 3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách (uniká CO 2 ) PO 3 4 Roztok reaguje alkalicky, pk B (CO 2 3 ) = 3,6. CO Ba(NO 3 ) 2 BaCO NO 3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách (uniká CO 2 ) 2 PO Ba(NO 3 ) 2 Ba 3 (PO 4 ) NO 3 bílá sraženina rozpustná ve zředěných kyselinách PO (NH 4 ) 2 MoO 4 po zahřátí vznikne žlutá sraženina fosfomolybdenanu amonného 37

38 2.2. Anionty: Cl, I Anionty této skupiny tvoří sraženinu s AgNO 3, vzniklá sraženina je nerozpustná ve zředěných kyselinách. Cl : Cl + AgNO 3 AgCl + NO 3 bílá sraženina rozpustná v NH 3 [Ag(NH 3 ) 2 ] + nerozpustná ve zředěných kyselinách I + AgNO 3 AgI + NO 3 žlutá sraženina nerozpustná v NH 3 a nerozpustná ve zředěných kyselinách 2.3. Anion SO 2 4 : Tento anion tvoří sraženinu s Ba(NO 3 ) 2, vzniklá sraženina je nerozpustná ve zředěných kyselinách. SO 2 : 4 SO 2 + Ba(NO 4 3) 2 BaSO NO 3 bílá sraženina nerozpustná ve zředěných kyselinách 2.4. Anion NO 3 Tento anion netvoří sraženinu ani s Ba(NO 3 ) 2 ani s AgNO 3. NO 3 : K několika kapkám roztoku vzorku přidejte několik kapek roztoku difenylaminu v kyselině sírové. Objeví se tmavěmodré zbarvení. Poznámky: 38

39 ÚLOHA 3. Analýza roztoku neznámé anorganické sloučeniny. V roztoku neznámé anorganické sloučeniny dokažte kation a anion. Podle postupu uvedeného v úloze 3.1. a 3.2. nejdříve zjistěte, do jaké skupiny kationtů nebo aniontů patří ionty analyzované sloučeniny. Příslušný kation a anion potom dokažte speciálními reakcemi uvedenými v úloze 1. a 2. (použijte vždy nový roztok vzorku!). Nezapomeňte na zjištění ph analyzovaného roztoku - tato informace vám pomůže při identifikaci neznámé sloučeniny! 3.1. Analýza kationtů - zařazení do skupiny 1 ml vzorku + HCl sraženina roztok Hg 2+, 2 Pb2+, Ag + Hg 2+, Cu 2+ Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+ Ca 2+, Ba 2+ Mg 2+, Na +, K +, NH H 2 S v nadbytku sraženina roztok Hg 2+, Cu 2+ Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+ Ca 2+, Ba 2+ Mg 2+, Na +, K +, NH

40 1 ml nového vzorku + případná neutralizace NH 3 + NH 4 Cl + (NH 4 ) 2 S sraženina roztok Zn 2+, Fe 2+, Fe 3+ Ca 2+, Ba 2+ Mg 2+, Na +, K +, NH ml nového vzorku + případná neutralizace NH 3 + NH 4 Cl + (NH 4 ) 2 CO 3 sraženina roztok Ca 2+, Ba 2+ Mg 2+, Na +, K +, NH + 4 Po zařazení kationtu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými v úloze 1. 40

41 3.2. Analýza aniontů - zařazení do skupiny 1 ml vzorku + Ba(NO 3 ) 2 sraženina roztok PO 3 HCO 4 3, CO 3, SO 2 Cl. I, NO HNO 3 + AgNO 3 roztok sraženina sraženina roztok PO 3 4 SO 2 4 C1, I NO 3 únik CO 2 Po zařazeni aniontu do skupiny proveďte jeho důkaz speciálními reakcemi uvedenými v úloze 2. Výsledek analýzy vzorku neznámé sloučeniny zapište do tabulky: vzorek č. ph vzorec název Poznámky: 41

42 VLASTNOSTI A REAKCE FUNKČNÍCH SKUPIN BIOCHEMICKY VÝZNAMNÝCH ORGANICKÝCH SLOUČENIN Klíčová slova: hydroxysloučeniny, oxosloučeniny, alkoholy, aldehydy, ketony, oxidace alkoholů, adiční reakce oxoskupiny, kyseliny, báze, fenoly, aminy, karboxylové kyseliny, soli, estery, amidy, komplexní sloučeniny, biuret. Reagencie: 1. methanol!jed! 2. ethanol 3. 4% roztok formaldehydu 4. kyselina salicylová 5. kyselina šťavelová 6. 70% roztok fenolu 7. kyselina mléčná 8. kyselina vinná 9. kyselina sulfanilová 10. močovina 11. Fehlingův roztok I (síran mědnatý 70 g/l) 12. Fehlingův roztok II (250 g hydroxidu sodného a 350 g vinanu sodnodraselného v 1 1 vody) 13. dichroman draselný 14. koncentrovaná kyselina sírová!žíravina! 15. Schiffovo činidlo (roztok fialového barviva fuchsinu odbarveného hydrogensiřičitanem sodným) 16. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l!žíravina! 17. koncentrovaný roztok amoniaku 18. zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 19. roztok chloridu vápenatého 0,1 mol/l 20. roztok chloridu železitého 0,05 mol/l 21. Millonovo činidlo (40 g rtuti v 57 ml koncentrované kyseliny dusičné, po zahřátí zředěno 2 objemy vody)!jed! 22. Ehrlichovo aldehydové činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/l v kyselině chlorovodíkové 200 g/l) 23. roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l 42

43 ÚLOHA 1. Oxidace alkoholů a aldehydů Primární alkoholy se oxidují na karbonylové sloučeniny aldehydy. V praxi se této reakce využívalo např. při detekci ethanolu v dechu (oranžový dichroman draselný v prostředí kyseliny sírové se v přítomnosti alkoholu redukuje na zelený síran chromitý, zatímco ethanol se oxiduje na acetaldehyd). K průkazu aldehydů lze dále použít tzv. Schiffova činidla (úloha 1.). Toto činidlo poskytuje reakcí s aldehydy barevnou sloučeninu za vzniku tzv. Schiffovy báze (aldiminu) (úloha 5.). Aldehydová skupina je přítomna v celém spektru biologicky významných organických molekul (sacharidy). K jejímu funkčnímu průkazu se používá zpravidla tzv. Fehlingovy zkoušky. Vinan měďnatý v alkalickém roztoku reaguje s aldehydem za vzniku příslušné kyseliny, oxidu měďného a vinanu sodného (úloha 2.). Fehlingovo činidlo se připravuje vždy těsně před použitím smícháním roztoků Fehling I (síran měďnatý) a Fehling II (hydroxid sodný a vínan sodnodraselný) v poměru 1:1 (princip vzniku komplexu v úloze 4.3). 43

44 1.1. Reakce aldehydů se Schiffovým činidlem Reakci proveďte s methylalkoholem i ethylalkoholem. Do zkumavky dejte malé množství dichromanu draselného a velice opatrně přidejte plastikovým kapátkem 5 kapek koncentrované kyseliny sírové. Přilijte 1 ml alkoholu a opatrně promíchejte, Zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni. Na ústřižek filtračního papíru kápněte 1 kapku Schiffova činidla. Nad ústím zkumavky přidržujte filtrační papír se Schiffovým činidlem, které se vznikajícím aldehydem barví červenofialově. Zapište chemickými rovnicemi oxidaci methanolu a ethanolu: a) b) Poznámky: 44

45 1.2. Redukce Fehlingova činidla Tmavě modré Fehlingovo činidlo obsahuje komplexně vázaný Cu 2+. Ten se snadno redukuje na Cu +, který již komplexní ion netvoří. Aldehydy, které se velmi snadno oxidují, vyredukují z tohoto roztoku nerozpustný červený oxid měďný. Ve zkumavce smíchejte Fehlingův roztok I a II v poměru 1:1, (celkový objem asi 1 ml), dobře promíchejte. Přidejte 2 kapky formaldehydu a krátce zahřejte ve vroucí vodní lázni. V přítomnosti aldehydu dojde k vyredukování červeného oxidu měďného. Poznámky: 45

46 ÚLOHA 2. Rozpustnost organických kyselin a jejich solí 2.1. Kyselina salicylová Kyselina salicylová (prekurzor pro výrobu kys. acetylsalicylové) je špatně rozpustná ve vodě, zatímco její sodná sůl se ve vodě rozpouští poměrně dobře. Do zkumavky dejte několik krystalů kyseliny salicylové, přidejte asi 1 ml vody a protřepejte. Část látky zůstane nerozpuštěna. Přidejte asi 2 ml roztoku hydroxidu sodného. Vzniklá sodná sůl je ve vodě rozpustná. Reakci zapište formou iontového zápisu: Poznámky: 46

47 2.2. Kyselina šťavelová Ze solí kyseliny šťavelové je významný oxalát vápenatý, který je nerozpustný ve vodě, ale rozpouští se ve zředěných silných kyselinách. Tvorba nerozpustného oxalátu vápenatého je příčinou toxicity kyseliny šťavelové. Oxalát (šťavelan) vápenatý se může vyskytovat v moči, kde tvoří snadno močové kameny. Ve zkumavce rozpusťte ve vodě několik krystalů kyseliny šťavelové. Vzniklý roztok zalkalizujte koncentrovaným roztokem amoniaku (použijte plastikovou pipeptku). Zkontrolujte indikátorovým papírem ph (a). Přidávejte po kapkách roztok chloridu vápenatého a pozorujte vznik bílé sraženiny (b). Sraženinu oxalátu vápenatého rozpusťte přidáním zředěné kyseliny chlorovodíkové, reakce probíhá kolem ph = 5 (c). Všechny tři reakce označené a), b), c), vyjádřete formou iontového zápisu: a) b) c) Poznámky: 47

48 ÚLOHA 3. Tvorba komplexních sloučenin 3.1. Reakce s chloridem železitým Roztoky aromatických hydroxysloučenin poskytují s roztokem chloridu železitého charakteristické barevné reakce, způsobené tvorbou komplexních sloučenin. Fialově zbarvený roztok, vzniklý reakcí fenolu s chloridem železitým, se pod názvem Uffelmannovo činidlo používal k průkazu kyseliny mléčné, patologicky přítomné v žaludeční šťávě. Kyselina mléčná, stejně jako některé další alifatické hydroxykyseliny, tvoří snadno komplexy s ionty kovů (viz úloha 4.3.). Protože vazba Fe 3+ s kyselinou mléčnou (chelátový ligand) je pevnější než jeho vazba s fenolem, vytěsní kyselina mléčná fenol z jeho komplexu s chloridem železitým. Do zkumavky dejte 1 ml roztoku fenolu a přidejte 1 2 kapky roztoku chloridu železitého. Roztok se zbarví fialově (Uffelmannovo činidlo). Za míchání přikapávejte kyselinu mléčnou (použijte plastikové kapátko) do vymizení fialového zbarvení (komplex kyseliny mléčné s Fe 3+ je světle žlutý). Analogicky jako s fenolem proveďte i reakci chloridu železitého s kyselinou salicylovou, kterou v tomto případě rozpusťte v 1 ml ethanolu. Vznikne červenofialový roztok komplexní sole. Vysvětlete rozdíl ve zbarvení komplexů! Poznámky: 48

49 3.2. Reakce s Millonovým činidlem Roztoky většiny aromatických hydroxysloučenin poskytují s Millonovým činidlem červeně zbarvené komplexní rtuťnaté sole svých nitrosloučenin. Do jedné zkumavky dejte 1 ml roztoku fenolu. Ve druhé zkumavce připravte roztok malého množství kyseliny salicylové v 1 ml ethanolu. Ke každému roztoku přidejte několik kapek Millonova činidla. Po mírném zahřátí ve vroucí vodní lázni vznikne červené zbarvení. Poznámky: 49

50 3.3. Reakce s hydroxidem mědnatým (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 1.2.) Kyselina vinná, alifatická hydroxykyselina, tvoří velmi snadno komplexy s ionty kovů (viz úloha 3.1.). Nerozpustný hydroxid mědnatý přejde po přidání kyseliny vinné do roztoku, protože vznikající komplexní sloučenina zabrání reakci Cu 2+ s hydroxidovými anionty (podstata Fehlingova činidla, viz úloha 2.). V jedné zkumavce si připravte asi 2 ml vodného roztoku kyseliny vinné. Ve druhé zkumavce smíchejte 1 ml Fehlingova roztoku I s 1 ml roztoku hydroxidu sodného. Vznikne modrá sraženina hydroxidu mědnatého. Potom přikapávejte roztok kyseliny vinné, dokud se sraženina nerozpustí. Vyjádřete iontovým zápisem vznik hydroxidu mědnatého: Poznámky: 50

51 ÚLOHA 4. Reakce primárních aminů s oxosloučeninami Oxosloučeniny poskytují kondenzací s primárními aminy sloučeniny s dvojnou vazbou mezi uhlíkem a dusíkem, iminy. Z hlediska biochemických přeměn aminokyselin je velmi důležitá kondenzace aromatických (resp. heterocyklických) aldehydů s primárními aminy za tvorby aldiminu (Schiffovy báze): C 6 H 5 CH=O + H 2 N R C 6 H 5 CH=N R aldimin Tuto reakci poskytuje i kyselina sulfanilová (kyselina 4-aminobenzensulfonová) s Ehrlichovým aldehydovým činidlem. Analogická reakce ruší důkaz žlučového barviva urobilinogenu v moči, jestliže byl vyšetřovaný pacient léčen sulfonamidy. Ve zkumavce rozpusťte několik krystalů kyseliny sulfanilové v 1 ml vody. Přidejte 1 ml Ehrlichova činidla, objeví se intenzivní žluté zbarvení, případně sraženina vzniklého aldiminu. Zapište uvedenou reakci chemickou rovnicí: Poznámky: 51

52 ÚLOHA 5. Močovina 5.1. Hydrolýza Močovina (urea), látka velmi dobře rozpustná ve vodě, je diamid kyseliny uhličité. Proto ji lze, jako jiné amidy, rozštěpit alkalickou hydrolýzou na amoniak a alkalickou sůl původní kyseliny, v tomto případě uhličitan sodný. Ve zkumavce rozpusťte malé množství močoviny v 1 ml vody. Přidejte 2 ml roztoku hydroxidu sodného a protřepejte. Reakční směs zahřívejte ve vroucí vodní lázni několik minut. Přes ústí zkumavky položte navlhčený indikátorový papírek, který se unikajícím amoniakem zbarví modře. Alkalickou hydrolýzu močoviny zapište chemickou rovnicí; Poznámky: 52

53 5.2. Biuretová reakce Biuret je látka vznikající tepelnou kondenzací dvou molekul močoviny za uvolnění amoniaku a vzniku vazby CO-NH-. 2 NH 2 CO NH 2 NH 2 CO NH CO NH 2 + NH 3 Biuret, stejně jako ostatní sloučeniny, obsahující dvě nebo více peptidových (amidových) vazeb, tvoří s ionty Cu 2+ fialově zbarvenou komplexní sloučeninu (chelát). Biuretová reakce se používá k průkazu i kvantitativnímu stanovení látek ve kterých jsou přítomné vazby CO-NH-, tedy i bílkovin a v následujících cvičeních bude využívána pro jejich detekci. Ve zkumavce pomalu zahřívejte nad mírným plamenem několik krystalů močoviny. Močovina nejprve taje, potom se začne uvolňovat amoniak a vzniká biuret. Zahřívání ukončete, když tavenina ztuhne v bílou hmotu. Po ochlazení na vzduchu zkumavku ještě ochlaďte pod tekoucí vodou. Biuret rozpusťte v 1 ml destilované vody. Přidejte 1 ml roztoku hydroxidu sodného a po kapkách přidávejte roztok síranu mědnatého (c = 0,02 mol/l). Roztok se zbarví fialově. Poznámky: 53

54 AMINOKYSELINY Klíčová slova: funkční skupiny kyselé a bazické, izoelektrický bod, tvorba komplexních sloučenin, nitrace, oxidace, redukce, hydrolýza bílkovin, rozdělovací rovnováhy, adsorpce, látky polární a nepolární, afinita. Reagencie: POZOR! Reagencie ad 1) - 6) jsou určeny pouze pro chromatografii! 1. roztok glycinu 0,005 mol/l (standard) 2. roztok argininu 0,005 mol/l (standard) 3. roztok methioninu 0,005 mol/l (standard) 4. roztok alaninu 0,005 mol/l (standard) 5. vzorek - směs aminokyselin 6. vyvíjecí směs: chloroform, methanol, vodný roztok amoniaku 6 mol/l v poměru 3 : 3 :1 7. kyselina glutamová 8. roztok tyrosinu 1,25 mmol/l 9. roztok tryptofanu 1,25 mmol/l 10. roztok kaseinu 5 g/l 11. roztok kyselého hydrolyzátu kaseinu 5 g/1 12. roztok želatiny 5 g/l 13. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l,!žíravina! 14. zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 15. roztok ninhydrinu v butanolu 2 g/l 16. Millonovo činidlo (40 g rtuti v 57 ml koncentrované kyselině dusičné, po zahřátí zředěno 2 objemy vody),!jed! 17. koncentrovaná kyselina dusičná,!žíravina! 18. koncentrovaná kyselina sírová,!žíravina! 19. Ehrlichovo aldehydové činidlo (4-dimethylaminobenzaldehyd 10 g/1 v kyselině chlorovodíkové 200 g/1) 20. roztok cysteinu 0,008 mol/l v HCl 1 mol/l 21. roztok cystinu 0,004 mol/l v HCl 1 mol/l 22. nitroprussid sodný 23. koncentrovaný vodný roztok amoniaku 24. nasycený vodný roztok sulfanu 25. roztok kyanidu draselného 1 mol/l!jed! 26. síran amonný 54

