DEGRADACE VĚTVENÝCH POLYESTERŮ VE VODNÉM PROSTŘEDÍ S RŮZNOU IONTOVOU SILOU

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie DEGRADACE VĚTVENÝCH POLYESTERŮ VE VODNÉM PROSTŘEDÍ S RŮZNOU IONTOVOU SILOU Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Hradec Králové, 2016 Anna Mecnerová

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Hradec Králové, 2016 Anna Mecnerová

3 Chtěla bych tímto poděkovat svému školiteli Doc. RNDr. Milanovi Dittrichovi, CSc. za pomoc, ochotu a vstřícný přístup při experimentálním měření v laboratoři a za rady, které mi poskytoval v průběhu vypracovávání diplomové práce.

4 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie Kandidát: Školitel: Název diplomové práce: Anna Mecnerová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Degradace větvených polyesterů ve vodném prostředí s různou iontovou silou. Diplomová práce je zaměřena na degradaci větvených polyesterů ve vodném prostředí s různou iontovou silou a je rozdělena na teoretickou a experimentální část. V teoretické části je práce zaměřena především na definicí a vlastnosti polymerů, biodegradabilních polymerů, alifatických polyesterů, větvených alifatických polyesterů a jejich využitím v praxi, získaných z bibliografických záznamů na dané téma. V experimentální části zkoumá vliv iontové síly na degradaci větvených polyesterů, konkrétně tří vzorků polyesterů, polymeru T3 větveném na tripentaerythritolu a oligomerů č. 73 a č. 74 větvených na mannitolu. Polymerní matrice o hmotnosti 150mg bobtnaly ve fosfátovém pufru o různé koncentraci a ve vodném prostředí v intervalech 1, 3, 7, 14, 21 dní. Na základě grafů bylo vyhodnoceno, že botnání větvených polymerů je ve vodném prostředí nižší, než v prostředí s obsahem iontů.

5 ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Technology Candidate: Supervisor: Title of diploma thesis: Anna Mecnerová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Biodegradation of branched polyesthers in the aquous medium with various ionic force The thesis is focused on the degradation of branched polyesters in an aqueous medium with different ionic strength and is divided into theoretical and experimental part. The theoretical part deals mainly with the definition and properties of polymers, biodegradable polymers, aliphatic polyesters, branched aliphatic polyesters and their use in practice, derived from bibliographic records on the subject. In the experimental section examines the effect of ionic strength on the degradation of branched polyesters, namely three samples polymers T3 (branched on tripentaerythritol), and No. 73 and No. 74 branched on mannitol. Polymer matrix weighing 150mg swollen in phosphate buffer at various concentrations and in an aqueous medium at intervals of 1, 3, 7, 14, 21 days. Subsequently evaluated two basic parameters and swelling and erosion. Based on the graphs were evaluated branched polymers that swell in aqueous medium is lower than in an environment containing ions.

6 Seznam zkratek Teoretická část IUPAC- Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii, International Union of Pure and Applied Chemistry PS- polystyren PE- polyethylen PA- polyamid PDO- polydioxanon PLA- polylaktid PGA- polyglykolid PLGA- poly(laktid-glykolid) PCL- polykaprolakton RAP- rozvětvené alifatické polyestery Tm- teplota tání Tg- teplota skelného přechodu Tc- teplota krystalizace PE- pentaerythritol DPE- dipentaerythritol RAP-PLA- rozvětvené alifatické polyestery-polylaktid

7 Praktická část ml- hmotnost prázdné lahvičky (g) m0- původní hmotnost tělíska (g) mlb- hmotnost lahvičky s nabobtnaným tělískem (g) mb- hmotnost nabobtnaného tělíska (g) mls- hmotnost lahvičky s vysušeným tělískem (g) ms- hmotnost vysušeného tělíska (g) B- stupeň botnání (%) E- stupeň eroze (%)

8 OBSAH I. Teoretická část 1 1. Polymery Klasifikace polymerů Základní dělení Klasifikace podle původu Klasifikace podle struktury 2 2. Základní pojmy Biomateriál Biokompatibilita Biodegradace 4 3. Biodegradabilní polymery Biodegradabilní přírodní a syntetické polymery 5 4. Využití biodegradabilních polymerů ve zdravotnictví Vstřebatelné šicí materiály Podpůrné konstrukce pro tkáňové inženýrství Krycí materiály Implantáty Podávání léčiv Nosiče léčiv 9 5. Alifatické polyestery Kyselina polyglykolová (PGA) Kyselina polymléčná Polykaprolakton (PCL) Polydioxanon (PDO) Poly(laktid-ko-glykolid) (PLGA) 13

9 6. Rozvětvené alifatické polyestery Syntéza rozvětvených alifatických polyesterů Rozvětvené alifatické polyestery PLA Aplikace rozvětveného alifatického polyesteru PLA 16 II. Experimentální část Zadání práce Postup přípravy Příprava polymerních tělísek Příprava pufru Stanovení stupně botnání a stupně eroze Použité chemikálie Použité přístroje Vzorce pro výpočet Výsledky tabulky a grafy Diskuze K řešenému problému Ke stupni botnání a eroze oligomeru kyseliny mléčné, glykolové a mannitolu ( č.73 ) Ke stupni botnání a eroze nízkomolekulárního oligomeru kyseliny mléčné, glykolové a mannitolu ( č. 74 ) Ke stupni botnání a eroze polymeru kyseliny mléčné, glykolové a tripentaerythritolu K vlivu molekulové hmotnosti polyesterů na stupeň jejich botnání a eroze v médiích s různou koncentrací pufru Závěry Použitá literatura 66

