Univerzita Karlova v Praze Pedagogická fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Bc. Štěpánka Štiková

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Pedagogická fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2015 Bc. Štěpánka Štiková

2 Univerzita Karlova v Praze Pedagogická fakulta Katedra biologie a environmentálních studií BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Lišejníky a jejich obsahové látky Lichenes and their methabolic compounds Bc. Štěpánka Štiková Vedoucí práce: PhDr. Petr Novotný, Ph.D. Studijní program: Specializace v pedagogice Studijní obor: Biologie, geologie a environmentalistika se zaměřením na vzdělávání - pedagogika 2015

3 ANOTACE Bakalářská práce je literární rešerší lišejníků vyskytujících se na území České republiky a sekundárních metabolitů lišejníků. Lišejníky se vyznačují produkcí velkého množství sekundárních metabolitů, z nichž většina je specifická pouze pro tyto organismy. Lichenologové běžně využívají tyto metabolity v odlišování jednotlivých druhů či rodů. Z tohoto důvodu pracují s celou řadou metod detekce lišejníkových látek. K nejvýznamnějším patří stélkové reakce, chromatografie a mikrokrystalizační testy. KLÍČOVÁ SLOVA Lišejník, stélka, sekundární metabolit, chemismus lišejníků, stélkové reakce, chromatografie ANNOTATION This bachelor thesis is a review of available literature about lichens of the Czech Republic and lichens secondary metabolites. Lichenes are characterized by the production of a large amount of secondary metabolites. Most of them are specific to these organisms. Lichenologists commonly use the metabolites to distinguish between phenotypically similar taxa. To achieve this aim, they use a plethora of detection methods, including spot reactions, chromatography, and microcrystalization tests. KEYWORDS Lichen, mycelium, secondary metabolites, chemistry of lichens, incuding spot reactions, chromatography

4 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Lišejníky a jejich obsahové látky vypracovala pod vedením vedoucího práce PhDr. Petra Novotného, Ph.D. samostatně za použití v práci uvedených pramenů a literatury. Dále prohlašuji, že tato práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Praze dne Štěpánka Štiková

5 Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu bakalářské práce PhDr. Petru Novotnému, Ph.D. za odborné vedení práce a za podporu, cenné rady, trpělivost a lidský přístup při jejím vytváření. Ráda bych poděkovala také své rodině, všem blízkým a přátelům, kteří mě při vytváření této práce podpořili, a bez jejichž pomoci by nebylo možné práci dokončit.

6 Obsah 1 ÚVOD LIŠEJNÍKY Vztah mykobionta a fotobionta Mykobiont Fotobiont Anatomická stavba Morfologie Růst Rozmnožování LIŠEJNÍKY V ČESKÉ REPUBLICE Kde najdeme lišejníky Významné lokality Lišejníky obecně se vyskytující v České republice SEKUNDÁRNÍ METABOLITY LIŠEJNÍKŮ Chemotaxonomie Sekundární metabolity Hlavní skupiny sekundárních metabolitů lišejníků Šikimátová metabolická dráha a biosyntéza fenylpropanoidů Biosyntetická dráha kyseliny mevalonové Acetyl-polymalonylová biosyntetická dráha DETEKCE LIŠEJNÍKOVÝCH LÁTEK Stélkové reakce a UV světlo Mikrokrystalizační testy Chromatografie Pigmenty a krystaly BIOLOGICKÁ AKTIVITA SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ VÝZNAM SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ Toxické sekundární metabolity DIDAKTICKÉ VYUŽITÍ SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ Sekundární metabolity v učebnicích Laboratorní práce stélkové reakce...43

7 9 ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÝCH INFORMAČNÍCH ZDROJŮ SEZNAM PŘÍLOH Příloha A metodický list k pracovnímu listu Příloha B - pracovní list...52

8 1 ÚVOD Lišejníky jsou neuvěřitelně zajímavé organismy. Lichenizované houby jsou lidem známé především jako citliví ukazatelé kvality životního prostředí, potrava sobů, jsou využívány v tradiční čínské medicíně, extrakt stélky je využíván v parfémech, případně pro někoho jako méně vítaní průkopníci života na střešních krytinách. Především jsou to však stále málo probádané komplexní organismy fungující díky spolupráci dvou partnerů. Nejčastěji vřeckovýtrusné houby (Ascomycetes), výjimečně stopkovýtrusné houby (Basidiomycetes) - mykobiont a zelené řasy či sinice - fotobiont (Liška 2000). Všeobecně známou schopností živých organismů je produkce primárních metabolitů, mezi něž patří např. aminokyseliny, sacharidy a fotosyntetické pigmenty. Produkují ale také řadu sekundárních metabolitů, čili látek, které zpravidla nejsou pro život jedince nezbytné, alespoň v krátkodobém měřítku. K těmto organickým sloučeninám patří alkaloidy, glykosidy a mykotoxiny (Stocker Wörgötter 2008). U lišejníků se můžeme setkat s velkým množstvím různých sekundárních metabolitů. V současné době se počet těchto látek s popsanou strukturou blíží číslu 1050 (Stocker Wörgotter 2008). Výjimečnost lišejníkových látek tkví v jejich obrovském taxonomickém významu, a tudíž v rutinním využívání metod jejich detekce. To je velký rozdíl oproti cévnatým rostlinám, mechorostům, nelichenizovaným houbám nebo řasám, kde se přítomnosti sekundárních metabolitů využívá pro určování taxonů jen ojediněle u vybraných skupin. Bakalářská práce je koncipována jako rešeršní studie rozvržená do dílčích kapitol. Pro uvedený účel byly vytyčeny základní cíle. Představit skupinu lišejníky, vedle nástinu lišejníků jako skupin představit lišejníky vyskytující se na území České republiky na základě dostupné literatury, definování sekundárních metabolitů, způsoby detekce sekundárních metabolitů a jejich začlenění do školní praxe. 8

9 2 LIŠEJNÍKY Lichenizované houby nejsou skupina taxonomická, ale skupina ekologická. Představují komplexní organismy, které jsou složené ze dvou komponent: složka houbová (mykobiont), ke které se vztahuje vědecké jméno lišejníků a složka řasová nebo sinicová (fotobiont, fykobiont či cyanobiont), jež má vlastní jméno. V lišejníkové stélce je obvykle převládající složkou mykobiont, která ve spojení s fotobiontem určuje i morfologický tvar stélky. Ve stélkách lišejníků se vyskytuje vcelku nízký počet fotobiontů, přibližně 100 druhů. Výjimečný je výskyt obou složek v rovnováze (Collema). Tvar stélky lišejníku může být určován vláknitým fotobiontem obklopeným hyfami mykobionta (Cystocoleus, Ephebe). Spojení obou komponent je velmi těsné a přesně determinované. Charakter soužití obou složek u lišejníků je velmi specifický (Kalina 2010). 2.1 Vztah mykobionta a fotobionta Každé soužití řasy (či sinice) a houby nelze považovat za lišejník. Na pojetí definice lišejníků existují různé názory. Hensen a Jahns (1974) považují za lišejníky organismy, které mají houbovou složku ve své výživě obligátně vázanou na určitou řasu (či sinici) a tvoří s ní morfologicko-fyziologickou jednotku. Tvorba specifických sloučenin a struktur nepohlavního rozmnožování nepředstavuje nutnou podmínku existence lišejníku. Podle této definice řadíme k lišejníkům i imperfektní lišejníky či stopkovýtrusné lichenizované houby, zcela shodné s nelichenizovanými typy morfologicky. Mezi lišejníky nepočítáme houby rostoucí náhodně společně s řasami, houby žijící saprofyticky nebo paraziticky na řasách ani iniciální a degenerační fáze lišejníkové stélky. Některé nepříliš těsné vztahy a vazby mezi určitými druhy hub a řas, které se projevují jako určitý typ symbiózy pouze v některých ontogenetických stádiích, jsou problémem pro hodnocení lišejníků. Mykofykobióza 1 lichenizace (Kalina 2010). je přijatelným počátkem 1 Jde o vztah řasy a houby, kdy není dokázán zjevný parazitismus houby, nevytváří se typická stélka lišejníků, obě komponenty si ponechávají svou typickou stélku (hnědá řasa Ascophyllum nodosum hostí houbu Mycosphaerella ascophylli) (Kalina 2010). 9

10 Styk mezi oběma složkami uvnitř lišejníku může být různý. Mykobiont i fotobiont někdy vedle sebe vegetují bez přímého kontaktu obou komponent. Běžněji jsou buňky fotobionta opleteny hyfami mykobionta, hyfy mykobionta vysílají haustoria přímo do odumřelých i živých buněk fotobionta. Fotobiont dodává celému organismu organické látky a mykobiont obstarává přísun vody a anorganických látek. Podstata této mutualistické symbiózy umožňuje osidlovat taková stanoviště, anorganické substráty, extrémně suchá stanoviště, která jsou pro obě složky zvlášť jinak nepřístupná (Kalina 2010). Mykobiont nemůže existovat delší dobu jen v podobě mycelia. Fotobiont se může vyskytovat v přírodě volně, až na několik specializovaných druhů, ale došlo k potlačení tvorby jeho zoospor a gamet ve stélce lišejníku (Dostál 2006). Vztah obou komponent nemá jednotný charakter, vzhledem k tomu, že lišejníky vznikly polyfyleticky, u různých skupin hub v různém stupni vývoje. Kromě mutualistické symbiózy, která je přínosem pro oba partnery, je u některých druhů prokázán i antagonistický parazitismus, kdy je fotobiont ve stavu ujařmení (helotismus), který vede od lokálních nekróz až k jeho odumření. U rodů Collema a Leptogium byl prokázán postupný rozpad kolonií fotobionta parazitujícím mykobiontem v určitých stádiích. Dalším typem vztahu obou složek je komenzalistický vztah, ve kterém má jeden partner ze soužití větší prospěch, ale nikoli za cenu újmy druhého partnera. Jiné možnosti vzájemného vztahu obou složek lišejníku předpokládají existenci endosaprotrofismu, tedy že mykobiont žije saprotroficky na odumřelých buňkách fotobionta (Schubert et al. 2005). 2.2 Mykobiont Mykobionty jsou většinou zástupci vřeckovýtrusných hub (Ascomycetes), v několika případech stopkovýtrusnou houbou (Basidiomycetes). Z nomenklatorického hlediska se k mykobiontům váže i vědecké jméno lišejníku. Rody, které zahrnují lichenizované a nelichenizované typy, jsou vzácné (Arthonia, Opegrapha, Thelocarpon) a nelichenizované typy těchto rodů jsou obvykle parazité lišejníkových stélek. Mitosporické houby (Deuteromycetes) jsou rovněž lichenizovány (rody Blarneya, Cystocoleus a Thamnolia). Lichenizace 10

