LIBERACE LÉČIV Z VĚTVENÝCH POLYESTERŮ PLASTIFIKOVANÝCH TRIACETINEM

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie LIBERACE LÉČIV Z VĚTVENÝCH POLYESTERŮ PLASTIFIKOVANÝCH TRIACETINEM Diplomová práce Hradec Králové 2012 Kateřina Hrubantová 1

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Velmi děkuji PharmDr. Evě Šnejdrové, Ph.D. za vřelý přístup, cenné rady a odborné vedení při zpracování této diplomové práce. Kateřina Hrubantová 2

3 OBSAH 1 Abstrakt Abstract Zadání práce Úvod Seznam zkratek Teoretická část Biokompatibilní polymery odvozené od α-hydroxykyselin Poly(mléčná) kyselina Kyselina poly(dl-mléčná) PGA PLGA Větvící monomery a plastifikace Liberace léčiv z biodegradabilních polymerů Experimentální část Použité přístroje Použité suroviny Měření hmotnostního úbytku plastifikátorů při zahřívání Měření absorpčního maxima plastifikátorů Příprava matric pro disoluční testy Příprava fosfát citrátového pufru o ph 7, Kalibrační přímka acikloviru Kalibrační přímka flukonazolu Disoluční test Stanovení množství uvolněného léčiva Výsledky Tabulky Grafy Diskuze Závěry Literatura

4 1 Abstrakt Cílem diplomové práce bylo studium liberace acikloviru a flukonazolu z větvených polyesterových nosičů plastifikovaných triacetinem. Teoretická část se věnuje polyesterům odvozených od α-hydroxykyselin, větvícím monomerům, plastifikátorům a liberaci léčiv. V experimentální části byl proveden modifikovaný statický disoluční test při 37 C do fosfát citrátového pufru ph 7,4 po dobu 25 dnů. Bylo zjištěno, že triacetin je vhodným plastifikátorem polyesterových matric formovaných tavením. V koncentracích 20 %, 30 % a 40 % neměl vliv na průběh liberace acikloviru a flukonazolu. Liberace léčiv z polyesterů větvených tripentaerythritolem a plastifikovaných triacetinem byla ovlivněna molární hmotností a stupněm větvení polyesteru. Klíčová slova: větvené polyestery, plastifikátory, liberace acikloviru, liberace flukonazolu 2 Abstract The aim of these graduation thesis was the study of acyclovir and fluconazole release from branched polyesters carriers plasticized with triacetin. The theoretical part introduces the polyesters derived from α-hydroxyacids, branching monomers, plasticizers and drug release. Modified static dissolution test at 37 C using phosphate citrate buffer for 25 days was done in the practical part. It was found, that triacetin is suitable plasticizer of polyester matrices formed by fusion. It has no effect on release of acyclovir and fluconazole in used concentration of 20 %, 30 % or 40 %. Molar weight and ratio of branching influence the drug release from polyesters branched with tripentaerythritol and plasticized with triacetin. Keywords: branched polyesters, plasticizers, acyclovir release, fluconazole release 4

5 3 Zadání práce Diplomová práce bude řešit problematiku liberace léčivých látek z plastifikovaných větvených polyesterů. V teoretické části práce budou z dostupných literárních databází zpracovány současné poznatky v oblasti biokompatibilních polymerů odvozených od α- -hydroxykyselin, možnosti jejich větvení a plastifikace. Dále bude pojednáno o mechanismu uvolňování léčiv z degradabilních polymerních nosičů. V rámci experimentální části práce je zadáno studovat průběh liberace acikloviru a flukonazolu z plastifikovaných větvených polyesterů. Jako nosiče léčiv budou použity polyestery větvené tripentaerytritolem v koncentraci 1 %, 3 % nebo 5 % v reakční směsi. Pro plastifikaci bude použit triacetin v koncentraci 20 %, 30 % nebo 40 %. Bude zjištěna míra evaporace plastifikátoru v průběhu plastifikace polyesterů. Do plastifikovaných polyesterů bude inkorporován aciklovir nebo flukonazol v koncentraci 4 %. S takto připravenými matricemi bude proveden modifikovaný statický disoluční test při 37 C do fosfát citrátového pufru ph 7,4. Ve vhodných časových intervalech bude disoluční médium vyměněno a v odebraných vzorcích bude spektrofotometricky stanoveno množství uvolněného léčiva. Bude určeno absorpční maximum triacetinu z důvodu možného zkreslení výsledků liberace léčiv. Výsledky budou zpracovány do tabulek a grafů znázorňujících průběh liberace léčiv, bude diskutován zjištěný průběh liberace a faktory, které ho ovlivňují. Budou učiněny závěry, které se uplatní v tematicky navazujících pracích. 5