10 Úvod Biodegradabilní polymery jsou dominantní skupinou polymerů a to zejména z důvodu jejich rozmanitých vlastností. Vzhledem k jejich všestrannému použití dochází v posledních letech ke zvýšenému zájmu o biodegradabilní polymery a to zejména v oblastech zdravotnictví a farmacie. V oblasti farmacie se biodegradabilní polymery využívají jako léková forma typu implantátů. Implantáty se podávají parenterální formou a slouží k cílenému transportu léčivých látek přímo na místo působení či do systémového krevního oběhu. Použitím zmíněných implantátů se dosáhne přesného dávkování léčiva za sníženého výskytu nežádoucích účinků a zároveň dochází k nižší spotřebě léčiva. Prvními implantáty schválenými k praktickému použití byly přípravky obsahující estrogen, určené ke zvýšení reprodukce skotu. Tyto implantáty byly vyrobeny jednoduchým slisováním účinné látky do pelet. Teprve v průběhu dalších let vznikaly implantáty obsahující řadu pomocných látek tvořících nosič léčiva, čímž se vyvíjely systémy umožňující modifikované uvolňování. Mezi tyto pomocné látky tvořící nosič léčiva patří již zmiňované biodegradabilní polymery ve formě matric. V humánní klinické praxi se implantáty uvolňující léčivo uplatňují v širším měřítku teprve posledních pár desetiletí. Mezi výhody těchto implantátů řadíme vyloučení negativního působení na gastrointestinální trakt, léčivo se dostává přímo na místa působení, kam je podání léčiva obtížné např. mozek, kosti, oči. Mezi další výhody těchto systémů patří zvýšení compliance pacienta, neboť uvolňování léčivé látky probíhá kontinuálně a pacient nemusí přemýšlet nad tím, zda léčivý přípravek užil či ne. Toto je výhodné především u pacientů trpících psychickými onemocněními. Implantáty mají ale i své nevýhody. Patří mezi ně riziko vyvolání zánětlivé reakce v místě zavedení implantátu, vyvolání imunitní reakce, kdy organismus reaguje na implantát jako na cizorodé těleso. Další nevýhodou je vysoká cena těchto systémů. Biodegradabilní polymery jsou výhodné především v tom, že se rozkládají na látky tělu vlastní a jsou přirozeně vyloučeny z těla. Nemají toxický účinek na organismus, a proto nemusí být invazivním způsobem odstraněny z organismu, na rozdíl od polymerů, které nejsou biodegradabilní.

11 I. Teoretická část 1. Polymery Definice polymeru podle dokumentu Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii (IUPAC) zní: polymer je látka sestávající z molekul charakterizovaných mnohonásobným opakováním jednoho nebo více druhů atomů nebo skupin atomů, navzájem spojených v tak velkém počtu, že existuje řada vlastností, které se znatelně nezmění přidáním nebo odstraněním jedné nebo několika konstitučních jednotek. (1) 1.1 Klasifikace polymerů Polymery obsahují ve své struktuře převážně atomy dusíku, uhlíku, vodíku, kyslíku, chlóru a dalších prvků. Díky tomu mají polymery širokou škálu vlastností a lze je uplatnit v různých oblastech. Polymery lze rozdělit podle základních faktorů. (2) Základní dělení Elastomery jsou vysoce elastické polymery, které lze malou silou deformovat bez poškození. Vzniklá deformace je převážně vratná. Do této skupiny lze zařadit kaučuky, ze kterých se vyrábí pryž. Termoplasty jsou polymery, které lze opakovaně ohřevem převést do stavu taveniny nebo viskózního toku a po ochlazení dochází k opětovnému ztuhnutí. Reaktoplasty mají prostorově zesíťovanou strukturu a molekuly jsou spojeny kovalentními vazbami v důsledku zpracování chemickou reakcí, působením tepla, použitím síťovacích činidel nebo zářením. Tento proces se označuje jako vytvrzování. Ve vytvrzeném stavu je reaktoplast netavitelný a nerozpustný. (3) 1

12 1.1.2 Podle původu Přírodní Polymery, které produkují biochemickými reakcemi mikroorganismy, rostliny a zvířata. Jsou biodegradabilní a na rozdíl od syntetických polymerů se liší chemickou strukturou základního polymerního řetězce, ve kterém je vždy přítomný kyslík a často i dusík. Příkladem přírodních polymerů je přírodní kolagen a celulóza. (3) Syntetické Syntetické polymery jsou připravovány uměle. Získávají se převážně z látek, které vznikají při zpracování ropy a ropných produktů. Můžeme je rozdělit na biologicky rozložitelné a nerozložitelné. Příkladem syntetických polymerů je polystyren (PS), polyethylen (PE) a polyamidy (PA). (4) Viz níže v kapitole Podle struktury Lineární polymery lineární struktury jsou nejjednodušším typem makromolekul. Vznikají polymerací za spojení dvojfunkčních monomerů. Větvené polymery větvené struktury vznikají polyreakcí trojfunkčních nebo vícefunkčních monomerních jednotek, tato struktura polymerů je charakterizována délkou a počtem postranních řetězců a polymerizačním stupněm. Síťované makromolekuly této struktury jsou propojeny kovalentními vazbami a vytváří síť. Výsledný polymer je netavitelný a nerozpustný. (5) 2

13 Obr. 1 struktury polymerů 2. Základní pojmy 2.1 Biomateriál Materiál, který je určen k interakci s biologickým prostředím. Slouží k léčbě a náhradám tkání a orgánů. Nejčastějším typem biomateriálu jsou polymery. Polymerní biomateriály můžeme rozdělit na biologicky nerozložitelné a biologicky rozložitelné. Všechny typy biomateriálů musí být biokompatibilní. (6) 2.2 Biokompatibilita Je snášenlivost látek v biologickém systému. Biologický materiál nesmí ovlivňovat koagulaci, uvolňovat toxické látky a vyvolávat zánětlivou reakci. Biokompatibilní materiál se hodnotí na základě rozsahu a kvality biodegradace, podle interakce s prostředím, alergických a toxikologických reakcí, cytotoxického působení, karcinogenity apod. (7) 3

14 2.3 Biodegradace Biodegradace probíhá působením enzymů a / nebo chemickým rozkladem spojeným s působením živých organismů. Tento děj nastává ve dvou fázích. V první fázi dochází k rozpadu molekul do nižších molekulových hmotností pomocí abiotických reakcí (oxidací, fotodegradací, hydrolýzou) nebo pomocí biotických reakcí, tedy degradací za působení mikroorganismů. Poté následuje bioasimilace polymerních fragmentů mikroorganismy a jejich mineralizace. Biologická odbouratelnost je závislá na původu polymeru, chemické struktuře a na podmínkách degradace. (8) 3. Biodegradabilní polymery Biologicky odbouratelné polymerní materiály představují dominantní skupinu polymerů. Biodegradabilní polymery jsou biologicky rozložitelné látky, které se používají v různých odvětvích např. při výrobě obalových materiálů, v zemědělství, v medicíně, ve farmacii a v dalších oblastech. V posledních letech dochází k nárůstu zájmu o biologicky rozložitelné polymery. K dispozici jsou polymery vyrobené ze surovin pocházejících buď z ropných zdrojů (neobnovitelných zdrojů), nebo z biologických zdrojů (obnovitelných zdrojů). (8) V zásadě je můžeme rozdělit podle stejných hledisek uvedených v kapitole 1.1.1, ale níže si navíc uvedeme výhody a nevýhody biodegradabilních přírodních a syntetických polymerů a jejich základních zástupců. 4

