Testování základních pracovních podmínek komprehenzivní plynové chromatografie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE P ř írodově decká fakulta Katedra analytické chemie Testování základních pracovních podmínek komprehenzivní plynové chromatografie Bakalář ská práce studijního oboru Chemie v př írodních vě dách Praha 2010 Václav Holeček

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracoval samostatně, pod vedením školitele RNDr. Radomíra Čabaly, Ph.D. a že jsem všechny použité prameny řádně citoval. Jsem si vědom toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne

3 Poděkování: Děkuji vedoucímu bakalářské práce RNDr. Radomíru Čabalovi, Ph.D. za odbornou i lidskou pomoc a cenné rady. Děkuji také mým rodičům a prarodičům. Tato bakalářská práce vznikla v souvislosti s řešením výzkumného záměru MSN a rámcového programu 14/63 MŠMT a za přispění Norway Grants (Project CZ0116).

4 Abstrakt Komprehenzivní dvojdimenzionální plynová chromatografie (GCxGC) je technika ideální při separaci komplikovaných organických směsí. Je založena na on-line separaci na dvou kolonách, které mají komplementární separační vlastnosti, a které spojuje interface cyklicky generující koncentrační pulzy. Separace trvá v řádech desítek minut a na její zpracování je nezbytné použít, kromě vhodného detektoru, software umožňující zpracovat výstupní data. V této práci byly testovány základní pracovní podmínky GCxGC na směsi uhlovodíků a Tee Tree oleje. Bylo zjištěno, že nastavení cyklu interface, tzv. modulační periody (P M ), má spolu s volbou teplotního programu největší vliv na celkovou separaci. S komplikovaností vzorku je třeba volit nižší teplotní gradient a prodloužit P M. Pro Tee Tree olej byla optimální osmisekundová P M a pro směs uhlovodíků postačovala jen třísekundová P M. Klíčová slova Komprehenzivní dvojdimenzionální plynová chromatografie, GCxGC, plynová chromatografie, GC, modulátor, Tee Tree olej

5 Abstract Comprehensive two-dimensional gas chromatography (GCxGC) is a ideal method for isolation of complex organic compounds. This technique is based on on-line separation in two comlumns with complementary separation selectivities, connected by interface cyclicaly generating concentrating pulses. The separation itself takes in order of tenth of minues and requires appropriate detector and suitable software capable of processing the output. In this work the basic working conditions for GCxGC on compound of hydrocarbons and Tee Tree oils were tested, with result that overall separation is affected mainly by setting of the interface cycle the modulation period (P M ) and the choice of thermal programme. Due to complexity of the sample the lower thermal gradient is being used and the P M itself is prolonged. Optimal P M setting for the Tee Tree oil was eight seconds and for the hydrocarbon compound three seconds only. Keywords Comprehensive two-dimensional gas chromatography, GCxGC, gas chromatography, GC, modulator, Tee Tree oil

6 Obsah 1 Úvod Teoretická část Základní principy Komprehenzivnost Volba kolon Modulace Instrumentace Modulátor...11 Modulace pomocí teploty...11 Modulace pomocí tlaku (VBM) Kombinace kolon Detekce...15 FID...15 μecd...15 qms...15 TOF-MS Experimentální část Chemikálie Použitá zařízení Pracovní podmínky Měření uhlovodíků Měření Tee Tree olejů Výsledky a diskuse Měření uhlovodíků Měření Tee Tree olejů Závěr Literatura...31

7 Seznam zkratek a symbolů 1 D první kolona, první dimenze 2 D druhá kolona, druhá dimenze μecd detektor elektronového záchytu FID plamenový ionizační detektor GC plynová chromatografie GCxGC komprehenzivní dvojdimenzionální plynová chromatografie GCxGC-qMS komprehenzivní dvojdimenzionální plynový chromatograf s kvadrupόlovým hmotnostním detektorem LMCS modulátor s podélnou kryofokusaci MDGC multidimenzionální plynová chromatografie MS hmotnostní spektrometr m/z efektivní hmotnost ionizované částice N počet teoretických pater pro poslední pík n kapacita píků na jedné koloně n(gcxgc) kapacita píků v komprehenzivní dvojdimenzionální plynové chromatografii n( 1 D) kapacita píků na první koloně n( 2 D) kapacita píků na druhé koloně P M qms t 1 modulační perioda kvadrupólový hmotnostní spektrometr retenční čas prvního píku 2 t M mrtvý čas na druhé koloně 1 t R retenční čas na první koloně 2 t R retenční čas na druhé koloně t n TDM TIC TOF-MS VBM retenční čas posledního píku tepelně desorpční modulátor odezva detektoru průletový hmotnostní detektor modulátor generující tokové pulzy

