Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká Fakulta Katedra antropologie. Diplomová práce

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká Fakulta Katedra antropologie Diplomová práce Praha 2003

2 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká Fakulta Katedra antropologie Molekulárně biologické stanovení pohlaví u lidských jedinců archeologického naleziště v Žatci autor: školitel: Markéta Bromová RNDr. Jaroslav Brouček školní rok: 2002/2003 2

3 Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci prováděla samostatně s použitím uvedené literatury. V Praze, dne... Podpis... 3

4 Úvodem této práce bych velice ráda poděkovala svým odborným konzultantům M. Hájkovi PhD., V. Černému PhD. a školiteli RNDr. J. Broučkovi za veškeré podnětné rady a sdělené zkušenosti. 4

5 Obsah ÚVOD 7 TEORETICKÁ ČÁST 9 1 adna Historický pohled na adna objevy DNA struktura a vlastnosti adna molekula chemické vlastnosti zjišťování zachovalosti DNA Problematika práce s adna chemická modifikace kontaminace fragmentace adna materiál Buňky kosterního materiálu, ze kterých se DNA izoluje Typ biologického materiálu vhodného pro izolaci Informace v adna a jejich využití Spektrum informací v adna pohlaví amelogenin a pohlaví METODIKA PRÁCE S adna 26 4 Výběr souboru Soubor žateckých jedinců morfologické určení pohlaví Soubor jedinců z Kriminalistického ústavu Čištění povrchu vzorku Drcení tvrdého biologického materiálu Izolace adna molekul Obecný pohled Výhody a nevýhody silikátové izolace Nevýhoda metody fenol-chloroformové pro adna izolaci Princip izolace postup izolace

6 8 Amplifikace zvoleného úseku adna PCR Polymerázová řetězová reakce jednotlivé komponenty PCR reakce Princip PCR teplotní profily Postup přípravy PCR amplifikace PCR proti-kontaminační opatření mastermix příprava mastermixu Optimalizace Detekce DNA fragmentů Princip hustota gelu a velikost fragmentu aplikované napětí pufry ethidium bromid Elektroforéza v agarózovém gelu Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu VÝSLEDKY Zjištěné údaje a hodnoty Výsledek analýzy jedinců ze sbírky Kriminalistického ústavu...61 Výsledky analýzy 19 jedinců historické populace z století...64 MPS systém mtdna...70 Amplifikace jaderného úseku amelogeninu 80/83 bp...73 DISKUZE 77 ZÁVĚR 81 Přílohy 82 Bibliografie 88 Seznam tabulek 94 Seznam obrázků 95 Seznam chemikálií 96 Seznam zkratek 96 6

7 Úvod V rámci studia antropologie se lidé snaží zjistit co nejvíce poznatků o sobě samých. Přirozená otázka odkud jsme a kam směřujeme lidstvo trápí už mnoho tisíc let a je tou hlavní silou, která vede k novým objevům. V současné době jsou to právě genetické studie, které antropologům dávají do rukou nástroj k odhalení nových skutečností o lidech, jejich nemocech a příbuzenských vztazích. Genetika je také nástrojem mnoha dalších vědních oborů současnosti. Antropologie kombinuje fyzické pozorování a měření kosterního materiálu s genetickými metodami, aby tak zpřesnila a dovedla do větších podrobností výsledky svých studií. DNA molekula uložená v tkáních se dědí z generace na generaci a umožňuje tak sledovat příbuznost určité linie jednoho a více druhů. Molekulární biologie odkrývá minulost na základě studia DNA. DNA studovaných populací po dlouhou dobu pocházela výhradně z biologického materiálu současně žijících populací. Před dvaceti lety však vyšlo najevo, že DNA přežívá i v historickém biologickém materiálu (kosti, zuby, tkáně mumifikovaných či zmrzlých těl). V polovině osmdesátých let se poprvé podařilo izolovat DNA ze svalu vyhynulého druhu zebry staré 140 let (Higuchi et al., 1984). Následné důkazy existence DNA v mnohem starších nálezech, až tisíce a dokonce milióny let, rozpoutaly celosvětovou honbu za molekulární minulostí. S možností aplikace metody PCR (Saiki et al., 1985; Mullis Faloona, 1987) se postupně formovalo nové odvětví archeogenetika (či biomolekulární archeologie), která aplikuje molekulárně genetické metody na historickou DNA, označovanou ancient DNA adna. Deoxyribonukleová kyselina se tedy kromě přízviska nositelka genetické informace stala také nositelkou informace o životě lidí v dávných dobách. Kromě psaných zdrojů a kulturních praktik jsou samotné kosterní ostatky nejcennějším materiálem pro získání obrazu struktury pradávných populací. Do doby, než byly vynalezeny moderní molekulární techniky, byla data získávána pouze pomocí morfometrických a morfoskopických metod Řada obtíží je spojena s prací s adna. Samotná izolace této molekuly z historických biologických tkání není přímočará a vyvinuté postupy mnohdy nevedou k výtěžku, který by bylo možné analyzovat. Chyba nemusí být v postupech, 7

8 které vznikly zkoumáním molekuly současné, ale v samotné historické adna, která se v dané tkáni nemusí vůbec uchovat. V případě práce s adna je velikým rizikem kontaminace cizorodou DNA, která se jen s obtížemi od pravé autentické rozezná. Přesto je tento obor biomolekulární archeologie velice přitažlivým pro veliký potenciál podstatných údajů ukrytých v historických molekulách Cílem této práce je ověřit, zda je možné z historického kosterního materiálu z století ze Žatce získat adna (s použitím izolace silikátovou metodou). Izolovaná adna musí dále být v takovém stavu a čistotě, aby na ní mohla být aplikována metoda PCR pro získání amelogeninového úseku pro určení pohlaví. Dále je nutné ověřit zda získané údaje o pohlaví jedinců odpovídají pohlaví stanovenému morfologicky a zda se opravdu jedná o adna jedince a ne moderní kontaminaci (poslední bod s přihlédnutím na možnosti laboratoře). 1. najít vhodný postup pro získání molekuly adna z tvrdé lidské tkáně (silikátovou metodou izolace) a pomocí něho extrahovat adna 19 dospělých jedinců pochovaných v době mezi stoletím. 2. metodami molekulární biologie určit pohlaví jedinců. 3. zjistit poměr shody v určování pohlaví dvou nezávislých metod genetické a morfologické. 4. prokázat autenticitu adna vzorků (systém slepých kontrol, vysoký podíl shody mezi oběma metodami) V České republice zatím není mnoho pracovišť, které by se biomolekulární archeologií zabývaly. Pro řadu archeologů a antropologů je však tento obor velikým přínosem. Otázka pohlaví je jednou z nejdůležitějších charakteristik při popisu historického jedince. Není vždy zřejmé, zda morfologické postupy, které vznikaly na základě studia současných populací, jsou aplikovatelné na populace historické. V případě fragmentárních nálezů a skeletů nedospělých jedinců nalezených bez hrobových výbav je informace o pohlaví zjistitelná pouze metodami molekulární genetiky. 8

9 Teoretická č ást 1 adna 1.1 Historický pohled na adna objevy Úplně první objev existence adna byl zaznamenán u muzejního, 140 let starého exempláře vyhynulého druhu zebry quagga (Higuchi et al., 1984). V následném roce se podařilo získat první adna sekvenci (Pääbo, 1985). Jednalo se o fragment izolovaný z egyptské mumie 5000 let staré. S příchodem metody PCR začal revoluční start v analýze stopového množství deoxyribonukleové kyseliny. Další roky přinášely zprávy o úspěšné izolaci a analýze historické molekuly (Pääbo et al., 1988; Hagelberg et al., 1989 a mnoho dalších), avšak velice malá pozornost byla věnována autenticitě studovaného vzorku (Young et al., 1995). Fenomén kontaminace vzorků cizorodou (exogenní) DNA je tou největší překážkou a bude o něm pojednáno ve vlastní kapitole. Kvůli kontaminacím, které se staly součástí studovaného materiálu, byly proklamovány velkolepé výsledky o nalezení molekuly adna u vzorků i několik miliónů let starých (Golenberg et al., 1990; Cano et al. 1992). Později se ukázaly jako chybné. V roce 1997 se podařilo izolovat mtdna (mitochondriální DNA) z části kosti pravěkého neandrtálce (Krings et al.,1997). Zjistilo se, že neandrtálci jsou s námi lidmi více příbuzní než šimpanzi, ale že rozdíly spadají mimo variaci mezi lidskými populacemi. V době Kringsova objevu nebyla známa možná sekvence stejně starého moderního člověka, která by danou příbuznost lidí a neandrtálců více potvrdila či vyvrátila. Teprve v roce 2001 se podařilo izolovat úsek lidské mtdna let staré (Adcock et al., 2001). Získaná sekvence však nebyla podobná ani neandrtálské z přibližně stejné doby, ani současné moderní lidské. Mnohé výsledky se stávají terčem kritik kvůli nemožnosti vyloučení přítomnosti kontaminace. To vedlo k navržení pravidel čistoty práce s historickým materiálem (Poinar, 2003). 9

10 1.2 DNA struktura a vlastnosti V každé buňce lidského těla (existují výjimky) je v jádře uloženo 46 chromozomů, které jsou tvořeny lineární dvouřetězcovou molekulou DNA. Kromě jádra je DNA uložena ještě v jiném buněčném kompartmentu v mitochondriích. DNA je polymer skládající se z nukleotidů. Jeden nukleotid se skládá z pětiuhlíkového monosacharidu 2-deoxyβ-D-ribózy (deoxyribózy), kyseliny trihydrogenfosforečné a ze čtyř možných bází adeninu A, guaninu G (A, G puriny), cytozinu C či thyminu T (C, T pyrimidiny). Dva řetězce lineárně za sebou jdoucích bází jsou k sobě poutány vodíkovými vazbami. A se vždy páruje s T a G s C. Každý chromozom obsahuje průměrně 5, páru bází (bp base pair). Pořadí nukleotidů v jednom řetězci udává specifickou sekvenci, která může, ale nemusí podléhat procesu transkripce pro tvorbu proteinů. Poprvé byl genetický kód dešifrován v roce Úsek sekvence, podle níž vzniká protein, se nazývá gen. Gen je dlouhý průměrně bp. Velikost záleží na složitosti biologické informace, kterou nese. Proteiny vzniklé na základě genů se podílejí na celém procesu vývoje a diferenciace, který postupně přetváří oplodněné vajíčko ve životaschopnou bytost. Molekula DNA je předlohou většiny proteosyntetických aktivit. Její dvoušroubovice je složena z úseků kódujících a nekódujících. V kódujících oblastech jsou za sebou 4 nukleotidy poskládané do dlouhých sekvencí tak, aby daly vzniknout tělu potřebnému proteinu či funkční transkripční jednotce. Mnohem větší podíl však zaujímají oblasti, které proteiny nekódují. Rozsáhlé intergenové oblasti zaujímají až 70 % DNA (Cox et al., 2000). Čas od času se na těchto úsecích objeví nová mutace. Jelikož na ni nepůsobí vliv selekce, uchovává se do dalších generací a postupně se kumuluje s dalšími mutacemi příbuzných populací. Rychlost mutací není ve všech intergenových oblastech stejná. Vlastnosti mutovat a nebýt selektován se využívá při populačních studiích a mezidruhové příbuznosti. V lidské DNA umožňují tyto sekvence určit jedince a jeho příbuznost k dalším jedincům. Určení příbuznosti jedince 10

11 je možné i přes variabilitu v kódujících oblastech, a to díky existenci různých forem jednoho genu, takzvaných alel. V nekódujících oblastech se nacházejí rozsáhlé úseky repetic. Repetice je specifická sekvence nukleotidů, která se vyskytuje v genomu na různých místech či tandemově za sebou. Většinou byly pojmenovány podle restrikčního enzymu, který je štěpí. Jelikož jsou repetice v rámci příbuzných druhů a částečně i v rámci jednoho druhu odlišné, neuvažuje se o jejich biologické funkci. V molekulární biologii však našly široké uplatnění. Lineární struktura DNA se během buněčného cyklu různě rozvolňuje či kompaktuje. Ve fázi transkripčně aktivní je její struktura rozvinuta na 10 nm vlákno, které je místy obtočeno okolo histonového (proteinového) komplexu. Ve fázi mitózy je struktura DNA naopak nejhustší a tvoří klasické chromozomy. Mitochondriální DNA (kružnicová dvoušroubovice) je oproti obrovské jaderné pouze nukleotidů dlouhá (37 genů) (viz tabulka 1-1). V jedné buňce je mnoho jejích kopií. Jelikož na jednu mitochondrii připadá 10 molekul a mitochondrií je přibližně 800 na jednu buňku, počet jejích molekul mnohonásobně převyšuje počet molekul jaderných. Z toho důvodu se v oblasti biomolekulární archeologie více využívá její fragmenty je snazší detekovat. Tabulka 1-1 Porovnání jaderné a mitochondriální DNA mtdna ndna Zastoupení v buňce * 23 v haploidní buňce Počet páru bází (bp) Počet genů (informace se liší) Typ molekuly DNA kružnicová dvoušroubovice lineární dvoušroubovice * průměrně 800 mitochondrií na buňku a 10 mtdna na jednu mitochondrii 11