15 3.1 Biodegradabilní přírodní a syntetické polymery Přírodní Pro aplikaci ve zdravotnictví se používají méně než ty syntetické. Zpravidla v důsledku jejich složitější struktury oproti syntetickým polymerům je jejich manipulace a zpracování komplikovanější. Jejich hlavní nevýhodou je, že mají tendenci rychle se měnit v těle. Příkladem přírodních biodegradovatelných polymerů používaných ve zdravotnictví jsou: (9) Kolagen Celulóza Škrob Chitin Alginát Kyselina hyaluronová Želatina Chitosan Syntetické Mají širší uplatnění oproti přírodním polymerům. Jsou přizpůsobivé a lze jejich vlastnosti upravit tak, aby vyhovovaly požadavkům dané aplikace. Dají se vyrobit různými technologiemi s požadovanou molekulovou hmotností, velikostí, tvarem a polaritou. Jejich degradace může probíhat kontrolovanou rychlostí, což je výhodnější než proměnlivá rychlost enzymatické degradace přírodních polymerů. Podle chemické struktury můžeme syntetické biodegradovatelné polymery rozdělit na: (9) Polyestery Poly (ortho-estery) Polyanhydridy Polyfosfazeny Poly (ester-amidy) Poly (alkylkyanoakryláty) Polyuretany Poly (ester-uretany) 5

16 4. Využití biodegradabilních polymerů ve zdravotnictví Biodegradabilní polymery mají široké uplatnění v oblasti zdravotnictví. Používají se jako vstřebatelné šicí materiály neboli chirurgické nitě, podpůrné konstrukce pro tkáňové inženýrství, krycí materiály a implantáty. V oblasti farmacie se využívají pro podávání léčiv tzv. enkapsulaci a dále nacházejí uplatnění jako nosiče léčiv. 4.1 Vstřebatelné šicí materiály (chirurgické nitě) Vstřebatelné šicí materiály slouží k uzavírání ran. Jsou vyráběny jak z přírodních tak i syntetických biomateriálů. Pokud jsou vyrobeny z přírodních polymerů, podléhají enzymatické degradaci, zatímco chirurgické nitě vyrobené ze syntetických polymerů podléhají zpravidla hydrolytické degradaci. Některé z těchto materiálů jsou určeny k rychlejší absorpci, zatímco jiné jsou chemicky ošetřeny tak, aby se prodloužil čas jejich absorpce. (3) Vstřebatelné šicí materiály mají vlákna buď polyfilní (jsou tvořeny z více vláken) nebo monofilní (tvořeny jedním vláknem). Materiálem pro polyfilní vlákna je např. polyglykolová kyselina a polyglactin 910. Vyznačují se svou pevností, ale jsou nevhodná do míst, kde se vyskytuje zánětlivá reakce, protože postupnou degradací vlákna, dochází ke zpomalenému hojení zánětlivého místa. Monofilní vlákna se vyrábějí např. z polydioxanonu (PDO), e- kaprolaktonu, polyglykonátu, polyglekapronu 25 nebo kopolymeru glykolidu. Jejich nevýhodou je jejich tuhost, která má za následek vyvolání obtíží při uzlení. Ideální šicí materiál by měl být zcela biologicky inertní, snadno manipulovatelný a lehce vytvářet uzel, neměl by způsobit tkáňovou reakci. Dále by měl být snadno rozložitelný, sterilizovatelný, neměl by vyvolávat žádné alergické a mutagenní reakce a nesmí podporovat růst buněk. (10) 6

17 Obr.2 monofilní vlákno a polyfilní vlákno 4.2 Podpůrné konstrukce pro tkáňové inženýrství Cílem tkáňového inženýrství je nahradit nebo obnovit poškozené tkáně nebo orgány. Jedná se o kombinaci živých buněk a podpůrného materiálu. Podpůrný materiál je většinou ve formě trojrozměrné matrice (scaffold). Ta osídlujícím buňkám zajišťuje dočasnou či trvalou podporu pro migraci a růst buněk v tkáni. Výhodným polymerem je PLA, jehož degradačním produktem je kyselina mléčná, která je přirozeným metabolitem pro lidské tělo. (11) Nevýhodou PLA, PGA a PGLA je pokles ph v místech degradace a to může přispívat ke zvýšení kyselosti a podporovat zánětlivou reakci. Proto je důležitá postupná biodegradace, aby tělo mělo dostatečný čas zbavit se odpadních produktů. Existují různé typy lešení např. porézní, mikrosférické, hydrogelové, vláknité nebo polymer-biokeramické kompozitní. (12) 7

18 4.3 Krycí materiály Krycí materiály slouží k ochraně tkáně pro její regeneraci. Bioaktivní materiály, které se využívají pro krycí materiály, jsou např. hydrokoloidy, kolageny, algináty a chitosany. 4.4 Implantáty Vstřebatelné implantáty pro opravu zlomenin kostí zejména v oblasti nosu, čelisti a očního důlku ve formě čepů a tyčí se začaly používat v roce Většina vstřebatelných implantátů je složena z PGA, PLA a polyparadioxanů, z důvodů jejich biodegradability, fyzikálních a chemických vlastností. Čepy a šrouby se vyrábějí z PGA, ostatní implantáty jako jsou kolíky, tyče, cvočky a desky jsou tvořeny z PLA. Nevýhodou vstřebatelných implantátů je nižší pevnost, vyšší cena a v některých případech i nežádoucí biologická reakce. (13) 4.5 Podávání léčiv (enkapsulace) Enkapsulace je proces inkorporace léčivých látek do vhodného nosiče. Systém slouží k dodávání léčivých látek na požadované místo v těle a poskytuje včasné uvolňování léčivých látek. Řízené uvolňovací systémy jsou navrženy k tomu, aby řídily působení léčiva v průběhu času, napomáhaly lékům k přechodu přes fyziologickou membránu a chránily lék před předčasným uvolněním. Mechanismus podávání léčiv lze rozdělit na tři mechanismy. V prvním typu mechanismu je léčivá látka připojena na polymerní řetězce, které mají vazby vysoce náchylné k hydrolýze. Postupnou hydrolýzou dochází k uvolňování částí řetězců a tak i samotné učinné látky. Ve druhém typu mechanisnu je léčivá látka obklopena biodegradovatelným polymerem, který slouží jako rezervoár. Po určité době se lék z rezervoáru uvolní. Ve třetím mechanismu je léčivá látka homogenně rozptýlena v biologicky rozložitelném polymeru. Léčivá látka je poté uvolněna erozí polymeru, difúzí nebo kombinací. (14) 8

