Obecně lze tyto interakce modelovat reakcemi makromolekuly M s menšími ligandy X podle schématu

Transkript

1 Stanovení termodynamických dat pomocí titrační kalorimetrie Karel Řehák, Ústav fyzikální chemie VŠCHT Praha 1. Úvod Titrační kalorimetrie je technika, která je v současné době intenzivně používaná pro studium termodynamiky mezimolekulárních interakcí. Nachází uplatnění při studiu biologicky aktivních látek (protein ligand, protein nukleová kyselina, protein protein interakce), v supramolekuární chemii (komlexační rekace s cyklodextriny nebo crown ethery). becně lze tyto interakce modelovat reakcemi makromolekuly M s menšími ligandy X podle schématu M+ X + X (1) M + X ( n-1) který je možno souhrnně zapsat ve tvaru n M+ n X n () Pro uvedený děj, titrační kalorimetrie umožňuje vyhodnotit důležitá termodynamická data, která charakterizují kvalitu interakce mezi M a X. Konkrétně se jedná se o rovnovážnou konstantu K (tzv. binding constant) a reakční teplo ΔH (tzv. heat of binding) a parametr n (number of sites), kterým je dána stechiometrie studovaného procesu. Následně lze ze získaných dat vyhodnotit standardní reakční Gibbsovu energii ΔG Δ G = RTln K (3) a standardní reakční změnu entropie ΔH ΔG Δ S = (4) T Podle hodnoty ΔG je možno usoudit jak ochotně reakce probíhá. Záporné hodnoty ΔG indikují, že reakce probíhá zleva doprava. Čím je hodnota zápornější, tím reakce probíhá ochotněji (tím větší je i hodnota K). Jsou-li hodnoty ΔG kladné, reakce samovolně neprobíhá tak, jak je zapsaná. Reakce by probíhala samovolně zprava doleva. Z definiční rovnice Gibbsovy energie, kterou pro konstantní teplotu můžeme zapsat ve tvaru Δ G =ΔH T ΔS (5) plyne, že hodnota ΔG se skládá ze dvou členů entalpického (ΔH ) a entropického ( TΔS ). Záporná hodnota reakční entalpie (tj. teplo se uvolňuje) indikuje, že v reakci převládá energie uvolněná při tvorbě vazeb v produktu. Naopak kladná hodnota ΔH (tj., teplo se spotřebovává) naznačuje, že v reakci převládá energie spotřebovaná na štěpení vazeb.

2 Reakční změna entropie souvisí s výslednou neuspořádaností děje. Záporné hodnoty ΔS znamenají, že neuspořádanost reakcí klesla. Kladné hodnoty naznačují, že neuspořádanost stoupla. V případě reakcí (1) je zřejmé, že dochází ke vzniku větší uspořádanosti a tudíž ΔS je záporné. Aby vznikaly stabilní sloučeniny n, musí být ΔG záporné. To znamená, že kladná hodnota členu ( TΔS ) musí být převážena dostatečně velkou zápornou hodnotou ΔH, která indikuje vznik pevných vazeb.. Úlohy pro dyssey simulace.1 Komplexace 18-crown-6-etheru s KCl 1. Pomocí strukturního editoru dyssey vytvořte molekulu 18-crown-6-etheru (viz obr. 1) a přidejte atom draslíku a chloru. Atomy KCl umístěte blízko středu a použijte funkci Minimize, která nalezne energeticky nejvýhodnější uspořádání vytvořených struktur. br. 1. Strukturní vzorec 18-crown-6-etheru a jeho model. Použijte zobrazení Space Filling a spusťte simulaci. 3. Sledujte vznik stabilního komplexu crownetheru s kationem K Pozorujte simulaci při různých teplotách. br.. Komplex 18-crown-6-etheru s kationem K +