8 1 Úvod GC naráží na své hranice při separaci složek komplikovaných organických směsí, jakými jsou například separace alergenů v potravinách, polutantů v životním prostředí, složek cigaretového kouře nebo složek různých petrochemických produktů. Je totiž omezena jak vlastnostmi vzorku, instrumentací, stacionární fází (selektivita nikdy nepokrývá vlastnosti všech složek směsi), tak i kapacitou píků. Hranice použitelnosti GC je u směsí obsahujících kolem 150 složek [1]. Je-li odhlédnuto od požadavku po mimořádně rychlém a citlivém detektoru (ideální zatím neexistuje), lze s výhodou podrobit nerozdělené složky vzorku další separaci na jiném druhu stacionární fáze. Takový proces je označován za multidimenzionální GC (MDGC). Typický nástroj, který využívá sériové zapojení dvou kolon v GC, je tzv. heart-cut proces, při němž je jedna nebo více úzkých frakcí eluátu z první separační kolony (první dimenze separace, 1 D) přenesena na druhou chromatografickou kolonu (druhá dimenze separace, 2 D) [2]. Je tedy zřejmé, že se jedná o nástroj analýzy cílené na jeden nebo malou skupinu analytů. Při aplikaci této metody na úplnou analýzu neznámého vzorku je pak její časová náročnost neúnosná. Tento problém řeší metoda komprehenzivní GC, patřící rovněž mezi MDGC, která analyzuje veškerý analyt z první kolony kolonou druhou v průběhu jednoho měření. Ačkoliv od doby sestrojení prvního komprehenzivního dvojdimenzionálního plynového chromatografu uplynulo již téměř dvacet let, širší rozvoj GCxGC nastal až s rozvojem výpočetní techniky a hmotnostní spektrometrie. V létě roku 2009 byl díky podpory Norských Grantů zakoupen do laboratoře pokročilých separačních metod na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy systém GCxGC s kvadrupόlovým hmotnostním detektorem (GCxGC-qMS). Cílem této práce je osvojení a otestování techniky práce s druhou dimenzí a volba základních podmínek pro úspěšnou analýzu. 8

9 2 Teoretická část 2.1 Základní principy Základní vztahy platné pro GC [3, 4], platí také pro GCxGC. Jednotlivé parametry jako je například rozlišení, účinnost, selektivita, atd. lze vztáhnou zvlášť na každou kolonu. Speciální teoretické aspekty GCxGC jsou mimo rozsah této práce a lze je vyhledat v publikované literatuře [5, 6, 7] Komprehenzivnost Exaktní vymezení pojmu komprehenzivní není dost dobře možné, rámcově se to však podařilo [8]. Musí platit, že množství jakékoliv složky z 1 D přenesené do 2 D se sobě musí rovnat a že chromatogramy z 2 D a z 1 D spolu musí korespondovat (rozlišení z 1 D by se nemělo v 2 D snížit víc jak o 10% [8]). Ať jsou nuance kolem tohoto pojmu jakékoliv, stěžejním bodem úspěšné GCxGC je dodržení podmínek pro volbu kolon (ortogonalita), interface (modulace) a detektoru. Výsledkem jsou pak úzké píky (od cca 50 ms) a tudíž vysoká kapacita píků (až několik milionů). Cenou za tento separační proces je, že analýza je relativně dlouhá (vzhledem ke klasické GC), ale zřídka přesahuje jednu hodinu Volba kolon Myšlenku o možném zvýšení kapacity píků a její matematické vyjádření poprvé popsal J. C. Giddins [9]. Jeho představa, že je možné volit kolony tak, aby retenční časy analytů byly prvky dvojdimenzionálního eukleidovského vektorového prostoru, kde jeho osy představují retenční časy v 1D a 2D, je všeobecně přijímána. Maximální teoretická kapacita píků v GCxGC je pak rovna n(gcxgc) = n( 1 D). n( 2 D) (1) kde n( 1 D) je kapacita píků na 1 D a n( 2 D) je kapacita píků 2 D [10]. Intuitivně lze chápat píkovou kapacitou jako maximální počet píků, které mohou být separovány na jedné koloně [9]. Lze jí vypočítat ze vzorce: 9

10 n = 1 + N/4 ln (t n /t 1 ) (2) kde t n je retenční čas posledního píku a t 1 je retenční čas prvního píku, N je počet teoretických pater pro poslední pík [10]. K odvození rovnice (1) je možné přistupovat z různých hledisek. Každopádně jde o idealizaci opírající se o podmínku vzájemné nezávislosti separačních mechanismů na jednotlivých kolonách (v 1 D a 2 D). Splnění této podmínky, tzv. ortogonality kolon, se dosahuje nejen vhodnou kombinací kolon, ale i teplotních programů. Nejčastěji se na 1 D dělí složky podle bodu varu, stacionární fáze je nepolární, zatímco 2 D odpovídá separaci podle polarity a stacionární fáze je polární Modulace Správná modulace je nutná podmínka, aby MDGC pracovala v režimu GCxGC. Veškerý analyt z 1 D je rozdělen na frakce a ty jsou okamžitě dávkovány a separovány na 2 D. Zařízení, v němž proces dávkování analytu z 1 D na 2 D probíhá, se nazývá modulátor a je často považován za centrální jednotku systému GCxGC. Je definován jako interface, který kumuluje analyt z 1 D v malé zόně, případně odděluje malý úsek eluátu z 1 D a rychle jej dávkuje (injektuje) do 2 D [8]. Mezi kumulací a dávkováním může být ještě fáze, tzv. fokusace, během níž se nakumulovaná frakce postupně soustřeďuje/zakoncentrovává ve velmi úzké zόně. Samotná modulace má pak čtyři fáze: kumulaci, oddělení, fokusaci (refokusaci v případě opakované fokusace) a dávkování. V závislosti na konstrukci modulátoru probíhají jednotlivé fáze současně (první dvě fáze mohou být přehozeny). Modulátor je tedy past pro analyt z 1 D a zároveň injektor pro 2 D a můžeme jej považovat za zařízení, které cyklicky generuje koncentrační pulzy v toku mobilní fáze. Doba odpovídající jednomu modulačnímu cyklu se nazývá modulační perioda (P M ). Obvykle je shodná s mrtvým retenčním časem v 2 D ( 2 t M ). V ojedinělém případě se stane, že silně zadržovaná látka nestačí během P M eluovat z 2 D a na záznamu z detektoru se objeví až v následující periodě. Tento jev je označován jako wrap-around (česky nejspíše přetečení). 10