11 u stopkovýtrusných hub je vzácná, na primitivní úrovni a pouze u hymenomycetoidních 2 typů. Převážná část lichenizovaných typů bazidiomycetů patří do rodu společně s nelichenizovanými typy (Multiclavula). Vzácné jsou samostatné rody lichenizovaných bazidiomycetů (Dictyonema, Lepidostroma). Nejsou známy samostatné čeledi a řády lichenizovaných bazidiomycetů. Všechny známé lichenizované bazidiomycety náleží do čtyř čeledí Thelephoraceae, Corticiaceae, Clavariaceae a Tricholomataceae (Kalina 2010). Každý druh lišejníku, charakterizovaný určitým typem stélky, je tvořen specifickým druhem mykobionta, vázaným na jeden druh fotobionta. Existují však výjimky, kdy stejný mykobiont je schopný vytvářet morfologicky odlišné lišejníkové stélky (fototypy či fotomorfy) nebo různé lišejníky s různými fotobionty. K vytvoření specifických výrůstků cefalodií (cefalopodií) na stélce lišejníku dojde, pokud se setká jeden mykobiont s dvěma nebo třemi kompatibilními fotobionty (Peltigera apathosa). Cefalodia tvoří sinice z rodu Nostoc a fotobiontem je řasa z rodu Coccomyxa. Jsou však známy i inverzní případy. Přítomností jiného druhu fotobionta u některých druhů rodu Sticta se vytváří i odlišný typ stélky (lupenitý, keříčkovitý). V jedné, morfologicky nijak neodlišené stélce lišejníku mohou být přítomni různý fotobionti (Schubert et al. 2005). 2.3 Fotobiont Asi v 8% případů jsou fotobionty lišejníků zástupci sinic patnáct rodů (Choococcus, Gloeocapsa, Nostoc, Scytonema, Stigonema aj.), v převážné většině jsou to ale zástupci zelených řas. Dvacettři rodů zelených řas (Coccomyxa, Myrmecia, Trentepohlia aj.); rod Trebouxia přítomný více než v polovině druhů lišejníků, se jako jediný nevyskytuje ve volné přírodě. Vzácně byly jako fotobionti zjištěny druhy Heteroccocus caespitosus (Xanthophyceae) u tří druhů rodu Verrucaria a Petroderma maculiforme (Phaeophyceae) a u jednoho druhu rodu Verrucaria. Samostatně se vyskytující druhy řas a sinic patří k převážné většině rodů fotobiontů (Kalina 2010). Téměř každý druh lišejníku je charakterizován jasným spojením určitého druhu mykobionta s určitým druhem fotobionta. Protože počet druhů fotobiontů vzhledem k počtu mykobiontů je nízký, určitý druh řasy (či sinice) může být fotobiontem většího množství druhů lišejníků. Takový fotobiont může vstupovat do asociace s větším množstvím mykobiontů, které 2 Hymenomycetoidní bazidie bazidie, jejíž bazidiospory jsou aktivně odvrhovány (balistospory) (Kalina 2010). 11

12 často patří k systematicky nepříbuzným skupinám. V přírodě tudíž může dojít k setkání několika mykobiontů s jedním fotobiontem, kdy každý takový mykobiont vytváří jiný druh lišejníku. Znamená to, že se spory jednoho mykobionta dostanou na již vytvořenou stélku jiného mykobionta s fotobiontem. V takovém případě může dojít k parasymbióze, při které jsou buňky fotobionta obklopeny novým mykobiontem. Výjimečně je likvidován mykobiont už existujícího lišejníku a převzat jeho fotobiont. Napadení Cladonia turgida mykobiontem Diploschistes scruposus je případ rozrušení celého lišejníku. Nejčastějším případem je parazitismus jedné houby (mykobionta) na již vytvořeném lišejníku, tzn. existence lichenikolních hub (přes 1000 známých druhů). Parazitovat mohou na lišejníkové stélce i mykobionti s vlastními fotobionty, tzv. lichenikolní lišejníky (asi druhů). Jestliže nově příchozí mykobiont není schopen vyprodukovat stélku s fotobiontem napadeného lišejníku, nedojde k žádné interakci a spory po vyklíčení odumřou (Kalina 2010). 2.4 Anatomická stavba Z anatomického hlediska rozlišujeme lišejníky homeomerické nebo heteromerické stavby stélky. Lišejníky s homeomerickou stélkou mají ve své stélce obě komponenty rovnoměrně rozptýleny. U lišejníků s heteromerickou stélkou bývá fotobiont lokalizován převážně v řasové vrstvě. Z hlediska morfologického tvoří lišejníky s homeomerickou stavbou stélky vláknitou nebo rosolovitou stélku, lišejníky se stavbou stélky heteromerickou vytvářejí korovitou, lupenitou nebo keříčkovitou stélku. Existují i přechody mezi jednotlivými typy nebo mohou vznikat u jednoho druhu stélky více typů (Schubert et al. 2005). Stélka heteromericky stavěných lišejníků se rozlišuje na několik jednotlivých vrstev: Korová vrstva Korová vrstva je tvořena izodiametrickými buňkami mykobionta vytvářejícími pseudoparenchymatickou tkáň. Zřídka je kůra tvořena protáhle válcovitými buňkami, které jsou orientovány kolmo k povrchu stélky (Endocarpon, Rocella) nebo paralelně s povrchem stélky (Alectoria, Usnea, Anaptychia). Kůra může být tvořena i rozvolněnými buňkami (Rocella) či může zcela scházet (Cladonia rangiferina). Korová vrstva je vytvořena pokaždé na svrchní straně, někdy i na spodní straně stélky lišejníku (Kalina 2010). 12

13 V kůře na spodní straně některých lišejníků (Sticta) vznikají nerovnoměrným růstem korové a dřeňové vrstvy specifické, morfologicky diferencované útvary. Jedná se o průlomy korovou vrstvou vyplněné bělavou dřeňovou tkání. Jsou významné ve výměně plynů a vodním režimu, nazýváme je cyfely. Pseudocyfely jsou průlomy představující pouze ztenčení nebo přerušení kůry. Jejich funkce je podobná jako u cyfel, ale jsou mnohem hojnější (Cetraria, Alectoria, Parmelia aj.), vyskytují se na svrchní i na spodní straně stélky (Kalina 2010). K postupnému odumírání vnější korové vrstvy dochází, u lišejníků se stálým tloustnutím stélky, odstředivým směrem. Náhradní korový paraplektenchym se vytváří bohatým větvením hyf ve svrchní řasové vrstvě. Fotobionti, kteří se nacházejí v povrchové části řasové vrstvy, odumírají, a proto je korová vrstva starších jedinců vždy vyplněna odumřelými buňkami fotobionta (Schubert et al. 2005). Řasová vrstva Dříve uváděna jako gonidiová vrstva, buňky fotobionta byly považovány za rozmnožovací částice analogické konidiím. Je tvořena oběma komponentami, fotobiontem i mykobiontem. Buňky mykobionta vytvářejí u většiny lišejníků intercelulární haustoria, která místně narušují buněčné stěny fotobiontů. Intracelulární haustoria vnikající do buněk fotobionta, kdy je často i usmrcují, vytvářejí lišejníky se slabě diferencovanou stélkou. U některých lišejníků (Peltigera) se netvoří haustoria, jelikož tenké buněčné stěny umožňují vzájemnou výměnu látek. Existují lišejníky, u kterých tvorba haustorií souvisí s ročním obdobím. Řasová vrstva může být odlišně silná (Schubert et al. 2005). Dřeňová vrstva Medulla je tvořena vzájemně propletenými, dlouhými hyfami, mezi kterými jsou dutiny. Pseudoparenchymatické struktury (Endocarpon, Dermatocarpon) se zde vyskytují zřídka. Vzácně bývá rozvolněná vrstva propletena tuhými hyfovými provazci (Usnea, Letharia). Část stélky bez fotobionta, která se nazývá prothalus, spojuje jednotlivé části stélky nebo je vytvořena na okrajích stélek (Kalina 2010). 2.5 Morfologie Morfologii stélky byl dříve přikládán velký význam. Vzhledem k dalším fylogeneticky podloženým znakům dnes ustupuje tento účel pro systematické členění druhů do pozadí. 13