12 1.3 adna molekula chemické vlastnosti adna molekula se v jistých parametrech od recentní DNA liší. K její obecné charakterizaci patří, že je degradovaná. Tento pojem v sobě zahrnuje její fragmentárnost a chemickou modifikaci. Bylo zjištěno, že degradace DNA ve tkáních je závislá na podmínkách, ve kterých se nachází, více než na době, po kterou je od smrti uložena. Ve vysušené lidské kůži 4 roky staré a let staré nebyl mezi délkou fragmentů DNA veliký rozdíl (Pääbo, 1989). Krátce po smrti v buňce dochází k autodegradaci. Enzymy nukleázy, běžně se vyskytující v buňce, začnou štěpit vlastní DNA (Rogan Salvo, 1990). Vodní prostředí a teplota mezi C je pro funkci těchto enzymů ideální. Větší odklon od tohoto optima napomáhá adna se uchovat. Po 20 dnech po smrti funkce těchto enzymů ustává a na další kondici molekuly DNA mají vliv organismy nacházející se v bezprostřední blízkosti bakterie, houby, hmyz. Mikroorganismy uvolňují do svého okolí volné radikály, které narušují strukturu poruchami v dusíkatých bazích. Více jsou poškozeny pyrimidinové báze C, T (Pääbo, 1989). Další vliv na zachovalost molekuly adna mají oxidace a hydrolýza, které modifikují jednotlivé stavební kameny celé struktury. RNA je kvůli 2'OH zbytku citlivější k hydrolýze a to hlavně v prostředí Ca- 2+ a Mg 2+. Tyto vlastnosti v dobách prvopočátku života mohly vést k redukci OH skupiny a vzniku deoxyribózy. Deoxyribóza má tedy zvýšenou rezistenci fosfodiesterové vazby v DNA, ale na druhou stranu má labilní N-glykosylovou vazbu, což je vazba mezi cukernou složkou a purinovou nebo pyrimidinovou bází. Hydrolýza N-glykosylové vazby vede k uvolnění báze od páteře DNA a vznikají tak apurinová či apyrimidinová místa. Podle Lindahla (1993) jsou puriny k hydrolýze náchylnější než pyrimidiny. Z purinů je potom náchylnější guanin. Na místě, kde došlo k ztrátě báze se krátce poté řetězec oddělí dochází tak k fragmentaci na kratší úseky. Při vysoké iontové síle je depurinace zpomalena. Navázání DNA na hydroxyapatit dokáže rychlost depurinace až 2 zpomalit. Velice často dochází k deaminaci cytosinového zbytku (Hofreiter et al., 2001), jež vede k tvorbě uracilu. Ten se za běžných podmínek páruje s adeninem. Původní cytosin se tedy nesprávně páruje s adeninem a dochází tak k transverzi (záměna purinu za pyrimidin). Tento 12

13 efekt může vést k chybné informaci při sekvenování vybraného úseku adna (Poinar, 2003). Vlivem oxidace vznikají fragmenty a cross-linky a často dochází k pozměnění báze. Hlavní cíl oxidací je dvojitá vazba mezi dvěma uhlíky pyrimidinových bází a imidazolový cyklus purinů. Obojí vede k rozrušení cyklu. Mezi oxidací modifikované báze patří hydantoiny. U vzorků s úspěšně amplifikovanou autentickou adna bylo naměřeno nižší množství hydantoinů oproti vzorkům, z jejichž extraktů PCR reakce neproběhla (Höss et al., 1996, Hofreiter et al., 2001). Jako nejčastější modifikace byly zaznamenány: 5-OH-5- MeHyd, 5-OH-Hyd, 8-OH-guanin. Hydantoiny blokují postup DNA-polymerázy při elongaci nově vznikajícího řetězce. K oxidaci DNA dochází nejenom ve vlastním buněčném prostředí při metabolismu, ale také při izolaci fenolem, chloroformem a při použití vzduchem saturovaných pufrů. V jádru buňky k metabolismu nedochází, za života je zde proto minimum šance poškození oxidací. Naproti tomu mitochondriální DNA je vystavena reaktivním oxidativním metabolitům mnohem častěji. Oxidací DNA hydroxylovými zbytky nejčastěji vzniká 8-OH-guanin (8-hydroxyguanin), který se nepáruje s cytozinem, ale s adeninem, a při replikaci tak vzniká chyba. 8-hydroxyguanin byl ve velkém množství detekován v mtdna. Poruchy vyvolané volnými radikály by mohly být zodpovědné za vysokou mutační rychlost mtdna. Chladné a suché prostředí by mělo být významné pro vysokou míru zachovalosti adna. Další vliv na adna má hloubka uložení ostatků v zemi, druh okolní zeminy, ph půdy, stupeň hnilobného procesu, voda, kyslík, kontaminace cizorodou DNA a mnoho dalších. Na Floridě se archeologům podařilo odkrýt rašeliništní nálezy lidského původu, kde sice šlo o kyselou půdu, ale uloženou na vápenci. Izolované fragmenty dosahovaly skoro 1000 bp. V tomto případě se ph blížilo neutrální hodnotě a adna se zachovala ve vysokomolekulárním stavu (Pääbo et al., 1988) Absorpční maximum, které se u moderní DNA uvádí okolo 260 nm, je u adna nižší. Z bází převládají purinové A/G nad pyrimidinovými C/T. Narušení nebo úplná ztráta báze může být opravena systémem enzymů polymerázy Escherichie coli a T4-DNA ligázy (Pusch et al., 1998), ale takové postupy jsou zatím vidinou budoucnosti. 13

14 Vhodnými podmínkami pro uchování vysokomolekulárního stavu DNA jsou: Částečná dehydratace Teplota mimo teplotní optimum enzymů, spíš nižší (Höss, 1996) Absence kyslíku Neutrální ph Absence mikroorganismů zjišťování zachovalosti DNA Mezi techniky zachycující zachovalost DNA ve vzorku patří snímky z elektronového mikroskopu příčným řezem kostí a následné zjišťování morfologických charakteristik (Kolman Tuross, 2000). Vyšší stupeň histologické neporušenosti indikuje stejně tak vyšší stupeň neporušenosti adna (Haynes et al. 2002), přičemž stádií zachovalosti je 5. Platnost takovýchto zákonitostí byla u dřívějších prací zpochybněna (Pusch Scholz, 1997). Poměrně často používanou metodou je racemizace AMK (Poinar et al., 1996). Bylo zjištěno, že zachovalost DNA koresponduje s poměrem D a L enantiomerů aminokyselin v proteinech. U živého člověka se nachází 100 % AMK v konfiguraci L (levotočivé). Postupující degradací tkání se některé aminokyseliny přetáčí do konfigurace D (pravotočivé). Pokud se zjistí, že poměr enantiomerů kyseliny asparagové je D : L > 0,08, potom by ve vzorku neměla být žádná amplifikovatelná adna. Kromě kyseliny asparagové se používá alanin a leucin. 1.4 Problematika práce s adna chemická modifikace fragmentace kontaminace chemická modifikace Práce s historickým materiálem přináší řadu obtíží. Chemické vlastnosti látek, které byly po dlouhou dobu vystaveny různorodým vnějším podmínkám (slunce, chlad, vlhko, půdní organismy ), jsou značně modifikované a dalo by se říci v jistém smyslu zchátralé (viz výše). Nemají tedy stejné vlastnosti jako 14

15 moderní recentní látky pocházející ze stejného typu materiálu. Na kostech nemůžeme na první pohled určit, zda z nich izolujeme dostatečně dlouhou molekulu DNA. Jistým pravidlem však zůstává, že ze zvětralých, suchých a drolících se kostí bude velmi pravděpodobné, že DNA bude velice málo zachovalá. Taková kost tedy nebude vhodná pro adna analýzu. Metody molekulární biologie postupně vznikaly pouze na recentních materiálech a proto jejich aplikace na historické chemické látky nemusí fungovat stejným způsobem kontaminace Ke kontaminacím (tabulka 1-2) patří DNA pocházející z jiných zdrojů než z jedince, jemuž zpracovávaná tkáň patřila. Také k nim patří anorganické soli, těžké kovy, půdní organické látky, proteiny (kolagen, hem, cytochromy, melanin apod.), které brzdí celý proces množení a analýzy adna (Cooper, 1994). Kontaminující lidská DNA bývá většinou recentní, tudíž pocházející od laborantů přímo v laboratoři, od archeologů, kteří kosterní pozůstatky vyndávají ze země, od antropologů, kteří zpracovávají kosterní materiál a konečně se historický vzorek může kontaminovat náhodnou osobou, jejíž DNA se nachází ve vzduchu. Tabulka 1-2 Typy a zdroje kontaminací kontaminace bránící řádnému průběhu PCR jedinci, kteří byli v kontaktu se vzorkem, jež mohli kontaminovat nejhorší typ kontaminace, zničí všechny vzorky půdní koextrakty archeolog produkty předchozí amplifikace biologické koextrakty antropolog archeogenetik náhodná osoba Recentní DNA není chemicky modifikovaná a mnohem snadněji podstupuje proces PCR s cyklickou denaturací, annealingem primerů a elongací nového řetězce. Snadno se tak může stát, že jediná recentní molekula DNA, která je ve vzorku izolátu v menšině oproti adna, ve výsledku převáží produkt 15

16 adna historického jedince a vznikne tak falešný výsledek. Pro účely zabránění kontaminace vznikla určitá pravidla: se vzorkem se od počátku zachází tak, aby se zabránilo kontaminaci s každým vzorkem se manipuluje s materiály na jedno použití, které se navíc často mění: gumové rukavice, plastové špičky k odebírání malých množství chemických činidel a sloučenin celý proces extrakce se provádí v laminárním boxu, který zabraňuje kontaminaci molekulami DNA v laboratoři, prostor se často sterilizuje chemickými látkami (lihobenzín) a intenzivním UV světlem z povrchu kosti se mechanicky i chemicky odstraňují možné kontaminující částice chemikálie se dekontaminují: UV radiace (240 nm), autokláv, přidání silikátu do chemikálií (ty se stočí a supernatant je bez kontaminujících molekul), veškeré plochy a nástroje se sterilizují: UV radiace (240 nm), autokláv, lihobenzín, 5% chlornan sodný k celé práci s adna musí sloužit minimálně dvě místnosti; jedna je určena k čištění kosti, drcení, extrakci a nasazování PCR, druhá slouží k PCR a analýze produktů při extrakci a následné analýze se vždy používá systém slepých kontrol čistoty práce (viz níže) není možné přenášet věci z druhé (post-pcr) místnosti do první v každé místnosti je jeden plášť každý z laborantů má vlastní chemikálie V práci s lidskou adna je tedy nutné určit, že výsledek skutečně pochází z historického materiálu. Autenticitu výsledků není jednoduché prokázat. V mnoha nově publikovaných pracích je běžně aplikované klonování a sekvenace výsledného fragmentu (Krings et al.,1997), přičemž 10 osekvenovaných klonů by mělo vypovědět o míře přítomnosti endogenních a exogenních sekvencí (Poinar, 2003). Sekvence by měly dávat fylogenetický smysl. Kriterium, že pro daný zkoumaný úsek bychom měli znát alelickou frekvenci a geografickou distribuci (Montiel et al., 2001; Poinar, 2003), se nám zdá nereálné v případě práce s adna. 16

17 Levnější metodou bývá opakovaná extrakce a analýza vzorku ve stejné a v jiné laboratoři. U systému slepých kontrol se monitoruje čistota používaných chemikálií a postupu práce. Běžně se používá kontrola izolační a amplifikační. Extrakční kontrola podstupuje stejné procedury jako ostatní vzorky při izolaci, ale neobsahuje lidskou DNA. Namísto lidského biologického materiálu se ke vzorku přidá voda, nebo extrakt ze zvířecí kosti ze stejného naleziště. Čisté slepé kontroly však podle některých studií neznamenají absenci kontaminace v ostatních vzorcích (Kolman Tuross, 2000). V amplifikačním kroku analýzy se jedna zkumavka použije na kontrolu čistoty chemikálií a postupu přípravy PCR amplifikace. Do PCR zkumavky se dají stejné chemikálie jako do ostatních vzorků a namísto templátu se přidá voda. Tento systém umožňuje zároveň odhalit, v jakém kroku (izolace či amplifikace) k případné kontaminaci došlo. K nejhorším typům kontaminace patří přenos dříve vzniklého produktu do prostředí zkumavek nových vzorků. Z tohoto důvodu existují 2 oddělené místnosti pre-pcr a post-pcr. Metodou, která úspěšně zabraňuje přenosu produktů amplifikace, je zabudování uridintrifosfátu na místo thymidintrifosfátu do nově syntetizovaného řetězce. Všechny vzorky se před amplifikací ošetří enzymem uracil-n-glykozylázou a pokud se produkt (řetězec s U) přenese do vzorku s ještě neproběhlou cyklickou reakcí, bude hned v prvním cyklu zničen tímto enzymem a zabrání se tak kontaminaci produktem. V jedné studii (Richards et al., 1995) při pokusu analyzovat zvířecí kosti ze stejného naleziště, ze kterého se analyzoval lidský materiál, došlo k velkému překvapení: 50 % zvířecích kostí bylo kontaminováno lidskou DNA. Komerčně dodávané chemikálie jsou běžně kontaminované sekvencemi do 200 bp (Kolman Tuross, 2000), jelikož se předpokládá jejich použití pro recentní DNA. Výsledek z recentní DNA není touto kontaminací ohrožen, jelikož vstupní množství je ve velikém nadbytku a běžně analyzované sekvence přesahují 1 kb. Obecně platí dodržování čistoty práce a používání co nejméně chemikálií a kroků. S ohledem na laboratorní vybavení bude autenticita v této práci prokázána vysokou mírou shody mezi výsledky genetické a morfologické studie a aplikováním systému slepých kontrol. 17

18 1.4.3 fragmentace Lineární DNA se formuje do nukleozomů, ty pak do solenoidů a ty se připojují na proteinové lešení, které utváří podobu chromozomu. Molekula adna je fragmentována na úseky v průměru kolem 200 bp (Pääbo, 1989). Struktura nukleozomu vypadá jako šňůrka, kde po zhruba 150 bp je histonový komplex, na němž je omotána lineární DNA zhruba 200 bp dlouhá. Dalo by se tedy uvažovat o tom, že přežívá právě tato část chráněna histonovými proteiny. Délka cca 200 bp je důležitým limitujícím faktorem při práci s adna. Neznamená to však, že všechny fragmenty adna jsou takto krátké. Výjimečně se objeví i 1500 bp dlouhá sekvence. Je ale téměř nulová pravděpodobnost, že by námi vybraný úsek, například 800 bp, ležel právě v takto extrémně dlouhé sekvenci. Většina primerů PCR reakce se proto designuje pro úseky okolo 200 bp, spíš kratší. Je nutné využívat informací, které se vejdou do takto krátkého úseku. Tuto podmínku například splňují STR lokusy pro určení příbuznosti nebo amelogeninový úsek pro určení pohlaví, ale ne telomerické konce chromozomů pro určování stáří jedince. V následující tabulce (1-3) je zmíněno stáří několika získaných adna. Tabulka 1-3 Stáří několika získaných adna stáří vzorku nález rok publikace autor australský moderní člověk 2001 Adcock et al neandrtálec 2000 Ovchinnikov et al moderní člověk 1995 Beraud-Colomb 7000 moderní člověk 1988 Pääbo moderní člověk 1994 Hänni 2000 moderní člověk 1999 Oota 80 moderní člověk ostatky Romanovců 1994 Gill 18