11 2.2 Instrumentace Modulátor Existují dvě skupiny modulátorů. První, běžnější, využívá k modulaci teplotu, P M je od 3 do 6 s, zatímco druhý typ využívá vysoký tlak a P M je roven 1 až 8 s. Modulace pomocí teploty Tepelně desorpční modulátor (TDM) Tento způsob použili J. Phillips a Z. Liu v roce 1991, čímž byl dán zrod GCxGC. Modulace byla založena na termodesorpci. První modulátor byl tvořen kapilárou umístěnou mimo termostat chromatografu. Na její části byla odstraněna polyimidová vrstva a nahrazena odporovou vrstvou (zlatá fόlie tloušťky cca 40 μm), na kterou byly vkládány pulzy elektrického proudu s vhodnou délkou a frekvencí [11]. Jakmile se analyt dostane do modulátoru o relativně nízké teplotě, nastane jeho sorpce a zachycení v krátké zόně. Následně je do odporové fόlie puštěn proudový pulz, čímž dochází k náhlému zvýšení teploty a k desorpci analytu. Podél modulátoru dochází k (re)fokusaci. Účinnost modulace závisí na schopnosti rychlého odvodu tepla z vytápěné zóny [12], tj. na její tepelné kapacitě. Pro tento účel Phillips a Xu přidali do série další vrstvu o jiném odporu napájenou pulzy s jinou frekvencí. Výsledkem byly ještě užší píky [13]. Slabinou tohoto systému byla však odporová vrstva při malé tloušťce docházelo k nečekanému odpaření a ze silnějšího materiálu se nedařilo rychle odvést teplo. I přes snahu výzkumníků několika laboratoří se nepodařilo zvládnout technické problémy TDM [14]. Elegantní řešení poskytl rotační vytápěný segment, který nahradil odporovou vrstvu. Zde má modulace čtyři fáze kumulaci, oddělení, fokusaci a dávkování [14]. Fáze kumulace je shodná s předchozím typem, segment je mimo kapiláru, která se tak plní analytem. Je však nutno uvažovat i případy, kdy ne všechen analyt bude sorbován, což se zřejmě týká velmi těkavých složek směsi a modulátor je těmito složkami tzv. prolomen. V další fázi se kapilára ocitá ve štěrbině vytápěného segmentu, analyt je oddělen a s pohybem segmentu podél kapiláry plynule fokusován do těsné blízkosti místa, v němž segment opouští kapiláru. Fokusovaný analyt se následně dostává na 2 D. Během posledních dvou fází přirozeně dochází ve vstupní části chladnoucí kapiláry k další kumulaci. 11

12 Tento systém je robustní, píky na 2 D jsou značně úzké od 60 ms [15]. Nevýhodou je, že k desorpci dochází zvýšením teploty o alespoň cca 100 C [1], maximální teplota na 1 D tedy nesmí tedy vzhledem k teplotní stabilitě stacionární fáze přesáhnout teplotu cca 230 C. Kryogenní systém Klíčové fáze modulace jsou zachycení a dávkování. Pokud je použito k zachycení výrazné lokální snížení teploty vyvolané chladícím médiem (v praxi kapalný CO 2 nebo N 2 chlazený kapalným N 2 ) a dávkování je způsobeno náhlým zvýšením teploty, jedná se o tzv. kryogenní modulátor. V současné době se v drtivé většině používá právě kryogenní přístup. A to hned z několika hledisek: efektivní fokusace i velmi těkavých látek, úplné přenesení složky z 1 D na 2 D, nepřehřívání kapiláry modulátoru a robustnost. Z těchto důvodů se jen málo studií kloní na stranu efektivity TDM [16, 17, 18]. Navíc teplotní limity kolony mohou být zcela využity a píky na 2 D jsou mimořádně úzké [19]. Použití kryogenní metody není nové. Možná proto bylo použití již první konstrukce tohoto typu modulátoru úspěšné [20]. S minimálními změnami se používá tzv. kryogenní systém s podélnou modulací (LMCS) dodnes. Zařízení je tvořeno cyklicky v prostoru oscilující komůrkou chlazenou kapalným CO 2, která obepíná kapiláru (obr. 1A). K zachycení a fokusaci (zde je označována jako kryofokusace) dochází v chladné zόně tvořené chlazenou komůrkou. Ohřev a dávkování je provedeno pouze teplotou termostatu chromatografu. Úspěch modulace záleží na přesném sledování teploty chlazené komůrky a pece, čímž je řízen režim modulátoru [15, 19]. Systém je však limitován nejnižší teplotou modulátoru, kdy pro kapalný CO 2 je to cca -60 C. I přes velký úspěch LMCS existovala snaha zkonstruovat srovnatelné zařízení co do kvality modulace, které by neobsahovalo žádný pohyblivý prvek. Pohyblivý segment v LMCS je u tohoto řešení nahrazen jednou až čtyřmi tryskami. Jednou nebo dvěma tryskami proudí ve vhodný okamžik horký vzduch sloužící k termodesorpci obvykle v případě, kdy je na kryofokusaci použit N 2. Zbývajícími tryskami proudí chladící médium způsobující kryofokusaci. Rotační pohyb u LMCS je zde nahrazen správným časováním trysek. Podle počtu kryofokusací analytu v průběhu modulace se systém označuje jako jedno nebo dvojstupňový (jednostupňový se již nepoužívá). Ne příliš časté, ale možné je použít jako 12