14 Vegetativní stélka lišejníků vykazuje velkou variabilitu a stanovištní podmínky mohou působit pouze na vznik modifikací (Kalina 2010). Keříčkovité lišejníky Frutikózní lišejníky přisedají k substrátu pouze úzkou částí a bývají vystouplé. Jsou k nim počítány jen negativně geotropicky rostoucí druhy (Cetraria, Thamnolia). Vousovité lišejníky (Usnea, Bryoria) jsou větvené v radiálně stavěné vláknité útvary a visí směrem dolů nebo odstávají od podkladu (Kalina 2010). Lupenité lišejníky Foliózní lišejníky mají na okraji laločnatou stélku přirůstající k podkladu v jednom nebo několika místech a od podkladu ji lze oddělit. Rhiziny hojná příchytná vlákna najdeme na spodní straně lemované kůrou, což je nápadné u rodu Peltigera. Lišejníky přirůstající k podkladu v jediném místě (Umbilicaria) jsou specifické (Kremer 2008). Korovité lišejníky Krustózní lišejníky jsou celou spodní stranou přirostlé k substrátu. Typickým korovitým lišejníkům chybí spodní kůra, která se ovšem vyskytuje u plakodiovitých typů (Placodium). Druhy lišejníků, u nichž je část stélky odstálá od podkladu (Squamaria) a lišejníky, kde odstálé části stélky laterálně srůstají (Peltula), představují přechod k lupenité stélce. Naduřelé typy naznačují přechod ke keříčkovitým typům (Toninia). Dvojtvarou stélku (dimorfickou) mají některé lišejníky (Cladonia, Baeomyces, Stereocaulon) rozlišenou v lupenitou čí korovitou přízemní část (thallus horizontalis) a keříčkovitou (thallus verticalis). Thallus verticalis je spojen vývojově s primordiem askokarpu u rodu Cladonia a příbuzných rodů, a je nazýván podecium. (Svrček 1976). Vláknité lišejníky Jejich stélku tvoří vlákno fotobionta opletené hyfami mykobionta (Cystocoleus, Racodium) a je velmi jemná (Schubert et al. 2005). 14

15 Rosolovité lišejníky Od korovitých, keříčkovitých nebo lupenitých typů se liší rosolovitou konzistencí po navlhčení (Collema) a homeomerickou stavbou stélky. Jejich fotobionty jsou hlavně sinice (Kremer 2008). Leprariovité stélky Leprózní stélky jsou práškovité a morfologicky nediferenciované. Mykobiontem je dána morfologie stélky u heteromerických typů. Vznik stélky určuje okraj, který se utvoří z konců hyf. Tento prothalus může mít jiné zbarvení než thalus a neobsahuje fotobionty, ty se ve stélce objeví až později. Tvar lišejníku u homeomerických lišejníků určuje fotobiont, mykobiont pouze sleduje růst fotobionta, ale nemění struktury a tvary dané fotobiontem. Napínání tkáně růstem a vysoušení také ovlivňuje celkovou strukturu stélky (Kremer 2008). 2.6 Růst Lišejníky jsou pomalu rostoucí organismy, některé korovité druhy lišejníků vykazují přírůstek jen 1 mm za 20 let. Arktické a alpínské druhy potřebují k dosažení stavu plodnosti desítky let, stáří některých stélek rodu Rhizocarpon, Lecidea se odhaduje na 1000 až 4500 let. Lupenité a keříčkovité stélky rostou rychleji asi let. Pravděpodobné příčiny pomalého růstu lišejníků jsou: výskyt na extrémních, živinami chudých stanovištích, střídání extrémně suchých a vlhkých období nebo omezené období optimální metabolické aktivity, s čímž souvisí nízká asimilace CO 2 a pomalá syntéza proteinů (Kalina 2010). 2.7 Rozmnožování Rozmnožování lišejníku, symbiotického organismu, musí být komplexní. Jestliže má vzniknout lišejníková stélka, při odděleném rozmnožování obou komponent, musí opakovaně dojít k setkání obou složek. Lišejníky se často rozmnožují vegetativně, při tom se fotobiont i mykobiont rozšiřují společně (Schubert et al. 2005). Fragmenatce stélky je nejjednodušší způsob rozmnožování, úlomky stélky mohou regenerací za příznivých okolností dorůst v novou stélu (Cladonia, Parmelia). Některé druhy lišejníků (Lecanora esculenta, Diploschistes scruposus) se rozmnožují tak, že se celá stélka rozpadne na drobné části (Kalina 2010). 15

16 Velmi významné je vegetativní rozmnožování lišejníků sorediemi a izidiemi, což jsou zvláštní útvary obsahující fotobiont i mykobiont (Rabšteinek 1987). Soredie Soredie jsou malá mikroskopická zrnka, složená ze shluku řas, která jsou hustě opletena houbovými vlákny. Soredie vznikají uvnitř stélky pod korovým pletivem, po jeho rozrušení vypadávají ven ve formě drobného prášku, který je roznášen větrem nebo vodou. Noví jedinci mohou vyrůst na příhodném místě na celém povrchu stélky, nebo v sorálech, což jsou ohraničená ložiska (Svrček 1976). Izidie Izidie jsou drobné, válcovité, kyjovité, korálkovité či šupinovité výrůstky na svrchní straně stélky, které jsou velmi snadno mechanicky oddělitelné a z nichž vznikají noví jedinci (Svrček 1976). Pouze mykobiont se může rozmnožovat pohlavními výtrusy, avšak tento druh rozmnožování je méně účinný, protože předpokládá výskyt řasy v místě vyklíčené spory. Rozlišují se dva základní typy plodnic perithecia a apothecia (Svrček 1976). Perithecia Perithecia mají polokulovitý či kulovitý tvar a jeví se jako drobné, tmavé tečky na povrchu stélky. Perithecia mají na vrcholu ositol, malý otvor, dále mají jednoduchý nebo dvojitý obal a vnitřek obsahuje vřecka s výtrusy a parafýzy a perifýzy, což jsou podpůrná vlákna (Svrčerk 1976). Apothecia Obsahují několik druhů pletiv. Ve středu apothecia je hymenium, výtrusorodá vrstva, složená z vřecek obsahujících výtrusy, prostory mezi nimi vyplňují parafýzy jednoduchá nebo větvená vlákna. Jejich vrcholky tvoří nad hymeniem epithecium odlišně zbarvenou vrstvu, pod ním je hypothecium (Svrček 1976). 16

17 3 LIŠEJNÍKY V ČESKÉ REPUBLICE V ČR se vyskytuje zajímavé spektrum druhů makro i mikrolišejníků různých ekologických i taxonomických skupin. Celkový počet lišejníků známých z území České republiky je asi druhů, to je % světového bohatství lišejníků. Z toho je 138 vyhynulých druhů (9%) a 37 % velmi ohrožených druhů. V budoucnosti se zřejmě počet zastoupených druhů bude snižovat, neboť citlivější druhy epifytických lišejníků mizí. I malé změny podmínek na stanovišti mohou způsobit rychlý úhyn lišejníků. Je zajímavé, že diverzita substrátů a ekologických nik je pro lišejníky důležitější než poloha státu (Liška 2012). V posledních letech se stav životního prostředí zhoršuje, lišejníky mají význam jako bioindikátory ovzduší. Ačkoli jsou uzpůsobeny nepříznivým půdním a klimatickým činitelům, nesnáší znečištěné ovzduší, a proto také v mnoha oblastech ČR ubývají a někde jim hrozí i úplné vyhubení. V ovzduší je mnoho toxických zplodin v různých koncentracích (sloučeniny těžkých kovů, brómu, fluoru či radioaktivní spady). Tyto imise působí nepříznivě na lišejníkovou vegetaci, jejich citlivost k těmto spadům závisí na druhu, anatomii a morfologii, stáří i na půdních a ekologických nárocích lišejníku. Některým druhům toto znečištěné ovzduší vyhovuje, pak se v takovýchto oblastech rozšiřují. Tyto druhy ve svých stélkách hromadí těžké kovy a fluor, takže jejich výskyt je ukazatelem zvýšené koncentrace těchto látek (Rabšteinek 1987). Lišejníky reagují i na eutrofizaci prostředí, čistotu vod, klimatické změny, znečištění prostředí, změna biotopu, změna ve skladbě přirozených lesů, ničení rašelinišť a vřesovišť (Liška et al. 1997). Většina našich lišejníků nepřesahuje svou velikostí několik málo desítek, výjimečně stovek milimetrů, zpravidla však jsou podstatně drobnější. Jejich tvary jsou stejně zajímavé jako jejich názvy - dutohlávka, pupkovka, misnička. Základy národního jmenosloví lišejníků položené Janem Svatoplukem Preslem byly shodné s vědeckou nomenklaturou dvouslovné pojmenování, kde podstatné jméno představovalo rod a přídavné druh. Česká jména lišejníků vznikala podle potřeb různých autorů a dodnes existují asi pro polovinu našich druhů. Vedle jmen u nás rostoucích lišejníků byla vytvořena i jména pro zástupce, kteří se na našem území nevyskytují. Většinou jde o druhy, které 17

18 mají nějaký význam pro člověka (druhy přímořského rodu skalačka Roccela, z nichž se vyráběl lakmus) nebo jsou jinak zajímavé. Pro česká jména nejsou žádná pravidla jako např. pravidlo priority existující pro jména vědecká, pro řadu zástupců tak vzniklo několik jmen. Jména byla během doby vytvářena různým způsobem. Druhová, která vyjadřují obvykle vlastnost, barvu, výskyt aj. a vznikla většinou překladem jmen vědeckých. Z gramatického hlediska je většina českých jmen lišejníků ženského rodu. Shoda rodu mezi latinským a českým jménem neexistuje. Výběr nejvhodnějšího jména byl učiněn na základě několika zásad: české jmenosloví je nezávislé na vědecké nomenklatuře, při změnách vědeckého jména tedy nemusí následovat změna jména českého z jazykových a kulturních důvodů je vhodné respektovat stará jména, přestože neplatí zásada priority vzít v úvahu dosavadní užívání jména, frekvenci užití různými autory, období užívání i charakter publikace, v níž bylo jméno použito vytvářet nová jména pouze v odůvodněných případech Hlavním kritériem je potřeba národní nomenklatury a její používání. Česká jména mají i didaktický význam (Liška 2011). 3.1 Kde najdeme lišejníky V horských oblastech, zejména ve smrkových porostech, se velmi dobře daří lišejníkům s keříčkovitou stélkou. Lišejníky zde rostou v typických společenstvech na kmenech a větvích stromů. Jedná se o epifytické druhy, které přijímají jako potravu odumřelé povrchové části pletiv, ale necizopasí. Znesnadňují však dýchání kmenů a větví. Poskytují úkryt škodlivému hmyzu. Na povrchu kůry udržují vysokou vlhkost, která usnadňuje kmenům a větvím nákazu hmyzem a parazitickými houbami (Rabšteinek 1987). Druhy s korovitou stélkou, celou plochou pevně přirostlé k podkladu, rostou na skalách. Většina skalních lišejníků roste na skalách, které mají určité chemické složení. Některé druhy jsou typické pro vápence, na přítomnost křemíku jsou vázány jiné druhy, další na přítomnost železa nebo dusíkatých látek. Výskyt skalních lišejníků je ukazatelem skalního podkladu (Rabšteinek 1987). 18