55 ÚLOHA 1. Chromatografie aminokyselin na tenké vrstvě Chromatografie je souhrnným označením pro separační metodiky používané k dělení směsi látek na základě jejich rozdílné afinity ke stacionární a mobilní fázi. Jednotlivé složky směsi rozpuštěné v mobilní (pohyblivé) fázi jsou při průchodu přes stacionární (zakotvenou) fázi v závislosti na svých fyzikálně-chemických vlastnostech v různé míře zbrzděny a dochází tak k jejich rozdělení. Mobilní fáze může být kapalina či plyn, zatímco stacionární fáze je pevná látka (např. papír, Al 2 O 3 ) nebo kapalina na pevném nosiči. Podle druhu mobilní fáze se chromatografické metody dělí na dva základní typy: kapalinovou a plynovou chromatografii. Kapalinová chromatografie (LC; liquid chromatography): K proudění mobilní fáze dochází za atmosférického tlaku, nízkého tlaku (FPLC; fast protein liquid chromatography) nebo vysokého tlaku (HPLC; high-performance liquid chromatography či high-pressure liquid chromatography), přičemž se vzrůstajícím tlakem roste rychlost separace směsi látek. K rozdělení směsi na jednotlivé složky dochází podle charakteru stacionární a mobilní fáze na základě: 1) velikosti separovaných částic (kapalinová vylučovací chromatografie, gelová filtrace). Tento typ chromatografie je používán k separaci syntetických nebo biologických polymerů (proteinů, nukleových kyselin, polysacharidů). Stacionární fázi tvoří mikroskopické gelové kuličky (agarosa, polyakrylamid, dextran) o definované porozitě, umístěné v chromatografické koloně. Po nalití směsi látek do kolony pronikají do pórů stacionární fáze pouze molekuly menší než je velikost pórů, čímž se jejich průchod kolonou zdrží. Frakce jímané po průchodu kolonou tak obsahují látky s postupně klesající velikostí molekuly, tj. kolonou nejrychleji prochází velké částice (srovnej s gelovou elektroforézou proteinů či nukleových kyselin!). 2) náboje částic (iontoměničová či iontová chromatografie). Ionty (kationty, anionty) či organické sloučeniny nesoucí elektrický náboj (proteiny, aminokyseliny, krátké oligonukleotidy) jsou děleny na základě interakce s opačně nabitou stacionární fází. Stacionární fáze je tvořena gelovými kuličkami (agarosa, celulosa) s kovalentně navázanými funkčními skupinami nesoucími záporný (katex) či kladný (anex) náboj. Navázané složky směsi mohou být následně ze stacionární fáze uvolněny např. promytím kolony roztokem obsahujícím ionty se shodným nábojem jako izolovaná látka, čímž dojde k jejímu vytěsnění. V klinické praxi je ionexová chromatografie užívána v diagnostice některých vrozených poruch metabolismu např. k identifikaci aminokyselin. 3) hydrofobicity (chromatografie na reverzní fázi). Tento typ chromatografie slouží k izolaci hydrofobních látek nesených hydrofilní mobilní fází. Stacionární fázi tvoří organické sloučeniny s alifatickým uhlíkovým řetězcem (C4-C18, s délkou řetězce narůstá jejich hydrofobní charakter). Navázané hydrofobní součásti dělené směsi látek jsou následně uvolněny promytím kolony organickým rozpouštědlem (methanol, acetonitril). 55

56 4) vazebné specifity (afinitní chromatografie). K separaci látek ze směsi dochází na základě vysoce specifické interakce separované látky se stacionární fází. Příkladem této interakce je např. vazba ligand receptor, antigen protilátka či enzym substrát. V klinické biochemii a toxikologii je široce užívána HPLC díky své rychlosti (čas separace méně než 1hodina), vysoké rozlišovací schopnosti, citlivosti (detekce pikomolárních množství látek) a možnosti automatizace. Slouží k detekci a stanovení hladiny např.: 1) léků (antiarytmikum amiodaron, psychofarmaka jako např. alprazolam, amitriptylin, diazepam, zolpidem atd.) 2) metabolitů hromadících se při vrozených či získaných defektech metabolismu (katecholaminy, homocystein, porfyriny, puriny, pyrimidiny atd.) 3) vitamínů (koenzym Q10, vitamín E, A či jeho prekurzor beta karoten). 4) glykovaného hemoglobinu (HbA1c, jeden ze základních parametrů používaných k hodnocení kompenzace pacientů s diabetes mellitus, viz Sacharidy II). Plynová chromatografie (GC; gas chromatography): Plynová chromatografie využívá jako mobilní fázi plyn. Skleněná či kovová kolona, ve které separace probíhá, je umístěna v termostatu. Stacionární fáze je tvořena mikroskopickou vrstvou kapaliny nebo pevnou látkou a mobilní fáze tzv. nosným plynem (např. helium nebo dusík). Vzorek (kapalina či plyn) se vstřikuje do nástřikového portu, v případě kapalného vzorku musí být nástřikový port předehřátý na dostatečně vysokou teplotu, aby byl vzorek ihned po vstříknutí převeden na plynnou fázi. Nosný plyn unáší vzorek přes kolonu, kde dochází k dělení jednolitých složek na základě jejich fyzikálněchemických vlastností a rozdílné interakce se stacionární fází. Po průchodu kolonou jsou jednotlivé složky vzorku detekovány na detektoru, který je připojen na počítač. Časový průběh detekovaného signálu představuje chromatogram tvořený souborem vrcholů, z nichž v ideálním případě každý odpovídá jedné složce směsi. V klinické biochemii a toxikologii je GC samotná či v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (MS) využívána k detekci a kvantifikaci ethanolu a řady drog v tělních tekutinách. Chromatografie na tenké vrstvě (TLC; thin layer chromatography): TLC představuje variantu kapalinové chromatografie, kde je stacionární fáze tvořena tenkou vrstvou adsorbentu (silikagel, oxid hlinitý, celulosa) nanesenou na inertní destičku (sklo, plastik, hliníková folie). Destička s nanesenými vzorky se umístí do chromatografické vany s mobilní fází, která vzlíná po povrchu fáze stacionární. Nanesené vzorky se při průchodu mobilní fáze v ní rozpustí a v závislosti na své polaritě/hydrofobicitě jsou s mobilní fází unášeny. Pokud je stacionární fáze tvořena polárním silikagelem a mobilní fáze převážně nepolárními rozpouštědly, je hydrofobní vzorek unášen dále než vzorek polární, který je poután k silikagelu větší silou. Po ukončení chromatografie jsou separované látky přímo viditelné, pokud separujeme směs barevných sloučenin, či u fluoreskujících látek po osvícení desky UV zářením, v ostatních případech lze vizualizovat jednotlivé skvrny postříkáním destičky vhodným detekčním činidlem. Při separaci směsi aminokyselin je detekce prováděna pomocí ninhydrinu, který reaguje s volnými aminoskupinami za vzniku tmavě modrého nebo fialového zabarvení (Ruhemanova violeť). Identifikaci jednotlivých složek směsi lze následně provést stanovením tzv. retenčního faktoru (R f ) a jeho srovnáním s R f standardních vzorků. R f se vypočítá podle vzorce: R f = vzdálenost vzorku od startu / vzdálenost čelo start (R f =1 mají látky putující s čelem mobilní fáze, R f =0 látky zůstávající na startu) TLC je v klinické praxi užívána k detekci a průkazu některých léčiv a především drog. 56

57 V této úloze budete pro dělení směsi aminokyselin používat chromatografii na tenké vrstvě (TLC). Adsorbentem (stacionární fázi) je v tomto případě silikagel na hliníkové folii (destičky Silufol), mobilní fází je směs rozpouštědel, mající ph blízko pi dělených aminokyselin. Jednotlivé aminokyseliny ve směsi budete po detekci identifikovat pomocí standardních vzorků aminokyselin. a R f = b a = vzdálenost středu skvrny od startu b = vzdálenost čela rozpouštědla od startu 1. Arg 2. Gly 3. vzorek (směs AMK) 4. Ala 5. Met Na kratší straně destičky Silufol obyčejnou tužkou lehce vyznačte start (asi 2 cm od okraje destičky) a pět bodů (po stranách destičky ponechte 1 cm), na které budete nanášet roztoky AMK (viz schéma). Mikropipetkami naneste na příslušné body roztoky standardních AMK a vzorku (opatrně, aby nedošlo k porušení tenké vrstvy!). Destičku vložte do chromatografické vany s připravenou mobilní fází. Start musí být nad hladinou kapaliny. Vanu dobře přikryjte skleněným víkem. Když čelo rozpouštědla dosáhne do vzdálenosti 1-2 cm od horního okraje, chromatogram vyndejte z vany. Čelo rozpouštědla označte tužkou a chromatogram sušte nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit! Suchý chromatogram v digestoří detekujte postřikem roztokem ninhydrinu v butanolu ze vzdálenosti asi 0,5 cm. Chromatogram zahřívejte asi 3 min nad ploténkou (stupeň 6). POZOR! Nespálit! Skvrny na chromatogramu odpovídající jednotlivým amininokyselinám obtáhněte tužkou. Pomocí vypočítaných hodnot R f standardů i vzorků idendfikujte jednotlivé AMK. Vzorek č.:. obsahoval tyto AMK: Poznámky: 57

58 ÚLOHA 2. Kyselina glutamová Rozpustnost aminokyselin ve vodě závisí na počtu a druhu funkčních skupin a charakteru uhlíkatého řetězce. Některé soli aminokyselin, v nichž aminokyselina vystupuje jako kation nebo anion, jsou ve vodě rozpustné daleko lépe než volné aminokyseliny. Do dvou zkumavek dejte vždy malé množství kyseliny glutamové, přidejte 1 ml vody a protřepejte. Část kyseliny zůstane nerozpuštěná. Do jedné zkumavky přidejte plastikovou pipetkou 2 kapky roztoku hydroxidu sodného a do druhé 1 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové. V obou případech přejde veškerá aminokyselina do roztoku, protože vzniklé soli jsou ve vodě dobře rozpustné. Obě reakce zapište chemickou rovnicí. Reakce Glu s HCl: Reakce Glu s NaOH: Poznámky: 58

59 ÚLOHA 3. Barevné reakce aminokyselin Tyto reakce se používají k důkazu aminokyselin. Velmi citlivá ninhydrinová reakce je pro aminokyseliny obecná (s výjimkou prolinu) a využívá se nejen k jejich důkazu (detekce aminokyselin při chromatografii, viz úloha 1.), ale i k jejich fotometrickému stanovení. Ostatní reakce jsou specifické pouze pro aminokyseliny určité struktury Ninhydrinová reakce Kondenzací aminokyselin se dvěma molekulami ninhydrinu (hydrát indantrionu) vzniká modrofialově zbarvený produkt. Připravte si vroucí vodní lázeň. K 1 ml roztoku tyrosinu přidejte 0,5 ml roztoku ninhydrinu v butanolu, promíchejte. Reakční směs zahřívejte asi 5 min ve vroucí vodní lázni. Po chvíli se objeví v horní organické vrstvě růžové až modrofialové zbarvení. Tutéž reakci vyzkoušejte i s kyselým hydrolyzátem kaseinu. 59

60 Poznámky: 60

61 Následující reakce , proveďte s tyrosinem, tryptofanem, kyselým hydrolyzátem kaseinu (indolové jádro je v kyselém prostředí nestabilní!), kaseinem a želatinou. Všechny výsledky provedených reakcí zapište do tabulky Reakce s koncentrovanou kyselinou dusičnou Aromatické aminokyseliny poskytují reakcí s kyselinou dusičnou žlutě zbarvené nitrosloučeniny. Tyrosin a tryptofan se za těchto podmínek nitrují zvlášť snadno. V alkalickém prostředí se zbarvení změní na oranžové, protože vznikne alkalická sůl tautomerní formy nitrosloučeniny. Stejnou reakci poskytují i bílkoviny, obsahující tyto aminokyseliny s aromatickým jádrem (xanthoproteinová reakce). Do zkumavky odlijte 1 ml zkoumaného roztoku a z dávkovače přidejte 0,5 ml koncentrované kyseliny dusičné. Zahřívejte ve vroucí vodní lázni (případně vzniklá sraženina se rozpustí) do vzniku žlutého zbarvení. Zkumavku ochlaďte pod tekoucí vodou. Opatrně přikapávejte plastikovou pipetkou roztok hydroxidu sodného až do vytvoření oranžového zbarvení Reakce s Millonovým činidlem Sloučeniny, obsahující v molekule hydroxyskupinu vázanou na aromatické jádro, poskytují s Millonovým činidlem komplexní rtuťnatou sůl svých nitroderivátů (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 4.2.). K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou 5 kapek Millonova činidla. Vzniklou bílou sraženinu zahřívejte ve vroucí vodní lázni do objevení červeného zbarveni komplexní rtuťnaté soli. 61

62 3.4. Reakce s Ehrlichovým činidlem K důkazu tryptofanu se využívá kondenzační reakce indolového jádra s oxoskupinou aldehydu, obsaženého v Ehrlichově činidle. Produkty této reakce jsou v kyselém prostředí fialové zbarveny. K 1 ml zkoumaného roztoku přidejte plastikovou pipetkou několik kapek Ehrlichova činidla a protřepejte. Z dávkovače přidejte pomalu po stěně zkumavky 1 m1 koncentrované kyseliny sírové. V pozitivním případě vznikne na rozhraní obou vrstev fialový prstenec lépe viditelný proti bílému pozadí. Tabulka 1. tyrosin tryptofan hydrolyzát kaseinu kasein želatina AMK HNO 3 Millon Ehrlich Poznámky: 62

63 ÚLOHA 4. Reverzibilní redox systém cystein - cystin Sloučeniny obsahující -SH skupinu tvoří v alkalickém prostředí s nitroprussidem sodným (pentakyanonitrosylželezitan sodný) červenofialově zbarvenou komplexní sloučeninu. Ve zkumavce si připravte asi 4 ml roztoku nitroprussidu sodného rozpuštěním velmi malého množství látky ve vodě. Dále si připravte čtyři zkumavky. Do první zkumavky odlijte 1 ml vodného roztoku sulfanu. Do druhé zkumavky odlijte 1 ml roztoku cysteinu. Do třetí zkumavky odlijte 1 ml roztoku cystinu. Do všech třech zkumavek přidejte 1 ml roztoku nitroprussidu sodného. Za míchání roztok nasyťte síranem amonným. Roztoky ve všech třech zkumavkách pomalu alkalizujte amoniakem a pozorujte vznik barevné komplexní sloučeniny. Do čtvrté zkumavky odlijte 1 ml roztoku cystinu, přidejte asi 3 kapky amoniaku a z dávkovače 5 kapek roztoku kyanidu draselného. Roztok nasyťte síranem amonným a přidejte 1 ml roztoku nitroprussidu sodného. Asi po 5 min porovnejte zbarvení ve všech čtyřech zkumavkách a výsledky zaznamenejte do tabulky 2. Vysvětlete průběh jednotlivých reakcí. Tabulka 2. sloučenina sulfan cystein cystin cystin a KCN zbarvení Poznámky: 63

64 BÍLKOVINY I Klíčová slova: biuret, peptidová vazba, koloidní roztok, izoelektrický bod, amfionty, amfolyty, amfotéry, vliv ph na ionizaci bílkovin, hydrofilní a hydrofobní skupiny, emulgace, reverzibilní a irreverzibilní srážení bílkovin. Reagencie: 1. roztok kaseinu 10 g/1 ve fyziologickém roztoku 2. roztok vaječného bílku ve fyziologickém roztoku (1:10) 3. roztok síranu mědnatého 0,02 mol/l 4. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l!žíravina! 5. slunečnicový olej 6. roztok octanu olovnatého 0,01 mol/l!jed! 7. roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l 8. koncentrovaná kyselina dusičná 9. roztok Ajatinu zředěný 1:4 10. roztok kyseliny octové 0,15 mol/l 11. roztok kyseliny octové 1,5 mol/l 12. chlorid sodný 13. fyziologický roztok (roztok chloridu sodného 0,15 mol/l) 14. krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem (1 : 1) 15. roztok močoviny 3 mol/l a laktátu lithného 0,2 mol/l 16. roztok dusičnanu stříbrného 0,06 mol/l 17. činidlo pro stanovení močoviny (kyselina sírová 0,9 mol/l + 1 tableta diacetylmonoxinu 0,05 mmol/l do 50 ml vody) % roztok fenolu 19. roztok chloridu železitého 0,05 mol/l 20. roztok hydrogenuhličitanu sodného 0.4 mol/l 21. roztok dusičnanu barnatého 0,2 mol/!jed! 22. Molischovo činidlo (roztok 1-naftolu v ethanolu 3 g/l) 23. koncentrovaná kyselina sírová!žíravina! 24. koncentrovaná kyselina chlorovodíková!žíravina! 25. roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml vody ml kyseliny dusičné 320 g/l) 64