13 chladící médium okolní vzduch, to bylo prokázáno při separaci n-alkanů (úspěšná byla modulace počínaje C 17 ) [18]. (A) CO 2 (l) (B) CO 2 (l) Injektor Detektor Injektor Ventil Detektor Pohyb modulátoru Dávkování Spojka Trysky Zachycení Spojka 1 D 2 D Termostat 1 D Termostat 2 D (C) Injektor Horké médium Spojka Chladné médium Horká tryska Chladná tryska Detektor (D) Injektor Horké médium Chladné médium Chladné trysky Horké trysky Spojka Detektor 2 D 1 D Termostat 1 D Termostat 2 D Obrázek 1. Schémata GCxGC s kryomodulací: (A) LMCS, (B) dvoutryskový modulátor (C) dvoutryskový modulátor se smyčkou, (D) čtyřtryskový modulátor Modulace pomocí trysek Dvoutryskový systém v lineárním uspořádání je tvořen párem trysek podél kolony, kdy vše je umístěno v termostatu chromatografu. Ve vhodném okamžiku proudí tryskami kapalný CO 2 [21], který míří na zónu kapiláry, kde dochází ke kryofokusaci (obr. 1B). Čtyřtryskový systém je tvořen dvěma páry paralelně uspořádaných trysek, kdy pár je vždy tvořen jednou tryskou s horkým N 2 a jednou tryskou s chladivem (obě míří na stejný bod kapiláry, obr. 1D). Systém je účinný i pro plynné látky a podařilo se separovat směs propanu s butanem [22]. 13

14 Jistou alternativou čtyřtryskového systému je dvoutryskový systém s jednou nebo dvěma smyčkami [23, 24]. Pod párem trysek pak prochází jedna kolona na dvou místech, dochází tak v jednom okamžiku a na dvou úsecích kolony/smyčky buď ke kumulaci a kryofokusaci, nebo k ohřevu a dávkování (obr. 1C). Modulovat se podařilo uhlovodíky již od C 4 (T v C) až do C 40 (T v 528 C) [17]. Modulace pomocí tlaku (VBM) Tento druh modulátoru má celou řadu výhod ve srovnání s rozšířeným kryogenním systémem. Předně nepotřebuje žádné chlazení, potlačuje wrap-around efekt a jeho pořizovací cena je mnohem nižší nehledě na nízké provozní náklady. Zprvu konstruované VBM nedokázaly beze ztráty přenést eluát z 1 D do 2 D. K obratu došlo v roce 2006, kdy nová třída VBM, tzv. modulátor s pulzy toku, nepoužívá k modulaci přímo žádné mechanické prostředky, pouze pulzy koncentrační a tokové generované trojcestným ventilem [25, 26, 27]. Byl též popsán systém kombinující TDM s předsazeným trojcestným ventilem [26] a jen dva modulátory, s mechanickým odklonem toku eluátu [27, 28] Kombinace kolon Podmínka ortogonality jednoznačně určuje charakter obou kolon. Vzhledem k faktu, že je jimi tvořen celý separační prostor, je třeba zajistit, aby jejich separační mechanismy byly komplementární. V drtivé většině případů se používá na 1 D nepolární fáze, kdy se jednotlivé složky dělí podle těkavosti neboli dle svých teplot varů, a proto na 2 D musí být fáze polární (interakce mezi stacionární fází a analytem musí být specifické - doplněk k 1 D). Efektu zvláště úzkých píků je dosaženo vyššími průtokovými rychlostmi na 2 D, čehož lze dosáhnout dvěma způsoby. V prvém případě se působí zvnějšku zvýšeným tlakem, což je obvyklý způsob u VBM, a pak průměry obou kolon mohou být stejné (standardně 0,25 mm) nebo větší na 2 D (0,32 nebo 0,53 mm). Druhý způsob, který používají modulátory využívající teplotní gradient, je založen na menším průměru na 2 D (standardně 1 D 0,25 mm a 2 D 0,1 mm). 14

15 Vzhledem k faktu, že délka analýzy na 2 D je rovna modulační periodě (P M ), která je ve srovnání s délkou analýzy na 1 D velmi krátká, probíhá analýza na 2 D prakticky za izotermálních podmínek Detekce Modulace a rychlá separace na 2 D mají za následek velmi úzké píky, které mají běžně u základny šířku ms, v některých případech až 45 ms [29]. Je proto požadován detektor s vysokou rychlostí sběru dat (akvizice). Ze široké palety detektorů se v GCxGC nejčastěji používá plamenový ionizační (FID) a elektronového záchytu (μecd), z hmotnostních kvadrupόlový (qms) a průletový (TOF-MS). FID Na spolehlivou kvantifikaci analytů je třeba akvizice odpovídající deseti hodnotám na pík [30]. Pro pík o šíři 50 ms je tedy potřeba odečíst hodnotu signálu každých 5 ms, což odpovídá vzorkovací frekvenci detektoru 200 Hz. V současné době jsou dostupné FID s frekvencí až 300 Hz. Bývá rovněž s výhodou použit jako doplňkový detektor v případě hmotnostní detekce. μecd Tento detektor je na hranici použitelnosti pro GCxGC, protože rychlost akvizice je jen 50 Hz [31]. Používá se především pro stanovení halogenovaných látek. qms Podmínka kvantitativní analýzy v případě hmotnostní detekce je asi sedm spekter na šířku píku [32]. Pro běžné kvalitativní určení stačí asi polovina, tj. tři až čtyři spektra [33]. Parametr charakterizující pracovní možnosti detektoru je kromě rychlosti sběru dat i rozsah hmotností tohoto spektra. Tyto dva parametry jsou spolu svázány, neboť rozsah spektra je limitován rychlostí skenu, tj. frekvencí sběru intervalu efektivní hmotnosti ionizované částice (m/z), viz. tab. 1 [34]. V současné době jsou komerčně dostupné qms plně dostačující pro identifikaci (až 50 Hz). 15