19 4.6 Nosiče léčiv Další důležité uplatnění těchto polymerů je v oblasti transportu léčiv k místu jejich působení jako tzv. transportní nosiče léčiv. Tímto způsobem dochází k aplikaci cytostatik, antibiotik, hormonů a růstových faktorů. Obvykle jsou užívány ve formě náplastí, mikročástic či filmů. Často jsou pro transport léčiv užívány laktido-glykolidové kopolymery a polyanhydridy. (3) 5. Alifatické polyestery Alifatické polyestery patří mezi nejpoužívanější syntetické biodegradabilní polymery v oblasti zdravotnictví. Zejména pak polylaktid (PLA), polyglykolová kyselina (PGA) a poly (ε-kaprolakton) (PCL). Alifatické polyestery jsou nejvíce studovanou třídou biologicky odbouratelných polymerů, z důvodu jejich rozmanitosti a jejich syntetické univerzálnosti. (15) Existují různé způsoby vedoucí ke vzniku syntetických polyesterů. Vznikají buď polykondenzací, které přednostně podléhají nízkomolekulární polymery nebo tzv. ring openning polymerization (polymerace za otevření kruhu), která je preferována, když jsou žádoucí vysokomolekulární polymery. Většina biodegradabilních polyesterů je připravována prostřednictvím polymerace za otevření kruhu z šesti- nebo sedmičlenných laktonů. (16) Jejich hydrolyzovatelné esterové vazby způsobují jejich biodegradabilitu. Alifatické polyestery je možné rozdělit do dvou skupin podle vazby základních monomerů. První skupina se skládá z polyhydroxyalkanoátů. Jedná se o polymery syntetizované z hydroxykyselin HO-R-COOH. Příkladem jsou poly(glykolová kyselina) nebo poly(mléčná kyselina). Druhou třídu představují poly(alken dikarboxyláty). Ty se připravují polykondenzací diolů a dikarboxylových kyselin. Příkladem jsou poly (butylen-sukcinát) a poly (ethylen-sukcinát). (17) 5.1 Kyselina polyglykolová (PGA): PGA je nejjednodušší lineární alifatický polyester. Jejím monomerem je kyselina glykolová, která se průmyslově vyrábí reakci kyseliny chloroctové a hydroxidu sodného. PGA lze připravit kruhem otevírající polymerací cyklických laktonů, dimeru kyseliny glykolové tzv. glykolidu. PGA je tvrdý, vysoce krystalický polymer s podílem krystalinity 45-55%, a proto není rozpustný ve většině organických rozpouštědel. Má vysokou teplotu tání ( C) a teplotu skelného přechodu C. Materiály vyrobené z PGA ztrácí polovinu své pevnosti za 2 týdny a 9

20 za 4 týdny ztrácí zcela svou pevnost. Do organismu se plně vstřebá během 4-6 měsíců. PGA je biokompatibilní a degraduje hydrolyticky na výchozí produkt kyselinu glykolovou. PGA má vynikající mechanické vlastnosti, přesto jeho biomedicínská aplikace je omezena jeho nízkou rozpustností a vysokou rychlostí jeho degradace, z něhož vznikají kyselé produkty. V důsledku toho byly připraveny kopolymery glykolidu s kaprolaktonem, laktidem nebo trimethylen karbonátem zdravotnické prostředky. Díky své biologické rozložitelnosti a schopnosti tvořit vlákna, je PGA vhodným materiálem pro výrobu chirurgických nití. (17) Obr.3 kyselina glykolová Obr.4 PGA 5.2 Polylaktid (PLA): PLA neboli kyselina polymléčná patří do stejné skupiny jako PGA. Je obvykle získána polykondenzací D nebo L-mléčné kyseliny nebo kruhem otevírající polymerací laktidu (cyklický dimer kyseliny mléčné). Výhoda techniky otevírání laktidového kruhu je v tom, že vzniká polymer s vyšší molekulovou hmotností, než při technice polykondenzace. Existují dvě optické formy: D-laktid a L-laktid. Přírodní isomer je L-laktid, a syntetická směs je DL-laktid. PLA je hydrofobní polymer, vzhledem k přítomnosti CH3 bočních skupin, je více odolný proti hydrolýze než PGA z důvodu stérického stínění methylových bočních skupin. Monomerem pro výrobu PLA je kyselina mléčná, vyskytující se v přírodě. Dále se vyrábí chemickou syntézou 10

21 nebo fermentačním procesem z bramborového škrobu, melasy nebo dextrozy z kukuřice. Typická teplota skelného přechodu PLA je C, teplota tání je C a pevnost v tahu je 32,22 MPa. Regulace fyzikálních vlastností a biologické rozložitelnosti PLA může být dosaženo použitím komonomerní složky nebo racemizací D- a L-izomerů. Degradace PLA probíhá ve dvou krocích. V prvním dochází k hydrolýze esterových vazeb za vzniku výchozího produktu kyseliny mléčné, která je součástí fyziologických procesů na buněčné úrovni. Kyselina mléčná dále degraduje na vodu a oxid uhličitý a tyto vedlejší produkty jsou následně odstraněny pomocí Krebsova cyklu. DL-PLA amorfní polymer nachází své využití v oblasti řízeného uvolňování léčiv a enkapsulacích obecně, díky své nízké pevnosti a vyšší rychlosti rozkladu. PLA díky svým vynikajícím mechanickým vlastnostem a dobrou zpracovatelností nachází využití pro konstrukci různých fixačních implantátů. (18) Obr.5 PLA Obr.6 kyselina mléčná 5.3 Polykaprolakton (PCL): je lineární, hydrofobní, měkký, semikrystalický polymer. Získává se otevřením kruhu cyklického monomeru ε -kaprolaktonu. PCL je rozpustný v široké škále rozpouštědel. Jeho teplota skelného přechodu je nízká, asi -60 C, a teplota tání je C. PCL je při pokojové teplotě polotuhý materiál, má nízkou pevnost v tahu 23 MPa, ale velmi vysoké prodloužení při přetržení (4700%). Kvůli jeho nízké teplotě tání, nižší hydrofilitě a pomalé rychlosti degradace je jeho použití výrazně omezeno. Tyto nevýhodné vlastnosti lze zlepšit kopolymerací ε -kaprolaktonu s jinými estery jako je glykolid nebo laktid, či methakrylát. Je více hydrofobní než PLA nebo PGA, díky tomu je doba jeho rozkladu delší, je v rozmezí 2-3 let. PCL se používá pro 11

22 dlouhodobé uvolňování léčiv (enkapsulaci), jako lešení pro podporu růstu fibroblastů a osteoblastů, nanokompozity pro regeneraci kostí a v oblasti tkáňového inženýrství pro regeneraci pokožky. Obr.7 ε kaprolakton Obr.8 PCL 5.4 Polydioxanon (PDO) - je polymer, v jehož struktuře se střídá polyester-etherová skupina. PDO je vysoce krystalický, bezbarvý, měkký polymer s nízkou teplotou skelného přechodu -10 C. Monomerem pro PDO je 2-dioxanon. PDO je dobrý biokompatibilní materiál, který po 3 týdnech ztrácí 50% své pevnosti a po 6 měsících je plně absorbován. PDO nachází typické využití jako materiál pro chirurgické nitě a to především z důvodu nižší zánětlivé reakce ve srovnání s PLA a PGA. (18) Obr.9 2-dioxanon Obr.10 PDO 12