65 ÚLOHA 1. Biuretová reakce V alkalickém prostředí tvoří bílkoviny s měďnatými kationty komplexní sole, které jsou fialově zbarveny. Volné elektronové páry pro tvorbu komplexu poskytují elektronegatívní atomy peptidové vazby CO NH. Název reakce je odvozen od biuretu (viz Reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 6.2.). Biuretová reakce je obecná reakce používaná pro důkaz bílkovin a peptidů. Je též základem kvantitativního stanovení koncentrace bílkovin v biologickém materiálu. POZOR! Při nadbytku Cu 2+ mědnatého. je fialové zbarvení překryto modrou sraženinou hydroxidu Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku. Ke každému roztoku bílkoviny přilijte 1 ml roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l. Do obou zkumavek přidávejte po kapkách roztok síranu měďnatého až do vzniku fialového zbarvení. Poznámky: 65

66 ÚLOHA 2. Emulgační schopnost bílkovin Protože bílkoviny obsahují hydrofilní i hydrofobní skupiny, mají emulgační schopnosti podobně jako jiné tenzidy. Tenzidy, které jsou součástí detergentů, snižují povrchové napětí na rozhraní hydrofilní a hydrofobní fáze. Jejich účinkem vzniká poměrně stabilní emulze tuků ve vodě. Tato vlastnost bílkovin, především albuminu, se uplatňuje při transportu hydrofobních látek krví (např. mastných kyselin, steroidních hormonů, bilirubínu). Přirozenou emulzí tuků ve vodě je mléko, v němž bílkoviny působí jako emulgátor. Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku bílku a 1 kapku slunečnicového oleje. Po protřepání se vytvoří emulze. Do druhé zkumavky odlijte 1 ml destilované vody a 1 kapku slunečnicového oleje. Po protřepání se obě vrstvy opět oddělí. Poznámky: 66

67 ÚLOHA 3. Ireverzibilní srážení bílkovin Denaturace je změna konformace nativní molekuly bílkoviny, která tím přechází na méně uspořádanou formu a ztrácí svou biologickou funkci. Denaturačně působí všechny vlivy, které porušují nekovaletní interakce vytvářející sekundární a terciární strukturu bílkovin. Mezi fyzikální vlivy patří především rozptýlení bílkoviny na velkém povrchu (pěněním roztoků) a zvýšená teplota. Srážení varem nastává nejrychleji v okolí pi bílkovin. K chemické denaturaci dochází např. působením silných kyselin, které ruší iontové interakce změnou náboje, naproti tomu organická rozpouštědla a tenzidy narušují nepolární interakce. Primárním účinkem všech denaturačních činidel je rozvinutí peptidového řetězce, snížení solvatace molekuly a tím i rozpustnosti bílkoviny. Srážení bílkovin, při kterém dochází k denaturaci bílkovin, může být vyvoláno např. i ionty těžkých kovů, které s bílkovinami vytvářejí sole nebo komplexní sloučeniny. Díky této schopnosti se mohou bílkoviny používat jako antidotum při otravách těžkými kovy. Denaturace bílkovin koncentrovanou kyselinou dusičnou se využívala jako Hellerova zkouška pro důkaz bílkovin v moči. V současné době se používá reakce s kyselinou sulfosalicylovou, která je nejcitlivější. Podobný účinek na bílkoviny jako kyselina sulfosalicylová mají i další silné organické kyseliny např. kyselina trichloroctová nebo pikrová, které slouží jako deproteinační činidla. Denaturaci způsobují i kvartérní alkylamoniové sole, které vytvářejí s negativně nabitými ionty bílkovin těžce rozpustné soli. Na tomto jevu jsou založeny desinfekční účinky Ajatinu (kvartérní amoniové sole s alkylem C 8 C 18 jako substituentem). Podobnou strukturu a tedy i vlastnosti má i další desinfekční prostředek Septonex. Kationty těchto tenzidů se adsorbují na buněčné stěny mikrobů, denaturují jejich životné důležité bílkoviny a tím blokují transportní funkci membrány mikrobů. Ajatin, Benzododecinií bromidum: CH 3 R N + CH 2 C 6 H 5 Br R = C 8 C 18 CH 3 67

68 POZOR! V následujících úlohách používejte jako bílkovinu roztok vaječného bílku Srážení těžkými kovy Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok octanu olovnatého dokud nevznikne sraženina. V nadbytku soli se sraženina rozpustí Srážení kyselinami Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a přidejte několik kapek roztoku kyseliny sulfosalicylové, vytvoří se bílá sraženina. Tutéž reakci proveďte s koncentrovanou kyselinou dusičnou Srážení Ajatinem Do zkumavky odlijte 1 ml bílkoviny a po kapkách přidávejte roztok Ajatinu, dokud nevznikne sraženina Srážení varem Do 5 zkumavek odlijte 1 ml bílkoviny a další reagencie dle návodu: zkumavka 1 pouze bílkovina zkumavka 2 přidejte kapku kyseliny octové 0,15 mol/l zkumavka 3 přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l zkumavka 4 přidejte několik kapek kyseliny octové 1,5 mol/l a malé množství chloridu sodného zkumavka 5 přidejte několik kapek roztoku hydroxidu sodného 2 mol/l Zkumavky povařte ve vodní lázni. Výsledky zapište do tabulky 1., vznik sraženiny označte +. Tabulka 1. sraženina zkumavka Poznámky: 68

69 ÚLOHA 4 Dialýza Dialýza je proces, který umožňuje pomocí polopropustné membrány oddělovat z roztoku látky nízkomolekulární od látek vysokomolekulárních. Na jejím principu je založena funkce umělé ledviny, kdy krev protéká soustavou dialyzačních trubic omývaných roztokem o specifickém složení iontů. Je samozřejmé, že ionty i ostatní nízkomolekulární látky mohou membránou procházet oběma směry. Schéma uspořádání: POZOR! Pro důkazy používejte vždy max. 1 ml roztoku! Připravte si vroucí vodní lázeň pro důkaz dialyzovaných látek a fosforečnanů (úloha 3.2.). Jeden konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na vnitřní okraj kádinky pro dialýzu. Ve zkumavce smíchejte 1 ml séra, 2 ml roztoku močoviny a laktátu, přidejte 9 ml fyziologického roztoku. 7 ml takto připraveného roztoku vlijte do dialyzační trubice připevněné kolíčkem ke kádince. Zbytek roztoku použijte k důkazu látek přítomných v roztoku před dialýzou. Druhý konec dialyzační trubice připevněte kolíčkem na protilehlou stranu kádinky. Do kádinky nalijte destilovanou vodu tak, aby dialyzovaný roztok byl ponořen ve vodě, dialýzu nechte probíhat 20 min (frakce I). Zbývající množství původního roztoku rozdělte do čtyř zkumavek. 69

70 V první zkumavce dokažte přítomnost chloridových iontů reakcí s roztokem dusičnanu stříbrného (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.2.). Ve druhé zkumavce dokažte přítomnost bílkovin reakcí s roztokem kyseliny sulfosalicylové (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.). Ve třetí zkumavce dokažte přítomnost močoviny: k 1 ml roztoku přidejte 2 ml činidla pro důkaz močoviny a zkumavku zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. Přítomnost močoviny se projeví vznikem červeného zbarvení. Tato reakce se rovněž používá i ke kvantitativnímu stanoveni močoviny v séru. Ve čtvrté zkumavce dokažte přítomnost laktátu reakcí s Uffelmannovým činidlem: k 1 ml roztoku fenolu přidejte 1 až 2 kapky chloridu železitého (roztok se zbarví fialově). Po 20 min odlijte část dialyzátu (frakce I) k důkazu přítomných látek, zbytek vylijte. Kádinku vypláchněte destilovanou vodou. Do kádinky opět nalijte destilovanou vodu a dialýzu nechte probíhat dalších 20 min (frakce II). Ve frakci I dokažte, zda jsou přítomné chloridy, močovina, laktát a bílkoviny. Celý postup po uplynutí 20 min opakujte, ale pro frakci III použijte místo destilované vody roztok hydrogenuhličitanu sodného. Ve frakci II dokažte, zda jsou přítomny chloridy, močovina, laktát a bílkoviny. Po dalších 20 min dialýzu ukončete. Ve frakci III dialyzátu dokažte, zda jsou přítomny hydrogenuhličitany reakcí s roztokem dusičnanu barnatého (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1.), močovina, laktát a bílkoviny. Stejnými reakcemi dokažte přítomnost uvedených látek v dialyzovaném roztoku po dialýze. Výsledky zapište do tabulky I. Tabulka 1. roztok Cl HCO 3 močovina laktát bílkoviny dialyzovaný roztok před dialýzou frakce I frakce II frakce III dialyzovaný roztok po dialýze Poznámky: 70

71 ÚLOHA 5. Důkaz některých složek bílkovin 5.1. Důkaz cukerné složky Molischovou zkouškou Mnoho bílkovin (např. řada plazmatických bílkovin) patří mezi glykoproteiny. Jejich prostetickou skupinu lze dokázat obecnou reakcí pro důkaz sacharidů - Molischovou zkouškou. Reakce je založena na dehydrataci sacharidů účinkem silných kyselin. Produkty této dehydratace snadno kondenzuji s fenoly na barevné sloučeniny. Do zkumavky odlijte 1 ml roztoku séra, přidejte přibližně 0,5 ml Molischova činidla, promíchejte. Po stěně zkumavky pomalu přidejte z dávkovače 1 ml koncentrované kyseliny sírové, aby došlo k podvrstvení roztoku. Na styčné ploše obou vrstev se v přítomnosti sacharidů vytvoří fialový prstenec Důkaz kyseliny fosforečné ve fosfoproteinech K důkazu lze použít reakci s molybdenanem amonným, která je vhodná k důkazu anorganického fosfátu stejně jako pro důkaz kyseliny fosforečné ve fosfolipidech (viz Vlastnosti a reakce biologicky a toxikologicky významných prvků a jejich sloučenin, úloha 2.1. a Lipidy I, úloha 5.2.). Do jedné zkumavky odlijte 1 ml roztoku kaseinu (před upotřebením zásobní roztok protřepejte), do druhé 1 ml roztoku vaječného bílku. Ke každé bílkovině přidejte z dávkovače 0,5 ml kyseliny chlorovodíkové a protřepejte. Po 2 min přidejte do každé zkumavky 1 ml roztoku molybdenanu amonného a zahřívejte na vodní lázni asi 2 min. V přítomnosti fosfoproteinů vznikne žlutý až oranžový zákal, případně sraženina. ` Poznámky: 71

72 BÍLKOVINY II Klíčová slova: elektroforéza, izoelektrický bod, amfolyty, vliv ph na ionizaci bílkovin, peptidová vazba, biuretová reakce, krevní plazma, krevní sérum, bílkoviny krevní plazmy, hypoproteinemie, hyperproteinemie, onkotický tlak, transportní proteiny, reverzibilní a irreverzibilní srážení bílkovin, iontová síla. Reagencie: 1. souprava Hydragel protein, SEBIA: a) Tris-barbitalový pufr ph 8,5 b) barvící lázeň roztok amidočerni c) odbarvovací lázeň roztok kys. citronové 0,05 g/l 2. standardní lyofilyzované bílkoviny pro ELFO ředěné fyziologickým roztokem dle komerčního návodu 3. vzorky krevního séra 4. souprava Celkové bílkoviny, BioSystems: a) biuretové činidlo: síran mědnatý 0,015 mol/l hydroxid sodný 1,0 mol/l Chelaton IIl 0,018 mol/l b) standardní roztok bílkoviny (koncentrace standardu podle aktuálního zadání) 5. souprava Albumin, Biosystems: a) pracovní roztok pro stanovení albuminu: bromkresolová zeleň 0,27 mmol/l citrátový pufr 0,1 mol/l, ph 4,1 b) standardní roztok albuminu (koncentrace standardu podle aktuálního zadání) 6. krevní sérum zředěné fyziologickým roztokem 1:1 (pro úlohu č. 4.) 7. nasycený roztok síranu amonného 8. síran amonný 9. roztok kyseliny sulfosalicylové 0,8 mol/l 10. souprava QuikRead CRP, Orion diagnostika 72

73 ÚLOHA 1. Elektroforéza bílkovin Elektroforéza je separační metoda umožňující rozdělit ve stejnosměrném elektrickém poli směs látek, které mají v roztoku elektrický náboj. Částice látek rozpuštěných v pufru o určitém ph migrují v nosiči k elektrodě s opačným nábojem. Rozdělení směsi, dané pohyblivostí částic, závisí na napětí mezi elektrodami, na typu nosiče, na velkosti částice a jejím náboji závislým na ph použitého pufru (při fyziologickém ph existuje většina proteinů ve formě aniontů). Pomoci připojeného densitometru lze odečíst po obarvení i množství látky v jednotlivých oddělených frakcích (viz Lipidy III, úloha 7.). Elektroforéza má široké použití nejen ve vědeckém výzkumu, ale je nepostradatelnou metodou i v klinicko-biochemických laboratořích. V této úloze budete používat pro elektroforézu bílkovin zařízení SEBIA. Proteiny jsou děleny na agarosovém gelu v Tris-barbiturátovém pufru o ph 8,5. Elektroforeogram je barven roztokem amidočerně. Úmístěte Hydragel K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu a zvedněte část s očíslovanými zuby (obr. A). Naneste 120 µl destil. vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. Z obalu vyjmětě agarosovou plotnu a rychle ji osušte filtračním papírem. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku gelem k sobě. Gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. B). Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. Umístěte aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. C). Do jamek aplikátoru napipetujte rychle 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat během 2 min. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči, čísla musí směřovat k obsluze (obr. D). Pomalu snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. Po 40 sec. aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. Gelovou plochu vložte do migrační elektroforetické komory podle polarity vyznačené na gelu dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru (asi 1 cm). Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K ml 300 ml 20 min 90 V 12 ± 3 ma Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. 73

74 Gel osušte v sušičce při 80 C asi 10 min. Usušený gel ponořte do barvícího roztoku amidočerně na 4 min. Odbarvěte ve 3 po sobě následujících lázních odbarvovacím roztokem (kys. citronové), dokud není pozadí zcela bezbarvé. Odsajte přebytečnou tekutinu z gelu filtračním papírem a vysušte gel při 80 C. Vyhodnoťte gel denzitometrem při 570 nm. 74

75 ELEKTROFORÉZA PLAZMATICKÝCH BILKOVIN Obr.4. Elektroforéza plazmatických bílkovin FRAKCE NORMÁLNÍ HODNOTY Albumin 59,4 74 % Alfa-1 globuliny 1,2 3,1 % Alfa-2 globuliny 7,0 12,2 % Beta-1 globuliny 4,9 9,4 % Beta-2 globuliny 1,6 5,6 % Gama-globuliny 6,9 14,7 % Poznámky: 75

76 ÚLOHA 2. Stanovení koncentrace bílkovin v séru Krevní plazma obsahuje asi 100 různých proteinů, podle jejich elektroforetických vlastností jsou obvykle rozdělovány do 5 různých skupin - albumin a α1, α2-, ß- a γ- globuliny. Bílkoviny krevní plazmy kromě svých specifických funkcí zajišťují koloidně osmotický (onkotický) tlak, který má význam pro udržení normálního objemu krve. Dále se podílejí na udržování acidobazické rovnováhy a transportu lipofilních látek a iontů kovů. Většina plazmatických bílkovin je syntetizována v játrech (mimo imunoglobuliny a proteohormony). S výjimkou albuminu jsou bílkoviny krevní plazmy glykoproteiny. Za fyziologického stavu jsou plazmatické proteiny ve vzájemné rovnováze a neustále se obnovují. Za patologických stavů dochází k porušení této rovnováhy, a tím i ke změnám jejich koncentrace a vzájemného zastoupení jednotlivých frakcí (dysproteinemie) (viz úloha 1.). Koncentrace celkových bílkovin je snížená (hypoproteinemie) při jejich nedostatku v potravě, nedostatečném vstřebávání nebo syntéze, při jejich zvýšené spotřebě (např. u dlouhodobých infekčních onemocněních nebo u nádorových procesů) nebo ztrátě (u nefrotického syndromu, u popálenin, při silném krvácení). Zvýšená koncentrace bílkovin (hyperproteinemie) bývá např. při dehydrataci nebo paraproteinemii. Koncentrace celkové bílkoviny se stanovuje v krevním séru, jednou z používaných metod je biuretová reakce (viz Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 6.2. a Bílkoviny I, úloha 1.). Intenzita modrofialového zbarvení komplexu se stanovuje spektrofotometricky a je přímo úměrná počtu peptidových vazeb. Jinou možností je UV spektroskopie, využívající absorbanci peptidové vazby při 280 nm. Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou. Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 1., malé objemy pipetujte ke dnu zkumavky! Tabulka 1. reagencie (ml) vzorek standard slepý vzorek sérum 0,02 standardní roztok bílkoviny 0,02 destilovaná voda 0,02 biuretové činidlo 1,5 1,5 1,5 Každou zkumavku dobře promíchejte. Přesně po 12 min změřte absorbanci při 540 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 2. Z průměrných hodnot absorbance vzorku (A vz ) a standardu (A st ) vypočítejte koncentraci celkové bílkoviny (g/l) v určeném séru. Výsledek zapište do tabulky 2. 76