3 . Komplexace crownetherů s různými ionty 1. Pomocí strukturního editoru dyssey vytvořte molekuly 1-crown-4-etheru, 15-crown-5- etheru a 18-crown-6-etheru. (Ve značení x-crown-y-ether je x celkový počet atomů v kruhu a y je počet atomů kyslíku.). Přidejte ionty Li +, Na + a K Použijte zobrazení Space Filling. 4. Vytvořte celu, ve které bude od každého etheru jedna molekula a od každého iontu 1 částic. 5. Spusťte animaci a dle potřeby měňte velikost cely a teplotu. 6. Pokuste se najít odpověď: a) Bude každá molekula crownetheru kompletovat s jiným iontem? b) Dojde zvyšováním teploty k rozpadu komplexu? 3. Vyhodnocení rovnovážné konstanty K a reakční entalpie ΔH z kalorimetrických dat 3.1 Popis kalorimetru a jeho funkce Hlavní součásti isotermního titračního kalorimetru jsou dvě stejné cely (měřicí a referenční), dávkovací stříkačka s míchadlem a elektronika, která udržuje konstantní teplotu, detekuje tepelný tok mezi měřicí a referenční celou a ovládá automatizovanou titraci měřicí cela referenční cela 3 injekční stříkačka titračního zařízení 4 motorek umožňující rotaci stříkačky 5 tepelná izolace 6 zesilovač signálu tepelného toku 7 záznam závislosti tepelného toku na čase v průběhu titrace 8 krokový motorek titrátoru μj/s min 6 br. 3. Hlavní součásti titračního kalorimetru

4 Měřicí cela o známém objemu V se naplní odplyněným roztokem makromolekuly M (např. 18-crown-6-etheru) o koncentraci (c M ) cel a dávkovací stříkačka roztokem ligandu L (např. KCl) o koncentraci (c X ) tit. (Referenční cela je obvykle naplněna čistou vodou.) Pomocí ovládacího softwaru kalorimetru se naprogramuje sekvence jednotlivých titračních přídavků (objemy V tit ). Spuštěním chodu celé sekvence se odstartuje kalorimetrické měření, během kterého elektronika kalorimetru zaznamenává tepelný tok (obvykle v μj/s) mezi měřicí a referenční celou. Kalorimetrický signál monitorovaný pomocí počítače v závislosti na čase má v tomto případě tvar série píků (viz obr. 3). Softwarovou integrací jednotlivých píků se získají tepla (dq) odpovídající jednotlivým přídavkům roztoku ligandu do cely. 3. Vyhodnocení experimentu Z experimentálních dat je možno vyhodnotit tzv. Wisemanovu isotermu [1], což je závislost tepla dq normalizovaného změnou koncentrace ligandu, tj. (dq/d(c X ) cel ) exp na poměru celkové koncentrace ligandu a makromolekuly X r = (c X ) cel /(c M ) cel. Pozn.: V případě, kdy se jedná o experimentální data, teplo označované dq a změnu koncentrace označovanou d(c X ) cel lze chápat jako ΔQ a Δ(c X ) cel, neboli jako uvolněné teplo a změnu celkové koncentrace ligandu X v měřicí cele způsobené titračním přídavkem. Experimentální křivka bude mít tvar, který určují jednak koncentrace (c X ) tit a (c M ) cel a dále rovnovážná konstanta K, entalpie ΔH a parametr n, který odpovídá stechiometrii reakce (). Neboli dq = fexp( Xr, K, ΔH, n) d( c ) (6) X cel exp Vyhodnocení rovnovážné konstanty K entalpie ΔH a parametru n z těchto experimentálních dat, je náročnější matematický optimalizační proces, který zavádí vypočtené hodnoty (dq/d(c X ) cel) vyp mezíme-li se pouze komplexační reakce (1), které probíhají v poměru M:L = 1:1 (tj. n = 1), lze dq = fvyp ( Xr, K, ΔH, n 1 d( c ) = ) (7) X cel vyp explicitně vyjádřit následujícím postupem. Probíhá-li reakce M+ X (8) je uvolněné (či spotřebované) teplo dq úměrné látkovému množství vzniklého komplexu dn a příslušné reakční entalpii ΔH podle vztahu dq= dn Δ H (9) Změnu látkového množství komplexu lze vyjádřit pomocí změny koncentrace v objemu V, tj. dq= dc V Δ H (1) Podělením rovnice změnou koncentrace d(c X ) cel dostaneme