19 2 adna materiál 2.1 Buňky kosterního materiálu, ze kterých se DNA izoluje Molekula deoxyribonukleové kyseliny pochází jen z několika typů buněk kosterního materiálu. Jedná se hlavně o osteocyty, osteoblasty a osteoklasty. Při vývoji kosti nejprve působí osteoblasty, jejichž činností vzniká základní hmota kosti. Jsou-li touto hmotou zcela obklopeny, mění se v osteocyty, stavební kameny kosti. Osteocyty jsou uloženy v lakunách základní hmoty, nejsou mitoticky aktivní a k jejich funkci patří regulace Ca 2+. Svými výběžky formují uvnitř kosti prostorovou plazmodiální síť, která prostupuje kostní lamely. Osteoklasty jsou mnohojaderné buňky ( ) a tedy vhodné pro izolaci jaderné adna. Jsou specializované na odbourávání při přestavbě kostní hmoty. Dalším typem buněk, ze kterých je možné izolovat DNA, jsou buňky krve uvízlé v lakunách kosti, buňky epitelu z Haversova systému a zbytky buněk chrupavky. 2.2 Typ biologického materiálu vhodného pro izolaci První izolace historické fragmentované adna byly provedeny na měkkých tkání organismů muzejních sbírek. Izolace pocházely ze svalu (Higuchi et al.,1984), egyptské mumie dítěte (Pääbo, 1985) či z rašeliništních nálezů těl organismů (Hagelberg et al.,1989). V dnešní době existuje mnoho úspěšných izolací z kosterního materiálu, kde je molekula DNA vázána na hydroxyapatit (Brown Brown, 1992; Pääbo,1989, Götherström et al., ). Kost je pro uchování molekuly DNA lepším prostředím než měkká tkáň, jelikož tvoří bariéru proti enzymatickému a bakteriálnímu rozkladu (Richards et al., 1995). S příchodem metody PCR (Saiki et al., 1985; Mullis Faloona, 1987) nastal revoluční start v analýze i stopových množstvích DNA. K extrakci jsou vhodné jen některé kosterní pozůstatky, avšak vzhled kosti neindikuje zachovalost adna (Pusch Scholz, 1997), což je ve sporu s jinou prací, která řadí kosti podle zachovalosti histologického řezu do 5 skupin a přiřazuje jim přítomnost amplifikovatelné adna (Haynes et al. 2002). Spongióza se zdá být pro extrakci naprosto nevhodná. Zub je v mnoha případech lepším konzervačním prostředím než kost a lépe zabraňuje 19

20 kontaminaci. Zubní tkáň je z větší části tvořena anorganickou složkou a její povrch lépe odolává bakteriálnímu působení (Kurosaki et al 1993; Merriwether et al., 1994). Kosterní pozůstatky ze stejného naleziště, a dokonce z téhož jedince, nemusí vykazovat stejnou zachovalost adna (Faerman et al.,1995). Pokud máme k dispozici kost stehenní, pažní a žebro, je vhodnější vzít pro analýzu vzorek z kosti stehenní či pažní, neboť ze žebra se adna špatně izoluje. Jeho kompakta je velice tenká (Faerman et al., 1995) a jeho DNA degraduje rychleji (Perry et al., 1988). Materiál, se kterým nebylo od počátku zacházeno s pravidly zamezujícími kontaminaci, není vhodný k izolaci adna (Machugh et al., 2000). Jak vybírat vzorky? Kost je lepší než měkká tkáň Kompakta kosti je lepší než spongióza Zub je lepší než kost Mohutnější kosti (stehenní) jsou lepším zdrojem než kosti drobné (žebro) Při výběru studovaného souboru mi nebyly všechny tyto okolnosti známy. Stalo se tedy, že většina vzorků pocházela ze žebra, které je jinými autory považováno za nevhodný biologický materiál pro izolaci adna. Se vzorky také nebylo od počátku zacházeno pro účely adna analýzy. 20

21 3 Informace v adna a jejich využití 3.1 Spektrum informací v adna Vlastnosti degradované molekuly adna umožňují jen omezené získávání informací. Limitovány jsou hlavně délkou sekvence, která jen výjimečně přesahuje 200 bp (Pääbo, 1989). Nejčastější aplikací je zjišťování informací o pohlaví a příbuznosti, jakožto nejdůležitějších markerů paleodemografických studií. Krátké sekvence adna však umožňují zodpovědět i jiné otázky (tabulky 3-1 a 3-2). Mezi ně patří možné genetické onemocnění jedince či potvrzení onemocnění vyvolané patologickým agens, které nemusí být patrné na osteologickém materiálu (tuberkulóza Mycobacterium tuberculosis, lepra Mycobacterium leprae, ikterus virový hepatitis nebo malárie Plazmodium malariae). Získání molekuly adna z více jedinců náležících do jedné a více populací umožňuje sledovat pohyb, nahrazování nebo stabilitu obyvatelstva určitého území. Pravděpodobně nejzajímavější jsou studie zabývající se evolucí člověka. Ty jsou však omezeny časově a zatím dokáží pracovat s nálezy do let (Stankiewicz et al. 1998), tedy s druhy Homo neanderthalensis a Homo sapiens. Kromě výše uvedených aplikací, je možné zjistit pomocí adna ukryté v netkáňových zdrojích mnohé charakteristiky společností historických populací (tabulka 3-2). V koprolitech může být zachována molekula adna flory a fauny dané doby a umožní vysledovat složení potravy obyvatelstva a složení preferovaného ekosystému. Z hlediska zkoumání kulturních praktik historických populací je možné díky adna ukryté v zářezech a ohybech kamenných nástrojů zjistit spektrum používání tohoto nástroje (zbraň, nástroj, pomůcka...). Tkanina oblečení muže z ledovce se skládá z travin, které se musely hojně vyskytovat v ekosystému, kde žil (Rollo et al., 1994). Spektrum zjistitelných informací Pohlaví (Faerman et al., 1995, Cippollaro et al., 1998,) Příbuznost (Gill et al.,1994) Evoluční mechanismy (Adcock et al., 2001) Původ infekčních a genetických onemocnění (Faerman et al., 2000) Vztah mezi genetickou a morfologickou variabilitou (Götherström et al., 1997) 21

22 Tabulka 3-1 Spektrum informací uložených v molekule adna jedinec rodina populace druh pohlaví příbuznost genetické onemocnění infekční onemocnění příbuznost rodin daného pohřebiště stupeň inbreedingu endo X exogamie matri/patrilinearita migrace fylogenetická příbuznost typ společnosti původ nemocí fylogenetická příbuznost matri/patrilokalita Tabulka 3-2 adna ze zdrojů, které nejsou živočišného původu či nepochází přímo z živočišné tkáně lidské atributy zdroje informací preferovaný ekosystém flora (semena), fauna (fosilní nálezy) složení potravy rozbor koprolitů kulturní zvyklosti adna v záhybech nástrojů Principy určování jednotlivých charakteristik historických populací jsou ve stručnosti popsány v příloze 4 této práce. Zde jsou jen pro ilustraci příklady studií využívajících informací v adna s konkrétní historickou aplikací: Studie využívající znalost pohlaví Faerman et al., 1998: Ashkelon: veliké naleziště novorozeneckých kostřiček v odpadním kanálu lázní doby Římského impéria. Společně s kostrami novorozenců byly na místě kosti zvířecí a běžný odpad. S ohledem na tento fakt a s ohledem na porovnání tohoto naleziště s nalezištěm běžného pohřbu novorozence z té doby, se usuzuje, že jedinci byli obětmi infanticidy. Genetickými metodami bylo stanoveno pohlaví u celkem 19 jedinců ze 43 (44,2% úspěšnost) a to ženské ku mužskému v poměru 5:14. Tento výsledek byl překvapující. Jak je možné, že bylo tolik mužských potomků podrobeno infanticidě, když muži byli v této době privilegovaní a obecně více uznávaní? Možné vysvětlení vyplývá z předpokladu, že infanticida byla provedena na potomcích kurtizán, které si raději nechávaly dcery, které mohly dál pokračovat v jejich řemesle. 22

23 Studie příbuznosti Jehaes et al., 1998: V Holandském Delftu jsou uloženy ostatky údajného Louise XVII. Genetické metody odkryly STR profil jedince, který s jistotou 100 % nebyl synem Louise XVI. ani Marie-Antoinetty. Z této studie vyplývá, že sledovaný jedinec buď nebyl opravdovým Louisem XVII., za kterého byl považován, a nebo že se údajným rodičům nedařilo mít vlastního potomka a Louis XVII. nebyl tedy pokrevním synem. Řešením nastalé situace také může být fakt, že vědci nezkoumali autentickou DNA Louise XVII., ale DNA, která vzorek kontaminovala. 3.2 pohlaví Pohlaví lidských ostatků v oblasti forenzních věd a antropologie je určitelné pomocí metod morfologických a genetických. Na zachovalé pánvi či lebce dospělého jedince je možné pohlaví velice spolehlivě určit pomocí měrných bodů a diskriminačních funkcí. V případě nálezu nedospělého jedince s nevyvinutými sekundárními pohlavními znaky či při nálezu pouhých úlomků kostí je situace složitější. Tam, kde není možné aplikovat klasické morfologické metody, které mají velikou výhodu v nízkých nákladech analýzy, nastupuje molekulární biologie Při znalosti pohlaví jedince je možné porovnat specifickou fyzickou zátěž, specifické potravní složení či sociální postavení mužů a žen. Také je možné ověřit aplikovatelnost morfologických metod na historické populace bez znalosti konkrétních podmínek prostředí. 3.3 amelogenin a pohlaví Systém molekulárně biologického určování pohlaví je založen na přítomnosti XX chromozomu u ženského pohlaví a XY chromozomu u pohlaví mužského. Jednou z nejvíce používaných technik je určení pohlaví přes detekci krátké oblasti genu pro amelogenin. Ten se nachází na pseudoautozomální oblasti krátkých ramének X a Y chromozomu, přičemž délka tohoto genu se na každém genoforu liší. Rozdíly jsou krátké delece a inzerce, které se v průběhu evoluce fixovaly (obrázek 1). Na detekci těchto detailů je založen celý princip určování pohlaví. Jedinec XX (žena) a XY (muž) může být rozpoznán díky rozdílné délce specifického úseku oblasti DNA. 23

24 V historii určování pohlaví byly nejdříve používány lokusy pouze pro Y chromozom (nejednalo se o lokus amelogeninu) (Hummel Hermann, 1991). V případě, že jedinec byl ženského pohlaví, nebyl viditelný výsledek žádný, což mohlo stejně dobře znamenat, že daný lokus ve fragmentované adna úplně chybí a přitom se jedná o pohlaví mužské. Později se studium zaměřilo na oblasti genu pro amelogenin (Nakahori et al., 1991), z něhož se dala vyčíst informace pro obě pohlaví. Bylo tedy zřejmé, zda je jedinec muž nebo žena či zda se adna vůbec zachovala. První zvolené sekvence však byly příliš dlouhé pro analýzu adna (863 bp (X) a 674 bp (Y) Akane et al., 1992). Sekvence do 300 bp (Faerman et al., 1995) jsou spíše za hranicí detekce u adna izolátu. Pokud zvolená sekvence přesahovala více jak 400 bp, výsledky byly zpochybněny (Ovchinnikov Goodwin, 2003). V oblasti amelogeninového lokusu se nachází 19 míst s absolutní homologií. Na chromozomu X se ve vývoji tohoto genu ustálilo 5 delecí (22 80 bp), na chromozomu Y také 5 delecí (1 183 bp). Velikost genu je 2872 bp na X a 3272 bp na Y. Pro určování pohlaví existuje mnoho systémů primerů, které vždy zahrnují nějakou z delecí/inzercí (Haas-Rochholz Weiler, 1997). Na genetické mapě leží amelogenin na Xp22.1 Xp22.3 a na Yp11.2. Gen pro amelogenin se skládá z exonů a intronů. Protein amelogenin se produkuje v buňkách specializovaných na výrobu zubní skloviny. Jeden ze systémů pro určování pohlaví z historické adna používal 3 primery v jedné PCR reakci. Primery 1 a 2 přisedaly k X chromozomu a primery 1 a 3 k Y chromozomu, kde zahrnovaly deleci 64 bp (Götherström et al., 1997). V tomto případě byla délka X specifické sekvence 195 bp dlouhá. Později se našel úsek amelogeninové oblasti, který zahrnoval deleci 6 bp. Tento systém je pojmenován AMEL 106/112 bp a své uplatnění našel i ve forenzních vědách (Sullivan et al., 1993). Jiný ze systémů určování pohlaví pomocí amelogeninového lokusu nevyužívá délkový rozdíl amplifikovaných segmentů, ale sekvenční specifika zjistitelná pomocí metody hybridizace (Stone et al., 1996). Oba fragmenty X a Y chromozomu mají délku 112 bp, ale uvnitř této sekvence jsou rozdílné úseky, které je možné detekovat pomocí hybridizačních sond. Pro PCR ve forenzních vědách a v bioarcheologii je vhodné, aby cílový fragment amelogeninového lokusu byl maximálně 150 bp dlouhý. Pro účely analýzy adna v této konkrétní práci byly použity primery pro úsek 106/112 bp a 80/83 bp (Haas-Rochholz Weiler, 1997). Fragmenty velikosti 80/83 bp 24

25 by v historickém materiálu měly být přítomny s vyšší pravděpodobností než fragmenty 106/112 bp. Naamplifikuje-li se pouze úsek o stejné délce, jedná se o ženu. Pokud ve výsledku budou dva produkty nestejné délky, jedná se o muže. Problémem při práci s malým množstvím degradované molekuly adna může být alelický drop-out, který při amplifikaci vynechává jednu z alel (buď X nebo Y) (Zierdt et al., 1996). Obrázek 1 Princip delece / inzerce v DNA sekvenci* * nejedná se o žádnou konkrétní sekvenci, ta je znázorněna na schématu 1 na str. 41 Jiný přesnější systém pro určování pohlaví je založen na multiplexové amplifikaci STR polymorfismů na pohlavních chromozomech (Schmidt et al., 2003). Jedná se o čtyři STR lokusy (2 na X a 2 na Y), které jsou veliké od bp a umožňují určit správně pohlaví i v případě alelického drop-outu. V době zpracování souboru Žatce se tato metoda multiplexové PCR nepoužívala. Jistě však bude v budoucnosti uplatněna. 25

26 Metodika práce s adna výběr souboru očištění tkáně (zub, kost) nadrcení na prášek izolace adna amplifikace zvoleného úseku adna délková analýza vzniklých produktů vyhodnocení 26