77 Tabulka 2. vzorek č.: absorbance průměr c (g/l) standard PROT sérum Poznámky: 77

78 ÚLOHA 3 Stanovení koncentrace albuminu v séru Nejdůležitějším proteinem v krvi je z kvantitativního pohledu albumin (tvoří 60 % všech bílkovin krevní plazmy). Fyziologická funkce albuminu spočívá v regulaci plazmatického objemu, dále plní transportní funkci (přenáší např. mastné kyseliny, lipidy, bilirubin, některé hormony, vitaminy, ionty kovů, léky i toxické látky). Má i funkci rezervní bílkoviny a při zátěži organismu slouží jako bohatá rezerva aminokyselin, zvláště esenciálních. Zvýšená koncentrace albuminu v krvi (hyperalbuminemie) bývá obvykle jen sekundární následek dehydratace. Hypoalbuminemie doprovází mnoho onemocnění (např. infekce, choroby jater, nefrotický syndrom), biochemickou příčinou je bud' snížení jeho syntézy nebo zvýšení jeho odbourávání. Albumin se řadí mezi tzv. negativní proteiny akutní fáze podobně jako transferrin, glykoprotein přenášející krevní plazmou železo jako Fe 3+. V akutní fázi je jejich koncentrace v plazmě nižší, protože na jejich úkor připadá zvýšená syntéza pozitivních proteinů akutní fáze (např. C-reaktivní protein). Ke stanovení albuminu je také vhodné sérum. Běžná metoda využívá reakce albuminu s bromkresolovou zelení, která tvoří s albuminem, v slabě kyselém prostředí a za přítomnosti povrchově aktivních látek, barevný komplex vhodný k fotometrování (s globuliny nereaguje). Stanovení albuminu proveďte ve stejném séru, ve kterém jste stanovovali koncetraci bílkovin. Vzorek séra i standard zpracujte v tripletu, slepý vzorek jednou. Do zkumavek napipetujte reagencie podle tabulky 3., malé objemy pipetujte ke dnu zkumavky! 78

79 Tabulka 3. reagencie (ml) vzorek standard slepý vzorek sérum 0,01 standardní roztok albuminu 0,01 destilovaná voda 0,01 pracovní roztok 1,0 1,0 1,0 Každou zkumavku dobře promíchejte. Nechte inkubovat 10 min při pokojové teplotě. Změřte absorbanci vzorku i standardu při vlnové délce 630 nm proti slepému vzorku. Naměřené hodnoty zapište do tabulky 4. Z průměrných hodnot absorbance vzorku (A vz ) a standardu (A st ) vypočítejte koncentraci albuminu (g/1) v určeném séru. Výsledek zapište do tabulky 4. Tabulka 4. vzorek č.: absorbance průměr c (g/l) standard ALB sérum VYHODNOCENÍ: Tabulka 5. vzorek séra č.: stanovovaná bílkovina REFERENČNÍ HODNOTY celková bílkovina (g/l) albumin (g/l) NAMĚŘENÉ HODNOTY 79

80 ÚLOHA 4. Stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru C-reaktivní protein (CRP) je markerem akutní fáze zánětu. Normálně je přítomen v séru zdravých lidí v nízkých koncentracích - méně než 6 mg/l. Je produkován játry, jeho plazmatická koncentrace se zvyšuje již během 6 12 hodin po vypuknutí zánětlivého procesu a maxima dosahuje za hodin. Vzestup koncentrace může být až 1000x vyšší proti fyziologické hodnotě. Stanovení CRP pomáhá určit, zda se jedná o infekci bakteriální nebo virovou a zvolit odpovídající způsob terapie. Zda zánět probíhá a v jaké fázi, určuje monitorování CRP. Vzhledem k tomu, že zánětlivým procesem reaguje náš organismus prakticky na cokoliv, jsou zvýšené bílkoviny akutní fáze a tedy i CRP poměrně častým nálezem. K jejich zvýšení dochází u infekcí jakéhokoliv původu, pooperačních stavů, u nádorových onemocnění i u autoimunitních chorob. Vyšší plazmatická koncentrace CRP také predikuje riziko infarktu myokardu nebo mozkové mrtvice. CRP byl objeven v roce 1930 Tilletem a Francisem, kteří zjistili, že séra některých akutně nemocných osob precipitují kapsulární C polysacharid bakterie Streptococcus pneumoniae. Sérový faktor, způsobující precipitaci, byl později identifikován jako protein a označen jako C-reaktivní protein. CRP aktivuje klasickou cestu komplementu a má funkci jako opsonin v leukocytové fagocytóze, stimulaci lymfocytů nebo aktivaci monocytů/makrofágů. CRP koncentrace v séru se zvyšují a snižují rychleji než sedimentace erytrocytů (FW), jako odpověď na změny ve stavu pacienta. Přetrvávající zvýšení hladiny CRP v plazmě indikuje neustávající zánět a obvykle znamená neúspěšnou terapii a špatnou prognózu (např. u maligních onemocnění, infekce a infarktu myokardu). Malé zvýšení CRP má predikční hodnotu pro výskyt kardiovaskulárních příhod u pacientů s koronárním srdečním onemocněním a stejně tak i u osob dosud zdravých. Ukazuje se, že má větší prognostický význam než hladina HDL a LDL. Stanovení koncentrace CRP je založeno na měření tvorby komplexu antigenu a protilátky. Reakci rozpustného antigenu s odpovídající protilátkou můžeme prokázat vznikem precipitátu v roztoku, V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného antigenu. Stupeň zákalu roztoku se kvantitativně měří pomocí imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie. Zapněte přístroj na displeji se objeví NAČTĚTE KARTU a poté PŘIPRAVEN K MĚŘENÍ Připravte si kyvetu s pufrem, sejměte ochranný kryt. Sestavte si kapiláru vsuňte píst do kapiláry tam, kde je na kapiláře modrý proužek. Proveďte odběr krve z prstu, otřete první kapku se stopami desinfekce. Přiložte kapiláru a další kapku krve nechte navzlínat po bílou zátku (20 ul), kapiláru zvenku pečlivě otřete. Vložte kapiláru se vzorkem krve do kyvety s pufrem a vytlačte krev pístem. Uzavřete kyvetu víčkem, které vyndáte z tuby. Pozor zatím nepromáčkněte modrý střed. Razantně promíchejte obsah kyvety nepřevracejte kyvetu dnem vzhůru obsah kyvety bude červeně čirý. Vložte kyvetu do přístroje na displeji se objeví MĚŘENÍ BLANKU (slepé zkoušky). Je-li vše v pořádku, asi po 30 s se na displeji objeví PŘIDEJTE ČINIDLO a VYNDEJTE KYVETU 80

81 Promáčkněte modrý střed kyvety, která je stále v přístroji. Kyvetu vyndejte z přístroje a pečlivě promíchejte její obsah převracením dna vzhůru. Na displeji mezitím probíhá hlášení PROTŘEPEJTE OBSAH KYVETY. Až se na displeji objeví hlášení VLOŽTE KYVETU, neprodleně vložte kyvetu s promíchaným obsahem zpět do přístroje. Na displeji mezitím probíhá hlášení PROBÍHÁ MĚŘENÍ a během dvou minut se na displeji objeví výsledek koncentrace CRP v jednotkách mg/l. Poznámky: 81

82 ÚLOHA 5. Reverzibilní srážení bílkovin - izolace albuminů a globulinů z krevního séra Příkladem reverzibilního srážení bílkovin, při kterém nedochází k jejich denaturaci, je např. vysolování síranem amonným nebo chloridem sodným. K vysrážení bílkoviny dojde zvýšením iontové síly roztoku, která vede ke ztrátě hydratačního obalu koloidních částic a jejich následné agregaci. Přidáním vody (snížením iontové síly) lze získat zpět roztok nativní bílkoviny. Globuliny se z roztoku srážejí při polovičním nasycení síranem amonným, albumin při úplném nasycení. POZOR! Pro důkazy používejte vždy maximálně 1 ml vzorku! Do zkumavky odměřte 2 ml séra a 2 ml nasyceného roztoku síranu amonného (výsledný roztok je právě polovičně nasycený roztok síranu amonného), dobře promíchejte. Po promíchání vzniká zákal, který po 5 min přejde ve sraženinu globulinů. Malé množství zakaleného roztoku odlijte do čisté zkumavky, pomalu přidávejte vodu a pozorujte, jak se zákal opět rozpouští. Sraženinu globulinů z původní zkumavky odfiltrujte. K filtrátu přidávejte pevný síran amonný, který se po úplném nasycení roztoku přestane rozpouštět. Z roztoku se začne vylučovat albumin, jehož sraženinu po 5 mín odfiltrujte. Reakcí s kyselinou sulfosalicylovou vyzkoušejte, zda jsou ve filtrátu ještě přítomny bílkoviny (viz Bílkoviny I, úloha 3.2.). Sraženinu albuminu dejte i s filtrem do kádinky s destilovanou vodou (asi 5 ml). V 1 ml vzniklého roztoku dokažte bílkoviny reakcí s kyselinou sulfosalicylovou. Poznámky; 82

83 NUKLEOVÉ KYSELINY I Klíčová slova: purinové a pyrimidinové báze, nukleosidy, nukleotidy, degradace purinových nukleotidů, kyselina močová, alantoin. Reagencie: 1. orcinolové činidlo (1 g orcinolu v 500 ml HCl 300 g/1+ 4 až 5 ml FeCl g/1) 2. floroglucinolové činidlo (0,5 g floroglucinolu ve 100 ml konc. HCl) 3. koncentrovaný roztok amoniaku 4. roztok molybdenanu amonného v kyselině dusičné (7,5 g molybdenanu amonného ve 100 ml H 2 O ml HNO g/1) 5. AgNO 3 2 mol/l 6. Discheho činidlo (1 g difenylaminu ve 2,5 ml konc. kyseliny sírové se doplní do 100 ml kyselinou octovou ledovou) 7. kyselina močová 8. roztok hydroxidu sodného 2 mol/l!žíravina! 9. roztok hydroxidu lithného 0,5 mol/l 10. roztok chloridu amonného 1 mol/l 11. zředěná kyselina chlorovodíková 1:1 12. vzorek krevního séra 13. vzorek moče 14. souprava Kyselina močová (Biosystems): a) pracovní roztok: fosfát 100 mmol/l, detergent 1,5 g/l, dichlorfenolsulfonát 4 mmol/l, urikasa >0,12 U/ml, ascorbátoxidasa >50 U/ml, peroxidasa >1U/mol, 4-aminoantipyrin 0,5 mmol/l, ph 7,8 b) standard 83

84 ÚLOHA 1. Důkaz složek nukleových kyselin Štěpné produkty nukleových kyselin vzniklé hydrolýzou je možné dokázat speciálními reakcemi, a to purinové báze jako nerozpustné stříbrné soli, kyselinu fosforečnou molybdenanem amonným jako nerozpustný žlutý fosfomolybdenan amonný a pentosu (ribosu nebo deoxyribosu) reakcí s orcinolem, floroglucinolem nebo difenylaminem. Pentosy vytvářejí po odštěpení molekuly vody silnou kyselinou 2-furaldehyd, který s uvedenými látkami dává barevné kondenzáty Důkaz purinových bází 1,5 ml kyselého hydrolyzátu RNA zneutralizujte přidáním 0,4 ml NaOH. Přidejte 1 ml koncentrovaného amoniaku a 8 10 kapek AgNO 3. Nerozpustné stříbrné soli purinových bází se vysráží jako bílá amorfní sraženina. Vlivem světla barva sraženiny se může měnit do hnědé až černé Důkaz pentos Reakce s orcinolem: Do zkumavky odlijte 1 ml orcinolového činidla a zahřejte do varu s 5 6 kapkami hydrolyzátu RNA. Za 2 3 minuty vznikne zelené zabarvení, které přísluší ribose Reakce s floroglucinolem: 1ml roztoku floroglucinolu zahřejte s 0,5 ml hydrolyzátu RNA. Vznikne červené zabarveni, jež přísluší ribose Reakce s difenylaminem: K 1 ml kyselého hydrolyzátu DNA přidejte 2 ml Discheho činidla. Protřepejte a zahřívejte 10 min ve vroucí vodní lázni. Vzniklé modré zabarvení dává deoxyribosa. 84

85 1.3. Důkaz fosfátu K 0,5 ml kyselého hydrolyzátu RNA nebo DNA přidejte stejný objem roztoku molybdenanu amonného v kyselině dusičné a zahřejte ve vodní lázni. Vytvoří se žlutá sraženina fosfomolybdenanu.amonného. Poznámky: 85

86 ÚLOHA 2. Kyselina močová Rozpustnost kyseliny močové a jejich solí Kyselina močová (2,6,8-trihydroxypurin), hlavní produkt degradace purinových bází u primátů, je vylučována močí. Purinové jádro zůstává tedy během degradačního procesu intaktní. Kyselina močová je látka nepatrně rozpustná ve vodě (25 mg/l při 18 C). Vůči bázím projevuje vlastnosti slabé dvojsytné kyseliny s hodnotami pk A = 5,4 a 10,3 při 25 C. Rozpustnost kyseliny močové se asi dvacetkrát zvýší v alkalických roztocích, v důsledku tvorby alkalických solí - urátů (viz Vlastnosti a reakce funkčních skupin biochemicky významných organických sloučenin, úloha 3.1.). Nejvíce rozpustný je urát lithný. Na rozdíl od běžných amonných solí je naopak urát amonný velmi málo rozpustný. Do tří zkumavek dejte vždy velmi malé množství kyseliny močové a 1 ml vody, protřepejte. Většina látky zůstane nerozpuštěna. Do první zkumavky přidejte 1 ml roztoku hydroxidu sodného. Do druhé zkumavky přidejte 1 ml koncentrovaného vodného roztoku amoniaku. Do třetí zkumavky přidejte I ml roztoku hydroxidu lithného. Porovnejte rozpustnost vznikajících solí. Obsah zkumavky s urátem lithným rozdělte na dvě části. K prvé části přikapávejte roztok chloridu amonného a pozorujte vylučování málo rozpustného urátu amonného. Druhý díl urátu lithného pomalu okyselujte přikapáváním zředěné kyseliny chlorovodíkové a pozorujte srážení kyseliny močové. Poznámky: 86

87 ÚLOHA 3. Stanovení kyseliny močové v séru a v moči Zvýšená koncentrace kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) může být důsledkem její zvýšené tvorby (včetně zvýšeného přísunu potravou), zvýšeného rozpadu buněk (maligní procesy, leukémie) nebo jejího sníženého vylučování ledvinami. Hyperurikémie může vést k ukládání málo rozpustných krystalů kyseliny močové do tkání a kloubů (dna). Kyselina močová a její soli jsou také často součástí močových sedimentů a konkrementů. Kyselina močová se oxiduje kyslíkem za katalýzy enzymem urikasou na peroxid vodíku a alantoin. Vzniklý peroxid vodíku se stanovuje oxidační kopulací s dichlorfenolsulfonátem a 4-aminoantipyrinem katalyzovanou enzymem peroxidasou. Pro stanovení koncentrace kyseliny močové v séru a moči obdržíte vzorek séra a moče pacienta označeného číslem a M- muž nebo Ž žena: S = sérum U = moč (připojen údaj o diuréze)!pozor! VZOREK MOČE ZŘEĎTE PŘED STANOVENÍM 10x. VÝSLEDEK PAK VYNÁSOBTE 10x! Do očíslovaných zkumavek napipetujte reagencie dle tabulky 1. Vzorky a standard zpracujte v tripletu, slepou zoušku pouze jednou. Tabulka 1. reagencie(ml) vzorek S vzorek U standard slepý vzorek sérum 0.05 moč zředěná 10x! 0.05 standardní roztok 0.05 destilovaná voda 0.05 pracovní roztok Všechny zkumavky nechte stát 10 min při pokojové teplotě ve tmě (laboratorní stůl). Do 60 min změřte absorbance vzorků a standardu proti slepé zkoušce při vlnové délce 500 nm. Naměřené hodnoty zapište do tabulky č.2. 87

88 Tabulka 2. vzorek č.: absorbance průměr c (µmol/l) standad sérum moč VYHODNOCENÍ: Tabulka 3. urikémie (µmol/l) vzorek č. REFERENČNÍ HODNOTY NAMĚŘENÉ HODNOTY množství vyloučené močí (mmol/24 hod) muži: ženy: ,2 Poznámky: 88