23 5.4 Poly(laktid-glykolid) (PLGA) je nejvíce využívaný biodegradabilní kopolymer. Jeho degradací vznikají jednoduché metabolity kyseliny glykolové a kyseliny mléčné, které jsou v těle metabolizovány pomocí Krebsova cyklu. Fyzikální vlastnosti PLGA jsou závislé na mnoha faktorech a to na: Teplotě skladování Molekulové hmotnosti Poměru výchozích monomerů PLA/PGA Parametrech povrchu PLGA je rozpustný v běžných rozpouštědlech a může být zpracován do různých tvarů a velikostí. Vzhledem ke své minimální systémové toxicitě se PLGA využívá jako biomateriál a je vhodný pro enkapsulaci léčiv. (18) Obr.11 PGLA 6. Rozvětvené alifatické polyestery Rozvětvené alifatické polyestery jsou polymerní materiály, které jsou tvořeny lineárními polymerními řetězci připojenými k centrálnímu jádru. Centrální jádro tvoří atom, molekula nebo makromolekula. Rozvětvené alifatické polyestery, ve kterých jsou polymerní řetězce ekvivalentní délky a struktury označujeme za homogenní a pokud jsou polymerní řetězce 13

24 variabilní délky a struktury označujeme je za heterogenní. RAP vykazují užitečné reologické, mechanické a biomedicínské vlastnosti, které jsou u lineárních polymerů nedosažitelné. (19) Mají lepší rozpustnost, nižší viskozitu taveniny, zlepšené fyzikální zpracování. (20) RAP byly poprvé vyvinuty v roce 1948 Schaefgenem a Florym, kteří syntetizovali čtyř a osmi-ramenné RAP ε - kaprolaktamu. (21) 6.1 Syntéza rozvětvených alifatických polyesterů Mohou být použity tři metody pro syntézu RAP, jak je znázorněno na Obr. 4 První metoda zahrnuje živou polymeraci reaktivního monomeru v přítomnosti multifunkčního iniciátoru. V tomto případě se polymerní řetězce vytvářejí přímo na jádře. Druhá metoda spojuje lineární polymerní řetězce s reaktivní molekulou jádra. Tato metoda může fungovat za použití multifunkčního činidla pro ukončení lineárních živých polymerů nebo může využívat latentní reaktivitu telechelických lineárních polymerů k připojení polymerních ramen k jádru. Jedna z nejdůležitějších tříd rozvětvených polymerů je vyrobena z alifatických polyesterů. Jejich výhoda spočívá především v jejich relativně snadné syntéze. S multifunkčními alkoholy poskytují snadno dostupná činidla k zahájení polymerace za otevření kruhu (ROP) cyklických esterů. RAP byly připraveny z monomerů laktidu, kaprolaktonu, glykolidu, P-butyrolaktonu a trimethylen karbonátu. ROP těchto monomerů je zahájena pomocí alkoholu a katalyzována kovovým komplexem za vzniku aktivního alkoxidu kovu, který následuje po koordinaci. (22) Zájem o odpovídající lineární polymery je odvozen primárně od jejich obnovitelnosti, biologické rozložitelnosti a biokompatibility. Tyto polymery snadno hydrolyzují za vzniku odpovídajících hydroxykyselin, z nichž jsou mnohé metabolizovány prostřednictvím cyklu kyseliny citrónové. Alifatické biologicky odbouratelné RAP nacházejí konkrétní využití pro kontrolované uvolňování léčiv a v nanotechnologických aplikacích. (19) 14

25 Obr.12 syntéza RAP 6.2 Rozvětvené alifatické polyestery PLA PLA je biologicky odbouratelný polymer, syntetizovaný polymerací za otevření kruhu monomerů laktidu. I když tento polymer může být vyroben prostřednictvím kondenzační polymerace kyseliny mléčné, je to neřízený proces, který vyžaduje vysoké energetické vstupy. (22) Ačkoli RAP byly poprvé zaznamenány v roce 1948, první rozvětvená PLA makromolekula byla připravena v roce 1989 a k intenzivnímu výzkumu v této oblasti došlo v posledních deseti letech. (23) V porovnání s lineární PLA vykazuje nižší teploty tání (Tm), teploty skelného přechodu (Tg) a teploty krystalizace (Tc.). (24) Rozvětvené alifatické polyestery-pla se s ohledem na jádro dělí na: Diskrétní Polymerní Miktoarmické Dendritické 15

26 U téměř všech uvedených systémů se v syntéze alifatických polyesterů používá katalyzátor TIN(II) ethylhexanoát neboli Sn(Oct)2-oktanoát cínatý, který produkuje ataktické PLA řetězy. Diskrétní jádra Diskrétní jádra jsou malé molekuly, které obsahují hydroxylové funkce, používané k iniciaci polymerace za otevření kruhu. Tyto iniciátory jsou označovány jako polyoly, pokud pocházejí z cukerných alkoholů. Jednoduché polyoly, jako jsou pentaerythritol (PE) a dipentaerythritol (DPE) se nejčastěji používají pro výrobu čtyř a šesti větvených alifatických polyesterů. Polyoly vhodné pro syntézu PLA: Trimethylolpropan a glycerol pro 3-větvené PLA Erythritol a di(trimethylolpropan)- pro 4-větvené PLA Xylitol- pro 5-větvené PLA Inositol a sorbitol pro 6-větvené PLA Tripentaerythritol pro 8-větvené PLA 6.3 Aplikace rozvětveného alifatického polyesteru-pla Mnoho prací zkoumá potenciální účinnost RAP-PLA pro podávání léčiv jako vektorů a samoorganizujících micel. Barviva, malé molekuly a vzorky léčiv byly úspěšně enkapsulovány s profilem uvolňování vykazujícím méně problémů při dávkování a s nižší iniciační dobou ve srovnání s analogickými lineárními systémy. Další kontrola nad rychlostí degradace je zprostředkována stereoregulární architekturou PLA a nabízí velký potenciál pro další ladění těchto systémů pro řízené uvolňování léčiv. (25) Polyesterové substituované prekurzory norfloxacinu byly připraveny za kovalentního spojení léčiva na rámce PLA a PCL. (26) 16

27 II. Experimentální část 7. Zadání práce Bylo zadáno k řešení téma v návaznosti na dříve dosažené poznatky o interakcích biodegradabilních polyesterů využitelných jako nosiče léčivých látek s vodným médiem v podmínkách in vitro. Úkolem bylo vybrat z polymerů syntetizovaných na katedře farmaceutické technologie FaF UK v Hradci Králové nosiče, které se liší parametry molekulové hmotnosti a stupněm větvení. Tyto nosiče bylo zadáno testovat z hlediska časového průběhu jejich botnání a eroze ve vodných roztocích fosfátcitrátového pufru lišících se jeho koncentrací. 17