27 4 Výběr souboru 4.1 Soubor žateckých jedinců Jedná se o soubor 19 dospělých jedinců z doby století s velice dobře zachovalými kosterními pozůstatky, které umožnily určení pohlaví na základě morfologických dat (Schmitt et al., 2001). Vysoká zachovalost pohlavních znaků na kostře se stala hlavním kritériem daného výběru. Díky výrazným pohlavním markerům bylo morfologické určení stanoveno s 95% spolehlivostí (5 mužů ze 100 má tedy pánev ženskou a naopak). Celý soubor naleziště Chelčického náměstí je uložen v kosterním depozitáři Národního muzea v Horních Počernicích. Po celou dobu experimentu mi bylo určené pohlaví utajeno. V tabulce 4-2 jsou jednotliví jedinci označeni specifickým číslem, které odpovídá číslu v databázi Archeologického ústavu Akademie věd v Praze. Tento soubor slouží jako materiál pro izolaci adna, na které bude provedena analýza pro určení pohlaví jedinců. Výsledky poté budou konfrontovány s morfologicky definovaným pohlavím. Případná shoda obou výsledků podpoří funkčnost obou metod, přičemž bude možné aplikovat molekulárně-biologickou metodu na fragmentovaný či nedospělý kosterní materiál a očekávat objektivní výsledek. Shoda obou metod také potvrdí čistotu práce v dané laboratoři zaměřené na práci s autentickou adna. 0 50% shoda v určení pohlaví by znamenala, že ve vzorcích byla s vysokou pravděpodobností kontaminující moderní DNA morfologické určení pohlaví Systém určení pohlaví pomocí morfologických metod byl založen na vyhodnocení morfoskopických dat a primární a sekundární analýzy dat morfometrických (Černý et al., 1999). Zachovalá pánev jedinců, jakožto nejspolehlivější část postkraniálního skeletu při určování pohlaví jedinců s neznámou mírou sexuálního dimorfismu pánevních rozměrů, sloužila k primární diagnóze. V případě morfometrického přístupu byly lineární rozměry (v počtu 4 8) vyhodnoceny počítačovým systémem (COMPUTSEX) k získání posteriorní pravděpodobnosti (Murail et al., n.d.). Tento počítačový program hodnotí rozměry neznámého dospělého jedince s rozsáhlou databází multietnických a multiregionálních dat. V případě morfoskopického přístupu 27

28 bylo vyhodnoceno 5 znaků (Bruzek, 2002), přičemž každému z nich byla přisouzena míra maskulinizace či feminizace. Sekundární pohlavní diagnóza byla stanovena výpočtem posteriorních pravděpodobností diskriminačních funkcí založených na 31 rozměrech naměřených na postkraniálním skeletu bez použití pánve. Konkrétně se jednalo o rozměry femuru (9), tibie (9), fibuly (1), humeru (7), radiu (1), ulny (1), scapuly (2) a claviculy (1) (Bräuer, 1988). Výsledné pravděpodobnosti určovaného pohlaví jedinců ze žateckého souboru jsou v tabulce 4-1. Tabulka 4-1 Morfologické určení pohlaví jedinec primární analýza pohlaví sekundární analýza pohlaví pf pm Morfoskopie SD1 F SD1 M SD2 F SD2 M SD3 F SD3 M Ao ,000 1,000 m 0,004 0,096 Ao ,003 0,997 m 0,687 0,313 0,256 0,744 0,229 0,771 Ao ,000 0,000 f 0,914 0,086 Ao ,000 1,000 m Ao ,000 0,000 f 0,565 0,435 0,644 0,356 Ao ,000 1,000 m 0,161 0,839 0,002 0,998 0,004 0,997 Ao ,994 0,006 f 0,967 0,033 0,921 0,079 Ao ,000 0,000 f 0,757 0,243 0,972 0,028 Ao ,996 0,004 f 0,898 0,102 Ao ,000 0,000 f 0,955 0,045 0,982 0,018 0,991 0,009 Ao ,000 0,000 f 0,909 0,091 0,998 0,003 0,994 0,006 Ao ,000 1,000 m 0,001 0,999 Ao ,000 1,000 m 0,030 0,970 0,000 1,000 Ao 9788a 0,000 1,000 m 0,803 0,197 0,628 0,372 Ao ,000 1,000 m 0,454 0,546 0,043 0,957 Ao ,000 1,000 m Ao ,000 0,000 f 0,134 0,867 Ao ,993 0,007 f 0,376 0,625 0,959 0,041 Ao ,000 0,000 f 0,691 0,309 0,874 0,126 0,826 0,174 vysvětlivky k tab. 4-1: pf pravděpodobnost ženského pohlaví (morfometrický přístup); pm pravděpodobnost mužského pohlaví (morfometrický přístup); morfoskopie morfoskopický přístup; SD1 F/M posteriorní pravděpodobnost diskriminační funkce založené na anterioposteriorním rozměru diafýzy femuru v kombinaci s maximální délkou tibie; SD2 F/M posteriorní pravděpodobnost diskriminační funkce založené na rozměru hlavy femuru v kombinaci s maximálním rozměrem středu humeru; SD3 F/M posteriorní pravděpodobnost diskriminační funkce založené na maximální délce radiu v kombinaci s maximální délkou kloubní plošky scapuly. 28

29 4.2 Soubor jedinců z Kriminalistického ústavu Části postkraniálního skeletu pěti jedinců ze sbírek Kriminalistického ústavu v Praze (viz tabulka 4-3), které slouží k extrakci DNA ze vzorků starých ne déle než 60 let. Kosti jsou v dobrém makroskopickém stavu. Kompakta je tvrdá a celistvost kosti není narušena. Analyzovanými částmi jsou zhruba 2,5cm klínky dlouhých kostí femuru a tibie vyříznuté ze zádní části dlouhé kosti tak, aby se nenarušila možná antropometrická měření. Pohlaví koster těchto jedinců je známé se 100% spolehlivostí (dochované kriminalistické soupisy) soubor slouží k ověření funkčnosti celé metody v izolaci a analýze DNA. U všech těchto jedinců se předpokládá, že podmínky uložení ostatků byly vhodné pro zachování molekuly DNA Tabulka 4-2 Soubor jedinců naleziště v Žatci vzorek hrob kost vzorek hrob kost 1. Ao 9586 článek prstu 10. Ao 9775 žebro zub 2. Ao 9602 žebro 11. Ao 9782 žebro zub 3. Ao 9732 žebro 12. Ao 9784 žebro 4. Ao 9736 žebro 13. Ao 9787 žebro 5. Ao 9738 zub 14. Ao 9788a žebro 6. Ao 9748 žebro 15. Ao 9795 žebro 7. Ao 9761 zub žebro 16. Ao 9798 žebro 8. Ao 9772 žebro 17. Ao 9821 žebro 18. Ao 9822 žebro 9. Ao 9774 žebro 19. Ao 9838 kost nártu 29

30 Tabulka 4-3 Soubor jedinců ze sbírky Kriminalistického ústavu vzorek označení část kostry pro analýzu stáří vzorku /1991 femur dx cca IDS 195 (1102) femur sin cca IDS 1002 prox epifýza femuru dx cca Válečná 1 femur cca Válečná 2 tibie cca 1940 S kosterním materiálem nebylo od počátku zacházeno pro účely extrakce historické DNA. Archeologové provádějící vykopávky nepředpokládali (a ani v současné době mnohdy nepředpokládají) možnost využití kosterního materiálu pro jiné než archeologicko-antropologické metody, zaměřené na měření charakteristických vzdáleností a na makroskopickém pozorování. V 60. letech bylo zvykem nalezené kosti konzervovat v želatinových hmotách a tak zvýšit jejich životnost ztvrzením celého povrchu (Tesař, 1984). V současné době se ukázalo, jak nebezpečné (z hlediska kontaminace) je takový postup pro biomolekulární archeology zkoumající lidskou adna (Nicholson et al., 2002). Želatinové hmoty jsou dobrým konzervátorem kontaminující DNA antropologů a archeologů. Nálezy jedinců ze Žatce byly po antropologickém vyhodnocení uskladněny v krabicích v prostorách s kolísáním teploty závislém na počasí. V jedné krabici se mohlo vyskytovat více jedinců, odděleni byli igelitovými sáčky. Tyto kolísavé podmínky by mohly značně narušit výsledek celé práce. K analýze byly určeny ze žateckého souboru převážně kosti (16 costae, 1 digitus, 1 metatarsus) a v menší míře zuby (4 dentes). Od 3 jedinců byly k dispozici zub i fragment žebra. Povrch tkání, ze kterých se adna izolovala, byl makroskopicky nenarušen (tzn.: malá poréznost, neodkrytá vnitřní spongióza, tvrdý povrch). Jejich odebráním nebyla ohrožena antropometrická a antropologická významnost. U jedinců, u kterých bylo možné odebrat zub, se této možnosti využilo, neboť podle literatury je tato tkáň v neporušeném stavu nejlepším konzervátorem adna (Kurosaki et al., 1993; Merriwether et al., 1994). 30

31 5 Čištění povrchu vzorku Z kosti (costae, digitus, metatarsus) jsem odřízla nebo odštípla takový kousek, abych měla k dispozici alespoň 2 g hmotnosti (zhruba 3 1 cm u těžké a 4 2 cm u lehké). Z povrchu kosti jsem skalpelem odškrábla cca 0,5 mm tkáně s nečistotami. Skalpelem jsem rovněž odškrábala spongiózu z vnitřku kosti. Vzorek musel mít alespoň 1,2 g před mletím, abych měla k dispozici 2 oddělené vzorky o hmotnosti zhruba 0,5 g. Před mletím jsem ještě kost ozářila UV světlem (254 nm) ze vzdálenosti 10 cm, 5 minut z obou stran. V průběhu manipulace s kostí jsem postupovala tak, aby nemohlo dojít ke kontaminaci. Pro každý vzorek zvlášť byly jedny a více gumových rukavic. Veškeré povrchy se důkladně sterilizovaly a na hlavě se nosil průhledný štít kvůli možné kontaminaci při dýchání na vzorek. 31

32 6 Drcení tvrdého biologického materiálu V mnoha studiích zabývajících se adna se na drcení tvrdé biologické tkáně využívá způsob kryogenního mletí pomocí přístroje SPEXmill. Jednotlivé vzorky jsou ve zkumavkách zmraženy pomocí tekutého dusíku. Střídavé magnetické pole pohybuje ocelovým člunkem, který naráží na stěny zkumavky a tím celý zkřehlý biologický vzorek rozdrtí. Pořízení takového vybavení je velice nákladné a proto v naší laboratoři využíváme přístroj Vibrom, který při vibracích drtí tvrdou biologickou tkáň ocelovou koulí. Samozřejmou nevýhodou je, že vzorky by teoreticky mohly v našem případě být kontaminovány práškem kosti předchozí. Aby k takové situaci nedocházelo, prostor ocelové nádobky, ocelová koule a víko se důkladně mezi jednotlivými vzorky sterilizují. Postup sterilizace: 1. voda + saponát 2. voda 3. 5% chlornan sodný (v některém případě 10% SAVO) 4. voda 5. superčistá voda (čištění na principu reverzní osmózy) 6. vysušení 32

33 7 Izolace adna molekul 7.1 Obecný pohled Principem izolace je získat z nadrcené lidské tkáně DNA ukrytou v buněčném jádře a v mitochondriích. Organickou složkou (25 %) kostní hmoty je ossein. Jde o směs bílkovin, z nichž nejdůležitější je kolagen (80 90 %), významný inhibitor PCR reakce. 75 % kosti tvoří anorganická složka tvořená fosforečnanem vápenatým (jedna z jeho forem je hydroxyapatit), který se vyskytuje v krystalické a amorfní podobě. Při izolaci je nutné eliminovat proteinovou a anorganickou složku a přiblížit se tak buňkám, ve kterých je DNA ukryta. Membrány buněk se chemicky rozvolní a do roztoku se dostane směs sloučenin buněčného prostředí. Následuje extrakce DNA od těchto látek. Mezi látky, které byly detekovány společně s adna v extraktu patří kontaminující moderní DNA, proteiny (kolagen, hem, cytochrom, melaniny), anorganické soli, těžké kovy či půdní organické látky (O Rourke et al., 1996, Cooper, 1994). Pro izolaci adna z kosterního materiálu jsem zvolila metodu, která využívá silikátový prášek SiO 2 (Boom et al., 1990; Höss Pääbo, 1993; Evison et al., 1997). Silika materiál v přítomnosti chaotropních solí specificky váže molekulu DNA na svůj povrch (obrázek 2) a v přítomnosti vody či jiného elučního činidla, které má velice nízký obsah solí, tuto molekulu ze svého povrchu uvolňuje. Vysoká specifita vazby mezi silikátovým materiálem a molekulou DNA je výhodná při eliminaci jiných buněčných látek. V současné době je veliký výběr biochemických a fyzikálních metod pro izolaci DNA z tvrdé lidské tkáně a na trhu se objevují komerční kity, neboli pomocné zjednodušené nástroje a postupy pro izolaci DNA. Hlavním cílem je získat adna v čistém, vysokomolekulárním stavu a relativně koncentrovanou. různé metody izolací: 1. fenol-chloroformová extrakce Sambrook et al., silikát Höss Pääbo, magnetické perličky 4. enzymatická izolace (kolagenáza/dispáza/lysozym) Pusch Scholz, extrakce pomocí elektrického napětí Bachmann et al., QIAquick Purification kit komerční kit a mnoho dalších... 33