5 dq dc d( c ) = d( c ) X cel vyp X cel V Δ H (11) Derivaci (dc / d(c X ) cel ) získáme ze vztahu pro rovnovážnou konstantu reakce (8) c K = (1) c c M X kde c X, c M a c jsou (neznámé) rovnovážné koncentrace příslušných látek. Pozn.: Takto uvedená rovnovážná konstanta bude mít rozměr (koncentrace) 1, což není z termodynamického hlediska správně. Rovnovážná konstanta je ve skutečnosti bezrozměrná veličina a správný zápis rovnice (1) by měl být c K = cst c c M X kde c st je standardní koncentrace 1 mol/dm 3. Vzhledem k tomu, že ve většině publikací se rovnovážné konstanty uvádí dle vztahu (1), bude v následujícím textu také používán tento klamný zápis a z něho vyplývající rozměr rovnovážné konstanty. Pomocí koncentrací c X, c M a c je možno vyjádřit celkové koncentrace (v měřicí cele) ( c ) = c + c (13) X cel X c ( c ) = c + c = + c (14) M cel M KcX Z rovnice (13) vyjádříme rovnovážnou koncentraci c X a dosadíme ji pravé strany rovnice (14), čímž získáme kvadratickou rovnici pro koncentraci c. c + c [ ( c ) ( c ) 1/ K] + ( c ) ( c ) = (15) M cel X cel M cel X cel Reálný kořen této rovnice udává vztah kde c b b 4c = (16) b= [ ( c ) ( c ) 1/ K], c= ( c ) ( c ) (17) M cel X cel M cel X cel Derivaci (dc / d(c X ) cel ) potřebnou ve vztahu (11), získáme derivací rovnice (16) podle (c X ) cel dc 1 1 (1 + r)/+ Xr / = + (18) d( c X) cel X X (1 r) + (1 + r) kde r 1 r r ( c ) = X cel, Xr K( cm) = cel ( cm) (19) cel Dosazením výsledného vztahu (18) do funkční závislosti (11) získáme konečný vztah dq 1 1 (1 + r)/ + Xr / V H d( cx) = + cel Δ vyp Xr Xr(1 r) + (1 + r) který v sobě zahrnuje K a ΔH optimalizací. () jakožto parametry. Tyto veličiny se vyhodnotí vhodnou

6 Pro účely této práce použijeme cílovou funkci ve formě součtu čtverců odchylek N dq dq F = i= 1 d( cx) cel d( c vyp X) cel exp (1) kde N je celkový počet titračních přídavků (počet experimentálních bodů). Tuto funkci budeme minimalizovat pomocí nástroje Řešitel programu MS Excel. 4. Zadání úlohy Pro stanovení rovnovážné konstanty komplexace a komplexačního tepla 18-crown-6-etheru s KCl byl připraven roztok crown etheru (M) o koncentraci 9 mmol/dm 3 a roztok chloridu draselného (X) o koncentraci 1 mmol/dm 3. Roztok M byl nadávkován do měřicí cely kalorimetru o objemu 1,45 cm 3. Roztokem X byl naplněn injektor kalorimetru. Byl sestavena sekvence titračních přídavků roztoku X do cely. bjemy jednotlivých přídavků jsou uvedeny v tabulce 1. Proběhlo kalorimetrické měření celé sekvence při 5 C, jehož výstupem byla závislost tepelného toku mezi měřicí a referenční celou na čase (viz obr. 3). Software kalorimetru zintegroval jednotlivé píky signálu a vypočetl příslušná tepla dq (viz tabulka 1). Tabulka 1. Základní experimentální data Č. přídavku V tit dq Č. přídavku V tit dq μl mj μl mj - - pokračování Z uvedených údajů 1. vyhodnoťte Wisemanovu isotermu. vypočtěte rovnovážnou konstantu K a reakční teplo ΔH za předpokladu, že reakce probíhá se stechiometrií 1:1. 3. určete standardní reakční Gibbsovu energii ΔG a entropii ΔS příslušné reakce.