28 8. Postup přípravy 8.1 Příprava polymerních tělísek Pro stanovení byla použita tělíska z polymeru o hmotnosti 0,150g ±5%. Polymer byl nejdříve zahřát na olejové lázni a následně pomocí injekční stříkačky natažen do silikonové hadičky. Po ztuhnutí polymeru byla silikonová hadička rozříznuta nožem, a tudíž byl k dispozici polymer ve formě tyček, ze kterých se dále pomocí skalpelu odřezávaly kousky cca 4mm dlouhé. Tyto kousky polymeru byly pak pomocí smirkového papíru upraveny na požadovanou hmotnost. 8.2 Příprava pufru Fosfátový pufr se připraví smísením roztoků hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného. Aby bylo docíleno požadovaného ph 7.0, musí být roztoky smíseny v poměru 40 ml roztoku dihydrogenfosforečnanu sodného a 60 ml roztoku hydrogenfosforečnanu sodného pro přípravu 100 ml pufru. Navážka dihydrogenfosforečnanu pro přípravu jeho roztoku je 10,4 g pro 1000 ml roztoku. Navážka hydrogenfosforečnanu sodného pro přípravu 1000 ml roztoku je 23,9g. Aby byl roztok izotonický, je třeba přidat 0,46g chloridu sodného na 100ml pufru. Takto připravený izotonický fosfátový pufr byl označen za koncentraci c=1. Část tohoto pufru byla naředěna destilovanou vodou v poměru 1:1 a připraven hypotonický pufr, ten byl označen jako koncentrace c=0,5. Dalším ředěním byly připraveny hypotonické pufry s koncentrací c=0,25, c=0,125. Ověření hodnoty ph pufru bylo provedeno pomocí phmetru. Hodnota ph připraveného pufru byla 7, Stanovení stupně botnání a stupně eroze Polymerní tělíska byla zvážena na analytických vahách a umístěna do vytárovaných scintilačních lahviček. Lahvičky byly označeny štítky určující den/ označení paralelního stanovení A nebo B/ koncentrací pufru. Tělíska byla zalita pufrem. Takto připravené vzorky byly umístěny do biologického termostatu, který byl nastaven na teplotu 37 C. Odebírání vzorků probíhalo v intervalu 1, 3, 7, 14 a 21 dní. Při odebírání vzorků, tak aby mohla být zjištěna hmotnost nabobtnaného tělíska, se vylil pufr a tělísko bylo osušeno pomocí vatového smotku a také pomocí vlasového 18

29 vysoušeče, ale pouze tak, aby byla odstraněna kapalina z lahvičky, nikoliv aby došlo k vysušení polymeru. Lahvička s polymerem byla zvážena na analytických vahách. Následně byly lahvičky umístěny do vakuové sušárny, kde se vzorky sušily cca 1 týden. Poté byly lahvičky s vysušeným tělískem zváženy na analytických vahách. Pomocí zjištěných hmotností byly vypočítány stupně botnání a stupně eroze. Současně se stanovením botnání v pufru bylo provedeno stanovení stupně botnání a stupně eroze v čisté vodě. Postup je totožný se stanovením botnání v pufru. Lahvičky byly označeny koncentrací c=0. U polymeru 3T byl postup stanovení totožný, avšak byl navíc použitý pufr o koncentraci c=1 na rozdíl od polymerů 73 a

30 9. Použité chemikálie Polymerní nosiče, FAF UK, Katedra farmaceutické technologie 3T- nosič PLGA (50:50) větvený 3% tripenterythritolu; Mn = 7900; Mw = nosič PLGA (50:50) větvený 2,9 % mannitolu; Mn = 2100; Mw = 4000; 7,5% kyselý katex Dowex MSC nosič PLGA; (50:50); větvený 3,8 % mannitolu; Mn = 1900; Mw = 3400 Čištěná voda, FAF UK, připravená reverzní osmózou Hydrogenfosforečnan sodný, Lachema a.s., Neratovice Dihydrogenfosforečnan sodný, Lach-Ner s.r.o., Neratovice Chlorid sodný, Lach-Ner s.r.o., Neratovice 10. Použité přístroje Analytické digitální váhy Kern ABS, max.220g, d=0,1mg Digitální váhy Kern, max. 8100g, d=0,05g Vakuová sušárna, Binder Horkovzdušná sušárna Memmert Biologický termostat, BT 1200 Laboratorní přístroje Praha ph metr, HI 221 Microprocessor ph Meter Elektromagnetická míchačka Hidolph MR

31 11. Vzorce pro výpočet Stupeň botnání B = ( m b m s m s ) 100 B-stupeň botnání (%) mb-hmotnost nabobtnalého tělíska (g) ms-hmotnost vysušeného tělíska (g) Stupeň eroze E = [1 ( m 0 m s m 0 )] 100 E-stupeň eroze (%) m0-počáteční hmotnost tělíska (g) ms-hmotnost vysušeného tělíska (g) 21

32 12. Výsledky- tabulky a grafy 1) Chování tělísek polymeru 73 o hmotnosti 150 mg ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu dne- tabulky. Tab. 1: Stupeň botnání a eroze polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí vody při 37 C v průběhu dne. (Obr. 1 a 2) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0/1/A 13,4682 0, ,6320 0, ,6207 0,1525 7, ,7100 0/3/A 13,6829 0, ,8528 0, ,8240 0, , ,8600 0/7/A 14,8662 0, ,0274 0, ,9823 0, , ,8800 0/14/A 15,3227 0, ,3973 0, ,3948 0,0721 3, ,5200 0/21/A 13,5283 0, ,5426 0, ,5424 0,0141 1,4181 9,7400 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0/1/B 14,5408 0, ,7070 0, ,6915 0, , ,6900 0/3/B 13,7321 0, ,9176 0, ,8790 0, , ,5300 0/7/B 13,5434 0, ,6841 0, ,6606 0, , ,8200 0/14/B 15,1699 0, ,2456 0, ,2378 0, , ,1600 0/21/B 13,6348 0, ,7520 0, ,7505 0,0157 9, ,