19 U půdních lišejníků dominuje lupenitá stélka, ale časté jsou i druhy s keříčkovitou stélkou. Lišejníky rostou přímo na půdním povrchu. Tyto druhy vytvářejí společenstva suchomilných lišejníků. Pokrývají velké plochy na písčitých půdách, chudých na živiny. Hromadný výskyt půdních lišejníků je ukazatelem půd nevhodných pro růst lesních dřevin (Rabšteinek 1987). Lišejníky rostoucí v oblasti ČR se vyskytují převážně v místech s vysokou vzdušnou vlhkostí, kde jim nehrozí vyschnutí. V horských polohách tyto rostliny snášejí dobře i relativně nižší teploty. Fotosyntéza u těchto druhů sice probíhá pomaleji, nejvhodnější teplota je mezi 10 až 15 C, ale tyto lišejníky mohou asimilovat, sice s poloviční intenzitou, i při velmi nízkých teplotách, dokonce i pod bodem mrazu (Rabšteinek 1987). 3.2 Významné lokality Znalosti o rozšíření lišejníku na území ČR jsou značně nekompletní, nicméně víme, že existují lokality na lišejníky bohaté, jako je Kralický sněžník či České Švýcarsko. Kralický Sněžník Na území Kralického Sněžníku byly nashromážděny údaje o 370 taxonech lišejníků, což představuje 24 % naší lichenoflóry. Druhově chudá je lichenoflóra mladších lesních porostů, kde převažují běžné druhy lišejníků Chaenotheca ferruginea, Cladonia coniocraea, Claodia digitata, Cladonia fimbriata, Cladonia macilenta, Lecanora argenata, Lecanora conizaeoides, Hypocenomyce scalaris, Hypocenomyce caradocensis, Hypogymnia physodes, Hypogymnia tubulosa, Parmelia sulcata, Platismatia glauca, Pseudevernia furfuracea, Scoliciosporum chlorococcum a Vulpicida pinastri. Ve starších smrkových porostech na Mokrém hřbetu se vyskytují druhy Chaenotheca chrysocephala, Chaenotheca trichialis, Hypogymnia farinacea, Tuckermanopsis chlorophylla a vzácně také Bryoria fuscescens (Halda 2008). Suť pod Vlaštovčími skálami a suť pod Klepým hostí horské a vysokohorské druhy Alectoria ochroleuca, Arctoparmelia incurva, Cladonia bellidiflora, Cladonia macrophylla, Lecanora cenisia, Melanelia hepatizon, Melanelia stygia, Miriquidica leucophaea, Miriquidica nigroleprosa, Ophiopharma ventosa, Parmelia omphalodes, Pertusaria corallina, Photoparmelia badia, Pseudephebe pubescens, Rhizocarpon alpicola, Rimularia furvella, Schaereria 19

20 fuscocinerea, Sphaerophorus fragilis, Stereocaulon pileatum, Stereocaulon vesuvianum, Umbilicaria cylindrica a Umbilicaria hyperbola (Halda 2008). Na vrchovišti severně od Sušiny pod Jelením vrchem byl zaznamenán největší počet lišejníků Bryoria fuscescens, Hypogymnia farinacea, Hypogymnia physodes, Lecanora conizaeoides, Lecidea pullata, Micarea botryoides, Parmeliopsis ambigua, Parmeliopsis hyperopta, Placynthiella icmalea, Platismata glauca, Pseudevernia furfuracea, Psilolechia clavulifera, Trapelia coarctata, Trapeliopsis flexuosa, Trapeliopsis granulosa, Tuckermanopsis chlorophylla a Vulpicida pinastri (Halda 2008). Na vrcholových partiích Sněžníku nalezneme arkticko-alpinské druhy lišejníků Alectoria ochroleuca, Brodoa intestiniformis, Cladonia bellidiflora, Cladonia macrophylla, Melanelia hepatizon a Melanelia stygia. Epifyty z pralesovitých porostů Agonimia repleta, Nephroma parile a Strigula stigmatella se vyskytují v údolí Moravy pod lavinovou dráhou zarostlou jeřáby a kleny. V nižších partiích pohoří nalezneme vzácnější epifyty Acrocordia gemnata, Bacidia rubella, Bacidia subincompta, Calicium glaucellum, Chaenotheca brachypoda, Chaenotheca chlorella, Chaenotheca xyloxena, Evernia prunastri, Fellhanera subtilis, Graphis scripta, Lecanora intumescens, Lecidella elaeochroma, Lobaria pulmonaria, Pertusaria leioplaca, Pertusaria pupillaris, Pyrenula nitida, Sclerophora peronella a Usnea filipendula (Halda 2008). Tvarožné díry v údolí Moravy jsou významnou lokalitou vápencových lišejníků Arthonia fusca, Caloplaca chrysodeta, Collema cf fuscovirens, Diploschistes muscorum, Gyalecta jenensis, Leptogium subtile, Polyblastia albida, Polyblastia dermatodes, Psoroma hypnorum, Solorina saccata, Verrucaria baldensis. Bazické substráty na Mokrém břehu hostí bazofilní druhy Bilimbia sabuletorum, Caloplaca holocarpa, Protoparmeliopsis muralis, Physcia caesia, Protoblastenia rupestris, Sarcogyne regularis a Verrucaria muralis. Pionýrské druhy Caloplaca holocarpa, Candelariella aureola, Cladonia glauca, Cladonia pocillum, Cladonia pyxidata, Lecanora disperza, Peltigera rufescens, Physcia caesia, Verrucaria muralis a Xanthoria elegans nalezneme v mramorovém lomu ve Velké Moravě (Halda 2008). České Švýcarsko Na území Národního parku České Švýcarsko bylo nalezeno 246 druhů lišejníků, to představuje 16 % naší lichenoflóry. Chrysotrix calorina prorůstá kolmé pískovcové skalní 20

21 stěny stejně jako prášenka (Lepraria sp.), plsťotvorka ebenová (Crystocoleus ebenus) nebo šálečka lesklá (Psilolechia lucida), na pískovcích se daří terčovce prohnuté (Parmelia incurut). Čedičové sutě jsou bohaté na drobnovýtrusku hnědavou (Acarospora fuscata), buelii stélkovou (Buellia aethalea), misničku nazlátlou (Lecanora subaurea), mapovník zeměpisný (Rhizocarpon geographicum) a pevnokmínek kloboukatý (Sterecaulon pileatum) (Liška et al. 2008). Epifytická flóra je tvořena terčovkou bublinatou (Hypogymnia physodes), strupkou lasturnatou (Hypocenomyce scalaris), misničkou práškovitou (Lecanora conizaedides), terčovkou skalní (Parmelia saxatilis) a terčovkou trubčitou (Pseudevernia furfuracea). Velmi vzácným nálezem je děratka (Pertusaria ocellata) vyskytující se pouze v pískovcových oblastech střední Evropy a epifytické druhy citlivé ke znečištění ovzduší čárnička psaná (Graphis scripta) a cecatka třásnatá (Theloprema lepadinum). Teprve nedávno zde byly nalezeny druhy vousatec hnědý (Bryoria fuscescens), pukléřka sosnová (Vulpicia pinastri), pukléřka zelenavá (Cetraria chlorophylla) a provazovka (Usnea sp.) (Liška et al. 2008). 3.3 Lišejníky obecně se vyskytující v České republice Mapovník zeměpisný (Rhizocarpon geographicum) Lišejník s korovitou stélkou, pevně přirostlou k substrátu. Bez poškození ji nelze odtrhnout. Žlutozelená až žlutobílá, kožovitá, strupovitá stélka je rozpraskaná v drobná políčka. Apothecia jsou černá (Rabšteinek 1987). Mapovník zeměpisný bývá jedním z prvních průkopníků vegetace na extrémních místech. Roste hlavně na povrchu skal, balvanů i na kůře stromů (Rabšteinek 1987). Terčovník zední (Xanthoria parietina) Terčovník zední je taktéž lišejník s korovitou stélkou, pevně přitisknutou do substrátu. Stélka je z obou stran kryta kůrou, která je na vrchní straně žlutá až oranžově žlutá, vespod bělavá s rhiziny, kterými je terčovník přichycen k podkladu. Stélka dovede vytvořit značně široké útvary podobné růžicím. Miskovitá, přisedlá, žlutě až oranžově zbarvená apothecia se ve velkém tvoří na povrchu stélky (Rabšteinek 1987). Terčovník zední je velmi plodný, tudíž je značně rozšířen po celém území ČR, od nížin až do hor. Vyskytuje se na kůře listnatých stromů, hojně však i na ostatních dřevinách, na tlejícím 21