6 4 Úvod Na katedře farmaceutické technologie UK v Hradci Králové byly syntetizovány větvené polyestery stupňovou kopolymerací. Reakční směs byla tvořena ekvimolárním množstvím kyseliny glykolové a kyseliny DL-mléčné. Jako větvící složka byl použit např. tripentaerythritol, větvící složky byly v reakční směsi vždy v koncentraci 1 %, 3 % nebo 5 %. Syntetizované polyestery byly poté analyzovány v Synpo, a.s. Pardubice. Byly u nich určeny tyto charakteristiky: číselně střední molární hmotnost, hmotnostně střední molární hmotnost, teplota skelného přechodu, větvící poměr. Nepotvrdil se předpoklad, že s rostoucí koncentrací větvícího monomeru v reakční směsi roste stupeň větvení. Tato diplomová práce navazuje na již obhájené diplomové práce na katedře farmaceutické technologie z předchozích let. 1, 2 Jsou studovány fyzikálně-chemické vlastnosti větvených polyesterů a možnost jejich využití jako nosičů léčiv. Pro přípravu matric pro disoluční testy byly pro tuto diplomovou práci využity polyestery větvené tripentaerythritolem, plastifikované triacetinem. 6

7 5 Seznam zkratek 1T polyester větvený 1 % tripentaerythritolu v reakční směsi 3T polyester větvený 3 % tripentaerythritolu v reakční směsi 5T polyester větvený 5 % tripentaerythritolu v reakční směsi A absorbance ACV aciklovir FLU flukonazol M n M w číselně střední molární hmotnost [g/mol] hmotnostně střední molární hmotnost [g/mol] PDLLA poly(dl-mléčná kyselina) PGA poly(glykolová kyselina) PLA poly(mléčná kyselina) PLGA kopolymery kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové PLLA chirálně čistá kyselina L-mléčná TA triacetin T g T m teplota skelného přechodu [ C] teplota tání [ C] 7

8 6 Teoretická část 6.1 Biokompatibilní polymery odvozené od α-hydroxykyselin Reakcí α-hydroxykyselin vznikají produkty, které mají lineární řetězce. Jedná se o poly(mléčnou kyselinu), poly(dl-mléčnou kyselinu), poly(glykolovou kyselinu) a kopolymer kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové. Tyto biodegradabilní, termoplastické polyestery nacházejí široké uplatnění nejen v tkáňovém inženýrství, chirurgii, ortopedii a ve farmacii při formulaci léčivých přípravků, ale např. i ve výrobě obalových materiálů. Biodegradabilní polymery pro výrobu léčivých přípravků musí být biokompatibilní a musí splňovat požadavky na toxicitu. Používají se v nejrůznějších lékových formách jako např. bioadhezivní lékové formy, implantáty, pelety, filmy, nanočástice a mikročástice, které jsou součástí léčivých přípravků s řízeným uvolňováním. Biokompatibilní polymery odvozené od α-hydroxykyselin lze syntetizovat několika způsoby: azeotropickou polykondenzací při použití vysoce účinného katalyzátoru a vhodného azeotropického rozpouštědla, přímou polykondenzací za přítomnosti katalyzátoru za sníženého tlaku, polymerací v pevném stavu nebo polymerací za otevření kruhu. 3 Poly(mléčná kyselina) a poly(glykolová) kyselina se syntetizují nejčastěji z původních α-hydroxykyselin mléčné a glykolové, nebo z laktidů a glykolidů, což jsou cyklické dimery kyselin Poly(mléčná) kyselina Poly(mléčná kyselina) PLA se skládá z monomerů kyseliny mléčné. Jedná se o biologicky odbouratelný alifatický polyester. Má minimální toxicitu a nevyvolává žádné nežádoucí tkáňové reakce. 5 Kyselina mléčná obsahuje ve své molekule asymetrický uhlík. Vyskytuje se tedy ve dvou stereoisomerech jako D-mléčná a L-mléčná kyselina a jako racemát DL-mléčná kyselina. Chirálně čistá kyselina L-mléčná (PLLA) je semikrystalický polymer, má vysokou pevnost v tahu a nízkou tažnost, díky čemuž má vysoký modul pružnosti. Je přibližně z 37 % krystalická, má teplotu tání (T m ) C a teplota skelného přechodu (T g ) je C. 6 Stupeň krystalinity závisí na molární hmotnosti a podmínkách polymerace. 7 8