34 Různé metody izolací byly mnohokrát porovnávány pro určení, která z nich nejvíce vyhovuje získávání adna z historických biologických tkání či moderní degradované DNA ve forenzních vědách (Hoff-Olsen et al.,1999; Cattaneo et al., 1997; Miller et al., 1999; Lalu et al., ). V souhrnu se zatím ukázala nejzdařilejší metoda izolace pomocí fenol-chloroformu a silikátu. Tyto výsledky potvrzuje úspěšná izolace adna z kostí neandrtálce (Krings et al., 1997), kde se obě tyto metody zkombinovaly. Velikou výzvou je v současné době kolonka firmy QIAGEN Q-5 (využívá silika materiálu), kterou se podařilo získat lidskou adna let starou (Adcock et al., 2001). 7.2 Výhody a nevýhody silikátové izolace Při zkoumání schopností silikátového materiálu pro navazování lidské recentní nukleové kyseliny (Boom et al., 1990) se zjistilo že 8 % DNA se od siliky omyje při etanolovém čištění, 8 % se vůbec nenaváže a 30 % se neuvolní do vody. Získáváme tedy 54 % DNA z původního množství v roztoku primárního extraktu. Tento podíl není příliš výhodný při práci s adna, jejíž množství je už tak nízké, ale velikou výhodou stále zůstává čistota extraktu. Při silika izolaci se maximálně sníží počet koextrahujících inhibitorů PCR reakce. PCR metoda amplifikace je velice citlivá a při vhodné optimalizaci dokáže teoreticky zachytit jedinou molekulu DNA. Záleží však na tom, aby byl extrakt zbaven všech inhibujících složek. Při porovnávání 5 extrakčních metod (fenol-chloroform, silika, filtr ze skleněného vlákna, InstaGene Matrix (komerční kit), Chelex) nejlépe vyšla izolace fenol-chloroformová a silika. Silika umožnila analýzu pomocí PCR u 90 % případů, fenol-chloroformová jen u 60 % (Hoff-Olsen et al.,1999, další porovnání v příloze 3). Metoda je 2,65 levnější než klasická fenolchloroformová reakce. Časová náročnost je v průměru 36 hodin. Tato hodnota není u všech protokolů stejná a nejnáročnější na čas je dekalcifikace vzorku, jež předchází navázání DNA na siliku. Porovnáváním tří extrakčních metod (acetát sodný, magnetické kuličky a silika) byla opět silika metoda úspěšností získaného profilu na prvním místě, a to v 65 %, oproti 55 % při metodě pomocí acetátu sodného a 37 % při použití magnetických kuliček (Cattaneo et al., 1997). V tabulce 7-1 jsou zmíněny výhody a nevýhody silikátové metody extrakce. 34

35 40 µl siliky, což je množství, které se běžně používá při izolaci, je schopno navázat až 20 µg DNA. Jelikož množství adna se pohybuje v rozmezí pikogramů, zůstává mnoho místa pro jakoukoliv cizorodou moderní DNA. Při práci se musí striktně dodržovat všechna pravidla čistoty, což ostatně platí pro všechny druhy izolací adna. Podle jiného autora (Kolman Tuross, 2000), se adna kvůli své chemické modifikaci balí s proteiny do konstitucí, jež zabraňují její navázání na částečky siliky. 7.3 Nevýhoda metody fenol-chloroformové pro adna izolaci Vodná fáze se po centrifugaci nachází nad fází organickou, ale vysoké koncentrace solí mohou jednotlivé fáze promíchat či úplně obrátit. Tento efekt většinou nastává právě u izolace adna, kde historický matrix má vysoký obsah solí. (Kaestle Horsburgh, 2002) Extrakt po takovémto postupu obsahuje vysoké množství DNA, ale také bohužel určité množství koextraktů, které inhibují PCR reakci. Fenol je látka vysoce toxická. adna je také vystavena působení silných oxidačních činidel, jež mohou dále poškozovat již degradovanou molekulu. Tabulka 7-1 Výhody a nevýhody silikátové extrakce výhoda citlivost a vysoká specifičnost čistota extraktu, vyšší úspěšnost PCR amplifikace nevýhoda 54% výtěžnost z primárního extraktu zanesení nepatrného množství silika materiálu do PCR amplifikace způsobí inhibici laboratorní nenáročnost zdravotní nezávadnost* nízké náklady * pouze při přípravě koncentrovaného GuSCN mohou vznikat za nižšího ph jedovaté páry, proto se doporučuje tuto chemikálii připravovat v digestoři!!! 35

36 Tabulka 7-2 Přehled autorů přistupujících kriticky k silikátové metodě extrakce PRO silika metodu Hoff-Olsen, 1999 Höss Pääbo, 1993 Poinar, 1991 Boom, 1990 Evison, 1997 Yang, 1998 Handt, 1996 PROTI silika metodě Kolman Tuross, 2000 Obrázek 2 Princip navázání DNA na povrch SiO 2 materiálu 7.4 Princip izolace K dekalcifikaci kosti se běžně používá EDTA. Jedná se o chelatační činidlo, které vychytává dvoumocné ionty, v kostech hlavně vápník. Hmota rozemleté kostní tkáně se ještě více rozvolní a zpřístupní se tak dalším činidlům. Na řadě je proteináza K, vysoce funkční endopeptidáza. Naštípáním proteinů rozvolní buněčné struktury a uvolní tak molekuly DNA. Přimícháním siliky do zkumavky k supernatantu zbaveného vysokomolekulárních komponent a fosforečnanu vápenatého se molekula DNA v prostředí GuSCN přichycuje k povrchu siliky. 36

37 GuSCN je silné chaotropní činidlo, které narušuje trojrozměrnou strukturu proteinů. Zároveň má tato reagencie ve své struktuře silné kationtové a aniontové skupiny, které ochotně formují vodíkové vazby (Sambrook Russel, 2001). Tím se narušují vazby, které se za normálních podmínek tvoří mezi molekulou DNA a vodou. Zmenšuje se rozpustnost DNA a molekula se sráží na povrchu silikátu (Kaestle Horsburgh, 2002). Centrifugací se oddělí peleta silikátu s navázanou DNA a zbytek se odsaje. V čisté vodě bez chaotropního činidla GuSCN se DNA od siliky uvolní. Celá procedura izolace je popsána níže postup izolace V průběhu zpracování vzorků jsem použila více izolačních postupů protokol podle Höss Pääbo, 1993 (příloha 1, dále označený jako EP 1), protokol podle Evisona (Evison et al., 1997) (viz níže, označený jako EP 2) a jeho drobnou modifikaci (viz níže, označený jako EP 3). Všechny jsou variantami silikátové metody extrakce. Odlišnost metod EP 1 a EP 2 spočívá v použitém dekalcifikačním činidle. Zatímco v EP 1 se používá EDTA v kombinaci s Tris-HCl a Tritonem X, v EP 2 je dekalcifikačním činidlem pouze EDTA. Použití proteinázy K, jako důležitého činidla v odbourávání proteinů, je u obou metod stejné. EP 1 dále používá stejný roztok jako v prvním kroku, ale obohacený chaotropním činidlem GuSCN (a bez proteinázy K), teprve po použití tzv. extrakčního pufru dochází k navazování DNA na povrch silikátu. EP 2 rovnou po dekalcifikaci vzorku (a působení proteinázy K) přechází k navazování DNA na siliku SiO 2. Omývání pelety tvořené silikou a DNA je v obou případech provedeno 70% etanolem, avšak EP 1 ještě vkládá krok s omýváním v GuSCN. Celkově tedy protokol EP 2 redukuje počet kroků a použitých chemikálií, tudíž snižuje riziko kontaminace. K extrakci adna jsem zvolila drobnou modifikaci (EP 3) k protokolu Evison, 1997, která se od originálu liší v: množství tkáně použité pro extrakci počtu dní, které se nechá vzorek inkubovat s EDTA proteináza K je ke vzorku přidána až po dvoudenní inkubaci v EDTA při uvolňování adna od silikátu se použije menší množství vody 37

38 Protokol postupu EP 2 Evison et al., g kostního prášku se smíchá s 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) a 25 µl (20 mg/ml) proteinázy K 2. důkladně se protřepe a nechá se na promíchávacím přístroji (rolleru) 48 hodin při pokojové teplotě (Tp) 3. centrifuga (10 min, 4000 g*) 4. supernatant (cca 0,5 ml) se přenese do nových zkumavek Eppendorf 1,5 ml 5. ke vzorku se přidá 20 µl silikátu a 0,5 ml 4 M GuSCN 6. DNA se nechá navazovat na povrch silikátu 2 hodiny při Tp 7. centrifuga (40 s, g) 8. peleta se omyje dvakrát v 70 % etanolu a supernatant se odsaje 9. peleta se jedenkrát omyje v acetonu a supernatant se odsaje 10. peleta se suší při 56 C 11. DNA se uvolní do 115 µl sterilní vody (s vodou se inkubuje při 56 C 15 minut, po každých pěti minutách se protřepe na vortexu) 12. po stočení při g (2 minuty) se odebere 105 µl do nové zkumavky, ve které se uchovává při 20 C EP 3 drobná modifikace k protokolu EP 2 (Evison et al., 1997) 1. 0,5 g kostního prášku se smíchá s 1 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) nechá se 2 dny na rolleru při Tp 2. přidá se 25 µl (20 mg/ml) proteinázy K nechá se další den na rolleru 3. centrifuga (10 min, 4000 g*) 4. supernatant (cca 0,5 ml) se přenese do nových zkumavek Eppendorf 1,5 ml 5. ke vzorku se přidá 20 µl silikátu a 0,5 ml 4 M GuSCN (ph cca 7,0, podle lakmusového papírku) 6. DNA se nechá navazovat na povrch silikátu 2 hodiny při Tp 7. centrifuga (40 s, g) 8. peleta se omyje dvakrát v 70 % etanolu a supernatant se odsaje 9. peleta se jedenkrát omyje v acetonu a supernatant se odsaje 10. peleta se suší při 56 C 11. DNA se uvolní do 75 µl sterilní vody (s vodou se inkubuje při 56 C 15 minut, po každých pěti minutách se protřepe na vortexu) 12. po stočení při g (2 minuty) se odebere cca 72 µl do nové zkumavky, ve které se uchovává při 20 C * g hmotnost; g zrychlení 38

39 8 Amplifikace zvoleného úseku adna 8.1 PCR Polymerázová řetězová reakce PCR základní kámen nejen archeogenetiky, ale celého odvětví molekulární biologie. Tato metoda je obdobou procesu, který se odehrává v každé živé buňce při replikaci genetického matriálu. Její realizování s nalezením parametrů, které fungují i mimo buňku in vitro (Saiki et al., 1985; Mullis Faloona, 1987), bylo oceněno Nobelovou cenou. Tato chemická reakce umožňuje z nepatrných množství DNA selektivně vybrat a namnožit známý úsek DNA. Vyšší koncentrace produkovaných fragmentů je výhodná pro další analýzy. Počáteční množství kopií n se po 30 cyklech exponenciálně namnoží n Jedinečná citlivost a síla této molekulární techniky umožnila analyzovat velice malá množství adna, která přežila stovky, tisíce i desetitisíce let. Metoda cyklického množení vybraného úseku DNA je velice jednoduchá na vybavení. Jejím největším úskalím zůstává optimalizace. Pro ověření funkčnosti PCR metody aplikované na adna se používá tzv. pozitivní kontrola, jejíž templát je recentní molekulou DNA. Znalost koncentrace počátečního množství recentního templátu ve vzorku rovněž umožňuje hrubě odhadnout množství vstupní adna jednotlivé komponenty PCR reakce adna templát dntp MgCl 2 2 primery Taq DNA polymeráza pufr doplňkové chemikálie v PCR reakci adna templát izolovaná adna z kosti či zubu. Ve vodném prostředí se nachází v ideálním případě adna o neznámé koncentraci a s minimálním množstvím koextrakčních látek (proteiny, cukry, lipidy). Její množství se podle mnoha autorů pohybuje rámcově v pikogramech. Podle jedné studie (Faerman et al., 1995) je hladina detekce 5 25 pg DNA, což se přibližně rovná množství 39

40 DNA v jedné diploidní buňce. Molekula adna slouží jako předloha pro tvorbu nově vznikajících fragmentů. dntp volné nukleotidové zbytky deoxyadenozintrifosfát, deoxyguanozintrifosfát, tyminozintrifosfát, deoxycytozintrifosfát. Jednotlivé dntp jsou polymerázou řazeny do nových fragmentů podle pravidel párování adenosin s thyminem a cytosin s guaninem. V případě chemických modifikací, u adna velice častých (Höss et al., 1996), se například zařadí chybně adenosin k cytosinu, který byl chemickou cestou (deaminací) pozměněn na uracil (Friedberg et al., 1995). Sekvence získávané z adna je třeba několikanásobně kontrolovat kvůli těmto možným záměnám a také kvůli efektu jumping PCR (Pääbo et al., 1990), kdy modifikované báze donutí polymerázu přeskočit na jiný templát a dosyntetizovat tak nově vznikající řetězec podle jiného templátu, pocházejícího například z kontaminující DNA. MgCl 2 vyšší koncentrace hořečnatých iontů stabilizuje dvoušroubovici DNA. Příliš vysoká koncentrace brání úplné denaturaci. Snižuje se tím specifičnost nasednutí primeru, jelikož primer se s nízkou stringencí naváže na jakékoliv jen částečně komplementární místo. Je-li koncentrace těchto iontů nižší než 0,5 mm, netvoří se komplex primer-templát nebo se celý komplex krátce po začátku prodlužování rozpadá. Některé z hořečnatých iontů jsou vychytávány dntp. 2 primery krátké nukleotidové sekvence kolem 25 bází. Jedná se o řetězce komplementární vždy k 3' konci oblasti vybrané části templátové DNA. Existuje několik pravidel výběru primerů, potažmo oblastí templátové DNA (viz podmínky výběru, níže). V přítomnosti velice nízké koncentrace vstupního templátu se krátké sekvence primerů na sebe nespecificky lepí a jejich 3' konec tvoří pozici pro nasednutí DNA polymerázy. Velikost takto nespecificky vzniklých produktů je do bp. Kvůli tvorbě primer-dimerů by koncentrace primerů neměla být vyšší než 12,5 pmolů/25 µl reakce PCR (McPherson et al., 1995). Nejdříve byly použity primery amelogeninového úseku 106/112 bp (schéma 1, str. 41) (Sullivan et al., 1993). Kvůli neúspěchům při amplifikaci jsem začala používat primery na kratší úsek amelogeninu 80/83 (Haas- 40

41 Rochholz Weiler, 1997). Pro zkoušku, zda se v extraktu nachází alespoň mtdna, byly pořízeny primery MPS 1, 2. Zkratka MPS znamená mini primer set. Jedná se o sadu primerů pro mitochondriální DNA na amplifikaci přesahujících se úseků hypervariabilní oblasti dlouhých od 126 bp do 170 bp. Tento systém byl poprvé aplikovaný na forenzní materiál, v případech, kdy oblast hypervariabilního úseku mtdna (250 bp) nebyla v degradované DNA detekována (Gabriel et al., 2001). V této práci byly použity primery pro oblast 126 bp. Sekvence použitých primerů: 106/112 5' CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTC 3' Tm = 54,5 5' ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 3' Tm = 55,1 80/83 5' CCCTTTTGAAGTGGTACCAGAGCA 3' Tm = 57 5' GCATGCCTAATATTTTCGGGAATA 3' Tm = 55 MPS mitochondriální úsek 5' CACCATGAATATTGTACGGT 3' Tm = 56 5' TGTGTGATAGTTGAGGGTTG 3' Tm = 58 (firma PROLIGO) Schéma 1 Amplifikovaná sekvence DNA při použití primerů 106/112 bp, na místě pomlček je u Y chromozomu navíc inzert sekvence AAAGTG. Celá délka sekvence je tedy 106 bp na X chromozomu a 112 bp na Y chromozomu. 5' CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGGGTGGATTCTTCATCCCAAAT AAAGT GGTTTCTCAAGTGGTCCCAATTTTACAGTTCCTACC ATCAGCTTCCCAGTTTAAGC TCTGAT 3' * oranžově jsou označeny místa přisedání primerů 41