7 5. Návod řešení úlohy 1. Vyhodnocení experimentu provádějte pomocí programu MS Excel. Při programování vzorců dbejte na správný převod jednotek. 3. Vytvořte tabulku se vstupními experimentálními daty, do které vyplňte údaje z tabulky 1 4. Do buněk nad vytvořenou tabulku uložte výchozí koncentraci roztoku M v cele (c M ) cel, koncentraci roztoku ligandu v titrátoru (c X ) tit, objem měřicí cely V a teplotu experimentu T. 5. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet d(c X ) cel, který bude vypočítávat o kolik se po každém přídavku změnila celková koncentrace ligandu X v cele. 6. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet (c X ) cel, který bude v každém bodě vypočítávat celkovou koncentraci ligandu v cele. 7. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet X r = (c X ) cel /(c M ) cel. 8. Do tabulky naprogramujte vzorec pro výpočet (dq/d(c X ) cel ) exp, což reprezentuje teplo dq normalizované změnou celkové koncentrace ligandu v cele. 9. Vytvořte graf Wisemanovu isotermu, neboli závislost (dq/d(c X ) cel ) exp na X r. 1. Do dvou buněk zadejte 1. aproximace (tj. odhad) hodnot K a ΔH. Hodnotu K volte v jednotkách tisíců (dm 3 /mol) a hodnotu ΔH volte v záporných desítkách tisíc (J/mol). 11. Do další buňky či sloupce tabulky vypočtěte pomocnou veličinu r (viz rovnice 19). 1. Do tabulky naprogramujte vztah pro (dq/d(c X ) cel) vyp (viz rovnice ). Vypočtené hodnoty přidejte do již vytvořeného grafu s Wisemanovou isotermou. Pokud jsou výpočty v pořádku, neměla by nově přidaná (vypočtená) křivka být příliš vzdálená od křivky experimentální. Pokud tomu tak není, překontrolujte výpočty - zejména převody jednotek. 13. Pokuste se 1. aproximaci hodnot K a ΔH zkusmo pozměnit tak, aby se vypočtená křivka přiblížila křivce experimentální. 14. Do dalšího sloupce tabulky přidejte kvadráty odchylek hodnot (dq/d(c X ) cel ) vyp a (dq/d(c X ) cel ) exp a do buňky sečtěte hodnoty celého sloupce. Tato buňka reprezentuje objektivní funkci F (viz rovnice 1). 15. Spusťte nástroj Řešitel. Nastavujte buňku s F na minimální hodnotu. Jako měněné buňky zadejte buňky s aproximací K a ΔH. Pokud optimalizace proběhne v pořádku, měli byste v grafu zaznamenat, že experimentální i vypočtená křivka je téměř shodná. Pokud tomu tak je, hodnoty buněk s K a ΔH lze považovat za výsledek. 16. Nakonec z výsledných hodnot K a ΔH vypočtěte hodnoty ΔG a ΔS (viz vztah 3 a 4). 6. Literatura [1] Wiseman T, Williston S., Brandts J.F., Lin L.-N., Rapid Measurement of Binding Constants and Heats of Binding Usány a New Titration Calorimeter, Analytical Biochemistry 179, 1989, Příloha Vyhodnocení úlohy PDF dokument určený pro asistenty (vyžaduje heslo). Práce vznikla za podpory grantu FRVŠ č. 8/7.