16 Tabulka 1. Vzájemná závislost šířky píku, hmotnostního rozsahu spektra a doby trvání skenu pro různé rychlosti akvizice a Rychlost akvizice [Hz] Šířka píku [ms] b Maximální rozsah spektra [m/z] Doba skenu [ms] c 9,6 19,6 29,6 39,6 a rychlost skenu je m/z/s, prodleva detektoru (dwell time) je 10,4 ms b šířka píku odpovídající sedmi skenům na pík c Doba skenu = celková doba cyklu zmenšená o prodlevu detektoru; pro případ akvizice 50 Hz je doba cyklu 20-10,4 ms, tj. na jeden sken vychází 9,6 ms. TOF-MS Tento detektor je ideální pro GCxGC. Rychlost akvizice je 100 Hz i víc pro spektrum o rozsahu 1000 m/z. Jeho nevýhodami jsou pořizovací cena a vysoké provozní náklady. 3 Experimentální část 3.1 Použité chemikálie Jako rozpouštědlo byl použit pentan (99 %, Fluka, Steinheim, Německo). Do směsi uhlovodíků byl použit hexan (95 %, Fluka, Steinheim, Německo), heptan (95%, Lachema, Neratovice, Česká Republika), oktan (čistý, Reachim, SSSR), nonan (99 %, Sigma-Aldrich, Steinhein, Německo) a dekan (99 %, Sigma-Aldrich, Steinhein, Německo). Byly vybrány dva esenciální oleje Tee Tree (Australian Bodycace), Tee Tree (Dr. Müller Pharm, Praha, Česká Republika) Byl připraven 0,02 M roztok uhlovodíků C 6 -C 10 v pentanu (v němž každý uhlovodík je 0,02 M) vzorek A; roztok Tee Tree oleje (Australian Bodycare) v pentanu vzorek B naředěn v objemovém poměru 1/100 a 1/10; roztok Tee Tree oleje (Dr. Müller Pharm) v pentanu vzorek C naředěn v objemovém poměru 1/

17 3.2 Použitá zařízení Systém GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Plus, jehož součástí je split/splitless injektor, GC a qms Kolony 1 D: 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, SLB 5ms (Supelco, Sigma-Aldrich, ČR) 2 D: 2,5 m x 0,1 mm x 0,1μm, Supelcowax 10 (Supelco, Sigma-Aldrich, ČR) Modulátor KT (Zoex Corporation, Houston, TX, USA), kryogenní dvojstupňový systém se smyčkou, chladícím médium kapalný N 2 Software GC Image (verze 2.0b2_2, Zoex Corporation, Houston, TX, USA) 3.3 Pracovní podmínky MS Nosný plyn: He (99,999%, Linde, ČR) Teplota iontového zdroje: 250 C, teplota interface: 235 C, rozsah m/z: , rychlost skenu: 1000 m/z/s Injektor Teplota nástřiku: 250 C Modulátor Horkou tryskou modulátoru proudil vzduch o teplotě 325 C po dobu 375 ms vždy jedenkrát počátkem P M. Dusík chlazený na teplotu kapalného dusíku proudil bez přerušení Měření uhlovodíků Studium vlivu změn vstupního tlaku u 1 D Pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, modulace, teplotní program 40 C drženo 5 minut, pak gradient 5 C/min do 90 C a gradient 15 C/min do 200 C, drženo 1 min, tlak byl měněn v řadě 80, 100, 120, 140 kpa 17

18 Studium vlivu změn teplotního programu Pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, modulace, tlak 120 kpa, teplotní program 50 C drženo 5 min, pak byla měněna teplotní rampa v řadě 2,5, 5, 7,5, 10 C/min vždy do 200 C Studium vlivu změn doby modulace Pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, modulace, tlak 120 kpa, teplotní program 40 C drženo 5 minut, pak gradient 5 C/min do 90 C a gradient 15 C/min do 200 C, drženo 1 min, P M byla měněna v řadě 2, 3, 4 s Měření Tee Tree olejů Základní program byl modulace 6 s, tlak 400 kpa, split poměr 1/50 a teplotní program 40 C drženo 5 minut, pak gradient 5 C/min do 225 C. Postupně byl měněn tlak, koncentrace, teplotní rampa a modulace (tab. 2).. Tabulka 2. Pracovní podmínky GCxGC použité při separaci vzorků Tee Tree olejů Metoda Vzorek Ředění Split Modulace Tlak Teplotní program poměr [s] [kpa] 1 B 1/100 1/50 6 5min 40 C, 5 C/min 225 C, 3 min B 1/10 1/50 6 5min 40 C, 5 C/min 225 C, 3 min B 1/100 1/50 6 5min 40 C, 2,5 C/min 225 C B 1/100 1/50 8 5min 40 C, 2,5 C/min 225 C B 1/100 1/50 6 5min 40 C, 5 C/min 225 C, 3 min C 1/100 1/50 6 5min 40 C, 5 C/min 225 C, 3 min Výsledky a diskuse 4.1 Měření uhlovodíků Studium vlivu změn vstupního tlaku u 1 D Změny vzestupu tlaku by měly ovlivňovat průtokovou rychlost v obou dimenzích a tím i 18