42 Podmínky pro správné primery: (Sambrook Russel, 2001) nesmějí být k sobě komplementární jejich délka by se měla pohybovat mezi bp a rozdíl v počtu bází jejich délek by neměl být větší než 3 disociační teplota Tm* (viz tabulka 8-1, krok 3.) by měla být přibližně stejná Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 69,3 + (0,41 (%G+C)) 650/délka Tm = 81,5 + 16,6(log10[K+]**) + 0,41(%G+C) 600/délka * Tm bývá běžně určována výrobcem primerů ** [K+]...koncentrace monovalentních kationtů v reakční směsi obsah GC by měl být v rozmezí % sekvence bez monotónních úseků na 3' konci by z posledních pěti nukleotidů měly být maximálně 2 G/C nesplněno! 3' konce by neměly být komplementární a neměly by končit NNCG či NNGC (snadná tvorba primer-dimerů) sekvence musí být unikání jen pro daný druh (v mém případě pro člověka ) Většina stanovených podmínek byla splněna. U primerů MPS a 80/83 bp je na 3' konci z posledních pěti nukleotidů více než 2 G/C. Taq DNA polymeráza Jde o replikační enzym bakterie Thermus aquaticus. Její přední vlastností je prodlužování DNA řetězce směrem k 5' konci templátu (tedy prodlužování 3' 5' nového řetězce) za vysokých teplot (72 C) a životnost i při denaturační teplotě větší než 96 C. Její rychlost je zhruba 2 4 kb/min (35 70 b/s). Kvůli nespecifickým produktům, které mohou vznikat již před začátkem cyklického množení, jsou některé polymerázy chemicky ošetřeny. Některé jsou například zalité ve vosku, který se roztaví až po první denaturaci (TaqBead TM Hot Start polymeráza). Také mohou být inaktivovány protilátkou, která se při vysokých teplotách denaturuje a Taq polymeráza tím znovu nabude svou funkčnost (AmpliTaq Gold Hot Start polymeráza). Vždy se jedná o nejdražší komponentu PCR amplifikace. 42

43 pufr Každá firma, která dodává do laboratoře chemikálie pro PCR reakce, dodává i pufr, jehož složení odpovídá optimálnímu prostředí pro Taq polymerázu. Ve své práci jsem použila 3 různé polymerázy. složení pufru: firma TaKaRa: 100 mm Tris-HCl (ph 8,3), 500 mm KCl, 15 mm MgCl 2 firma Fermentas bez MgCl 2 : 100 mm Tris-HCl (ph 8,8 při 25 C) 500 mm KCl 0,8% Nonidet P40 firma Applied Biosystems: 150 mm Tris-HCl (ph 8,0) 500 mm KCl doplňkové chemikálie v PCR reakci Jedná se o chemické sloučeniny, které mají stimulovat enzymatickou schopnost polymerázy, či tlumit případné inhibitory přítomné v PCR reakční směsi. Patří sem například: BSA bovinní sérový albumin DMSO dimetylsulfoxid glycerol Tween 20 43

44 8.2 Princip PCR Principem průběhu exponenciálního množení zvoleného úseku řetězce DNA je cyklické opakování specifických tepelných a funkčních kroků (viz obrázek 3). Při tepelné denaturaci o teplotách okolo 95 C dochází k rozvolnění struktury dvoušroubovité DNA na jednořetězcovou molekulu. Na tu, při teplotách mezi zhruba 50 C až 65 C, nasedají primery (cca 25 bp) podle komplementarity. Taq polymeráza je enzym izolovaný z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Tento enzym při vysoké teplotě (72 C) komplementárně doplňuje sekvenci k templátové molekule DNA a to tak, že nasedá na 3' konec primeru a jde směrem k 5' konci templátu a cestou přikládá chybějící nukleotidy. Poté opět dojde k denaturaci a celý cyklus se znovu a znovu opakuje. V roztoku již po několika málo cyklech převládají pouze sekvence délky známé oblasti DNA. V případě adna je doporučováno 40 cyklů a více (Gill, 2001; Kefi et al., 2003). Obrázek 3 Průběh PCR reakce teplotní profily Každá PCR reakce prochází teplotními cykly specifickými k určitému stadiu množení DNA segmentů. Teplotní parametry a počet cyklů lze u PCR cykleru manuálně nastavit. Jsou důležitým krokem k optimalizaci PCR reakce. V tabulce 8-1 je schematicky představen klasický profil reakce. Na straně 46 jsou zmíněny modifikace klasického průběhu, které podporují množení DNA materiálu, který je v malém množství a degradovaný. 44

45 Tabulka 8-1 Profil klasické PCR; kroky 2, 3 a 4 se cyklicky opakují KROK TEPLOTNÍ PROGRAM PCR TEPLOTA DOBA TRVÁNÍ 1. iniciační denaturace 94 C minuty* denaturace Dochází k rozvolnění dvoušroubovice na dva samostatné řetězce. nasednutí primerů annealing Annealingová teplota Ta se určuje podle teploty tání (melting temperature) Tm primerů. Při Tm je polovina primerů komplementárně spojená s templátovou molekulou. Každý primer má jinou Tm a existují různé rovnice pro její stanovení. Doporučuje se, aby Ta byla o 3 C nižší než Tm, avšak různými rovnicemi výpočtu Tm se dojde k různým výsledkům a proto je třeba Ta experimentálně optimalizovat. Při tomto stadiu tedy nasedají primery na templátovou molekulu podle pravidel párování (komplementarity). prodlužování elongace K 3' konci primeru, který se spojil s templátem, nasedne polymeráza, která pomocí volných dntp dosyntetizovává nový řetězec podle komplementarity k templátu. Po tomto kroku se za sebou opakují cyklicky: denaturace, annealing, elongace. Počet cyklů je dán typem DNA (recentní, historická, bakteriální apod.) a složitostí získávaného produktu (jeden produkt, více produktů v jedné reakci) konečná elongace Dochází k dosyntetizování zprvu nedodělaných segmentů C sekundy až minuty* C sekundy až minuty* 72 C sekundy až minuty* 72 C minuty* * vždy záleží na typu templátové molekuly (recentní, fragmentovaná, degradovaná apod.), na typu polymerázy a na primerech 45

46 Modifikace standardní PCR: Touch down PCR Jde o alternativu klasické PCR. Annealingová teplota se zpočátku nastaví o několik stupňů výš (například až o 10 C ) než je Tm primerů. Každým druhým cyklem (libovolné) se pak snižuje o 1 2 C do té doby než dosáhne Tm. Během postupného snižování annealingové teploty se zvolený specifický primer dostává k hledanému segmentu DNA s vyšší stringencí. Úplné redukci v tvorbě nespecifických primer-dimerů se tím nezabrání, ale jejich zastoupení se výrazně redukuje. V případě adna, kde nízké vstupní množství předpokládá vyšší tvorbu primer-dimerů, je tento postup velice výhodný. Hot start PCR Tato varianta PCR také slouží k redukci tvorby nespecifických produktů, které by mohly vznikat ještě před začátkem prvního cyklu. Dříve byla tato metoda upravena tak, že do směsi mastermixu se nedala jedna z komponent (dntp, polymeráza, primery...). Přidala se až po první denaturaci, když teplota dosáhla zhruba 70 C. V dnešní době je mnohem praktičtější používat upravené polymerázy firem, které je modifikují, tak aby byly funkční až při vysokých teplotách po určitém čase (AmpliTaq Gold od firmy Applied Biosystems). DOP-PCR Tato zkratka znamená degenerated oligonucleotide-primed PCR, neboli PCR používající degenerované primery. Degenerovanými primery jsou krátké oligonukleotidové sekvence, které mají větší pravděpodobnost komplementarity s templátovou DNA. Spolu s nízkou annealingovou teplotou tak nasedají nespecificky na mnoho míst templátu. V případě degenerované adna mohou pomoci dosyntetizovat chybějící sekvence ještě před vlastní specifickou amplifikací. 46

47 8.3 Postup přípravy PCR amplifikace PCR proti-kontaminační opatření Příprava PCR reakce se uskutečňuje ve stejné místnosti, kde probíhala extrakce. Celý prostor laminárního boxu se vysterilizuje pomocí lihobenzínu a intenzivního UV světla (10 min). Kovové nástroje (pinzety atp.) jsou na 5 min namočeny v roztoku 5% chlornanu (poté opláchnuty ve sterilní vodě a osušeny). Použité špičky a zkumavky Eppendorf jsou zautoklávovány. Na rukách jsou plastové rukavice na jedno použití, na těle je laboratorní plášť. Mastermix se připravuje za proudění vzduchu laminárním boxem (130 V max. účinnost) mastermix Nejprve si připravím tzv. mastermix (MM). Jedná se o reakční směs všech PCR komponent před rozdělením do jednotlivých reakcí. Pokud budu předpokládat objem jedné reakce 30 µl, tak mastermix bude objemově násobkem této hodnoty a počtu reakcí +1 (viz tabulka 8-3). Jednotlivé komponenty jsou ve stejných koncentracích jak v mastermixu, tak v jednotlivých mikrozkumavkách (viz tabulka 8-2). Do mastermixu se nedá templát. Spočítám si kolik budu potřebovat jednotlivých komponent (viz tabulka 8-3). Tabulka 8-2 Komponenty a koncentrace PCR reakce aplikované v této studii Komponenta Zásobní roztoky Složení 1 PCR reakce adna templát neznámá koncentrace v extraktu 7 µl dntp 2,5 mm 0,2 mm 2 primery různé např. 75 pmol/µl/každý 5 pmol/reakci/každý Taq polymeráza 5 U/µl 0,025 U/1µl reakce pufr pro PCR reakci 10 x 1 x voda doplnění do objemu reakce 47

48 Tabulka 8-3 Výpočet objemových zastoupení komponent MM = (počet reakcí +1) x objem jedné reakce příklad 10 reakcí po 30 µl MM = (10 + 1) x 30 = 330 µl dntp zásobní roztok 2,5 mm, do reakce chci 0,2 mm 330 / (2,5 / 0,2) = 26,4 µl primery zásobní roztok 25 pmol/µl, do reakce chci 5 pmol 5 x 11 reakcí = 55 pmol 55 / 25 = 2,2 µl Taq polymeráza zásobní roztok je 5 U/µl, do 1 µl reakce chci 0,025 U 8,25 / 5 (zásobní) = 1,65 µl pufr zásobní roztok je 10 x koncentrovaný, chci 1 x 330 / µl MgCl 2 jeho koncentrace se liší pro každý pár primerů a typ polymerázy, vždy je nutné si najít optimální koncentraci, která by měla být v rozmezí 1,0 4,0 mm (každý dodavatel udává jiné rozmezí) zásobní roztok je 25 mm, do reakce chci 2,25 mm 330 / (25 / 2,25) = 29,7 µl voda 330 (templát: 7 x 11) 26,4 2,2 1, ,7 = 160, µl BSA je bovinní sérový albumin, který byl v některých případech přidán do PCR amplifikace (3 µg / 25 µl PCR amplifikace). Nespecificky se balí s možnými inhibitory PCR reakce a zlepšuje tak celkově exponenciální růst DNA fragmentů (Sambrook Russel, 2001; Pääbo, 1989) 48

49 8.3.3 příprava mastermixu 1. do 2 ml zkumavky Eppendorf dám nejdříve vodu, pufr a potom ostatní komponenty bez templátu 2. mastermix řádně promíchám na vortexu 3. rozpipetuji objem do jednotlivých PCR mikrozkumavek a postupně k nim při-dávám 7 µl extrahovaného roztoku templátu (celý extrakt před odběrem 7 µl krátce zcentrifuguji, kvůli možné přítomnosti silikátu) 4. uzavřené mikrozkumavky opatrně přenesu do jiné místnosti, kde probíhá PCR reakce a následná analýza produktů. (viz kapitola kontaminace výše) 5. na termocykleru nastavím teplotní program cyklů a PCR profil (tabulka 8-1) a nechám proběhnout celou reakci PCR reakce probíhá v cykleru Techne, firmy Techgene. Mikrozkumavky se vzorky mají tenké stěny, aby rychle docházelo k ohřevu na určitou teplotu v celém objemu. Víko cykleru je předehřáté, což zamezuje odpařování. V čase klesá koncentrace dntp a primerů, které se postupně zabudovávají do nově vznikající DNA. Naopak koncentrace DNA exponenciálně narůstá do okamžiku, než je množství primerů a dntp kritické (výrazně méně primerů, než templátu), pak nastává tzv. fáze plató, při níž množství DNA roste už jen lineárně. Podmínky PCR je nutno optimalizovat pro každou laboratoř. Závisejí zejména na typu použitých primerů, polymeráze, koncentraci hořečnatých iontů, termocykleru, ale i na typu mikrozkumavek. 8.4 Optimalizace Pro mou práci bylo nejdříve nutné najít takové parametry pro PCR reakci, aby získávaný produkt byl v co nejvyšší možné koncentraci a bez nespecifických koproduktů. Každá složka mastermixu ovlivňuje celý průběh reakce a je nutné najít její optimální koncentraci a kvalitu (každá firma dodává komponenty s jinými charakteristikami). Žádný optimalizační protokol, běžně dostupný v laboratorních manuálech či na internetu, nelze aplikovat na konkrétní laboratoř (každá pracuje s konkrétním postupem extrakce, typem tkáně, druhem organismu). Je možné však z doporučovaných optimalizačních protokolů vycházet. 49