89 NUKLEOVÉ KYSELINY II Klíčová slova: biopolyméry, DNA, RNA, nukleoproteiny, vysolování. Reagencie: 1. Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega: a) Cell Lysis Solution b) Nuclei Lysis Solution c) Protein Precipitation Solution 2. isopropanol 3. 70% ethanol 4. redestilovaná voda (ddh 2 O) 89

90 ÚLOHA 1. Izolace genetického materiálu Prvním krokem molekulárně-biologických analýz je izolace genetického materiálu DNA a RNA. Práce s genetickým materiálem přináší některé zvláštní aspekty. Detekcí dědičných, charakteristik genetického materiálu konkrétního jedince se získávají velmi citlivá osobní data, se kterými je nutné zacházet náležitým způsobem. Na rozdíl od většiny biochemických vyšetřeni, která jsou dynamickým obrazem aktuálního dění v těle vyšetřované osoby, vyšetření genetického materiálu přináší informace o neměnných charakteristikách jedince, nebo i celých rodin. Izolace DNA Izolaci genomové DNA lze provést z libovolného materiálu obsahujícího jaderné buňky. Nejčastěji je genomová DNA izolována z periferní nesrážlivé krve, kde se nachází v leukocytech. Při izolaci DNA z tkání je nejprve nezbytné rozrušit tkáň na jednotlivé buňky (tento krok odpadá při izolaci DNA z krve / kostní dřené nebo buněčné suspenze), lyzovat cytoplazmatickou a jadernou membránu buněk a uvolnit DNA z nukleoproteinových komplexů. DNA se následně z roztoku vysráží pomocí isopropanolu nebo ethanolu. Sražená DNA se po vysušení rozpustí v redestilované vodě. Pro izolaci genomové DNA použijeme Wizard Genomic DNA Purification Kit firmy Promega). Izolace probíhá ve čtyřech krocích: 1. lýza erythrocytů pomocí Cell Lysis Solutio 2. lýza leukocytů a jejich jader pomocí Nuclei Lysis Solution 3. precipitace proteinů účinkem Protein Precípitation Solution 4. vysrážení DNA isopropanolem Práce s genetickým materiálem klade vysoké nároky na přesnost a čistotu laboratorních postupů. Základem většiny analýz nukleových kyselin je amplifikace cílového úseku DNA/cDNA. Amplifikace znamená zmnožení cílové sekvence v řádech Z tohoto důvodu je nezbytné zachovávat přísně sterilní podmínky (práce v rukavicích, sterilní roztoky, sterilní zkumavky, špičky), aby analyzovaný genetický materiál nebyl kontaminován cizorodou DNA (např. jiným vzorkem), nebo DNA z "vnějšího prostředí". 90

91 Izolace DNA z bukální sliznice Dnes se pro molekulárně genetické vyšetření stále častěji používá stěru z bukální sliznice, který je zcela neínvazivní a je snadno proveditelný i neodborníkem. Pro izolaci se používají výše uvedené reagenční systémy. Vzorky bukální sliznice získejte stěrem buněk bukálni sliznice krouživým pohybem pomocí speciální stěrky Před odběrem si vypláchněte ústa vodou. Doporučená doba mezi odběrem a posledním příjmem potravy je nejméně 10 min. Stěrku vložte do 2 ml zkumavky s 300 µl Nuclei Lysis Solution a 10 µl Proteinasy K, ulomte horní část stěrky. Zkumavku protřepejte na vortexu a inkubujte 15 min při 65 C. Centrifugujte 1 minutu při ot./min (maximální rychlost). Supernatant odpipetujte do nové 1,5 ml zkumavky, roztok je viskózní. Připipetujte 100 µl Protein Precipitation Solutíon a ihned intenzívně zvortexujte 20 s. Centrifugujte 3 minuty maximální rychlostí. Opatrně odpipetujte supernatant obsahující DNA do čisté eppendorfky. Pelet se zkumavkou vyhoďte. K supernatantu přidejte 300 µl isopropanolu a zkumavku opatrně obracejte, dokud neuvidíte formující se sraženinu DNA. Centrifugujte 4 min maximální rychlostí. Na dně je viditelný pelet DNA. Supernatant opatrné slijte do odpadní kádinky tak, abyste nevylili pelet a osušte ústí eppendorfky na filtračním papíru. K peletu připipetujte 300 µl 70% ethanolu. Eppendorfku několikrát jemně převraťte pro omytí peletu. Centrifugujte 1 min maximální rychlostí. Supernatant opatrně slijte do odpadní kádinky. Osušte opatrně vnitřek eppendortky filtračním papírem srolovaným pomocí pinzety do ruličky tak, abyste se nedotkli peletu. Otevřenou eppendorfku otočte dnem vzhůru a nechte stát na stole, dokud se neodpaří zbytky ethanolu (cca 10 minut). K peletu DNA připipetujte 40 µl redestilované H 2 O. Zkumavku uzavřete a jemně zvortexujte Opatřete zkumavku přiděleným číslem a odevzdejte praktikovému asistentovi. Izolovaná DNA se uchovává při 4 C pro další analýzy. Poznámky: 91

92 NUKLEOVÉ KYSELINY III Klíčová slova: nukleové kyseliny, DNA, integrita, spektrofotometrie absorpční maximum, gelová elektroforéza. Reagencie: 1. vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol) 2. TAE pufr ( Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l) 3. 2,5% agarosový gel v 1 x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium) 4. redestilovaná H 2 O (ddh 2 O) 92

93 ÚLOHA 1. Stanovení koncentrace a čistoty nukleových kyselin Pro další analýzy je nutné určit koncentraci izolované nukleové kyseliny a ověřit její čistotu a kvalitu - integritu (neporušenost). Koncentrace nukleových kyselin se určuje spektrofotometricky. Nukleové kyseliny absorbují v důsledku přítomnosti dusíkatých bází v ultrafialové oblasti spektra s absorpčním maximem při 260 nm. Pro určení koncentrace vycházíme z toho, že při měření v 1 cm kyvetě je optická denzita: 1 OD 260 nm dsdna = 50 µg ml -1 1 OD 260 nm RNA = 40 µg ml -1 1 OD 260 nm ssdna = 33 µg ml -1 Vzhledem k tomu, že izolované nukleové kyseliny mohou být často kontaminovány proteiny, které dosahují absorpčních maxim při 280 nm, provádíme při stanovení koncentrace nukleových kyselin i vyhodnocení poměru OD 260 nm/280 nm. Tento poměr by u čistého roztoku DNA měl dosahovat hodnot kolem 1,8. K ověření integrity nukleové kyseliny slouží gelová elektroforéza. Elektroforézu lze provádět v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Výběr gelové matrice záleží na délce analyzované nukleové kyseliny. Pro běžné analýzy DNA používáme agarosový gel, který je schopen separovat DNA fragmenty od 100 bp do 20 kbp. Pro fragmenty kolem 100 bp a kratší a pro analýzy proteinů používáme gely založené na bázi akrylamidu. Určení velikostí analyzované DNA/RNA se provádí porovnáním s velikostním standardem DNA/RNA o známé délce fragmentů. Pro vizualizaci dvouřetězcových nukleových kyselin se užívá eihidiumbromid - interkalační činidlo, které se vmezeřuje mezi planárně orientované báze DNA/RNA spojené vodíkovými můstky (obr. 5.). Po prosvětlení gelu UV světlem emituje ethidiumbromid viditelné jasně oranžové světlo v místech jeho vysoké koncentrace, tedy v místech, kde se nachází DNA. Obr. 5. Vizualizace nukleových kyselin pomocí ethidiumbromidu. Pro vizualizaci dvouřetězcové i jednořetězcové DNA nebo RNA v agarosových i polyakrylamidových gelech lze místo mutagenního ethidiumbromidu použít fluorescenčního barviva GelRed, které má navíc i vyšší citlivost. 93

94 1.1. Měření koncentrace DNA Měření na spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) Zvedněte vzorkové rameno přístroje a pipetou (0 2 µl) naneste na dolní měřící plošku 1 µl vzorku DNA (viz obr.) Přiklopte vzorkové rameno a na obrazovce počítače odečtěte koncentraci vzorku DNA a poměr její čistoty 260/280 nm. Před dalším měřením obě měřící plošky otřete čtverečkem buničiny Měření na spektrofotometru Jenway Genova Zkumavku se vzorkem DNA krátce promíchejte na vortexu a zcentrifugujte. Do sterilní označené 0,5 ml eppendorfky napipetujte 190 µl redestilovné H 2 O a přidejte 10 µl DNA. Promíchejte na vortexu a zcentrifugujte při ot/min. Do spektrofotometrické 100 µl mikrokyvety odměřte 100 µl roztoku DNA a změřte OD 260 nm a OD 280 nm. Výsledek zapište do tabulky 1. Z mikrokyvety odsajte pipetou zpět 100 µl roztoku DNA. Vypočítejte koncentraci DNA podle vzorce: cdna [µg/ml] = OD 260 nm x 50 x ředění Vyhodnoťte čistotu DNA pomocí poměru OD260 nm/280 nm. 94

95 Tabulka 1. vzorek č. OD 260 nm OD 280 nm µg/ml OD 260 nm/280 nm 1.2. Kontrola integrity DNA elektroforézou v agarosovém gelu Vzorek smíchaný s vzorkovým pufrem se nanáší do jamek v agarosovém gelu umístěného v elektroforetické vaně obsahující lx TAE pufr. Vzorkový pufr obsahuje glycerol, který je zde proto, aby při pipetování vzorku klesal vlivem zvýšené hustoty roztok analyzované DNA na dno jamky. Barevná komponenta ve vzorkovém pufru je směs dvou barev bromfenolové modři a xylencyanolu a slouží pro vizuální kontrolu migrace molekul v průběhu elektroforézy. Bromfenolová modř se pohybuje stejnou rychlostí jako dsdna o velikosti 300 bp, kdežto xylencyanol jako dsdna dlouhá 4 kb. Pohyb molekul DNA v gelu ve stejnosměrném elektrickém poli (7 V/cm délky gelu) závisí nepřímo na logaritmu délky DNA fragmentů. Do označené 0,2 ml eppendorfky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 3 µl vaší DNA. Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte při ot/min. Naneste celý objem vzorku (6 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně s 1 x TAE pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva) s vaším vzorkem DNA. Připojte elektroforetickou vanu na zdroj el. proudu (cca 100 V). Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu. Vyjměte gel a zkontrolujte jej pod UV světlem. Poznámky: 95

96 NUKLEOVÉ KYSELINY IV Klíčová slova. genetický kód, polymerasová řetězová reakce - PCR, RT-PCR, real-time PCR, polymorfismus, bodové mutace, apolipoprotein E, restrikční enzymy, rekogniční místo, restrikční fragmenty, palindrom, fragmenty s kohezními a tupými konci, izoschizomery, gelová elektroforéza, ethidiumbromid. Reagencie: 1. mastermix [obsahuje 1 U Faststart Taq DNA Polymerase (Roche), 2,5 µl 10x PCR buffer, 2,5 µl 50x dtp (2,5 mm každého] 2. restrikční mix (APOE) : 10x restrikční pufr s MgCl 2, bovinní sérový albumin v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy HhaI), 3. restrikční mix (BRCA I): 10x restrikční pufr s MgCl 2, bovinní sérový albumin v koncentraci 1 µg/µl a 0,25 U restrikční endonukleasy Ddel), 4. vzorkový pufr (0,25% bromfenolová modř, 0,25% xylencyanol, 30% glycerol) 5. TAE pufr (Tris- acetát 0,04 mol/l, EDTA 0,001 mol/l) 6. 2,5% agarosový gel v 1x TAE obsahující GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium) 96

97 PCR polymerasová řetězová reakce Podstatou PCR je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3 OH-konce směřují proti sobě. Jako primery se obvykle používají dva uměle připravené krátké oligonukleotidy o délce bází, odvozené z koncových sekvencí DNA určených k amplifikaci. Podmínkou pro jejich syntézu je znalost sekvence studované nukleové kyseliny. Primery ohraničující amplifikovanou oblast, slouží jako iniciátory polymerační reakce a jsou DNA polymerasou prodlužovány ve směru 5 3. Provedení vlastní PCR trvá přibližně 2 hodiny a kompletní analýza prováděná například pro diagnostické účely obvykle nepřesáhne 48 hodin. Podle typu výchozího templátu rozeznáváme dvě varianty polymerasové řetězové reakce: DNA-PCR a RNA-PCR (reverzní PCR, RT-PCR). Obě metody nacházejí široké uplatnění ve výzkumu i v klinické diagnostice. DNA-PCR DNA-PCR je určena pro selektivní amplifikaci vybraných úseků DNA in vitro. Principem metody je amplifikace cílových úseků DNA vymezených primery mnohonásobným opakováním cyklů PCR (Tab. 1.). Každý cyklus tvoří 3 periody: 1. tepelná denaturace cílové DNA 2. vazba primerů hybridizací ("annealing") s jednořetězcovýmitempláty 3. extenze (elongace) primerů pomocí termostabilní DNA-polymerasy. Tabulka 1. PERIODA REAKČNÍ PODMÍNKY teplota čas 1. CYKLUS 1. ÚVODNÍ DENATURACE C 3-10 min 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) C sec 3. EXTENZE POLYMERACE 72 C sec CYKLUS 1. DENATURACE C sec 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) C sec 3. EXTENZE POLYMERACE 72 C sec POSLEDNÍ CYKLUS 1. DENATURACE C sec 2. VAZBA PRIMERŮ (annealing) C sec 3. EXTENZE POLYMRACE 72 C 3-10 min 4. OCHLAZENÍ 5 C dle potřeby První cyklus PCR má vždy prodlouženou denaturační fázi a poslední cyklus fázi polymerační. Účelem je účinná aktivace termostabilní polymerasy a terminální elongace produktu PCR. Původně se používala jako polymerační enzym termolabilní DNA-polymerasa I z E. coli, která se však inaktivuje vysokou teplotou (94 C) v denaturační periodě. Enzym se 97

98 proto musel znovu přidávat v každém cyklu. Problém odstranilo zavedení termostabilní DNA-polymerasy, Taq DNA-polymerasy, izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Enzym je aktivní při teplotách C, má také 5 3 exonukleasovou aktivitu, postrádá však 3 5 exonukleasovou aktivitu. Polymerační rychlost je 2-4 kbp/min.v současné době se používají rekombinantní enzymy. Cílový úsek molekuly DNA je po tepelné denaturaci vymezen dvěma oligonukleotidovými primery, které hybridizují s komplementárními sekvencemi na okrajích studovaného segmentu (jeden je komplementární k "+" vláknu a druhý k "-" vláknu DNA). Primery nesmí obsahovat vzájemně komplementární úseky a jim odpovídající sekvence se musí v analyzované DNA vyskytovat pouze v jediné kopii. Ideální primery by měly mít přibližně shodné zastoupení pyrimidinových a purinových bází. Koncentrace primerů a teplotní podmínky pro jejich nasednutí (annealing) na templát se pohybují v rozmezí C (podle zastoupení nukleotidů v primeru). Teplotní optimum pro prodlužování (elongaci primerů se v závislosti na nukleotidovém složení templátu obvykle pohybuje mezi C. K prodlužování primeru dochází již během jeho asociace s templátem, což je důležité pro stabilizaci vznikajícího hybridu. Primery musí být vzhledem ke koncentraci amplifikované DNA přítomny v reakční směsi v nadbytku. Obr. 1. První 3 cykly klasické PCR. Jelikož produkty každého cyklu PCR slouží zároveň jako templáty pro následující cykly, narůstá každým opakováním počet kopií amplifikované oblasti exponenciálně (2 n ). Po třetím cyklu jsou produkovány převážně řetězce, jejichž délka odpovídá úseku DNA ohraničenému 98

99 primery. Většinou postačuje cyklů, během nichž se může specifická sekvence amplifikovat teoreticky až krát Automatické opakování jednotlivých cyklů umožňují speciální programovatelné a procesorem řízené termostaty, tzv. PCR-termocyklery (obr.2), ve kterých lze dosáhnout přesně definovaných změn inkubačních teplot během krátkých intervalů (s rychlostí změny přibližně 1 C/sec). Délka amplifikovaných úseků činí většinou několik desítek, set bází až 10 kb, za speciálních podmínek lze dosáhnout až 47 kb. Současně se vzorky provádí tzv. negativní kontrola (kompletní reakční směs bez templátu). Amplifikované úseky DNA se nejčastěji analyzují elektroforeticky v agarosovém gelu a zviditelňuje se ethidiumbromidem nebo fluorescenčním barvivem GelRed. K průkazu bodových mutací v produktu PCR slouží elektroforéza v gradientu denaturující látky a sekvenování. RNA-PCR (RT-PCR) Obr. 2. MJ Research PTC-100 Thermal Cycler Techniku PCR lze rovněž použít při analýzách RNA-molekul, zejména při studiu expresní aktivity genu a průkazu RNA virů, např. viru hepatitidy C (HCV, VHC). Reverzní transkriptasová PCR se může provádět dvěma způsoby: 1. Dvoukroková RT-PCR a) Dvouzkumavková, dvoukroková RT-PCR b) Jednozkumavková, dvoukroková RT-PCR 2. Jednokroková, jednozkumavková RT PCR Pro RT-PCR se používají reverzní transkriptasy viru ptačí myeloblastosy (Avian myeloblastosis virus - AMV) nebo Moloneyové viru myší leukemie (např. Moloney murine leukemia virus - M-MLV). Při dvojkrokové, dvouzkumavkové RT-PCR (obr. 3) se používají dva polymerační systémy, jeden s reverzní transkriptasou v jedné zkumavce a druhým je klasická PCR s termostabilní DNA-polymerasou ve druhé. V první zkmavce se pomocí reverzní transkriptasy nasyntetizuje jednovláknová komplementární DNA (cdna) při použití oligodt nebo random hexanukleotidů jako primerů. Druhým krokem v další zkumavce, po přidání ekvivalentního množství cdna z předchozí reverzní reakce a dvou sekvenčně specifických primerů, je amplifikace cdna klasickou PCR. Jednokroková RT PCR se provádí v jednom systému obsahujícím oba enzymy, reverzní 99