19 celkovou délku analýzy. Účinnost separace by měla odpovídat Van Deemterově křivce. S růstem tlaku v řadě 80 kpa, 100 kpa, 120 kpa, 140 kpa se zkracovala doba analýzy bez ztráty kvality separace, zkracovaly se i retenční časy na 2 D ( 2 t R ), obr (Dva rozmyté píky při tlaku 100 kpa byly pravděpodobně způsobeny přechodnou poruchou modulace). Nezávislá kvalita separace je patrná na hodnotách rozlišení mezi cyklohexanem a C 6, viz. tab. 3. Tabulka 3. Závislost rozlišení mezi cyklohexanem (C 6,cyklo ) a C 7 na změnách vstupního tlaku Tlak [kpa] Rozlišení v 1 D 1,87 2,10 2,05 1,92 C 9 C C 6 C 7 C 10 C 8 6,cyklo 1 t R [min] Obrázek 1. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při vstupním tlaku 80 kpa, pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, modulace, teplotní program 40 C, 5 minut, 5 C/min do 90 C, 15 C/min do 200 C, 1 min Intenzity signálů rostou v barevné škále od modré přes fialovou a zelenou ke žluté. 1 t R [min] Obrázek 2. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při vstupním tlaku 100 kpa, pracovní podmínky: viz obr. 1 19

20 1 t R [min] Obrázek 3. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při vstupním tlaku 120 kpa, pracovní podmínky: viz obr. 1 1 t R [min] Obrázek 4. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při vstupním tlaku 140 kpa, pracovní podmínky: viz obr. 1 Studium vlivu změn teplotního programu Je známo, že teplotní gradient má na separaci mnohem větší vliv než změny vstupního tlaku. Byly proto zkoušeny různé teplotní programy. S růstem teplotní rampy a tedy se zkracující se dobou analýzy se zhoršovala celková separace, jak lze pozorovat na trojici minoritních píků (dva píky o stejném 2 t R jsou pravděpodobně izomery oktanu, třetí je pravděpodobně organokovová sloučenina molibdenu) v oblasti U na obr Chvosty píků u gradientu 10 C/min byly způsoben pravděpodobně nedokonalou kryofokusací z důvodu poklesu chlazení modulátorem. Ve shodě s teorií lze konstatovat, že teplotní gradient má výrazný vliv na separaci a potvrzuje pravidlo, že výhodné jsou gradienty o nízké hodnotě. 20

21 U 1 t R [min] Obrázek 5. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků za teplotního programu 5 min 50 C, 2,5 C/min do 200 C, pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, modulace, tlak 120 kpa, modulace 8 s U Obrázek 6. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků za teplotního programu 5 min 50 C, 5 C/min do 200 C, pracovní podmínky: viz. obr. 5 1 t R [min] U 1 t R [min] Obrázek 7. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků za teplotního programu 5 min 50 C, 7,5 C/min do 200 C, pracovní podmínky: viz. obr. 5 21

22 U 1 t R [min] Obrázek 8. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků za teplotního programu 5 min 50 C, 10 C/min do 200 C, pracovní podmínky: viz. obr. 5 Studium vlivu změn modulace Ne náhodou bývá označován modulátor za srdce GCxGC. Narušení některé z fází modulace může být jednou z příčin chvostování píků, wrap-around efektu nebo zhoršeného rozlišení. P M byla měněna od 2 do 4 s. Ukázalo se, že dvousekundová modulace je nevhodná. Píky, které jsou pří ní rozštěpeny na dvě části mají stejná hmotnostní spektra, obr. 9. Příčin může být celá řada, velmi často bývá klíčová volba doby chlazení. Jednotlivé uhlovodíky v důsledku svých podobných polarit nepotřebují dlouhou P M, již třísekundová je dostačující, obr. 10. Bylo potvrzeno, že P M má nejdramatičtější vliv na celkovou separaci. 1 t R [min] Obrázek 9. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při modulaci 2 s, pracovní podmínky: koncentrace vzorku 0,02 mol/l, split poměr 1/100, teplotní program 40 C, 5 minut, 5 C/min do 90 C, 15 C/min do 200 C, 1 min 22

23 1 t R [min] Obrázek 10. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při modulaci 3 s, pracovní podmínky: viz. obr. 9 1 t R [min] Obrázek 11. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku uhlovodíků při modulaci 4 s, pracovní podmínky: viz. obr Měření Tee Tree olejů Studium vlivu změn vstupního tlaku u 1 D Předběžnými experimenty bylo zjištěno, že pro analýzu vzorku s látkami o široké škále polarit jsou dosud testované tlaky zcela nevhodné. Jako optimální byl zjištěn tlak 400 kpa, obr. 13. Vzorek, který byl použit při měření za vstupního tlaku 120 kpa, byl zřejmě znečištěn ftaláty, tomu odpovídají výrazný vertikální pás chvostujících píků o malé intenzitě s počátkem 1 t R = 38 min, 2 t R = 1,2 s, obr

24 1 t R [min] Obrázek 12. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky: metoda 2, tab. 5, tlak 120 kpa Intenzity signálů rostou v barevné škále od modré přes fialovou a zelenou ke žluté. Při programu č.1 v tab. 2 byly porovnávány Tee Tree oleje od firem Australian Bodycare (obr. 12) a Dr. Müller Pharm (obr. 13). Dále byl analyzován složkově pestřejší, tedy od firmy Australian Bodycare. Separace při tlaku 400 kpa je ve srovnáním s tlakem 120 kpa mnohem lepší. Nejenže se zkrátila doba separace o více než 7 minut, ale zlepšila se i celková separace (obr. 12, 14). 24