50 Templát z recentní molekuly DNA (v řádově nanogramech) byl naředěn 10, 100 a 1000 pro účely optimalizace PCR amplifikace. Nejnižší koncentrace měla simulovat množství adna. Postupně se hledaly podmínky chemického složení zároveň v kombinaci s možnou modifikací PCR amplifikace a s určitým profilem cyklických teplotních změn. Při optimalizaci jsem postupovala následovně: 1. vhodná koncentrace MgCl 2 pro každý pár primerů a typ polymerázy je vhodná jiná koncentrace hořčíku. Vždy jsem vyzkoušela koncentrační rozpětí od 0,5 2,5 mm 2. možné Taq polymerázy: Takara, Fermentas a AmpliTaq Gold Takara v naší laboratoři používaná zpočátku, kvůli nízké životnosti a velkému množství nespecifických produktů zvolena další zmíněná Fermentas často v laboratoři používaná AmpliTaq Gold upravená polymeráza pro hot start amplifikaci; nejlepší, ale kvůli vysoké ceně v mé práci použita jen zřídka 3. koncentrace primerů: 5 15 pmol/reakci Určité modifikace standardního PCR postupu přinášejí pro konkrétní práci s degradovaným templátem znatelné výhody. Malé množství a chemické změny ve struktuře adna způsobují preferenční množení nespecifických produktů, hlavně primer-dimerů. 50

51 9 Detekce DNA fragmentů Délkový rozdíl DNA produktů, na kterém je založena analýza pohlaví jedince, může být analyzován pomocí tzv. elektroforézy. Analýza je založena na rozdílné rychlosti v putování fragmentů DNA různých délek skrze gelový matrix v elektrickém poli. 9.1 Princip DNA nese záporný náboj a tudíž je přitahována ke kladné elektrodě. V cestě jí však stojí matrix gelu (agarózového nebo polyakrylamidového). Kratším fragmentům je kladem menší odpor a tudíž putují rychleji. Poloha určité délky fragmentu je vizualizována a porovnáním se standardem molekulové hmotnosti (viz níže) se odečítá jeho velikost. Rychlost průstupu gelovou matrix závisí na několika parametrech. Především je závislá na velikosti fragmentu, hustotě gelu, použitém pufru a aplikovaném napětím (viz níže). U jednořetězcové DNA závisí prostupnost gelem i na prostorové konformaci hustota gelu a velikost fragmentu Čím je gelová matrix hustší, tím vyvolá větší odpor, čímž se efektivněji rozdělí kratší fragmenty o podobné délce (např. 110 a 120 bp). Existuje lineární korelace mezi logaritmem pohyblivosti (mobility) a koncentrací gelu pro určitý rozsah velikostí dělených fragmentů (tabulky 9-1 a 9-2). To znamená, že koncentrace gelu musí být volena v závislosti na velikosti separovaných DNA fragmentů. Závislost logaritmu molekulové váhy známých markerů a jejich mobility umožňuje sestavit kalibrační křivku a určit molekulovou váhu neznámých fragmentů. markery molekulové hmotnosti (molekulové standardy) V elektroforetickém gelu jsou zároveň s analyzovanými vzorky puštěny molekulové standardy. V objemu tohoto separovaného vzorku jsou fragmenty DNA o známé velikosti. Dají se připravit pomocí štěpení restrikčními endonukleázami 51

52 známé sekvence recentní DNA. V běžné praxi jsou k dostání od firem, které dodávají chemikálie pro molekulárně-biologické analýzy. Při elektroforetickém dělení jsem použila standard s označením puc18 DNA MspI DIGEST (firmy Sigma). Tato plazmidová DNA je štěpená restrikční endonukleázou Msp I na fragmenty: 501, 489, 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34 a 25 bp. Tabulka 9-1 Hustota gelů a odpovídající velikost fragmentů pro efektivní rozdělení Akrylamid (% [w/v]) rozsah fragmentů efektivně rozdělených (bp) 3, , , , , , Tabulka 9-2 Rychlost průstupu gelovou matrix Rychlost putování BPB barvičky (viz nanášecí pufr níže) v přirovnání k velikosti fragmentu DNA (v bp) v gelu agaróza (v %) BPB loading pufr (1 x TBE pufr) 0, , , , , , , ,00 70 polyakrylamidový gel (v %) BPB loading pufr (1 x TBE pufr) 3, ,0 65 8, , , ,0 12 Příklad: V 1,25% agarózovém gelu putuje BPB nanášecí barvička takovou rychlostí, jako by se jednalo o fragment DNA o velikosti 260 bp. Dělíme-li fragment o velikosti cca 300 bp, víme, že se nachází mezi barvičkou a startovací jamkou, neboť je pomalejší. 52

53 9.1.2 aplikované napětí Obecně platí, že pro dosažení kvalitního rozlišení fragmentů se aplikuje takové napětí, které vystihuje optimální rychlost migrace, které ještě nezahřívá gel natolik, aby denaturoval DNA, nebo se dokonce neroztavil. Udává se ve voltech na centimetr. V centimetrech je zde měřena vzdálenost mezi elektrodami (ne mezi konci gelu!!!). Pro fragmenty DNA větší než 2 kb by elektrické napětí nemělo převyšovat 5 8 V/cm. U minigelů, při detekcích fragmentů do 3 kb, je aplikováno 5 20 V/cm a celá separace trvá minut. Obrázek 4 Aparatura pro agarózovou elektroforézu Rozměry mého gelu jsou 10 11,5 cm. Vzdálenost mezi elektrodami je rovněž 11,5 cm. Aplikovala jsem napětí V = 76 V (6,6 V/cm). Separace trvá 60 min pufry Celý proces separace musí probíhat za určitých konstantních chemických parametrů (ph, iontová síla), které jsou udržovány pufrovacím systémem. Jsou obsaženy jednak v gelu samotném a jednak ve vaničce elektroforetické aparatury. S vysokou koncentrací iontového pufru roste velikost proudu s nímž roste teplota a může dojít k situaci, kdy celý gel roztaje a DNA zdenaturuje, což není žádoucí. Hlavní vlastností nanášecího (loading) pufru je vizualizace přesné aplikace vzorku do jamky a monitoring průběhu elektroforézy. elektroforetické pufry: TAE Tris-acetát EDTA TPE Tris-fosfát EDTA TBE Tris borát EDTA Nejpoužívanějším elektroforetickým pufrem je TBE. Má vysokou pufrovací kapacitu. 53

54 TBE Tris borát EDTA složení 5 TBE: 0, 9 M Tris-borát (54 g Tris báze + 27,5 g kyseliny borité do 1000 ml pufru) 0,02 M EDTA (20 ml 0,5 M EDTA (ph = 8,0)) nanášecí pufr (loading buffer) Jedná se o barevný pufr, který je přidáván ke vzorku před aplikací do jamky. Obarvuje a koncentruje vzorek. Zkoncentrovaný vzorek je lépe aplikovatelný do jamky gelu (DNA je stažena na dno jamky a neuniká do prostoru vaničky). Celkově umožňuje sledovat vývoj elektroforetického dělení, neboť barvička rovněž putuje v elektrickém poli. Bromfenol blue (BPB) složení: 0,25 % (w/v objemová procenta) bromfenolové modři 40 % (w/v) sacharózy ve sterilní vodě ethidium bromid Standardní metodou vizualizace je inkorporace ethidium bromidu do struktury molekuly DNA. Tato chemická sloučenina má tu vlastnost, že pokud je v inkorporovaném stavu prosvětlena UV světlem určité délky, emituje fluorescenční záření. Práh detekce ethidium bromidem je 2 ng DNA v 0,5 cm jamce. Ethidium bromid inkorporovaný do molekuly snižuje její záporný náboj a tak ji zpomaluje (až o 15 %). Sám je přitahován v elektrickém poli k záporné elektrodě. Putuje tedy v opačném směru než DNA a při dlouhotrvajících elektroforézách může úplně vycestovat z gelu pryč do prostředí pufru. V takovém případě je schopnost detekce bandů výrazně snížena. Sloučenina ethidium bromid je karcinogen. Je tedy nutné předcházet přímému kontaktu s touto sloučeninou (i s jejími výpary při přípravě gelu). Existují i jiná interkalační činidla se schopností zachycovat mnohem menší koncentrace DNA. Například u detekce pomocí Sybr Green (či Sybr Gold) je hranice vizualizace 20 pg v 0,5 cm jamce. Nevýhodou takovýchto činidel je však jejich vysoká cena. 54

55 9.2 Elektroforéza v agarózovém gelu Horizontální agarózové gely jsou klasickým materiálem používaným při detekci rozdílů v délce fragmentů DNA. Agaróza se připravuje chemickou modifikací agaru izolovaného z mořských řas a má podobu bílého prášku. V mé práci jsem použila agarózový gel k detekci přítomnosti naamplifikovaných fragmentů. Výsledem v takovém případě bylo zjištění, zda se vůbec podařilo získat fragmenty informující o pohlaví, či nikoliv. V případě, že byl detekován band (fragment amplifikované DNA), bylo možné postoupit k polyakrylamidové elektroforéze (viz níže) a určit tak pohlaví. Obrázek 5 Aplikace vzorku do agarózového gelu 2% gel v 60ml 1,2 g agarózového prášku 6 ml 10 TBE 54 ml vody dá se do mikrovlnné trouby (1 2 min) při prvních bublinkách se vyndá, protřepe a dá zpět tvoří-li se opět bublinky, obsah se protřepe a nechá se chladnout při cca 60 C se přidá 6 µl ethidium bromidu (1 ng/ml) nalije se do připravené elektroforetické vaničky s hřebenem po ztuhnutí se zalije 0,5 TBE po okraj rysky (naředěný z používaného 10 TBE) vyndá se hřeben a do každé jamky se dá 8 µl směsi 8 µl amplikonu a 1,5 µl 6 BPB marker se aplikuje na první a poslední jamku (3 µl směsi: 3 µl marker + 0,5 µl 6 BPB) přiloží se víko a pustí napětí 77 V za hodinu se vypne a prohlédne na UV-transluminátoru firmy Syngene vyfocený obrázek se vyhodnotí na softwaru GeneSnap a GeneTools. 55

56 Obrázek 6 Vizualizace bandů pomocí EtBr a UV světla 9.3 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu Jedná se o vertikální aparaturu s gelovou matrix, která slouží k rozdělení fragmentů o rozdílné velikosti až 0,1 %, tudíž 1 bp v 1000 bp. Směs akrylamidu a bisakrylamidu polymerizuje při pokojové teplotě v pufru (TBE) pomocí volných radikálů poskytovaných persulfátem amonným (APS), který způsobuje homolytické štěpení vazeb O-O. K urychlení polymerizace se používá volná zásada TEMED (tetrametyletylendiamin), který katalyzuje tvorbu volných radikálů persulfátu amonného. Velikost pórů v gelové matrix je závislá na koncentraci akrylamidového monomeru a bisakrylamidu. příprava gelu: Používaná koncentrace pro rozdělení fragmentů amelogeninového lokusu při určování pohlaví, kde se X a Y fragment liší ve 3 bp, je 14 %. 56

57 pro přípravu 40 ml 14% gelu: 1. spočítá se množství komponent pro vytvoření 14% 40ml gelu: Akrylamid : bisakrylamid* (19 : 1) 14 ml vody 22 ml 10 % TBE 4 ml 2. komponenty se smíchají a přidá se k nim činidlo utvářející volné radikály APS * 300 µl TEMED 30 µl 3. do předem připravené aparatury se nalije ještě neztuhlý roztok; je třeba dát pozor na tvorbu bublin, které nejsou žádoucí; gel se nechá tuhnout asi 1,5 hodiny 4. gel se zalije 1 TBE 5. do jamek se aplikuje 8 µl směsi: 8 µl amplifikovaného vzorku + 1,5 µl 6 nanášecí pufr BPB 6. přes noc (16 18 hod) se nechá separovat při 90 V / cca 15 cm 7. po proběhlé separaci se vypne proud, gel se vyřízne a obarví v koncentrovaném ethidium bromidu (0,5 µg/ml) (je třeba mít rukavice dvojitě, neboť se jedná o koncentrovaný karcinogen a mokrou manipulaci) 8. gel se nechá prosvítit UV světlem a fosforeskující bandy se vyfotí pomocí optické kamery firmy Syngene 9. bandy se analyzují v softwarovém programu GeneTools * pozor, jed! 57

58 Obrázek 7 Vertikální polyakrylamidová aparatura 58

59 Výsledky 10 Zjištěné údaje a hodnoty Většina výsledků je shrnuta v tabulkách (10-2 až 10-11). Použité obrázky gelů (9 až 14) mají v některých případech doložit a přiblížit postup analýzy při použití molekulárně biologických metod. Zde na začátku sumarizace jsou jednotlivé dosažené výsledky v souhrnných bodech. označení extrakčních postupů: EP 1 Höss Pääbo, 1993 (příloha 1) EP 2 Evison et al., 1997 (str. 38) EP 3 modifikace protokolu Evison (str. 38) Na začátku používaný EP 1 nepřinesl v žádném případě adna, která by byla detekovatelná (ověřeno v Kriminalistickém ústavu, kde nebylo možné získat žádný STR lokus do velikostí 200 bp). Aplikací EP 2 se podařilo detekovat fragmenty DNA jedinců souboru z Kriminalistického ústavu, avšak až v průběhu 2. či 3. izolace (amplifikace byla nastavena se stejnými parametry jako u předchozích reakcí, které měly amplifikovat adna extrahovanou pomocí EP 1). K další analýze byly ze souboru jedinců sbírky Kriminalistického ústavu odebrány nové vzorky pro izolaci DNA pomocí EP 2 (1. extrakce) a EP 3 (následné extrakce). EP 3 se ukázala jako úspěšnější varianta EP 2. Na stranách 61 až 63 jsou zaznamenané výsledky izolace a analýzy pohlaví jedinců ze sbírky Kriminalistického ústavu. Úspěch při použití EP 3 odstartoval analýzu souboru žateckých jedinců. Pro analýzu byly použity vzorky, ze kterých bylo původně izolována adna pomocí neúspěšné EP 1 (jednalo se o vzorky, které nebyly při povodni v roce 2002 odplaveny) a úplně nové vzorky kostí. Je těžké určit, zda izolace ze zubů byla úspěšnější než u kosti, jelikož postupy a použité chemikálie se měnily. S jistotou lze však tvrdit, že v případě, kdy byly porovnány výsledky stejného pořadí izolace a stejné 59