33 Tab. 2: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí vody při 37 C v průběhu dne. (Obr. 1 a 2) dny B-0 E-0 1 8, , , , , , , , , ,2550 Tab. 3: Stupeň botnání a eroze polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,5 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 3 a 4) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/A 13,7233 0, ,8289 0, ,8081 0, , ,1700 0,5/3/A 15,5325 0, ,6990 0, ,6142 0, , ,9600 0,5/7/A 13,8033 0, ,9452 0, ,8502 0, , ,1000 0,5/14/A 14,5454 0, ,8697 0, ,3832 0, , ,3400 0,5/21/A 15,4389 0, ,8422 0, ,4672 0, , ,4400 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/B 13,4951 0, ,6018 0, ,5790 0, , ,7100 0,5/3/B 13,9138 0, ,0795 0, ,9921 0, , ,8300 0,5/7/B 13,5060 0, ,6778 0, ,5523 0, , ,7900 0,5/14/B 13,4958 0, ,7789 0, ,5291 0, , ,5300 0,5/21/B 13,3006 0, ,8952 0, ,3303 0, , ,

34 Tab. 4: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,5 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 3 a 4) dny B-0,5 E-0,5 1 25, , , , , , , , , ,3200 Tab. 5: Stupeň botnání a eroze polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,25 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 5 a 6) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/A 15,0980 0, ,2401 0, ,2159 0, , ,0500 0,25/3/A 14,7268 0, ,9203 0, ,8180 0, , ,4100 0,25/7/A 13,1917 0, ,2866 0, ,2134 0, , ,7200 0,25/14/A 13,3872 0, ,4137 0, ,3893 0, ,0000 1,3000 0,25/21/A 15,4816 0, ,5305 0, ,4872 0, ,2143 3,9700 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/B 13,6434 0, ,7819 0, ,7614 0, , ,9800 0,25/3/B 13,6438 0, ,8070 0, ,7371 0, , ,8400 0,25/7/B 13,5965 0, ,7121 0, ,6372 0, , ,9700 0,25/14/B 13,7372 0, ,7722 0, ,7396 0, ,3333 1,5400 0,25/21/B 15,4987 0, ,5518 0, ,5020 0, ,0909 2,

35 Tab. 6: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,25 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 5 a 6) dny B-0,25 E-0, , , , , , , ,6667 1, ,1526 3,0800 Tab. 7: Stupeň botnání a eroze polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,125 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 7 a 8) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/A 13,6047 0, ,8107 0, ,7540 0, , ,5700 0,125/3/A 13,8200 0, ,0922 0, ,9619 0, , ,6100 0,125/7/A 13,5695 0, ,7220 0, ,6686 0, , ,6800 0,125/14/A 14,4219 0, ,4744 0, ,4676 0, , ,7100 0,125/21/A 15,5134 0, ,5619 0, ,5295 0, , ,6900 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/B 13,5504 0, ,7651 0, ,6573 0, , ,4800 0,125/3/B 13,7157 0, ,5200 0, ,8582 0, , ,4200 0,125/7/B 14,1648 0, ,2934 0, ,2638 0, , ,1300 0,125/14/B 14,8404 0, ,8946 0, ,8902 0,0494 8, ,7300 0,125/21/B 13,7022 0, ,7589 0, ,7159 0, ,8686 9,

36 Tab. 8: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 73 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,125 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 7 a 8) dny B-0,125 E-0, , , , , , , , , , ,1100 2) Chování tělísek polymeru 74 o hmotnosti 150 mg ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu dne- tabulky. Tab. 9: Stupeň botnání a eroze polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí vodném prostředí při 37 C v průběhu dne. (Obr. 11 a 12) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0/1/A 15,0949 0, ,2655 0, ,2463 0, , ,0600 0/3/A 13,7618 0, ,9250 0, ,8901 0, , ,3500 0/7/A 13,7684 0, ,9518 0, ,8731 0, , ,0300 0/14/A 13,8119 0, ,8906 0, ,8724 0, , ,4900 0/21/A 13,3454 0, ,3912 0, ,3666 0, , ,7600 označení vzorků / dny ml mo mlb mb Mls ms B E 0/1/B 15,4300 0, ,5914 0, ,5777 0,1477 9, ,4000 0/3/B 13,9052 0, ,0719 0, ,0402 0, , ,3000 0/7/B 13,6990 0, ,8362 0, ,7986 0, , ,9900 0/14/B 15,5328 0, ,6298 0, ,6003 0, , ,4600 0/21/B 18,8376 0, ,8780 0, ,8643 0, , ,

37 Tab. 10: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí vodném prostředí při 37 C v průběhu dne. (Obr. 11 a 12) dny B-0 E , , , , , , , , , ,8100 Tab. 11: Stupeň botnání a eroze polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,5 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 13 a 14) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/A 12,9421 0, ,0988 0, ,0645 0, , ,6700 0,5/3/A 13,5883 0, ,8172 0, ,6928 0, , ,9700 0,5/7/A 13,2366 0, ,5270 0, ,3165 0, , ,9800 0,5/14/A 12,7556 0, ,9576 0, ,8066 0, , ,5200 0,5/21/A 13,8334 0, ,0168 0, ,8723 0, , ,5500 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/B 14,7960 0, ,9523 0, ,9145 0, , ,8300 0,5/3/B 15,5318 0, ,7670 0, ,6466 0, , ,8400 0,5/7/B 13,3220 0, ,5557 0, ,4016 0, , ,5200 0,5/14/B 15,5041 0, ,6624 0, ,5560 0, , ,4200 0,5/21/B 15,4597 0, ,6596 0, ,5027 0, , ,

38 Tab. 12: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v prostředí fosfátového pufru o koncentraci c=0,5 při 37 C v průběhu dne. (Obr. 13 a 14) dny B-0,5 E-0,5 1 29, , , , , , , , , ,5750 Tab. 13: Stupeň botnání a eroze polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v fosfátového pufru o koncentraci c=0,25 při 37 C v průběhu dne. ( Obr. 15 a 16 ) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/A 13,5482 0, ,7002 0, ,6775 0, , ,7100 0,25/3/A 14,1023 0, ,3074 0, ,2100 0, , ,6600 0,25/7/A 14,4503 0, ,6667 0, ,5031 0, , ,3900 0,25/14/A 13,7223 0, ,7408 0, ,7330 0, ,8972 6,7800 0,25/21/A 15,3465 0, ,3761 0, ,3518 0, ,4906 3,5700 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/B 13,7356 0, ,8766 0, ,8587 0, , ,9300 0,25/3/B 14,8350 0, ,0226 0, ,9417 0, , ,2900 0,25/7/B 15,2674 0, ,4808 0, ,3171 0, , ,7000 0,25/14/B 13,5741 0, ,6005 0, ,5821 0, ,0000 5,1200 0,25/21/B 14,8715 0, ,9172 0, ,8774 0, ,5763 3,