22 i na starém opracovaném dřevě, na skalách i na zdech. Terčovník je nitrofilní druh. Je průkopníkem další vegetace, pro niž připravuje vhodnější podmínky k růstu (Rabšteinek 1987). Hávnatka psí (Peltigera canina) Hávnatka psí je známý a nápadný lišejník. Má lasturnatě lupenitou, na okrajích hluboce laločnatou stélku. Vrchní strana je šedobílá či nahnědlá, spodní strana je bílá, hustě žilkovaná. Laloky stélky jsou nápadně široké, jemně plstnaté a za sucha povadlé a měkké. K substrátu přichycují hávnatku četné svazky houbových vláken, zatímco okraje laloků jsou lehce nadzvednuty. Vzpřímená, do rourek svinutá, hnědě zbarvená apothecia s četnými výtrusy jsou na svrchní straně laloků (Rabšteinek 1987). Hávnatka psí je velmi rozšířený lišejník po celém území ČR, v lesích, na vlhkých skalách, na zmechovatěných loukách, mezích i na okrajích cest. V lese roste nejvíce na zastíněných středně vlhkých půdách nejrůznějších typů, na vlhčích balvanech porostlými mechy a ve skalních rozsedlinách. Hávnatku nalezneme vždy na stinných místech s vyšší vzdušnou vlhkostí od nížin až do vysokohorských oblastí (Rabšteinek 1987). Pupkovka chlupatá (Umbilicaria hirsuta) Pupkovka chlupatá je lišejník s velkou jednovrstevnou, tenkou lupenitou stélkou, která je šedavě zbarvena. Stélka je rozdělena velice jemnou síťkou na nepatrná políčka. Rub stélky je tmavší, hnědavý, může být bradavičnatě rozpukaný, jindy hladký. K podkladu je stélka přichycena středovou stopkou a její okolí je tmavě hnědé. Okraj stélky je na obvodu ohrnutý (Rabšteinek 1987). Pupkovku chlupatou nalezneme ve vlhkém klimatu, zpravidla na stěnách balvanů. Na žule a na granodioritu vytváří velké kolonie v nápadném uspořádání kolmých řad nad sebou. Roste od středních poloh až vysoko do hor (Rabšteinek 1987). Větvičník slívový (Evernia prunastri) Stélka větvičníku je rozvětvená, stužkovitá, šedozelená, podélně rýhovaná nebo důlkovaná, měkká a plochá. Pentlicovité laloky mohou být až 100 mm dlouhé. Šedozelená až žlutošedá barva se střídá se světlejšími skvrnami soredií, které jsou buď čočkovité, umístěné 22

23 na hranách laloků, nebo bodovité až kupkovité a roztroušené po ploše. Spodní strana stélky je svraskalá a bělavě zbarvená (Rabšteinek 1987). Větvičník slívový vystupuje z nižších poloh do hor. Najdeme ho nejčastěji přirostlý na kůru listnatých stromů v lesních hájích, ve stromořadích podél cest, na starém dřevě a na keřích. Výjimečně může růst na skalách. Je velmi citlivý na znečištěné ovzduší (Rabšteinek 1987). Dutohlávka sobí (Cladonia ragnifernia) Patří mezi naše nejznámější a nejrozšířenější lišejníky. Stélka se skládá ze dvou částí. Bohatě keříčkovitě rozvětvené až 150 mm vysoké podecium vyrůstá z drobných přízemních, k substrátu přichycených šupin. Čtyři větvičky u jednoho místa vyrůstají při větvení. Hustě bradavičnatá stélka má šedou až šedobílou spodní část, u starších stélek obvykle světlejší. Koncové části větviček bývají zahnědlé a jednostranně ohnuté. Přisedají k nim drobná, kulovitá, hnědě zbarvená apothecia s četnými výtrusy (Rabšteinek 1987). Dutohlávka sobí je příznačný druh suchých, osluněných stanovišť s kyselými půdami. Nejčastěji ji nalezneme v suchých borových lesích, na pasekách, při okrajích porostů a na vřesovištích. Vyhledává propustné písčité půdy. Přežije i plné vyschnutí, stélka se rozpadne na malé části, při deštích opět nasaje vodu a stélka nabobtná. Ukazatelem suchých, písčitých, propustných a na živiny chudých půd je hromadný výskyt dutohlávky sobí ve velkých, rozsáhlých polštářích. Roste od nížin až do vysokohorských oblastí. (Rabšteinek 1987). Provazovka obecná (Usnea florida) Provazovka obecná patří mezi lišejníky s keříčkovitou až provázkovitou stélkou, která je přirostlá v jednom místě k substrátu, kterým je vždy kůra větví a kmenů či odumřelé dřevo. Hrubě bradavičnatá, šedě zbarvená, s odstínem do žluté nebo zelené barvy, odstálá až převislá a řídce větvená je stélka tohoto druhu. Nejdelší výhonky stélky mohou měřit 100 až 150 mm a jsou porostlé různě dlouhými, jakoby ojíněnými vlákny na zužujících se koncích. Apothecia mají podobu kulatého terče a vytvářejí se na koncích hlavních výhonů. Obsahují četné askospory, kterými se provazovka rychle množí (Rabšteinek 1987). 23

24 Provazovka je typicky stromový druh lišejníku, s nímž se na půdním podkladu nesetkáme. Často visí z větví v dlouhých provazcích v horských lesích. Tento lišejník je velmi citlivý na zhoršené životní prostředí (Rabšteinek 1987). Terčovka bublinatá (Parmelia physodes) Lupenitá stélka tohoto našeho nejrozšířenějšího lišejníku je přitisknutá k substrátu. Odstává pouze na okrajích lupenů. Tvoří jednostranně nebo růžicovitě se rozrůstající polštáře, které jsou na vrchní straně většinou šedé, šedozelené a šedohnědé. Na spodní straně je stélka mnohem tmavší, hnědá až černá. Ve střední části je terčovka jen lehce přichycena k podloží rhizinami. Okraje lupenů se dělí v úzké laloky, jež jsou k sobě přitisknuté a někdy se i překrývají. Bělavé soredie slouží k vegetativnímu rozmnožování, které jsou ve velkém množství umístěny při okrajích laločnaté stélky. Světle hnědá apothecia se na stélce tvoří výjimečně, proto je rozmnožování pomocí výtrusů ojedinělé (Rabšteinek 1987). Terčovka bublinatá je zhusta rozšířena po celém území od nížin až do nejvyšších hor. Je typickým průvodcem lesních společenstev, kde obaluje kmeny všech druhů dřevin. Roste zejména v místech s vyšší vzdušnou vlhkostí, na kůře kmenů, větví, na pařezech a na kořenových nábězích. Vyskytuje se i na odumřelém dřevě, na balvanech nebo na nerozložené hrabance (Rabšteinek 1987). Pukléřka islandská (Cetraria islandica) Pukléřka islandská je lišejník s keříčkovitou stélkou, která na okrajích vybíhá v úzké výrůstky, porostlé tuhými brvami. Stélka je okrouhlá, její laloky jsou stočeny do kornoutků nebo rourek. Na svrchní straně je často hnědá nebo šedozelená, lesklá, na spodní straně světlá, s bílými tečkami. Na okrajích krátkých a širších větviček jsou umístěna apothecia (Rabšteinek 1987). Pro pukléřku islandskou jsou charakteristické písčité půdy, především v horských a podhorských oblastech. Hojná je v jehličnatých lesích, na rašeliništích, vřesovištích a na kyselých substrátech. Vyskytuje se i na skalách, balvanech, a tlejících pařezech. Roste v jednotlivých trsech nebo v menších skupinách (Rabšteinek 1987). 24

25 Malohubka ryšavá (Baeomyces rufus) Malohubka ryšavá patří do čeledi dutohlávek. Korovitá spodní část dvoutvaré stélky je zeleně až šedozeleně zbarvená. Je zrnitě bradavičnatá a bradavičky přecházejí v šupinky. Spodní část nese soredie, které umožňují vegetativní rozmnožování. Vznik novému lišejníku dají na příhodném místě soredie roznášené větrem jako jemný prach (Rabšteinek 1987). Horní část stélky je vzpřímená, válcovitá, mírně zploštělá a žabernatá. Shluky řasových buněk jsou opleteny houbovými vlákny. Apothecia jsou plochá až vypouklá, hnědá až červenohnědá. Nalezneme ji od nejnižších poloh až do vysokých hor (Rabšteinek 1987). Obrázek 1 - Baeomyces rufus 25

26 4 SEKUNDÁRNÍ METABOLITY LIŠEJNÍKŮ 4.1 Chemotaxonomie Už v druhé polovině 19. století se objevily první publikace popisující přítomnost sekundárních metabolitů v lišejnících. O sto let později nastal rozvoj chemotaxonomie. Přesněji v 60. letech minulého století, v souvislosti s vývojem a širším využitím chromatografických metod. Nově se mohly rozlišovat druhy s pomocí chromatografie, které kvůli nedostatku anatomických a morfologických znaků nebylo do té doby možné určovat. Typickým příkladem je běžný a široce rozšířený rod prášenka (Lepraria), který netvoří plodnice a vyskytuje se pouze v podobě sterilních šedavých povlaků. Možnost detekce sekundárních metabolitů však napomohla rozvoji taxonomie i mnoha známých druhů makrolišejníků - zvláště z rodu provazovka (Usnea), vousatec (Bryoria) a dutohlávka (Cladonia) Výjimečnost lišejníkových látek tkví v jejich obrovském taxonomickém významu a tudíž v rutinním využívání metod jejich detekce. To je velký rozdíl oproti cévnatým rostlinám, mechorostům, nelichenizovaným houbám nebo řasám, kde se přítomnosti sekundárních metabolitů využívá pro určování taxonů jen ojediněle u vybraných skupin (Malíček 2012). Když bylo zbarvení lišejníku uznáno jako rodový nebo druhový znak, začal se chemismus lišejníků používat jako taxonomická charakteristika. Šedozelené lišejníky rodu Physcia (v kortexu obsahují atranorin) byly odděleny od morfologicky velmi podobných oranžových lišejníků rodu Xanthoria (obsahují kortikální parietin a oranžový pigment). Podobně Parmeliopsis ambigua, lišejník se žlutě zbarvenou stélkou díky přítomnosti kyseliny usnové, byl oddělen od Parmeliopsis hyperopta, lišejník s šedou stélkou, jehož zbarvení je způsobené přítomností atranorinu (Nash 2008). 4.2 Sekundární metabolity Všeobecně známou schopností živých organismů je produkce primárních (intracelulární) metabolitů, mezi něž patří např. aminokyseliny, sacharidy a fotosyntetické pigmenty. Produkují ale také řadu sekundárních (extracelulárních) metabolitů, čili látek, které zpravidla nejsou pro život jedince nezbytné, alespoň v krátkodobém měřítku. Sekundární metabolity jsou tedy produkty vyvolané soužitím obou partnerů ve stélce, samostatně kultivovaný mykobiont 26