60 procedury provedené ve stejném dni, pak produkt amplifikace byl u vzorku zubu (a jiných kostí než žeber) silnější, či jediný patrný. Vhodné ph použitých chemikálií při vazbě a uvolňování DNA z povrchu silikátu by mohlo být jedním ze zásadních důvodů úspěchu. Převážná většina detekovaných produktů pocházela z adna izolované až v druhém a třetím kroku extrakce (zub i kost) (zub), 9795 (žebro), 9782 (žebro), 9602 (žebro) došlo k detekci adna fragmentu už v prvním kole izolace pomocí EP 3. V případě použití zoptimalizovaného protokolu pro izolaci (viz EP 3 str. 38) v 2. kole extrakce, zoptimalizované PCR reakční směsi a profilu amplifikace bylo možné detekovat hledaný fragment jaderné adna 80/83bp u 10 z 11 jedinců. Ukázalo se, že přidáním BSA do PCR reakce (3 µg / 25 µl reakce) se zlepšila amplifikace. Při malém vstupním množství templátu (případ adna) je vhodné koncentraci primerů spíše snižovat. Kontaminace produktem (106/112 bp) byla zaznamenána v chemikáliích PCR amplifikace v období analýzy pohlaví 5 jedinců z kriminalistických sbírek. Všechny kontaminované chemikálie byly vyhozeny, celý prostor izolační místnosti byl důkladně sterilizován, zakoupil se nový laminární box s hepa-filtrem a optimálním výkonem při 130 V a začaly se více používat primery 80/83 bp. Při veškeré další práci byly všechny kontaminační kontroly (Ke, K) bez patrného produktu PCR amplifikace! Pozitivní kontrola byla použita u každé PCR, kvůli ověření úspěšnosti amplifikace. Modifikace PCR (touchdown PCR a Hot start PCR) profilu byla klíčovou pro detekci malého množství degradované adna. Dvakrát byly příčinou neúspěšné amplifikace nefunkční dntp. Použitím Hot start AmpliTaq Gold polymerázy se výrazně snížilo množství nespecifických produktů (primer-dimerů). 60

61 Výsledek analýzy jedinců ze sbírky Kriminalistického ústavu Ze vzorků všech pěti jedinců bylo cílem získat DNA, která v následné analýze měla určit pohlaví jedinců. V tomto konkrétním případě byla použita metoda EP 2. Amplifikovaným úsekem byl amelogenin 80/83 bp. Tabulka 10-1 Pořadí jedinců v konkrétní analýze pořadí vzorku označení jedinců pořadí provedené extrakce na stejném kostním prášku v konkrétním případě zdařilé izolace 1. extrakční kontrola (Ke) extrakt 3. tibie válečná 3. extrakt extrakt extrakt 6. femur válečný 2. extrakt extrakt extrakt 9. pozitivní kontrola (K+) 10. negativní kontrola PCR (K-) Obrázek 8 2% agarózový gel s viditelnými bandy v oblasti 80/83 bp marker Ke 2* K+ K marker * pořadí v vzorků v gelu odpovídá pořadí v tabulce

62 Zde na tomto agarózovém gelu (obrázek 8) je patrné, že pouze u jedince 1002 (č. 2) nebyl naamplifikován produkt 80/83 bp. Systém kontrol (Ke, K+, K ) ukázal, že v extrakčním a PCR postupu nedošlo ke kontaminaci a zároveň, že moderní templát se podle předpokladů amplifikoval u K+. Jednotlivé signály mezi sebou tvoří logický ráz dva vzorky téhož jedince dávají podobný signál. Dále byly amplifikační produkty vzorků separovány na polyakrylamidovém gelu (obrázek 9). Obrázek 9 Analýza pohlaví na polyakrylamidovém gelu marker 1002 tibie femur K+ K marker Z gelu na obrázku 9 je možné určit pohlaví 4 jedinců. Dva bandy nad sebou reprezentují velikosti fragmentů 80 bp a 83 bp, které odpovídají amplifikovanému úseku na X a Y chromozomu, tedy pohlaví mužskému. Jeden band (případ pozitivní kontroly) reprezentuje bandy pouze o velikosti 80 bp, amplifikovanému úseku na dvou X chromozomech, tedy pohlaví ženskému. U vzorku 1520 se v jednom případě preferenčně amplifikoval band 80 bp a v druhém naopak band 83 bp. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 10-2 a

63 Tabulka 10-2 Porovnání určeného pohlaví Porovnání stanoveného pohlaví s údaji zaznamenanými Kriminalistickým ústavem v Praze označení jedince geneticky určené pohlaví morfologicky určené pohlaví 1002 neznámé žena 1102 muž muž 1520 muž muž tibie muž muž femur muž muž pozitivní kontrola žena vlastní DNA žena Tabulka 10-3 Výsledek procento úspěšnosti izolace DNA 80 % procento shody se zaznamenaným pohlavím v soupisech Kriminalistického ústavu 100 % pravděpodobnost náhodnosti shody v pohlaví 6,25 % Pravděpodobnost náhodné shody obou přístupů je výpočtem: 1 0,

64 Výsledky analýzy 19 jedinců historické populace z století Na vzorcích jedinců ze sbírky Kriminalistického ústavu byla zjištěna úspěšnost modifikovaného protokolu Evisona (EP 3). Tento protokol byl proto použit pro izolaci adna vzorků jedinců z naleziště v Žatci. V následné tabulce 10-4 jsou uvedeny konkrétní získané bandy při detekci fragmentů na polyakrylamidovém gelu. Pořadí určení udává kolikrát se podařilo zachytit adna u různých vzorků (vzorky dvou odlišných mletí). V tabulkách 10-5 a 10-6 jsou shrnuty výsledky určení pohlaví. Tabulka 10-4 Zpracování výsledků při určování pohlaví hrob kost elektroforetický obrázek fragment adna obarvený EtBr poznámky spodní fragment 80 bp, horní 83 bp 1. určení 2. určení 3. určení Ao 9782 žebro v obou případech pouze band 80/80 bp žena zub žena Ao 9772 žebro bohužel určená pouze jednou žena Ao 9774 žebro v obou případech pouze band 80/80 bp žena žena Ao 9732 žebro tento jedinec nebyl geneticky určen Ao 9784 žebro muž muž v obou případech je Y fragment 83 bp slabě patrný, ale detekovatelný Ao 9736 žebro patrné bandy 80/83 bp muž 64

65 hrob kost elektroforetický obrázek fragment adna obarvený EtBr poznámky spodní fragment 80 bp, horní 83 bp 1. určení 2. určení 3. určení Ao 9798 žebro band 80/80 bp žena bohužel určená pouze jednou Ao 9761 žebro neurčeno zub band 80/83 bp muž Ao 9795 žebro žena muž muž ve dvou případech je patrný band 83 bp, u třetího obrázku je patrný jenom band 83 bp a naopak chybí X fragment Ao 9748 žebro bohužel určená pouze jednou žena Ao 9586 digiti jasně patrné 2 bandy 80/83 bp muž Ao 9602 žebro jasně patrné 2 bandy 80/83 bp muž Ao 9788a žebro jasně patrné 2 bandy 80/83 bp muž 65

66 hrob kost elektroforetický obrázek fragment adna obarvený EtBr poznámky spodní fragment 80 bp, horní 83 bp 1. určení 2. určení 3. určení Ao 9787 žebro patrné bandy 80/83 bp muž Ao 9821 žebro ve dvou případech band 80/80 bp žena žena Ao 9838 metatarsus ve všech třech pokusech se jednalo o ženu žena žena žena Ao 9822 žebro bohužel určená pouze jednou žena Ao 9738 zub pouze band 80/80 bp žena jedinec určen pouze jednou Ao 9775 žebro jenom jeden band 80/80 bp žena zub jenom jeden band 80/80 bp žena 66

67 Tabulka 10-5 Porovnání genetického a morfologického pohlaví hrob genetické určení morfologické určení shoda x neshoda jedinci s bandem 80 bp určení pouze jednou Ao 9782 žena žena shoda Ao 9772 žena žena shoda Ao 9774 žena žena shoda Ao 9732 žena Ao 9784 muž muž shoda Ao 9736 muž muž shoda Ao 9738 žena žena shoda Ao 9775 žena žena shoda Ao 9798 žena muž neshoda Ao 9761 muž žena neshoda Ao 9795 muž muž shoda Ao 9748 žena muž neshoda Ao 9586 muž muž shoda Ao 9602 muž muž shoda Ao 9788a muž muž shoda Ao 9787 muž muž shoda Ao 9821 žena žena shoda Ao 9838 žena žena shoda Ao 9822 žena žena shoda 15 shoda výsledků morfologických a genetických 3 neshoda 1 nepřítomnost adna pro analýzu pohlaví 2 možný drop-out (možnost, že by Y fragment nebyl amplifikován) 5 jedinec s bandem 80 bp určen pouze z jedné analýzy 67

68 Výpočty: ,33%... shoda v určeném pohlaví oběma metodami ,66%... neshoda v určeném pohlaví oběma metodami , 73%... úspěšná izolace z tvrdé lidské tkáně historického jedince , 003%... pravděpodobnost náhodné shody obou metod 4 100% 4... úspěšnost izolace adna ze zubní tkáně , 44%... úspěšnost izolace adna z kostní tkáně 68

69 Tabulka 10-6 Výsledky shoda v určení pohlaví při použití genetické a morfologické metody neshoda v určení pohlaví při použití genetické a morfologické metody 83,33 % 16,66 % úspěšná izolace historické adna 94,7 % pravděpodobnost náhodné shody obou metod při stanovení pohlaví 0,003 % úspěšnosti izolace z tkáně zubu 100 % úspěšnost izolace z tkáně kosti 94,4 % 69

70 MPS systém mtdna Amplifikace mtdna měla původně sloužit k zjištění přítomnosti adna v izolátu. Molekulární zastoupení mitochondriální DNA v buňce několika set násobně převyšuje jadernou DNA. Proto se přítomnost amplifikovatelné jaderné adna nepředpokládala, když nebyla detekována ani mtdna. Pouze v případě pozitivní amplifikace mtdna se tedy postoupilo k amplifikaci jaderné DNA. Tento postup byl zvolen v době, kdy jsme v laboratoři zaznamenali kontaminaci produktem 106/112 bp. Šetřilo se tak primerů pro oblast amelogeninového lokusu 80/83 bp. Avšak, jak z obrázků 10 a 11 vyplývá, nesprávná optimalizace by vedla k falešné domněnce o nepřítomnosti jaderné adna. Tento postup jsem proto v pozdější práci vypustila a zaměřila se na řádnou optimalizaci amplifikace úseku amelogeninu 80/83 bp. V tomto oddíle jsou shrnuty výsledné hodnoty optimální amplifikace MPS (126 bp) mtdna. Program touchdown byl zvolen kvůli zvýšení specifičnosti amplifikace, jež mělo zamezit tvorbu nespecifických primer-dimerů (tabulka 10-9). Počet cyklů 38 odpovídá množení sekvencí z adna (Gill, 2001). Optimální koncentrace hořečnatých iontů pro primery MPS (7 pmol / 30 µl reakci) a polymerázu od firmy Fermentas byla stanovena na 2,4 mm (tabulka 10-7). Tabulka 10-7 Optimální parametry komponenta MgCl 2 primery MPS koncentrace v PCR reakci 2,4 mm 7 pmol templát 10 µl 70

71 Tabulka 10-8 Nalezený optimální profil pro MPS 126 bp amplifikaci fáze amplifikace teplota čas počet opakovaní Iniciační denaturace 94 C 4 min 1. stupeň 94 C 30 s 2 x 56 C 30 s 72 C 30 s 2. stupeň 94 C 30 s 3 x 55 C 30 s 72 C 30 s 3. stupeň 94 C 30 s 3 x 54 C 30 s 72 C 30 s 4. stupeň 94 C 30 s 10 x 53 C 30 s 72 C 30 s 5. stupeň 94 C 30 s 10 x 52 C 30 s 72 C 30 s 6. stupeň 94 C 30 s 10 x 51 C 30 s 72 C 30 s Konečná elongace 72 C 5 min 71

72 Obrázek 10 MPS úsek (126 bp) touchdown C m 9788a 9788a 9788a Ke K K+ Obrázek 11 MPS (126 bp) touchdown C stejní jedinci jako na obr. 10 marker 9788a 9788a a 9788a Ke K+ K 72

73 Amplifikace jaderného úseku amelogeninu 80/83 bp Optimální variantou PCR pro získání jaderného úseku 80/83 bp byla vícestupňová PCR (Evison et al., 1997). Jde o obdobu typu touchdown, ale jednotlivé stupně annealingu nepřecházejí po jednom stupni Celsia. Tento profil PCR amplifikace zaručuje specifičtější nasedání primerů na cílové sekvence. V prvních 9 cyklech není teplota držena při 72 C a tudíž probíhá elongace jen velice minimálně, zatímco střídání denaturace s annealingem zaručuje vysokou stringenci primeru a cílové sekvence. V tabulce 10-9 jsou znázorněny výsledné parametry komponent pro optimální amplifikaci degradované jaderné adna s použitím profilu v tabulce Aplikováním optimálních parametrů bylo možné, jak z obrázků 12 až 14 vyplývá, detekovat amelogeninový lokus 80/83 bp. Tabulka 10-9 Nalezené hodnoty optimální amplifikace komponenta MgCl 2 primery koncentrace v PCR reakci 2,25 mm 5 pmol v některých případech bylo možné použít polymerázu AmpliTaq Gold, která představuje typ Hot start PCR reakce 73

74 Tabulka Profil optimální amplifikace 80/83 bp fáze amplifikace teplota čas počet opakování Iniciační denaturace 94 C 2 min* 1. stupeň 94 C 20 s 9 x 58 C 30 s 2. stupeň 94 C 30 s 25 x 56,5 C 30 s 72 C 30 s 3. stupeň 94 C 30 s 11 x 55,5 C 30 s 72 C 30 s Finální elongace 72 C 5 min * v případě použití AmpliTaq Gold bylo nutno iniciační teplotu prodloužit na 4,5 minuty 74

75 Obrázek 12 2% agaróza detekce bandů 80/83 bp marker 9788a 9788a a 9788a Ke K+ K marker příklad agarózového gelu obarveného ethidium bromidem k detekci DNA fragmentů bráno od spodu, u osmého bandu markeru (fragment 89 bp) jsou pomocí EtBr vizualizovány amplifikační produkty 80/83 bp; z tohoto gelu není ještě pohlaví určitelné Obrázek 13 14% PAGE analýza pohlaví jedinců (stejné pořadí jako na obrázku 12) marker 9788a 9788a a 9788a Ke K+ marker muž muž žena žena muž muž žena žena muž 75

76 Obrázek 14 14% polyakrylamidový gel primer- -dimery marker K marker žena muž žena muž - - muž žena žena muž zde jsou jednotlivé bandy dobře patrné. Ve spodní části jsou vizualizovány i nespecifické produkty, které jsou u všech případů do 65 bp. Nejsilnější odezva je podle očekávání u pozitivní kontroly. 76