100 transkriptasu i termostabilní DNA polymerasu. Reakce se provádí nejprve při teplotě 55 C a je syntetizováná cdna, potom nastupuje klasická PCR. Schéma RT PCR ukazuje obr. 3. Uplatnění PCR v klinické diagnostice Obr. 3. Schéma RT PCR PCR umožňuje přímo identifikovat v infikovaném biologickém materiálu přítomnost velmi malých množství DNA virových nebo bakteriálních patogenů. Proto nachází široké uplatnění v rychlé mikrobiologické a virologické diagnostice u řady infekčních onemocnění, zejména těch, jejichž původci se obtížně nebo zdlouhavě kultivují (chlamydie, mykobakterie, Treponema pallidum, legionelly, virů hepatitidy B a C, lidského papilomového viru HPV, HIV atd.). PCR a následná analýza amplifikovaných sekvencí jsou důležité při identifikaci osob v kriminalistice, při potvrzování rodičovství v paternitních sporech a při typizaci biologického materiálu (DNA-fingerprinting). Výhodou je potřeba minimálního množství biologického materiálu (postačující je jediný vlas, kapka krve, spermatu, potu či slin atd.). Vzhledem k vysoké stabilitě DNA lze amplifikaci a analýzu provádět i ve vzorcích, jejichž stáří může dosahovat tisíců let (antropologické, paleoantropologicé i paleozoologické studie). V onkologii slouží PCR k detekci mutací některých genů, u nichž se předpokládá vztah k maligní transformaci buňky. Detekcí tzv. minimálního rezidua nádorové choroby prokázat přetrvávání nádorové choroby po provedené terapii. U hematologických maligních onemocnění se PCR a RNA-PCR uplatňuje zejména při zjišťování chromosomových translokací (např. translokace mezi chromosomy 9 a 22 u chronické myeloidní leukemie - Philadelphský chromosom). Širokého uplatnění dosáhla PCR v prenatální diagnostice dědičných onemocnění, kde poskytuje přímou informaci o eventuálním postižení plodu. Významně časově zkrátila detekci bodových mutací, které jsou častou příčinou těchto chorob. Materiálem pro izolaci DNA jsou buňky amniové tekutiny nebo choriových klků a cirkulující fetální DNA v maternální krvi. Pomocí PCR lze také z minimálního počtu buněk amplifikovat sekvence DNA 100

101 specifické pro pohlaví plodu. Markerem chromosomu Y je repetitivní sekvence Hae 3,4. Přehled využití PCR v základním výzkumu i klinické diagnostice ukazuje tabulka 3. Tabulka 3. Základní výzkum Aplikovaný genetický výzkum Klinické disciplíny Ostatní izolace genů nebo jejich částí Detekce mutací v genech detekce patogenních bakterií, virů, prvoků a hub archeologie sekvenace lidského genomu studium polymorfismu genů typizace patogenních mikroorganismů kriminalistika (identifikace jedince) mutageneze in vitro, modifikace konců DNA populační genetika identifikace onkogenů soudnictví (určení otcovství) analýza klonů z genových knihoven typizace nádorů příprava značených sond diagnostika dědičných metabolických chorob stanovení pohlaví prenatální diagnostika dědičných chorob Převzato z Jan Šmarda a kolektiv, Metody molekulární biologie. 101

102 Real-time PCR (R-T PCR) Základem real-time PCR je klasická PCR se 2 primery, ale s fluorescenční sondou, což umožňuje kontinuálně monitorovat přírůstky amplikonů během každého cyklu (u klasického PCR se detekuje až finální produkt). Amplifikace a detekce produktu se provádí buď ve skleněných či polykarbonátových kapilárách, mikrozkumavkách nebo mikrodestičkách s jamkami ve speciálních termocyklerech, které umožňují snímat a kvantifikovat fluorescenci v každém cyklu. Obr. 3. Lightcycler 2.0 Real-time PCR umožňuje kvantifikovat DNA nebo pomocí RT-PCR RNA. Základní podmínkou je přítomnost fluorescenční sondy, která se váže na syntetizované amplikony a úroveň detekované fluorescence pak odráží množství vytvořené nukleové kyseliny. Data jsou sbírána během celého PCR procesu ve speciálních "termocyklerech" s optikou umožňující excitaci sondy a následnou detekci fluorescence v každém kapiláře nebo jamce a vyhodnocení speciálním softwarem. Základní schéma excitace a detekce fluorescence je na obr. 3. Základní schéma Lightcycleru 2.0 Roche, včetně optické detekční jednotky je na obr. 4. Obr. 3. Základní schéma excitace a detekce fluorescence. Excitační laserový paprsek prochází vzorkem s fluorescenční sondou a emituje fluorescenční světlo, které je snímáno a vyhodnocováno fluorometrickým analyzátorem. 102

103 Obr. 4. Funkční schéma Lightcycleru 2.0 Roche. Levá část ukazuje vzduchový termocykler s kapiláramy se vzorkem a pravá část optickou měřící jednotku. Fluorescenční sondy používané v real-time PCR se dělí do dvou základních skupin: 1. nespecifické - barviva vázající se nespecificky na dvouvláknovou strukturu DNA jako je SYBR Green nebo LC Green (Obr. 5A); 2. specifické - oligonukleotidové sondy, které hybridizují s amplikonem PCR. Fungují na principu FRET (fluorescence resonance energy transfer) mezi fluorescenčním barvivem (fluorofor - F nebo R) a zhášečem (quencher - Q): a) TaqMan, neboli duální hydrolyzující sondy (Obr. 5B) v tomto případě nárůst fluorescenční aktivity je způsoben zvýšením vzdálenosti mezi molekulou R a Q po rozštěpení navázané sondy polymerasou 103

104 Obr. 5. Nespecifická sonda SYBR Green (A). Specifická hydrolyzující sonda Taqman (B) b) Hybridizační FRET sondy Roche (obr. 6 A, B, C) se sestávají ze dvou různě značených sond. Jedna je značená na 5 -konci excitačním barvivem a druhá emitorovým, fluorescenčním barvivem. Fluorescence nastává po dokonalém a těsném nasednutí obou sond barvivy proti sobě. Fluorescence se snímá při teplotě nasednutí primerů (annealingu). Tento typ sondy umožňuje prokazovat polymorfismy na základě změny Tm. Obr. 6 A. Diagram dvou značených sond užívaných ve FRET systému. Oligo 1 je donorová molekula a Oligo 2 je receptor. B. Fluorescence emitovaná ve FRET systemu. Oligo 1 je donorová molekula a Oligo 2 je receptor. C. Oligo 1 a 2 jsou dostatečně těsné, aby přenesly světelnou energii k akceptorové molekule, která potom fluoreskuje. 104

105 c) Molekular Beacons neboli molekulární majáky (obr. 7) obsahují vlásenkovou, komplementární strukturu a smyčku tvořenou sondou. Na 3 -konci vázán reporter (fluorogen), případně přes tzv. bloker, a na 5 -konci zhášeč. Obr. 7. Molekulární majáková sonda (molecular beacon probe). Ve vlásenkové formě, nevázané na cílové sekvencce amplikonů je sonda fluorescenčně neaktivní, při denaturaci dojde k rozvolnění vlásenkové struktury. Při reasociační teplotě (annealingu) dojde k hybridizaci sondy smyčkou s amplikony, dokonalému oddálení reportéru a zhášeče a emisi fluorescence. d) Škorpionové primer-sondy (Scorpion probe) jsou bifunkční molekuly, ve kterých je primer kovalentně vázán k sondě (obr. 8). Molekuly také obsahují fluorofor a zhášeč. V nepřítomnosti cílu, zhášeč téměř úplně absorbuje fluorescenci emitovanou fluoroforem. Během škorpionové PCR ve fázi annealingu v přítomnosti cílové molekuly se separují fluorofor a zhášeč, což vede k vzestupu fluorescenční emise. Fluorescence pak může být detekovaná a měřená v reakční zkumavce. Na rozdíl od TaqManu, FRET hybridizačních sond a molekulárních majáků, reakce škorpionové primer-sondy, je reakce vedoucí ke tvorbě signálu monomolekulární, vzhledem k tomu, že sonda je kovalentně spojena s primerem. 105

106 Obr. 8. Funkce škorpion primer-sondy. Po jednom cyklu PCR se kompletuje extenze primeru sondy a nově syntetizovaná cílová oblast se připojí k témuž řetězci jako sonda. Při následujícím druhém cyklu, denaturace a annealing, hybridizují sonda a cíl na elongovaném primeru. Denaturace vlásenkové smyčky vyžaduje méně energie, než tvorba nové duplexní DNA. Následně, vlásenková struktura hybridizuje k části nově tvořeného produktu PCR, což vede k separaci fluoroforu od zhášeče a vzniku emise světla. Využití real-time PCR Real-time PCR na rozdíl od klasické PCR má daleko širší využití: detekce a identifikace patogenů (bakterií, hub, virů i parazitů např. detekce a kvantifikace cirkulující DNA Plazmodia falciparum.) kvantifikace bakteriální a virové nálože diferenciální genová exprese pomocí reverzní real-time PCR, zejména v onkologii při zjišťování exprese genů asociovaných s nádorovým onemocněním monitorování minimální nádorové choroby, jak na úrovni DNA cirkulujících nádorových buněk, tak na úrovni exprimované RNA monitorování efektivity léčby 106

107 SNP genotypizace, resp. zjišťování mutací (např. zjišťování polymorfismu ApoE, FVL Lydenské mutace faktoru V, faktoru I protrombinu, methylentetrahydrofolátreduktasy 677 a 1298 methylace DNA validace RNA pro DNA čipy detekce nepříznivého výsledku transplantace analýza genetických chorob cystické fibrosy, fenylketonurie, thalassemie, hemofilie, srpkovité anemie a favismu neinvazivní prenatální diagnostika analysou fetální DNA v mateřské plazmě. detekce potravinových a environmentálních patogenů forenzní studie identifikace jedince, zjišťování paternity (otcovství) 107

108 ÚLOHA 1. Analýza známých polymorfismů a častých mutací pomocí PCR s restrikčním štěpením a real-time PCR Pro detekci známých polymorfismů a bodových mutací se často využívá amplifikace studovaného úseku DNA pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) s následnou restrikční analýzou, tj. rozštěpení fragmentu zkoumaného genu enzymem restrikční endonukleázou, který má schopnost rozeznat a rozštěpit specifickou sekvenci DNA. Protože restrikční analýza je volena tak, aby restrikční reakce zasahovala místo polymorfní sekvence, změna této sekvence vede k vytvoření nebo naopak k zániku restrikčního místa. Produkty restrikční reakce jsou následně separovány na agarosovém (případně polyakrylamidovém) gelu. Vizualizace se provádí obarvením DNA fragmentů ethidiumbromidem. Cílem praktického cvičení je genotypizace genu APOE u pacientů s hyperlipidémií a/nebo hypercholesterolémií a obezitou nebo detekce specifické mutace genu BRCA Analýza alel genu APOE Gen APOE je lokalizován na 19 chromosomu (19q13.2). Protein ApoE (apolipoprotein E) je exprimován v řadě tkání. Je součástí lipoproteinových komplexů remnantních částic chylomiker, HDL, IDL a LDL. ApoE je důležitou součástí pro receptory remnantních částic a HDL v jaterních buňkách. V remnantních částicích chylomiker a IDL resp. LDL se objevuje ApoE sekundárně; během intravazální interakce těchto lipoproteinů s částicemi HDL. V exonu 3 genu APOE se nacházejí polymorfní lokusy, které vytvářejí tři alely, označované jako ε2, ε3 a ε4 (tabulka 1). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou nukleotidu 3932 (kodon 130) a/nebo nukleotidu 4070 (kodon 176). V obou případech se jedná o záměnu C za T na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To znamená, že se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cystein (C) nebo triplet CGC, kodující arginin (R). Tabulka 1. Alela Aminokyselina 130 Aminokyselina 176 ε2 TGC (C) TGC (C) ε3 TGC (C) CGC (R) ε4 CGC (R) CGC (R) V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací jednotlivých alel. Nejčastější je výskyt homozygotní alely ε3. Tato alela znamená expresi plně funkčního proteinu ApoE. Vzhledem k tomu, že záměna C za T vede ke změně tripletu kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze předpokládat, že jednotlivé sekvenční varianty genu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad na strukturní a funkční charakteristiky výsledného proteinu ApoE, který se podílí na 108

109 rozpoznání remnantních chylomiker a LDL částic jejich receptory (záměna Cys za Arg je záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu). U normálních osob jsou zbytky chylomiker a LDL částice rychle odstraňovány z cirkulace receptorem zprostředkovanou endocytózou především v hepatocytech. Při onemocnění familiální dysbetalipoproteinemii nebo hypolipoproteinémii typu III se setkáváme se zvýšenou plazmatickou hladinou cholesterolu a triacylglycerolů, která je důsledkem poruchy clearance remnantních chylomiker a LDL na základě defektu apolipoproteinu E. Akumulace lipoproteinových komplexů v cirkulaci způsobuje vznik xantomů a předčasné aterosklerózy koronárních a/nebo periferních tepen se všemi závažnými klinickými důsledky (angina pectoris, akutní infarkt myokardu, apod) v mladém věku. Většina pacientů s familiální dysbetalipoproteinemií jsou homozygoti ε2/ ε2. Osoby s alelou ε4 jsou ohroženy zvýšeným rizikem vzniku Alzheimerovy choroby (nejčastější forma demence v dospělé populaci; progresivní neurodegenerativní onemocnění CNS). LOCUS HUMAPOE bp DNA linear PRI 09-NOV-1994 DEFINITION Human apolipoprotein E (epsilon-4 allele) gene, complete cds. ACCESSION M10065 J03053 J03054 KEYWORDS Alu repeat; allelic variation; apolipoprotein; apolipoprotein E; lipoprotein; repeat region; very low density lipoprotein. SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 5515) AUTHORS Das,H.K., McPherson,J., Bruns,G.A., Karathanasis,S.K. and Breslow,J.L. TITLE Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the human apolipoprotein E gene JOURNAL J. Biol. Chem. 260 (10), (1985) MEDLINE PUBMED ggaacttgat gctcagagag gacaagtcat ttgcccaagg tcacacagct ggcaactggc 61 agacgagatt cacgccctgg caatttgact ccagaatcct aaccttaacc cagaagcacg 121 gcttcaagcc ctggaaacca caatacctgt ggcagccagg gggaggtgct ggaatctcat 181 ttcacatgtg gggagggggc tcctgtgctc aaggtcacaa ccaaagagga agctgtgatt 241 aaaacccagg tcccatttgc aaagcctcga cttttagcag gtgcatcata ctgttcccac 301 ccctcccatc ccacttctgt ccagccgcct agccccactt tctttttttt ctttttttga 361 gacagtctcc ctcttgctga ggctggagtg cagtggcgag atctcggctc actgtaacct 421 ccgcctcccg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc caagtagcta ggattacagg 481 cgcccgccac cacgcctggc taacttttgt atttttagta gagatggggt ttcaccatgt 541 tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctt aagtgattcg cccactgtgg cctcccaaag 601 tgctgggatt acaggcgtga gctaccgccc ccagcccctc ccatcccact tctgtccagc 661 cccctagccc tactttcttt ctgggatcca ggagtccaga tccccagccc cctctccaga 721 ttacattcat ccaggcacag gaaaggacag ggtcaggaaa ggaggactct gggcggcagc 781 ctccacattc cccttccacg cttggccccc agaatggagg agggtgtctg tattactggg 841 cgaggtgtcc tcccttcctg gggactgtgg ggggtggtca aaagacctct atgccccacc 901 tccttcctcc ctctgccctg ctgtgcctgg ggcaggggga gaacagccca cctcgtgact 961 gggctgccca gcccgcccta tccctggggg agggggcggg acagggggag ccctataatt 1021 ggacaagtct gggatccttg agtcctactc agccccagcg gaggtgaagg acgtccttcc 1081 ccaggagccg gtgagaagcg cagtcggggg cacggggatg agctcagggg cctctagaaa 1141 gagctgggac cctgggaagc cctggcctcc aggtagtctc aggagagcta ctcggggtcg 1201 ggcttgggga gaggaggagc gggggtgagg caagcagcag gggactggac ctgggaaggg 1261 ctgggcagca gagacgaccc gacccgctag aaggtggggt ggggagagca gctggactgg 1321 gatgtaagcc atagcaggac tccacgagtt gtcactatca ttatcgagca cctactgggt 1381 gtccccagtg tcctcagatc tccataactg gggagccagg ggcagcgaca cggtagctag 1441 ccgtcgattg gagaacttta aaatgaggac tgaattagct cataaatgga acacggcgct 1501 taactgtgag gttggagctt agaatgtgaa gggagaatga ggaatgcgag actgggactg 1561 agatggaacc ggcggtgggg agggggtggg gggatggaat ttgaaccccg ggagaggaag 1621 atggaatttt ctatggaggc cgacctgggg atggggagat aagagaagac caggagggag 1681 ttaaataggg aatgggttgg gggcggcttg gtaaatgtgc tgggattagg ctgttgcaga 109