27 či fotobiont není schopen fotosyntézy. K těmto organickým sloučeninám patří kyseliny, většinou slabě fenolického typu a alifatické až různě složité aromatické látky s nejrůznějšími radikály - alkaloidy, glykosidy a mykotoxiny (Stocker Wörgötter 2008). U lišejníků se můžeme setkat s velkým množstvím různých sekundárních metabolitů. V současné době se počet těchto látek s popsanou strukturou blíží číslu 1050 (Stocker Wörgotter 2008). Sekundární metabolity se v lišejnících vyskytují v různých částech stélky a v různých podobách. Většina z nich patří mezi organické látky, chová se jako chemické signály a obaluje povrch houbových vláken. Lze je však nalézt také jako granulky, krystaly, kapénky nebo pigmenty v generativních částech a vzácněji ve vegetativních částech stélky. Tyto látky jsou ve vodě nerozpustné, lze je extrahovat organickými rozpouštědly. Výskyt sekundárních metabolitů ve stélce lišejníků je nerovnoměrný, souvisí s funkcí metabolitu. Protože mohou určovat barvu lišejníku, jejich přítomnost někdy bývá patrná na první pohled (Malíček 2012). K nejčastějším sekundárním metabolitům patří kyselina usnová, která způsobuje žlutozelené zbarvení provazovek, atranorin šedou barvu terčovníků (Physcia), parietin žlutooranžovou stélku terčníku zedního (Xanthoria parietina) a kyselina rodoklanová způsobuje nápadné červené zbarvení plodnic některých dutohlávek (Malíček 2012). Další typické látky pro lišejníky jsou antrachinony a kyselina lekanorová (lecanoric acid) pojmenovaná podle lišejníku Lecanora (Nash 2008). Obrázek 2 kyselina usnová Obrázek 3 - atranorin 27

28 Obrázek 4 - parietin Také výrazně hořkou chuť většiny druhů zapříčiňují lišejníkové látky. Přítomnost kyseliny pikrolichenové přímo v terénu můžeme zjistit u vratky hořké (Pertusaria amara) podle svíravé chuti, čímž druh celkem spolehlivě odlišíme od velmi podobné vratky bělavé (Petrusaria albescens). Růžové zbarvení herbářových položek i po několika letech skladování způsobuje kyselina alektorialová obsažená např. u některých vousatců. I výskyt některých terpenoidů (zvláště běžně rozšířeného zeorinu) se projevuje vytvořením drobných jehlicovitých krystalů na povrchu stélek u několik let starých herbářových položek (Malíček 2012). Stélky lišejníků mohou obsahovat značné množství sekundárních metabolitů většinou mezi 0,1 5 % suché hmotnosti stélky, u některých druhů dokonce až 20 % (Molina et al. 2003). Molekuly sekundárního metabolitu mohou obsahovat více funkčních skupin a jejich biologická aktivita je vícestranná. Některé z nich nemusí být jen konečnými produkty metabolismu, ale jsou současně zapojeny i do dalších procesů. Význam sekundárních metabolitů pro lišejníky je mnohem komplexnější, zahrnující mnoho funkcí v plnohodnotné realizaci života lišejníku (Jahodář 2011). Principem metabolismu uhlíku u lišejníků a syntézy sekundárních metabolitů je využití energie z jednoduchého cukru vzniklého při fotosyntetických reakcích v buňkách fotobionta. Druhy lišejníků obsahujících sinice jako symbiotického partnera produkují většinou sacharózu a řasy produkují ribstol, erythritol nebo sorbitol (Nash 2008). Biogeneze sekundárních metabolitů se odvíjí z několika primárních metabolitů aminokyselin, acetylkoenzymu A, mevalonové kyseliny a meziproduktů biosyntézy šikimové kyseliny. Vznikající produkty jsou polyketidy, terpeny a steroidy, polyakiny a šikimáty. U alkaloidů a polyfenolů prostupuje biogeneze oběma cestami (Jahodář 2011). Sekundární metabolismus zahrnuje jedinečné metabolické dráhy, které umožňují vytvořit obrovské množství více či méně složitých chemických struktur. Tyto dráhy jsou katalyzovány 28

29 enzymy, jejichž substrátová a reakční specifita bývá ve srovnání s enzymy obecného metabolismu nižší. Vzniká skupina chemicky a strukturně podobných látek. Primární a sekundární metabolismus využívá v celé řadě klíčových bodů metabolických drah společné intermediáty. Většina sekundárních metabolitů je tvořena biosyntetickými drahami, které se odštěpují z několika bodů primárního metabolismu a zahrnují relativně malý počet reakčních typů. Existují tři základní biosyntetické dráhy syntézy sekundárních metabolitů: dráha kyseliny šikimové, dráha kyseliny mevalonové a acetyl-polymalonylová dráha. První klasifikace lišejníkových látek, založená na známých strukturách a biosyntetických drahách, byla vytvořena Asahinou a Shibatou (Asahina & Shibata 1954). 4.3 Hlavní skupiny sekundárních metabolitů lišejníků ACETYL-POLYMALONYLOVÁ DRÁHA Alifatické kyseliny, estery a jiné deriváty Polyketidy Fenolické sloučeniny Depsidy, tridepsidy, benzylové estery Depsidony a dibenzofurany Depsony Antrachinony a xantthony Chromony MEVALONOVÁ DRÁHA Di- a triterpeny Steroidy ŠIKIMÁTOVÁ DRÁHA Terpenylchinony Kyselina purinová a její deriváty 29

30 Obrázek 5 Zjednodušené schéma metabolických drah (Lumbsch 1998) Šikimátová metabolická dráha a biosyntéza fenylpropanoidů Kyselina šikimová vzniká spojením fosfoenolpyrohroznové kyseliny s cukerným derivátem erytrosa-4-fosfátem. Přeměnami v následných reakcích se mění v kyselinu chorismovou, dále v aromatické aminokyseliny a kyselinu skořicovou. Aminokyseliny jsou prekurzorem alkaloidů, kyselina skořicová je prekurzorem fenylpropanů, polyfenolů a arylglukosinolátů (Jahodář 2011). Šikimátová metabolická dráha je sled reakcí vedoucí k biosyntéze dvou aromatických aminokyselin, fenylalaninu a tyrosinu. Erytrosa-4-fosfát a fosfoenolpyruvát jsou důležitými látkami, ze kterých šikimátová dráha vychází. Jedná se o látky vznikající při fotosyntetické syntéze cukrů. Kondenzací erytrosa-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu, 30

31 která je následována řadou dalších reakcí, vzniká kyselina šikimová neboli šikimát. Šikimát je meziprodukt, podle kterého je tato metabolická dráha pojmenována. Produkty šikimátové dráhy jsou terpenylchinony, kyseliny purinová a její deriváty. Jedná se o látky důležité pro metabolismus fenylpropanoidů (Mácholán 1998) Biosyntetická dráha kyseliny mevalonové Základní metabolická dráha, která poskytuje isopentenylpyrofosfát a dimetylallylpyrofosfát, dvě pětiuhlíkaté stavební molekuly, které jsou důležité pro syntézu všech izoprenoidních sloučenin. Klíčovým enzymem pro biosyntetickou cestu mevalonové kyseliny je HMG-CoA-reduktása 3. Vzniknou diterpeny, triterpeny a steroidy (Geuns 2003). Tyto látky mají strukturu založenou na základní jednotce pětiuhlíkatém isoprenu. V živém organismu se nachází v aktivní formě jako 3-methyl-3-butenyldifosfát a 3-methyl-2- butenyldifosfát. Jejich vznik vychází z acetylkoenzymu A. Lineárním spojením izoprenových jednotek vznikají diterpeny (C-20) a triterpeny (C-30). Z triterpenu skvalenu cyklizací vznikne základní struktura pro steroidy. Jestliže lineární triterpen cyklizuje do pěti kruhů, vzniká základ pro pentacyklické triterpeny (Jahodář 2011) Acetyl-polymalonylová biosyntetická dráha Z acetyl-polymalonylové dráhy je odvozena většina sekundárních metabolitů. Aromatické látky vytvořené spojením dvou nebo tří orcinolů nebo -orcinol-typů fenolických jednotek prostřednictvím esterických, etherických a C-C vazeb, jsou nejčastějšími produkty této metabolické dráhy. Vzniká tak většina depsidů, depsonů, depsidonů, dibenzofuranů a kyselina usnová a její deriváty. Chromony, xantony a antrachinony, zbylé aromatické sloučeniny této dráhy, jsou pravděpodobně tvořeny cyklizací polyektidového řetězce a často jsou stejné či obdobné jako u hub nebo vyšších rostlin (Stocker Wörgötter 2008). Polyketidy jsou tvořeny acetátem, základní biosyntetickou jednotkou. Acetát nalezneme v rostlinách ve formě thioesteru octové kyseliny s koenzymem A. Reaktivní thioester kyseliny octové se zapojuje do tvorby vyšších mastných kyselin a poskytuje základní úsek pro tvorbu polyketidů (Jahodář 2011). 3 HMG-CoA-reduktáza 3-hydroxy3-metylglutaryl-CoA reduktáza, klíčový enzym cholesterolu, katalyzuje vznik malonátu 31