25 1 t R [min] Obrázek 13. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Dr. Müller Pharm), pracovní podmínky: metoda č. 1, tab. 2, tlak 400 kpa 1 t R [min] Obrázek 14. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky: metoda 1, tab. 2, tlak 400 kpa 25

26 Studium vlivu změny koncentrace vzorku S menším naředěním vzorku, které je jen desetinásobné, se sice zvětšil počet pozorovaných minoritních složek, ovšem současně došlo k částečnému splynutí majoritních a středně velkých píků. Proto se v podstatě nezměnil počet identifikovaných složek. Zvýšené chvostování majoritních píků je také důsledkem zvýšené koncentrace vzorku. 1 t R [min] Obrázek 15. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky: metoda 2, tab. 2, ředění 1/10 Studium vlivu změn teplotního programu Změnou teplotní rampy z 5 C/min na 2,5 C/min bylo docíleno výrazné zlepšení separace složek, které zprvu nebylo možné identifikovat. Toto zlepšení je však na úkor prodloužení doby analýzy z 40 (obr. 14, str. 24) na 63 min (obr. 16, 17). Na píku A je lze pozorovat wrap-around efekt. Jedná se o terc. bulylester 4-hydroxy-4-methylhex-5-enové kyseliny. Z toho plyne, že modulace 6 s není pro separaci optimální. 26

27 A 1 t R [min] Obrázek 16. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky: metoda 2, tab. 2, teplotní program 5 min 40 C, 2,5 C/min do 225 C A 2 t R [s] 1 t R [min] Obrázek 17. Třídimenzionální zobrazení dvojdimenzionální separace Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky viz. obr. 16. Odezva detektoru (TIC). 27

28 Použitý software umožňuje pravé 3D zobrazení, které je výhodné pro názornou vizualizaci chromatogramu, ovšem pro identifikaci, kvantifikaci a praktické vyhodnocení je nevhodné. Na obrázku 17 je uveden příklad pravého 3D zobrazení chromatogramu z obrázku 16. Studium vlivu změn modulace Shrnutím závěrů studia vlivu P M a teplotního gradientu se jako optimální ukázaly gradient 2,5 C/min a P M 8 s. Za těchto podmínek byla provedena analýza vzorku Tee Tree oleje Modulace 8 s spolu s teplotní gradientem 2,5 C/min je pro separaci Tee Tree oleje (obr. 18) optimální. Srovnáním s obr. 16 je vidět, že wrap-around složky A je odstraněn. V Tee Tree ojeji (Australian Bodycare) bylo zjištěno asi 150 píků, z nichž u 13 byla odezva detektoru větší než dva miliony, dalších asi 40 píků mělo intenzitu více než půl milionu. 13 nejintenzivnějších píků bylo identifikováno (tab. 4). Složky I a II byly vybrány pro studium opakovatelnosti. Tabulka 4. Číslo složky Název složky 1 t R [min] 2 t R [s] 1 2Tthujen 18,33 0,52 2 α-pinen 18,73 0,52 3 α-terpinen 25,33 0,64 4 o-cymen 24,87 0,76 5 Sylvestren 21,27 0,64 6 Eucalyptol 25,53 0,68 7 γ-terpinen 27,13 0,68 8 α-terpinolen 29,00 0,68 9 Terpinen-4-ol 35,27 1,16 10 α-terpieol 36,07 1,40 11 Alloaromadendren 49,93 0,76 12 (+)-Leden 52,60 0,80 13 δ-cadinen 53,93 0,84 I 2-Isopropenyl-5-methylhex-4-enal 46,80 3,12 II Diethyl ftalát 57,30 2,16 28

29 A 10 I II Obrázek 18. Konturové zobrazení dvojdimenzionální separace vzorku Tee Tree oleje (Australian Bodycare), pracovní podmínky: metoda 4, tab. 2, modulace 8 s 1 t R [min] Opakovatelnost Na závěr práce byla při základním programu Tee Tree olejů studována opakovatelnost měření na retenčních časech dvou vybraných minoritních látek (viz. tab. 5). Retenční časy na 1 D jsou u všech měření identické, avšak relativní standardní odchylka u 2 t R je pro diethyl-ftalát 3,3 % a pro 2-isopropenyl-5-methylhex-4-enal 4,3 %. Lze tedy konstatovat, že měření za výše uvedených podmínek jsou opakovatelná. Tabulka 5. Měření opakovatelnosti retenčních časů diethyl-ftalátu a 2-Isopropenyl-5-methylhex-4-enalu při základním programu Tee Tree olejů Číslo měření 1 t R 2 t R Číslo měření 1 t R 2 t R diethyl-ftalát [min] [s] isopropenyl-5-methylhex-4-enal [min] [s] 1 35,7 2, ,35 2, ,7 2, ,35 2, ,7 2, ,35 2, ,7 2, ,35 2, ,7 2, ,35 2, ,7 2, ,35 2,58 29