110 1741 taatgcaaca aggcttggaa ggctaacctg gggtgaggcc gggttggggg cgctgggggt 1801 gggaggagtc ctcactggcg gttgattgac agtttctcct tccccagact ggccaatcac 1 M K V L W A A L L V T F L A G 1861 aggcaggaag ATGAAGGTTC TGTGGGCTGC GTTGCTGGTC ACATTCCTGG CAGgtatggg tccgtccttc TACTTCCAAG ACACCCGACG CAACGACCAG TGTAAGGACC GTCcataccc 1921 ggcggggctt gctcggttcc ccccgctcct ccccctctca tcctcacctc aacctcctgg 1981 ccccattcag acagaccctg ggccccctct tctgaggctt ctgtgctgct tcctggctct 2041 gaacagcgat ttgacgctct ctgggcctcg gtttccccca tccttgagat aggagttaga 2101 agttgttttg ttgttgttgt ttgttgttgt tgttttgttt ttttgagatg aagtctcgct 2161 ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcggg atctcggctc actgcaagct ccgcctccca 2221 ggtccacgcc attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg ggactacagg cacatgccac 2281 cacacccgac taactttttt gtattttcag tagagacggg gtttcaccat gttggccagg 2341 ctggtctgga actcctgacc tcaggtgatc tgcccgtttc gatctcccaa agtgctggga 2401 ttacaggcgt gagccaccgc acctggctgg gagttagagg tttctaatgc attgcaggca 2461 gatagtgaat accagacacg gggcagctgt gatctttatt ctccatcacc cccacacagc 2521 cctgcctggg gcacacaagg acactcaata catgcttttc cgctgggccg gtggctcacc 2581 cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggaggat cacttgagcc caggagttca 2641 acaccagcct gggcaacata gtgagaccct gtctctacta aaaatacaaa aattagccag 2701 gcatggtgcc acacacctgt gctctcagct actcaggagg ctgaggcagg aggatcgctt 2761 gagcccagaa ggtcaaggtt gcagtgaacc atgttcaggc cgctgcactc cagcctgggt 2821 gacagagcaa gaccctgttt ataaatacat aatgctttcc aagtgattaa accgactccc 2881 ccctcaccct gcccaccatg gctccaaaga agcatttgtg gagcaccttc tgtgtgcccc 2941 taggtagcta gatgcctgga cggggtcaga aggaccctga cccgaccttg aacttgttcc 16 C Q A K V E Q A V E T E P E P E L R 3001 acacaggatg CCAGGCCAAG GTGGAGCAAG CGGTGGAGAC AGAGCCGGAG CCCGAGCTGC tgtgtcctac GGTCCGGTTC CACCTCGTTC GCCACCTCTG TCTCGGCCTC GGGCTCGACG 34 Q Q T E W Q S G Q R W E L A L G R F W D 3061 GCCAGCAGAC CGAGTGGCAG AGCGGCCAGC GCTGGGAACT GGCACTGGGT CGCTTTTGGG CGGTCGTCTG GCTCACCGTC TCGCCGGTCG CGACCCTTGA CCGTGACCCA GCGAAAACCC 54 Y L R W V Q T L S E Q V Q E E L L S S Q 3121 ATTACCTGCG CTGGGTGCAG ACACTGTCTG AGCAGGTGCA GGAGGAGCTG CTCAGCTCCC TAATGGACGC GACCCACGTC TGTGACAGAC TCGTCCACGT CCTCCTCGAC GAGTCGAGGG 74 V T Q E L R 3181 AGGTCACCCA GGAACTGAGg tgagtgtccc catcctggcc cttgaccctc ctggtgggcg TCCAGTGGGT CCTTGACTCc actcacaggg gtaggaccgg gaactgggag gaccacccgc 3241 gctatacctc cccaggtcca ggtttcattc tgcccctgtc gctaagtctt ggggggcctg 3301 ggtctctgct ggttctagct tcctcttccc atttctgact cctggcttta gctctctgga 3361 attctctctc tcagctttgt ctctctctct tcccttctga ctcagtctct cacactcgtc 3421 ctggctctgt ctctgtcctt ccctagctct tttatataga gacagagaga tggggtctca 3481 ctgtgttgcc caggctggtc ttgaacttct gggctcaagc gatcctcccg cctcggcctc 3541 ccaaagtgct gggattagag gcatgagcac cttgcccggc ctcctagctc cttcttcgtc 3601 tctgcctctg ccctctgcat ctgctctctg catctgtctc tgtctccttc tctcggcctc 3661 tgccccgttc cttctctccc tcttgggtct ctctggctca tccccatctc gcccgcccca 3721 tcccagccct tctcccccgc ctccccactg tgcgacaccc tcccgccctc tcggccgcag agggtcggga agagggggcg gaggggtgac acgctgtggg agggcgggag agccggcgtc 80 A L M D E T M K E L K A Y K S E L E E Q 3781 GGCGCTGATG GACGAGACCA TGAAGGAGTT GAAGGCCTAC AAATCGGAAC TGGAGGAACA CCGCGACTAC CTGCTCTGGT ACTTCCTCAA CTTCCGGATG TTTAGCCTTG ACCTCCTTGT 100 L T P V A E E T R A R L S K E L Q A A Q 3841 ACTGACCCCG GTGGCGGAGG AGACGCGGGC ACGGCTGTCC AAGGAGCTGC AGGCGGCGCA TGACTGGGGC CACCGCCTCC TCTGCGCCCG TGCCGACAGG TTCCTCGACG TCCGCCGCGT 110

111 120 A R L G A D M E D V R G R L V Q Y R G E 3901 GGCCCGGCTG GGCGCGGACA TGGAGGACGT GCGCGGCCGC CTGGTGCAGT ACCGCGGCGA CCGGGCCGAC CCGCGCCTGT ACCTCCTGCA CGCGCCGGCG GACCACGTCA TGGCGCCGCT 140 V Q A M L G Q S T E E L R V R L A S H L 3961 GGTGCAGGCC ATGCTCGGCC AGAGCACCGA GGAGCTGCGG GTGCGCCTCG CCTCCCACCT CCACGTCCGG TACGAGCCGG TCTCGTGGCT CCTCGACGCC CACGCGGAGC GGAGGGTGGA 160 R K L R K R L L R D A D D L Q K R L A V 4021 GCGCAAGCTG CGTAAGCGGC TCCTCCGCGA TGCCGATGAC CTGCAGAAGC GCCTGGCAGT CGCGTTCGAC GCATTCGCCG AGGAGGCGCT ACGGCTACTG GACGTCTTCG CGGACCGTCA 180 Y Q A G A R E G A E R G L S A I R E R L 4081 GTACCAGGCC GGGGCCCGCG AGGGCGCCGA GCGCGGCCTC AGCGCCATCC GCGAGCGCCT CATGGTCCGG CCCCGGGCGC TCCCGCGGCT CGCGCCGGAG TCGCGGTAGG CGCTCGCGGA 200 G P L V E Q G R V R A A T V G S L A G Q 4141 GGGGCCCCTG GTGGAACAGG GCCGCGTGCG GGCCGCCACT GTGGGCTCCC TGGCCGGCCA CCCCGGGGAC CACCTTGTCC CGGCGCACGC CCGGCGGTGA CACCCGAGGG ACCGGCCGGT 220 P L Q E R A Q A W G E R L R A R M E E M 4201 GCCGCTACAG GAGCGGGCCC AGGCCTGGGG CGAGCGGCTG CGCGCGCGGA TGGAGGAGAT CGGCGATGTC CTCGCCCGGG TCCGGACCCC GCTCGCCGAC GCGCGCGCCT ACCTCCTCTA 240 G S R T R D R L D E V K E Q V A E V R A 4261 GGGCAGCCGG ACCCGCGACC GCCTGGACGA GGTGAAGGAG CAGGTGGCGG AGGTGCGCGC CCCGTCGGCC TGGGCGCTGG CGGACCTGCT CCACTTCCTC GTCCACCGCC TCCACGCGCG 260 K L E E Q A Q Q I R L Q A E A F Q A R L 4321 CAAGCTGGAG GAGCAGGCCC AGCAGATACG CCTGCAGGCC GAGGCCTTCC AGGCCCGCCT GTTCGACCTC CTCGTCCGGG TCGTCTATGC GGACGTCCGG CTCCGGAAGG TCCGGGCGGA 280 K S W F E P L V E D M Q R Q W A G L V E 4381 CAAGAGCTGG TTCGAGCCCC TGGTGGAAGA CATGCAGCGC CAGTGGGCCG GGCTGGTGGA GTTCTCGACC AAGCTCGGGG ACCACCTTCT GTACGTCGCG GTCACCCGGC CCGACCACCT 300 K V Q A A V G T S A A P V P S D N H * 4441 GAAGGTGCAG GCTGCCGTGG GCACCAGCGC CGCCCCTGTG CCCAGCGACA ATCACTGAac 4501 gccgaagcct gcagccatgc gaccccacgc caccccgtgc ctcctgcctc cgcgcagcct 4561 gcagcgggag accctgtccc cgccccagcc gtcctcctgg ggtggaccct agtttaataa 4621 agattcacca agtttcacgc atctgctggc ctccccctgt gatttcctct aagccccagc 4681 ctcagtttct ctttctgccc acatactgcc acacaattct cagccccctc ctctccatct 4741 gtgtctgtgt gtatctttct ctctgccctt tttttttttt tagacggagt ctggctctgt 4801 cacccaggct agagtgcagt ggcacgatct tggctcactg caacctctgc ctcttgggtt 4861 caagcgattc tgctgcctca gtagctggga ttacaggctc acaccaccac acccggctaa 4921 tttttgtatt tttagtagag acgagctttc accatgttgg ccaggcaggt ctcaaactcc 4981 tgaccaagtg atccacccgc cggcctccca aagtgctgag attacaggcc tgagccacca 5041 tgcccggcct ctgcccctct ttctttttta gggggcaggg aaaggtctca ccctgtcacc 5101 cgccatcaca gctcactgca gcctccacct cctggactca agtgataagt gatcctcccg 5161 cctcagcctt tccagtagct gagactacag gcgcatacca ctaggattaa tttggggggg 5221 ggtggtgtgt gtggagatgg ggtctggctt tgttggccag gctgatgtgg aattcctggg 5281 ctcaagcgat actcccacct tggcctcctg agtagctgag actactggct agcaccacca 5341 cacccagctt tttattatta tttgtagaga caaggtctca atatgttgcc caggctagtc 5401 tcaaacccct ggctcaagag atcctccgcc atcggcctcc caaagtgctg ggattccagg 5461 catgggctcc gagcggcctg cccaacttaa taatattgtt cctagagttg cactc 111

112 Vysvětlivky: Kódující sekvence s exony je vyznačena jako dsdna Sekvence aminokyselin je vyznačena nad kódující sekvencí v jednopísmenkovém kódu. Sekvence signálního peptidu (AA 1 18) je označena kurzívou. Sekvence primerů jsou označeny podtrženě a kurzívou Rekogniční místa HhaI jsou vyznačena v tmavých rámečcích (šedě nepolymorfní místa, černě místa možných polymorfismů CGC->TGC (C->R) Sekvenci genů naleznete na stránkách serveru NCBI (National Center for Biotechnology Information) v databázi nukleotidů ( PCR amplifikace fragmentu exonu 3 genu APOE Sterilní 0,2 ml PCR zkumavku si na víčko označte uvedeným způsobem: např. A10; A je amplifikace APOE, 10 je číslo vaší DNA. Do zkumavky napipetujte reakční směs dle tabulky 1: mastermix, 15 pmol každého ze dvou primerů, 200 ng vaší DNA a doplňte ddh 2 0 na celkový objem 20µl. Tabulka 1. reakční směs (µl) mastermix* 10 primer 1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3' (5 µm) 2 primer 2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3' (5µM) 2 DNA ( mg/ml) ddh 2 0 ad 20 µl konečný objem 20 Reakční směs zvortexujte a krátce zcentrifugujte. Zkumavku vložte do bloku cykleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program apo-e 112

113 Elektroforéza PCR produktu Označte sterilní 0,2 ml eppendorfku, na víčko dle instrukcí (např. AR10; AR je restrikce APOE, 10 je číslo vaší DNA) Do zkumavky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 6 µl vašeho PCR produktu. Zvortexujte a krátce zcentrifugujte. Naneste celý objem vzorku (9 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně s pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva). Po nanesení všech vzorků připojte vanu na zdroj stejnosměrného proudu (7V/cm). Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu. Vyjměte gel a proveďte vyhodnocení po skupinách pod UV světlem Restrikční analýza PCR APOE Označte 0,2ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní 6 µl restrikční směsi a 6 µl svého PCR produktu. Zvortexujte a krátce centrifugujte. Umístěte zkumavku do bloku cycleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program restrikce. Inkubujte 2 hod při 37 C Elektroforéza restrikční reakce produktu PCR APOE Označte 0,2 ml eppendorfku na víčko číslem svého PCR produktu. Napipetujte do ní 3 µl modrého vzorkového pufru a 6 µl neštěpeného PCR produktu. Do zkumavky s restrikční reakcí (12 µl) přidejte 3 µl nanášecího pufru. Obě zkumavky protřepejte na vortexu a krátce centrifugujte. Naneste celý objem vzorků (9 µl a 15 µl) na dno dvou sousedních jamek v agarosovém gelu umístěném ve vaně s pufrem (1. jamka neštěpený PCR produkt; 2. jamka produkt po restrikci). Zaznamenejte čísla jamek (zleva) a vašich vzorků. Po nanesení všech vzorků aplikujte stejnosměrný proud (7V/cm). Elektroforézu ukončete po 40 minutách. Vyjměte gel a vyhodnoťte jej po skupinách pod UV světlem. 113

114 Detekce alel genu ApoE pomocí real-time PCR Další možností detekce alel genu ApoE, mnohem rychlejší a elegantnější, je real-time PCR. V našem případě budeme používat systém Lightcycler s fluorescenčními FRET hybridizujícími sondami a analýzou T m, která nám umožní odečet polymorfismů. Reagencie: ApoE ToolSet pro LightCycler Genes-4U (ApoE E2/E3/E4, kodony 112 Cys/Arg a 158 Cys/Arg) 1. Obsah testovací soupravy Lahvička Označení Obsah Množství ApoE-16 1, Červené víčko OligoTool lyofilizované Pro 16 testů oligonukleotidy pro PCR obsahuje detekci Rozpuštěno: 50 µl mutace a kotvící sondu, primery 2, Zelené víčko Kontrola (Control) lyofilizovaná ApoE E2/E4 HET Rozpuštěno: 20 µl 3, Modré víčko Rozpouštědlo (Solvent) 4, Žluté víčko DMSO Pozor dráždivé! Může se absorbovat kůží! DNA k rozpuštění OligoTool / Control - PCR přísada pro oblasti bohaté na GC (GC rich) 1000 µl rozpouštědla 100 µl DMSO Kontrola:E2 / E4 heterozygtní kontrolní DNA, lyofilizovaná (= Cys112Arg / Cys158Arg kombinovaný heterozygot 114

115 Připravte si tři sterilní 0,2 ml zkumavky, jednu označte na víčko písmenem A a číslem vaší DNA, druhou zkumavku, pro vzorek kontrolní pozitivní DNA, označte ACP, třetí zkumavku pro negativní kontrolu, označte ACN. Napipetujte do zkumavek reakční směs dle tabulky: Činidlo Kontrola pozitivní µl Kontrola negativní µl Vzorek µl OligoTool ApoE-16, rozpuštěný 1,4 1,4 1,4 Rozpouštědlo ApoE-16 4,0 4,0 4,0 MgCl 2 25 mm 0,6 (koneč. 2,5 mm) 0,6 (koneč. 2,5 mm) DMSO (žluté víčko) 1,0 1,0 1,0 Master Hybridization Probes 10x 1,0 1,0 1,0 Celková reakční směs 8,0 8,0 8,0 Kontrolní ApoE E2/E4 HET 16 2,0 Rozpouštědlo ApoE-16 2,0 Vaše DNA 2,0 CELKOVÝ OBJEM 10,0 10,0 10,0 0,6 (koneč. 2,5 mm) Promíchejte na vortexu a krátce zcentrifugujte zkumavky při ot/min. Přepipetujte obsah zkumavek do kapilár a kapiláry umístěte do karuselu Lightcycleru. Aktivujte příslušný program Denaturace Programová data cyklu Hodnota Cykly 1 Analytický mód Žádný Teplotní cíle Segment 1 Cílová teplota ( C) 95 Inkubační doba (s) 60 Temperature Transition Rate ( /s) 20 Sekundární cílová teplota ( C) 0 Velikost kroku ( C) 0 Krok zdržení (cycly) 0 Akviziční mod Žádný 115