32 5 DETEKCE LIŠEJNÍKOVÝCH LÁTEK K detekci lišejníkových látek slouží různé metody. Mnohé produkty látkové výměny jsou stálé pro určité druhy a jsou proto velmi dobrými rozlišovacími znaky. Lze je zjistit makrochemicky podle barevných reakcí, které jsou vyvolány různými činidly nanášenými na povrch stélky nebo její dužinu (dřeň). Mikrochemicky podle barvy a tvaru krystalů, pomocí fluorescence a chromatograficky (Svrček 1976). V následujících kapitolách stručně představím metody, které lichenologové rutinně využívají. 5.1 Stélkové reakce a UV světlo Jednoduchým způsobem zjištění vybraných látek využívaných při určování druhů jsou stélkové (bodové) reakce lišejníků s chemikáliemi. Pro jejich použití je potřeba roztok hydroxidu draselného, chlorové vápno (respektive jiný dezinfekční přípravek obsahující chlór, např. Savo) a parafenylendiamin (Smith et al. 2009). Nepatrné množství těchto reagencií se nanese na stélku lišejníku, kde v případě přítomnosti hledané látky dochází k barevným změnám nejčastěji na červenou, žlutou, oranžovou a růžovou. Nevýhodou těchto reakcí je, že bývají nespecifické (specificky reaguje jen určitý typ sloučenin), a tudíž často nelze jednoznačně určit konkrétní látku obsaženou ve stélce. Další slabou stránkou je, že v případě nízkých koncentrací sekundárních metabolitů v lišejníku není bodová reakce zpravidla čitelná. Pro účinnější využití metody se provádí stanovení na mikroskopických řezech (Malíček 2012). Aplikace Lugolova roztoku obsahujícího jod k detekci vybraných skupin polysacharidů patří také ke stélkovým reakcím. Nejčastěji se nanáší na dřeň (střední vrstva lišejníkové stélky tvořená houbovými vlákny), a ta se v případě kladné reakce zbarvuje modře. Zásadní uplatnění nachází využití Lugolova roztoku u zkoumání struktury vřecek, kde vznikají výtrusy (Malíček 2012). Některé sekundární metabolity světélkují v ultrafialovém světle. Kvalitní UV lampa je proto nezbytným vybavením. Lišejník svítící pod UV lampou bíle nebo modře, obsahuje depsidy a depsidony, popřípadě značí přítomnost xantonů, když svítí v odstínech žluté, oranžové a červené (Orange et al. 2001). Ultrafialové záření je velmi užitečným nástrojem např. při určování dutohlávek. 32

33 Obrázek 6 vysokohorský lišejník šídlovec krtkovitý (Thamnolia vermicularis) se ve střední Evropě vyskytuje ve dvou chemotypech. Jeden obsahuje kyseliny baeomycesovou a squamatovou (vlevo) a svítí pod UV lampou bělavě. Druhý chemotyp s kyselinou thamnolovou (vpravo) na UV záření nereaguje. (Malíček 2012) 5.2 Mikrokrystalizační testy Tato metoda se v současné době používá spíše ojediněle, protože byla zastíněna chromatografií. Ta je v porovnání s mykrokrystalizačními testy citlivější a spolehlivější, avšak také časově i finančně náročnější. Výhodou mikrokrystalizačních testů je naopak možnost rozlišení několika látek, které se tenkovrstevnou chromatografií neoddělí. Postup je takový, že nejprve naneseme kapku rozpouštědla (nejčastěji acetonu) na část stélky umístěnou na podložním sklíčku. Rozpouštědlo z lišejníku vyextrahuje sekundární metabolity. V dalším kroku přidáme k získanému extraktu vybrané mikrokrystalizační činidlo, jehož základ tvoří nejčastěji glycerol, etanol, voda a kyselina octová (Asahina & Shibata 1954). Sklíčko zahřejeme a necháme zchladnout. Postupně se vytvoří krystaly specifických tvarů a velikostí, které jsou charakteristické pro jednotlivé látky. Jejich vzhled a vlastnosti pak sledujeme mikroskopem. Obrázek 7 krystaly kyseliny vulpinové vzniklé při mikrokrystalizačních testech (Malíček 2012) 33

34 Obrázek 8 kyselina norstiktová vytváří v hydroxidu draselném nezaměnitelné červené krystalky o délce 5 10 m (Malíček 2012) 5.3 Chromatografie Při zkoumání sekundárních metabolitů využíváme v zásadě dva základní typy chromatografie tenkovrstevnou (TLC) 4 a vysokoúčinnou kapalinovou (HPLC) 5. Chromatografie je separační analytická a fyzikálně chemická metoda pro separaci a analýzu směsí látek, jejímž základním principem je rozdělování složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi (Schneiderka 2000). Historie chromatografie Ruský botanik, fyziolog a biochemik M. S. Cvet provedl v roce 1906 experiment, při kterém rozdělil rostlinné barvivo chlorofyl na jeho složky chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy. Průběh experimentu spočíval v protékání petroletherového extraktu chlorofylu v kolonce přes sloupec křemeliny (CaCO 3 ). Jednotlivá barviva obsažená v chlorofylu se při průchodu kolonkou rozdělila a na kolonce se vytvořily jednotlivé barevné zóny pozorovatelné okem. Podle slova barvopis (z řec. chroma = barva) Cvet tuto metodu pojmenoval chromatografie. Už tento jednoduchý chromatografický systém obsahoval kapalnou a pevnou fázi. Kapalnou fázi tvořil petrolether, ve kterém byl rozpuštěn chlorofyl (analyzovaná směs) a křemelina tvořila pevnou fázi. Kapalná fáze se pohybovala skrz pevnou fázi (Schneiderka 2000). 4 TLC z angl. Thin Layer Chromatography 5 HPLC z angl. High Performance Liquid Chromatography 34

35 Princip chromatografie Chromatografické metody tedy umožňují vzájemnou separaci látek obsažených ve zkoumané směsi a poskytnou kvalitativní či kvantitativní analýzu směsi. Výsledkem separace složek směsi může být experimentální zjištění, z jakých látek se zkoumaná směs skládá. Kvalitativní analýza nám přesně určí, jaké látky jsou obsažené ve směsi, výsledek kvantitativní analýzy je zjištění přesné koncentrace jednotlivých složek. Chromatografické analýzy se používají pro složité směsi látek, které mají podobné chemické a fyzikální vlastnosti a které by se jinými metodami analyzovaly obtížně (Schneiderka 2000). Mobilní fáze je pohyblivá fáze, protože se v chromatografickém systému pohybuje. Jako mobilní fáze se používá kapalina nebo plyn. Podle mobilní fáze rozdělujeme chromatografii na kapalinovou chromatografii nebo plynovou chromatografii (Schneiderka et al. 2000). Stacionární fáze je nepohyblivá fáze v chromatografickém systému. Jako stacionární fáze může být použita pevná látka nebo film zakotvený na pevné látce (Schneiderka et al. 2000). Chromatogram je tvořen soustavou píků, které mají různou plochu a výšku, jsou od sebe různě vzdáleny, v ideálním případě jsou symetrické a mají tvar Gaussovy křivky. Každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi, pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena. Retenční čas uvádí poloha píku na ose X (určeno podle polohy vrcholu) a určuje, o jakou látku se jedná. Koncentraci látky ve směsi určuje plocha píku (či jeho výška). Identifikace látek (podle píků) se provede s provedením standardní směsi. Standardní směs je připravená směs o známém kvalitativním složení. Jestliže se retenční časy píků na chromatogramu neznámé směsi shodují s retenčními časy píků, jedná se o stejné látky. Koncentrace látek ve směsi se určuje metodou kalibrace z ploch nebo výšek píků a existuje pro ni několik způsobů provedení (Schneiderka 2000). Dělení chromatografických metod Existuje několik různých hledisek, podle kterých se chromatografické metody dělí. Povaha mobilní fáze (kapalina - plyn), způsob provedení (plošné uspořádání na koloně), princip separace (rozpouštění adsorpce iontová výměna) atd. (Schneiderka 2000). 35

36 Tenkovrstevná chromatografie využívá principu rozdělovací, adsorpční, iontové (výměna iontů) a afinitní (specifická vazba látek na nosič) chromatografie. Pracuje s průmyslově vyráběnými hliníkovými foliemi s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým. Vzorky se nanášejí pipetou a vyvíjejí se v chromatografické vaně v soustavě rozpouštědel. Lze použít i dvourozměrné tenkovrstevné techniky, kdy se chromatogram po doběhnutí čela rozpouštědla na konec desky vysuší, deska se otočí o 90 a chromatografie se provede v kolmém směru s jinou soustavou rozpouštědel. Detekce může být destruktivní (reakce s H 2 SO 4, KMnO 4, K 2 Cr 2 O 7 ) nebo nedestruktivní (UV světlo, přechodná absorpce par jodu) (Schneiderka 2000). Tenkovrstevná chromatografie je velmi rozšířená na lichenologických pracovištích a v taxonomii představuje nezbytnou metodu při zjišťování lišejníkových látek. Sloučeniny vyextrahované v acetonu se nanášejí na chromatografickou desku, kterou po ponoření vzlíná roztok organických rozpouštědel a s ním i nanesené metabolity. Ty se podle velikosti molekul rozmísťují na různých místech v rámci desky. Umístění je charakteristické a zásadní pro určování jednotlivých látek (Orange et al. 2001). Přítomnost mastných kyselin, které jsou bezbarvé, se dá zjistit krátkým ponořením desky do vody. Po aplikaci kyseliny sírové a zahřátí po dobu několika minut se organické látky zbarvují. Změny barvy taktéž slouží k identifikaci látek, stejně jako zkoumání vlastností skvrn (vzniklých po předchozím zahřívání) pod UV světlem. TLC je velmi efektivní metoda a její používání není složité ani příliš finančně náročné (Malíček 2012). Obrázek 9 výsledná chromatografická deska, kde byla analyzována skupina příbuzných zástupců rodu misnička. K nejrozšířenějším sekundárním metabolitům u lišejníků patří atranorin, který se v tenkovrstevné chromatografii používá jako standard. (Malíček 2012) 36