30 5 Závěr GCxGC je technika velice účinná při separaci komplikovaných organických směsí. Při testování základních pracovních podmínek GCxGC-qMS bylo zjištěno, že ze všech parametrů postupně měněných na systému GCxGC má zásadní vliv na celkovou separaci P M. Volba teplotního programu je vždy kompromis mezi dobou separace a kvalitou identifikace. Vyšší teplotní gradienty byly dostačující pouze pro jednoduché směsi. Vliv tlaku na separaci není sice tak markantní, ale při jeho nižších hodnotách se zbytečně prodlužuje doba analýzy a současně klesá rozlišení. Ukázalo se, že v případě separace komplikované směsi s růstem koncentrace vzorku se počet rozlišených píků nemění, vyšší počet pozorovaných minoritních složek směsi byl na úkor rozlišení středně a majoritně zastoupených složek. Pro směs uhlovodíků postačovala čtyřsekundová, v případě Tee Tree oleje osmisekundová modulace. Jak pro směs uhlovodíků, tak pro Tee Tree olej (Australian Bodycare) byla nejlepší separace při teplotním gradientu 2,5 C/min a P M 8 s. V případě směsi uhlovodíků byl však dostačující gradient 5 C/min a modulace dokonce jen 3 s. Na příkladu dvou minoritních složek u Tee Tree oleje (Australian Bodycare) byla prokázána opakovatelnost měření na retenčních časech v obou dimenzích. Na 1 D byly retenční časy vždy identické, na relativní směrodatná odchylka 2 t R nepřesáhla 5%. 30

31 6 Literatura [1] Phillips, J. B., Beens, J.: J. Chromatogr. A, 856, 331 (1999) [2] Bertsch, W.: J. High Resol. Chromatogr. 22, 647 (1999) [3] Purnell, H.: Plynová chromatografie, Praha, SNTL 1966 [4] Guiochon, G., Guillemin, C. L.: Quantitative gas chromatography, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, Elsevier 1988 [5] Davis, J. M.: Anal. Chem., 65, 2014 (1993) [6] Blumberg, L. M., David, F., Klee, M. S., Sandra, P.: J. Chromatog. A 1188, 2 (2008) [7] Blumberg, L. M.: J. Sep. Sci. 31, 3358 (2008) [8] Schoenmakers, P., Marriott, P. J., Beens, J.: LC-GC Eur 16, 335 (2003) [9] Giddings, J. C.: Anal. Chem. 39, 1027 (1967) [10] Giddings, J. C.: J. High Resolut. Chromatogr. 10, 319 (1987) [11] Liu, Z. Y., Phillips, J. B.: J. Chromatogr. Sci. 29, 227 (1991) [12] De Geus, H., De Boer, J., Brinkman, U. A. Th.: J. Chromatogr. A. 767, 1 (1997) [13] Phillips, J. B., Xu, J.: J. Chromatogr. A 703, 327 (1995) [14] Phillips, J. B., Gaines, R. B., Blomberg, J., Schoenmakers, P., Van der Wielen, F. W. M., Dimandja, J.-M., Green, V., Granger, J., Patterson, D., Racovalis, L., De Geus, H., De Boer, J., Haglund, P., Lipsky, J., Ledford, E. B.: J. High Resolut. Chromatogr. 22, 3 (1999) [15] Beens, J., Blomberg, J.,Tijssen, R.: J. Chromatogr. A 822, 233 (1998) [16] Tiyapongpattana, W., Wilairat, P., Marriott, P. J.: J. Sep. Sci. 31, 2640 (2008) [17] Haglund, P., Harju, M., Danielsson, C., Marriott, P.: J. Chromatogr. A 962, 127 (2002) [18] Gaines, R. B., Frysinger, G. S.: J. Sep. Sci. 27, 380 (2004) [19] Kinghorn, R. M., Marriott, P. J.: J. High Resolut. Chromatogr. 22, 235 (1999) [20] Marriot, P. J., Kinghorn, R. M.: Anal. Chem. 69, 2582 (1997) [21] Beens, J., Adahchour, M., Vreuls, R. J. J., Van Altena, K., Brinkman, U. A. Th.: J. Chromatogr. A 919, 127 (2001) [22] Pursch, M., Eckerle, P., Biel, J., Strefo, R., Cortes, H., Sun, K., Winnford, B.: J. Chromatogr. A 1019, 43 (2003) [23] Kristenson, E. M., Korytár, P., Danielsson, C., Kallio, M., Brandt, M., Mäkelä, J., 31

32 Vreuls, R. J. J., Beens, J., Brinkman, U.A.Th.: J. Chromatogr. A 1019, 65 (2003) [24] Ledford, E. B., TerMaat, J. R. Billesbach, C. A.: Technical Note KT Zoex Corporation, Lincoln, Nebraska, USA [25] Seeley, J. V., Micyus, N. J., Bandurski, S. V.: Anal. Chem. 79, 1840 (2007) [26] Poliak, M., Kochman, M., Amirav, A.: J. Chromatogr. A 1186, 189 (2008) [27] Gu, Q., David, F., Lynen, F., Rumpál, K., Xu, G., De Vos,P., Sandra, P.: J. Chromatogr. A, 1217, 4448 (2010) [28] Oldridge, N., Panic, O., Gorecky, T. : J. Sep. Sci. 31, 3378 (2008) [29] Adahchour, M., Beens, J., Brinkman, U. A. Th.: J. Chromatogr. A 67, 3305 (2008) [30] Mohler, R. E, Prazen, B. J., R.E. Synovec, R. E.: Anal. Chim. Acta 555, 68 (2006) [31] Wang, F. C. Y.: J. Chromatogr. A, 1188, 274 (2008) [32] Mondello, L., Tranchida, P. Q., Dugo, P., Dugo, G.: Mass Spectrometry Reviews 27, 101 (2008) [33] Pizzutti I. R., Vreul, R. J. J., De Kok, A., Roehr, R.,Martel, S., Friggi, C. A., Zanella, R.: J. Chromatogr. A, 1216, 3305 (2009) [34] Adahchour, M., Brandt, M., Baier, H.-U., Vreuls, R. J. J., Batenburg, A. M., Brinkman, U. A. Th.: J. Chromatogr. A 1067, 245 (2005) 32