116 Amplifikace Programová data cyklu Hodnota Cykly 60 Analytický mód None Teplotní cíle Segment 1 Segment 2 Segment 3 Cílová teplota ( C) Inkubační doba (s) Temperature Transition Rate ( /s) Sekundární cílová teplota ( C) Velikost kroku ( C) Krok zdržení (cycly) Akviziční mód Žádný Single Žádný Analýza křivky tání Chlazení Programová data cyklu Hodnota Cykly 1 Analytický mod Křivky tání Teplotní cíle Segment 1 Segment 2 Segment 3 Cílová teplota ( C) Inkubační doba (s) Temperature Transition Rate ( /s) ,2 Sekundární cílová teplota ( C) Velikost kroku ( C) Krok zdržení (cykly) Akviziční mód Žádný Žádný Kontinuální Programová data cyklu Hodnota Cykly 1 Analytický mód Žádný Teplotní cíle Segment 1 Cílová teplota ( C) 40 Inkubační doba (s) 30 Temperature Transition Rate ( /s) 20 Sekundární cílová teplota ( C) 0 Velikost kroku ( C) 0 Krok zdržení (cykly) 0 Akviziční mód Žádný LC programová verze a mód fluorescenčního zobrazení Vyvinuto s LC programovou verzí 3.5 s automatickou kontrolou nárůstu. Pro odečet použijte F2 a F3 s kompenzací barvy color compensatiom (povinné!). 116

117 Typické výsledky a vyhodnocení Užití programu křivky tání k zjišťování genotypu vzorků lidské genomové DNA. Vrcholy křivky tání umožňuje diskriminace mezi možnými genotypy kodónu 112 a 158 polymorfismy v genu ApoE. Obr. 1 ukazuje typický výsledek získaný s ApoE ToolSet pro LightCycler : Obr. 1: Analýza křivky tání genotypů kodónů 112 a 158 genu ApoE. MODRÁ: Homozygoti Arg112Arg (vlevo) a Arg158Arg (vpravo) ZELENÁ: Oddělený heterozygot Cys112Arg / Cys158Arg = ApoE E2 / E4 HET kontrola obsažená v soupravě ToolSet. ČERVENÁ: Homozygoti Cys112Cys (vlevo) a Cys158Cys (vpravo) ČERNÁ: Žádná kontrolní DNA. Podmínky: Kompenzace barvy (Color Compensation). Pro konverzi křivky tání kodónu 112 / 158 do ApoE genotypů, použít následující tabulku: Tabulka 1: Konverze křivky tání kodónu 112 / kodonu 158 je výsledkem genotypu ApoE Genotyp E2/E2 (Cys/Cys) E3/E3 (Cys/Arg) E4/E4 (Arg/Arg) ANO: vrchol pozorovaný v indikované Tm ne: žádný vrchol není v indikované Tm Kodón 112 (LCRed 640, F2) Kodón 158 (LCRed 705, F3) T m C T m C T m C T m C ANO ne ANO ne ANO ne ne ANO ne ANO ne ANO Genotyp E2/E2 (Cys/Cys) E3/E3 (Cys/Arg) E4/E4 (Arg/Arg) E2/E3 ANO ne ANO ANO E2/E3 E2/E4 ANO ANO ANO ANO E2/E4 E3/E4 ANO ANO ne ANO E3/E4 Poznámka : Hodnoty pro odpovídající teploty tání se mohou lišit o +/- 2,5 C mezi různými experimenty. T mezi vrcholy tání pro různé genotypy se mohou lišit o +/- 0.5 C. 117

118 Další možnost určení sestavy Kombinováním výsledků Analýzy křivky tání ve fluorescenčním alelové kanálu 2 (F2) a fluorescenčním kanálu 3 (F3) může být určena alelová sestava analyzovaných vzorků. Genotyp kodónu 112 Genotyp kodónu 158 Alelová sestava TGC TGC E2 / E2 TGC CGC E3 / E3 CGC CGC E4 / E4 TGC CGC/TGC E2 / E3 CGC/TGC CGC/TGC E2 / E4 CGC/TGC CGC E3 / E4 118

119 1.2. Detekce specifické mutace genu BRCA 1 Gen BRCA1 byl lokalizován v roce 1990 a klonován v roce Nachází se na dlouhém raménku 17. chromozómu (17q21), kde zaujímá úsek o 81kbp. Obsahuje 24 exonů, z nichž 22 je kódujících (5592 nukleotidů). Produktem genu je jaderný protein o 1863 aminokyselinách. BRCA1 a blízce příbuzný gen BRCA2 jsou tumor supresorové geny kódující velké jaderné proteiny exprimované v průběhu pozdní G1 fáze a časné S fáze v mnoha tkáních. Proteinové produkty obou genů hrají významnou roli v procesech opravy poškozené DNA a rekombinace, kontroly buněčného cyklu a transkripce. Nosičky zárodečné mutace genu BRCA1 nebo BRCA2 mají vysoké riziko vzniku karcinomu prsu nebo vaječníků. Převážná většina karcinomů prsu a ovaria se vyskytuje u žen sporadicky, bez rodinného výskytu. Určitá část případů karcinomu prsu a ovaria (5-10 %) je však geneticky podmíněna (hereditární, někdy též familiární, karcinom). Většina hereditárních karcinomů prsu souvisí s přítomností alterací (mutací) predisponujících genů BRCA1 a BRCA2; toto onemocnění má autosomálně dominantní charakter přenosu. Příčinou predispozice k malignímu nádorovému onemocnění je přenos zárodečné mutace inaktivující jednu z alel odpovědného genu. V cílové tkáni vede pak následná genetická změna (např. ztráta) druhé intaktní alely k inaktivaci genu, která iniciuje tumorogenezi, např. v důsledku genomové nestability spojené se vznikem dalších mutací. V BRCA genech bylo odhaleno několik set různých patogenních mutací. Pro některé populace je typické, že spektrum detekovaných mutací je relativně úzké a jedna (nebo jen několik málo) mutací tvoří většinu objevených alterací. V České republice je nejčastější mutace (asi 40 % všech alterací) inzerce jednoho nukleotidu ve 20. exonu genu BRCA1 (5382insC). Mezi tři cytosiny v pozicích (počítáno podle referenční sekvence cdna genu BRCA1, kterou lze nalézt v databázi GenBank pod číslem U14680) je inzertován cytosin čtvrtý (mutace je podle nové nomenklatury označována také jako 5385dupC). Frekvence mutací genu BRCA1 v populaci je zhruba 1:800. Riziko vývoje karcinomu prsu dosahuje u nosičů těchto mutací více než 80 % ve věku do 70 let, u karcinomu ovaria více než 60 % do věku 70 let. Vysoké je i riziko druhostranného karcinomu prsu (více než 60 % do 70 let). Odhalení nosičů mutací jsou zařazeni do systému časné prevence malignit. Analýza mutace probíhá ve dvou krocích: nejprve se pomocí PCR zamplifikuje úsek genomové DNA obsahující 20. exon genu BRCA1. Následuje restrikce amplifikátu. Oblast, kde se ve 20. exonu nachází místo mutace (inzerce cytosinu), však není rozeznávána žádným restrikčním enzymem. Proto je pro analýzu nutné restrikční místo v PCR amplifikátu vytvořit uměle. Dosáhneme toho pomocí modifikovaného primeru: Jeden z primerů (BRC20-1) se v jednom nukleotidu liší od referenční sekvence amplifikovaného úseku. Tato inkomplementarita (mismatch), není překážkou pro nasednutí primeru a normální průběh PCR. Protože fragmenty vznikající při PCR reakci vždy obsahují primery, je sekvence každé nově syntetizované kopie cílové sekvence pozměněna. Tato jednonukleotidová změna vede v tomto případě v kombinaci s třemi cytosiny v pozicích ke vzniku místa rozeznávaného restrikční endonukleázou DdeI. Štěpena je však pouze nemutovaná sekvence, neboť inzerce dalšího cytosinu (v případě sekvence s mutací) způsobuje zánik rekogniční sekvence DdeI. Tato metoda se nazývá PCR-mediated site directed mutagenesis (PSM). Restrikční profil (velikost fragmentů vzniklých po rozštěpení PCR produktu endonukleasou a vizualizovaných ethidiumbromidem po elektroforéze v agarózovém gelu) je odlišný u jedince s hereditární mutací (jednou mutovanou alelou) a u jedince s oběma zdravými (wild type) alelami. 119

120 Níže je uvedena část genomové sekvence genu BRCA1 v oblasti exonu 20. Sekvence 20. exonu je zvýrazněna velkými písmeny a je zde uveden její příslušný proteinový překlad; primery jsou podtrženy. Všimněte si inkomplementarity (mismatch) sekvence forward primeru a normální sekvence exonu. Černě jsou zobrazeny sekvence rozeznávané a štěpené restrikční endonukleázou Dde I (rozeznávaná sekvence: CTNAG). LOCUS HUMBRCA bp DNA linear PRI 04-DEC-1996 DEFINITION Human BRCA1, Rho7 and vati genes, complete cds, and ipf35 gene, partial cds. ACCESSION L78833 VERSION L GI: KEYWORDS BRCA1 breast cancer susceptibility gene; ifp35 interferon induced gene; rho7 gene; vati homologue. SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to ) AUTHORS Smith,T.M., Lee,M.K., Szabo,C.I., Jerome,N., McEuen,M., TITLE Taylor,M., Hood,L. and King,M.C. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1 JOURNAL Genome Res. 6 (11), (1996) MEDLINE PUBMED ccatgttggt cagactggtg tcgaactcct gacctcaagt gatctgcctg cctcagt ctcccaaagt gctaggatta caggggtgag ccactgcgcc tggcctgaat gccttaaata tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 1732 H D F E V R G D V V N G R N H tgtttggttt ctttcagcat GATTTTGAAG TCAGAGGAGA TGTGGTCAAT GGAAGAAACC acaaaccaaa gaaagtcgta CTAAAACTTC AGTCTCCTCT ACACCAGTTA CCTTCTTTGG 1747 Q G P K R A R E S Q D R K CC AAAGCGAGCA AGAGAATCTC ACCAAGGTCC AAAGCGAGCA AGAGAATCCC AGGACAGAAA Ggtaaagctc cctccctcaa TGGTTCCAGG TTTCGCTCGT TCTCTTAGGG TCCTGTCTTT Ccatttcgag ggagggagtt gttgacaaaa atctcacccc accactctgt attccactcc cctttgcaga gatgggccgc caactgtttt tagagtgggg tggtgagaca taaggtgagg ggaaacgtct ctacccggcg ttcattttgt aagacttatt acatacatac acagtgctag atactttcac acaggttctt aagtaaaaca ttctgaataa tgtatgtatg tgtcacgatc tatgaaagtg tgtccaagaa ttttcactct tccatcccaa ccacataaat aagtattgtc tctactttat gaatgataaa aaaagtgaga aggtagggtt ggtgtattta ttcataacag agatgaaata cttactattt actaagagat ttagagaggc tgtgtaattt ggattcccgt ctcgggttca gatcttagct tgattctcta aatctctccg acacattaaa cctaagggca gagcccaagt ctagaatcga gataagtgga agagctggga ctttaagcag atgagaatct aaagactttg ctcttttcac ttcactgggg tgtctttctc tctctctctc ttgctctctc tctctctttt ttttttt... Níže je uvedena část mrna sekvence (resp. cdna) z 3 -konce transkriptu zdravé alely genu BRCA1 s příslušnou translací. Šedě je zvýrazněna sekvence 20. exonu. LOCUS HSU bp mrna linear PRI 10-JUN

121 DEFINITION Homo sapiens breast and ovarian cancer susceptibility (BRCA1) mrna, complete cds. ACCESSION U14680 VERSION U GI: SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 5711) AUTHORS Miki,Y., Swensen,J., Shattuck-Eidens,D., Futreal,P.A., Harshman,K., Tavtigian,S., Liu,Q., Cochran,C., Bennett,L.M., Ding,W., Bell,R., Rosenthal,J., Hussey,C., Tran,T., McClure,M., Frye,C., Hattier,T., Phelps,R., Haugen-Strano,A., Katcher,H., Yakumo,K., Gholami,Z., Shaffer,D., Stone,S., Bayer,S., Wray,C., Bogden,R., Dayananth,P., Ward,J., Tonin,P., Narod,S., Bristow,P.K., Norris,F.H., Helvering,L., Morrison,P., Rosteck,P., Lai,M., Barrett,J.C., Lewis,C., Neuhausen,S., Cannon-Albright,L., Goldgar,D., Wiseman,R., Kamb,A. and Skolnick,M.H. TITLE A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 JOURNAL Science 266 (5182), (1994) MEDLINE PUBMED REFERENCE 2 (bases 1 to 5711) AUTHORS Skolnick,M.H. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (14-SEP-1994) Mark H. Skolnick, Myriad Genetics Inc. and the University of Utah, 421 Wakara Way, Suite 201, Salt Lake City, UT 84108, USA AGCTATT TCTGGGTGAC CCAGTCTATT AAAGAAAGAA AAATGCTGAA TGAGCATGAT 1734 F E V R G D V V N G R N H Q G P K R A R 5341 TTTGAAGTCA GAGGAGATGT GGTCAATGGA AGAAACCACC AAGGTCCAAA GCGAGCAAGA 1754 E S Q D R K I F R G L E I C C Y G P F T 5401 GAATCCCAGG ACAGAAAGAT CTTCAGGGGG CTAGAAATCT GTTGCTATGG GCCCTTCACC 1774 N M P T D Q L E W M V Q L C G A S V V K 5461 AACATGCCCA CAGATCAACT GGAATGGATG GTACAGCTGT GTGGTGCTTC TGTGGTGAAG 1794 E L S S F T L G T G V H P I V V V Q P D 5521 GAGCTTTCAT CATTCACCCT TGGCACAGGT GTCCACCCAA TTGTGGTTGT GCAGCCAGAT 1814 A W T E D N G F H A I G Q M C E A P V V 5581 GCCTGGACAG AGGACAATGG CTTCCATGCA ATTGGGCAGA TGTGTGAGGC ACCTGTGGTG 1834 T R E W V L D S V A L Y Q C Q E L D T Y 5641 ACCCGAGAGT GGGTGTTGGA CAGTGTAGCA CTCTACCAGT GCCAGGAGCT GGACACCTAC 1854 L I P Q I P H S H Y * 5701 CTGATACCCC AGATCCCCCA CAGCCACTAC TGActgcagc cagccacagg tacagagccc 5761 aggaccccaa gaatgagctt acaaagtggc ctttccaggc cctgggagct cctctca

122 1.2.1.Amplifikace fragmentu BRCA1 exonu 20 s přilehlou intronovou sekvencí Pracovní postup Připravte si dvě sterilní 0,2 ml zkumavky, jednu označte na víčko písmenem B a číslem vaší DNA ( např. B10; B je amplifikace BRCA1, 10 je číslo vaší DNA), druhou zkumavku. pro vzorek kontrolní pozitivní DNA označte BC1. Do zkumavek napipetujte reakční směs dle tabulky 1: mastermix, 15 pmol každého ze dvou primerů, 200 ng vaší DNA (nebo pozitivní kontroly) a doplňte ddh 2 0 na celkový objem 20µl Tabulka 3. reakční směs mastermix* 10 primer BRC20-1: 5'-CCAAAGCGAGCAAGAGAATCTC-3' (5 µm) 2 primer BRC20-2: 5'-CGACACATTAAACCTAAGGG-3' (5µM) 2 DNA ( mg/ml) ddh 2 0 ad 20 µl konečný objem 20 Zvortexujte a krátce zcentrifugujte obě zkumavky. Umístěte zkumavky do bloku cycleru GeneAmp PCR System 2700 a aktivujte program 5382insC (µl) Elektroforéza PCR produktu Označte sterilní 0,2 ml eppendorfku, na víčko dle instrukcí (např. BR10; BR je restrikce BRCA1,, 10 je číslo vaší DNA). Do zkumavky napipetujte 3 µl modrého vzorkového pufru a 6 µl vašeho PCR produktu. Zvortexujte a krátce zcentrifugujte. Naneste celý objem vzorku (9 µl) na dno jamky v agarosovém gelu umístěném ve vaně s pufrem. Zaznamenejte si číslo jamky (zleva). Po nanesení všech vzorků připojte vanu na zdroj stejnosměrného proudu (7V/cm). Elektroforézu ukončete při vyputování bromfenolové modři z gelu. 122