37 Přesnější metodou je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Látky se dělí ve dvoufázovém dělícím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou stacionární fází, na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta. Celý děj probíhá v kolonách. Účinnost všech typů chromatografických kolon se hodnotí podle počtu teoretických pater. Čím je větší počet pater, tím je kolona účinnější, obrovskou účinnost mají kolony obsahující několik set tisíc teoretických pater. HPLC pracuje s úzkými ocelovými, skleněnými nebo křemennými kolonami obsahující nosné částice ve stacionární fázi (Schneiderka 2000). Průtok mobilní fáze probíhá pod určitým tlakem díky účinku gravitace. Při dávkování vzorku do kapalinového chromatografu lze použít přímý nástřik na kolonu přes elastickou membránu (nízkotlaká verze) nebo speciální ventil s dávkovací smyčkou (vysokotlaká verze). Vícecestný ventil umožňuje nástřik do smyčky, kdy současně jinou cestou prochází ze zásobníku do kolony mobilní fáze. Vzorek vytlačí mobilní fázi ze smyčky za kolonou po přepnutí ventilu. Na výstupu z kolony je připojen detektor UV-VIS, fluorimetrický, detektor diodového pole, kde se coulometricky sleduje redoxní reakce stanovovaných látek na pracovní elektrodě. Získaný signál je číselně vyhodnocen integrátorem (Schneiderka 2000). Významnou částí kapalinového chromatografu jsou pístová čerpadla, která se pohybují tak, aby došlo k maximálnímu potlačení pulsace toku mobilní fáze. HPLC lze aplikovat i při stanovení termolabilních látek (enzymy). Několik set analýz za 24 hodin lze udělat na plně automatizovaných HPLC systémech schopných nepřetržitého provozu (Schneiderka 2000). K jejím výhodám patří možnost stanovení koncentrace metabolitů, detekce látek zastoupených pouze ve stopových množstvích a rozlišení příbuzných látek, které bohužel v TLC splývají v jedné skvrně. Kapalinové chromatografy také zároveň měří absorpční maxima detekovaných sloučenin, což je důležité pro identifikaci. HPLC je zvláště užitečná u skupin lišejníků, které obsahují barevné pigmenty rozpustné v organických rozpouštědlech, jako jsou antrachinony a xantony. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie má ve výzkumu lišejníkových látek do budoucna značný potenciál (Malíček 2012). Dokáže totiž zjistit mnoho sloučenin zastoupených pouze v nepatrných koncentracích, z nichž velké procento není prozatím známo. 37

38 Cena zařízení však přesahuje rozpočet průměrného pracoviště, tudíž nebývá standardním vybavením lichenologické laboratoře. Obrázek 10 schéma HPLC Obrázek 11 HPLC Obrázek 12 výsledný chromatogram z vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Na ose X je zobrazen retenční čas, který pomáhá k identifikaci sloučeniny, na ose Y je koncentrace látek, Jednotlivé vrcholy představují různé antrachinony obsažené v krásnici zubaté (Caloplaca crenularia). (Převzato Sochtig 2012) 38

39 Slabinou chromatografických metod jsou potíže s identifikací jednotlivých metabolitů, která vyžaduje často mnohaletou zkušenost badatele a značné využívání srovnávacího materiálu. 5.4 Pigmenty a krystaly Ne všechny lišejníkové pigmenty jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, a proto je nelze identifikovat pomocí chromatografie nebo mikrokrystalizačních testů. Z tohoto důvodu nejsou známy ani jejich strukturní vzorce. Obvykle se vyskytují v generativních částech stélky v apotheciích a peritheciích. Mají různé barvy, nejčastěji zelenou, hnědou, červenou a modrou. Pro identifikaci se sleduje chování (barevná reakce) v zásaditém a kyselém prostředí po přidání hydroxidu draselného či kyseliny chlorovodíkové. Důležitá je také reakce s kyselinou dusičnou, která mění barvu některých pigmentů na červenou. V běžné praxi jsou pigmenty velmi důležitým vodítkem při mikroskopickém určování řady taxonů (Malíček 2012). Mezi sekundární metabolity lišejníků se řadí i šťavelan vápenatý. Šťavelan je produkován houbovými organismy. U lišejníků se vyskytuje v apotheciích, ale také na povrchu stélky v podobě ojínění. U několika rodů hraje velikost a rozmístění krystalů této látky podstatnou roli pro určování. Ke zkoumání krystalů šťavelanu se využívá polarizované světlo, které zviditelní za normálních podmínek těžko patrné krystalické komponenty a umožní jejich odlišení od jiných podobných struktur (Malíček 2012). Obrázek 13 šťavelan vápenatý 39

40 6 BIOLOGICKÁ AKTIVITA SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ Sekundární metabolity mají několik velmi důležitých biologických účinků. Jsou velmi odolné proti vysokým dávkám slunečního záření, mají allelochemickou, antivirovou, protinádorovou a antibakteriální funkci, mohou působit jako antioxidanty, analgetika a antypiretika. Hrají důležitou roli v toleranci lišejníků proti znečištění životního prostředí (Molnár & Farkas 2010). Lišejníky představují potenciál různorodých chemických struktur. Popsání a poznání zdrojů účinných léčivých látek se využívá ve farmacii a medicíně. K rozšiřování poznatků o biologicky aktivních látkách využitelných ve farmacii se využívají tři strategie: 1. Bioassay-guided separace pracuje s moderními separačními technikami provázenými vhodnými screeningovými biologickými testy. Obrázek 14 Bioassay-guided izolace přírodních látek (převzato z Jahodář 2011) 2. Studie, které vycházejí z poznatků etnofarmakologie. Studování a shromáždění poznatků evropské, čínské, indické a jihoafrické tradiční medicíny, které umožňuje zaměřit se na zdroje hledaných biologických aktivit s cílem potvrdit je a zjistit, jak účinné složky z nich izolovat. 3. Počítačové modelování s virtuálním screeningem 3D databází přírodních látek. Databáze obsahují poznatky o strukturách doposud izolovaných molekul z rostlinného materiálu. Počítače umožní vyhledat perspektivní látky a orientovat zájem na jejich možné zdroje (Jahodář 2011). 40

41 7 VÝZNAM SEKUNDÁRNÍCH METABOLITŮ Sekundární metabolity lišejníků a jejich funkce v organismu jsou doposud velmi málo prozkoumanou oblastí. Mohou zvyšovat schopnost růstu, reprodukce nebo rozšíření v určitém prostředí. Lišejníkové látky dávají naději dalších nových objevů v budoucnu, např. v medicíně. Nejvýznamnější způsoby uplatnění nebo působení lišejníkových metabolitů: barvení látek, výroba lakmusu, léčivé účinky, antibiotické a protirakovinné působení, výroba parfémů atd. V samotném lišejníku uskutečňují tyto látky různé úkony, avšak u většiny z nich funkci zatím neznáme. Uplatňují se v kompetici s jinými organismy nebo pomáhají přežít v extrémních podmínkách, mohou působit jako inhibitory růstu rostlin a enzymové aktivity, chrání lišejník před býložravci, symbiotickou řasu chrání před nadměrným UV zářením, mají vliv na propustnost membrán fotobiontů nebo vznikají jako tzv. stresové metabolity (Lumbsch 1998). Ne všechny druhy lišejníků obsahují sekundární metabolity, chybějí např. u většiny cyanolišejníků (obsahují jako fotobionta sinici) a také u pyrenokarpních lišejníků (typem plodnice je perithecium). Zde se při determinaci musíme spoléhat na anatomické, morfologické a popřípadě molekulární znaky (Lumbsch 1998). S lišejníkovými látkami souvisí jejich fytogeografická variabilita a existence tzv. chemotypů. Chemotyp je označení, které se používá pro případy, kdy se jeden druh vyskytuje s různými sekundárními metabolity. U některých taxonů je popsána změna přítomnosti určitých látek v rámci jejich areálu, např. evropské populace houboplodky krvavějící (Mycoblastus sanguinarius) obsahující kyselinu kaperatovou, zatímco americké a asijské kyselinu rangiformovou. Je tedy zajímavé studovat, zda chemotypy mají nějaký taxonomický význam a odlišují jinak morfologicky totožné druhy. V mnoha případech ale jde pouze o přítomnost chemicky blízce příbuzných látek, kde o výsledném metabolitu mohou rozhodovat např. podmínky prostředí, stabilita molekul daného produktu či genetické příčiny (Malíček 2012). Produkce sekundárních metabolitů je energeticky náročná. Sekundární metabolity představují až 30 % hmotnosti lišejníku a mají, shrneme-li výše vyjmenované funkce, adaptivní význam. Izolované houbové kultury neprodukují sekundární metabolity. Optimální podmínky pro fotosyntézu pomáhají zachovávat hydrofobní látky ve dřeni (Hájek 2001). 41

42 7.1 Toxické sekundární metabolity Některé sekundární metabolity mohou vykazovat škodlivé účinky. V severní Evropě tradičně užívaná Letharia vulpina k trávení lišek a vlků (účinná na všechny masožravce) obsahuje toxin kyselinu vulpinovou, který je toxický i vůči hmyzu a měkkýšům, ale myši a králíci jsou vůči němu rezistentní. Lišejníky, které obsahují deriváty kyseliny vulpinové, jsou prudce jedovaté (Vulpiaria vulpina, Cetraria pinastri či Cetraria juniperina). Kyselina vulpinová působí na centrální nervový systém, prudce zrychluje dýchání, které může vést až k vyčerpání. Dermatitidy, alergické reakce a podráždění mohou způsobovat kyselina usnová, kyselina evernová, kyselina fumarprotocetrarová, kyselina stiktová a atranorin. Atranorin a kyselina stiktová mohou způsobovat také fotosenzitivaci kůže. V Severní Americe umírají sobi, pokud jsou nuceni opustit svůj obvyklý areál a dostanou se do nižších nadmořských výšek, začnou jíst Xanthoparmelia chlorochroa, kterou jinak nespásají, protože obsahuje kyselinu salazinovou (Kalina 2010). Obrázek 15 - Xanthoparmelia chlorochroa 42