39 Tab. 14: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B v fosfátového pufru o koncentraci c=0,25 při 37 C v průběhu dne. ( Obr. 15 a 16 ) dny B-0,25 E-0, , , , , , , ,4486 5, ,5335 3,6850 Tab. 15: Stupeň botnání a eroze polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,125 při 37 C v průběhu dne.( Obr. 17 a 18 ) označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/A 14,4335 0, ,6240 0, ,5779 0, , ,0700 0,125/3/A 13,2396 0, ,4600 0, ,3694 0, , ,7200 0,125/7/A 13,5636 0, ,7105 0, ,6644 0, , ,2400 0,125/14/A 13,5918 0, ,6610 0, ,6412 0, , ,8900 0,125/21/A 13,8893 0, ,9325 0, ,9117 0, , ,3800 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/B 15,0896 0, ,2897 0, ,2421 0, , ,5200 0,125/3/B 13,2929 0, ,5546 0, ,4308 0, , ,3100 0,125/7/B 13,3179 0, ,5217 0, ,4233 0, , ,5800 0,125/14/B 13,6653 0, ,7298 0, ,7175 0, , ,9600 0,125/21/B 14,7140 0, ,7617 0, ,7363 0, , ,

40 Tab. 16: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků polymeru 74 o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,125 při 37 C v průběhu dne..( Obr. 17 a 18 ) dny B-0,125 E-0, , , , , , , , , , ,8950 3) Chování polymeru 3T tělísek o hmotnosti 150 mg ve vodném prostředí při teplotě 37 C v průběhu dne- tabulky. Tab. 17: Stupeň botnání a eroze 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve vodném prostředí při 37 C v průběhu dne. označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0/1/A 13,6905 0, ,8597 0, ,8466 0,1561 8, ,7100 0/3/A 14,2886 0, ,4736 0, ,4385 0, , ,7300 0/7/A 13,5808 0, ,7901 0, ,7284 0, , ,0600 0/14/A 13,2104 0, ,3829 0, ,3096 0, , ,6500 0/21/A 13,5945 0, ,6699 0, ,6514 0, , ,8300 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0/1/B 14,5151 0, ,6934 0, ,6642 0, , ,7400 0/3/B 13,6875 0, ,8587 0, ,8383 0, , ,0000 0/7/B 14,7253 0, ,9328 0, ,8726 0, , ,0000 0/14/B 13,8352 0, ,0346 0, ,9326 0, , ,1500 0/21/B 13,6242 0, ,7049 0, ,6798 0, , ,

41 Tab. 18: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve vodném prostředí při 37 C v průběhu dne. dny B-0 E , , , , , , , , , ,2000 Tab. 19: Stupeň botnání a eroze 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,25 při 37 C v průběhu dne. označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/A 13,3764 0, ,5644 0, ,5266 0, , ,4000 0,25/3/A 15,4091 0, ,6752 0, ,5602 0, , ,4000 0,25/7/A 13,5276 0, ,9781 0, ,6677 0, , ,3000 0,25/14/A 14,3579 0, ,8480 0, ,4652 0, , ,1600 0,25/21/A 14,2208 0, ,3045 0, ,2790 0, , ,5200 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,25/1/B 13,8147 0, ,9964 0, ,9664 0, , ,4600 0,25/3/B 13,7468 0, ,0121 0, ,8942 0, , ,2300 0,25/7/B 13,7257 0, ,1435 0, ,8672 0, , ,0000 0,25/14/B 15,8696 0, ,1772 0, ,9667 0, , ,9500 0,25/21/B 13,6837 0, ,7774 0, ,7413 0, , ,

42 Tab. 20: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,25 při 37 C v průběhu dne. dny B-0,25 E-0, , , , , , , , , , ,8750 Tab. 21: Stupeň botnání a eroze 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,5 při 37 C v průběhu dne. označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/A 13,5031 0, ,6680 0, ,6542 0,1511 9, ,8700 0,5/3/A 13,6931 0, ,8836 0, ,8385 0, , ,5800 0,5/7/A 13,4701 0, ,6549 0, ,5944 0, , ,0800 0,5/14/A 14,6415 0, ,8246 0, ,7277 0, , ,5200 0,5/21/A 13,5878 0, ,8053 0, ,6613 0, , ,4200 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,5/1/B 13,6894 0, ,8652 0, ,8473 0, , ,2100 0,5/3/B 14,5320 0, ,7358 0, ,6817 0, , ,1400 0,5/7/B 15,3455 0, ,5329 0, ,4697 0, , ,1400 0,5/14/B 14,2675 0, ,4530 0, ,3551 0, , ,0000 0,5/21/B 15,4988 0, ,7028 0, ,5666 0, , ,

43 Tab. 22: Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,5 při 37 C v průběhu dne. dny B-0,5 E-0,5 1 10, , , , , , , , , ,4200 Tab. 23: Stupeň botnání a eroze 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,125 při 37 C v průběhu dne. označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/A 13,5802 0, ,7862 0, ,7307 0, , ,1300 0,125/3/A 13,2020 0, ,4863 0, ,3570 0, , ,1700 0,125/7/A 14,3246 0, ,6827 0, ,4764 0, , ,8000 0,125/14/A 13,7060 0, ,0865 0, ,8291 0, , ,8300 0,125/21/A 14,9065 0, ,0378 0, ,9640 0, , ,5000 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 0,125/1/B 15,4125 0, ,6110 0, ,5663 0, , ,5900 0,125/3/B 15,5691 0, ,8405 0, ,7231 0, , ,5500 0,125/7/B 15,4586 0, ,8493 0, ,5998 0, , ,2000 0,125/14/B 13,4490 0, ,7876 0, ,5724 0, , ,5900 0,125/21/B 13,7151 0, ,8305 0, ,7741 0, , ,

44 Tab. 24:Průměrné hodnoty stupně botnání a eroze u vzorků 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 0,125 při 37 C v průběhu dne. dny B-0,125 E-0, , , , , , , , , , ,7100 Tab. 25: Stupeň botnání a eroze 3T o hmotnosti 150 mg vzorků A, B ve fosfátovém pufru o koncentraci c= 1 při 37 C v průběhu dne. označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 1/1/A 15,2942 0, ,4636 0, ,4521 0,1579 7, ,2800 1/3/A 15,7367 0, ,9153 0, ,8796 0, , ,7800 1/7/A 13,6999 0, ,9363 0, ,8542 0, , ,1000 1/14/A 13,5674 0, ,9274 0, ,6862 0, , ,0000 1/21/A 13,5818 0, ,7696 0, ,6590 0, , ,6900 označení vzorků / dny ml mo mlb mb mls ms B E 1/1/B 13,6912 0, ,8676 0, ,8441 0, , ,7900 1/3/B 14,8329 0, ,0563 0, ,9800 0, , ,0000 1/7/B 15,4314 0, ,6878 0, ,5854 0, , ,8800 1/14/B 14,6384 0, ,0310 0, ,7657 0, , ,4200 1/21/B 13,6438 0, ,7930 0, ,7226 0, , ,