9 Vyšší krystalinita PLLA ovlivňuje řízené uvolňování léčiv, snižuje biokompatibilitu s měkkými tkáněmi, a tím se stává překážkou pro využití jako nosič léčiv. Řešením tohoto problému je například větvení PLLA. 8 Oproti polyglykolidům je více hydrofobní a její degradační rychlost je velmi nízká. Bylo zjištěno, že u PLLA s vysokou molární hmotností může degradace in vivo trvat dokonce od 2 do 5,6 let. 7, 9 PLLA je syntetizována většinou polymerací za otevření kruhu z laktidů (obr. 1), což jsou cyklické dimery kyseliny mléčné. Ty se získávají z nízkomolekulárních oligomerů v přítomnosti katalyzátoru za vysoké teploty a nízkého tlaku. 4 Obr. 1: Syntéza poly(mléčné kyseliny) Kyselina poly(dl-mléčná) Kyselina poly(dl-mléčná) (PDLLA) je amorfní polymer mající náhodné rozložení obou isomerických forem kyseliny mléčné, a proto netvoří krystalicky uspořádané struktury. Tento materiál má nižší pevnost v tahu, větší tažnost a oproti PLLA mnohem rychleji degraduje, díky čemuž je atraktivnější pro využití jako nosič léčiv. Tg je C PGA Polyester kyseliny glykolové (PGA) je jedním z prvních biodegradabilních, synteticky vyrobených polymerů, které byly zkoumány pro biomedicínské aplikace. Díky jeho schopnosti tvořit vlákna byl už v roce 1969 schválen FDA jako první vstřebatelný syntetický šicí materiál DEXON. PGA je vysoce krystalický, jeho krystalinita se pohybuje kolem %, a proto je velmi málo rozpustný ve většině organických rozpouštědel a má vysokou pevnost a modul elasticity. Kvůli své vysoké pevnosti nachází často uplatnění v ortopedii, např. při fixaci kostí. Jeho T g je v rozmezí 35 C až 9

10 40 C a teplota tání (T m ) je vyšší než 200 C. K biodegradaci PGA dochází hydrolýzou nestabilních esterových vazeb. In vivo je degradován na glycin, který může být vylučován močí, nebo je glycin přeměněn na oxid uhličitý a vodu v Krebsově cyklu. 11 Obr. 2: Struktura PGA PLGA PLGA (obr. 3) je kopolymer kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové. Jedná se o amorfní látku, pokud je kyselina DL-mléčná zastoupena v převaze. Ze široké škály alifatických polyesterů se jako nosič léčiv používá PLGA spolu s PLA nejvíce. Mezi jejich výhodné vlastnosti patří především relativně rychlá degradace, výborná bezpečnost a biokompatibilita. Rychlost rozkladu PLGA je závislá na jeho složení a molekulové hmotnosti. Dále ji ovlivňují další fyzikálně chemické faktory, jako jsou počáteční ph a teplota vnějšího prostředí, molární poměr obsažených monomerů, enantiomerní forma, krystalinita a velikost vzorku. Vliv má i tvar a struktura matrice. 13,14 Poměr kyseliny DL-mléčné a glykolové v PLGA hraje velkou roli v rychlosti degradace. Pokud jsou kyselina DL-mléčná a glykolová zastoupeny v PLGA v poměru 50 : 50, rozkládá se během 1 až 2 měsíců, při poměru 75 : 25 za 4 5 měsíců a při 85 : 15 za 5 6 měsíců, s rostoucím množstvím kyseliny mléčné v PLGA se totiž prodlužuje degradační čas. 15 Množství kyseliny glykolové je kritickým parametrem ladění hydrofility matrice, a tím i degradace a rychlosti uvolňování léčiva viz (obr. 4). 16 PLGA se využívá v přípravcích s řízeným uvolňováním léčivých látek, jako jsou mikrosféry, mikrokapsule, nanosféry a nanovlákna. Průběh liberace závisí na použitém PLGA a léčivé látce, bylo prokázáno, že dochází v různé míře k vzájemnému ovlivnění, které zapříčiní buď zrychlené, nebo prodloužené uvolňování

11 Obr. 3: Struktura kopolymeru kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové (x značí počet jednotek kyseliny mléčné a y počet jednotek kyseliny glykolové) 18 Fyzikální vlastnosti polymerních matric léčiv se dají upravit volbou vhodných parametrů polymeru, jak již bylo zmíněno, například pomocí molární hmotnosti, poměru kyseliny mléčné ku kyselině glykolové v PLGA, ale i koncentrací léčiva k dosažení požadované dávky a intervalu uvolňování v závislosti na druhu léčiva. PLGA je intenzivně zkoumán pro řízené uvolňování léčiv s nízkou molekulovou hmotností, proteinů i dalších makromolekul pro komerční využití i pro výzkum. PLGA může být zpracován do téměř jakéhokoliv tvaru a velikosti a také může nést molekuly o libovolné velikosti. Je rozpustný v řadě běžných rozpouštědel včetně chlorovaných rozpouštědel, acetonu, ethyl-acetátu a tetrahydrofuranu. 19 Ve vodě podléhá rozkladu hydrolýzou nestabilních esterových vazeb v řetězci. Na laktid bohaté kopolymery PLGA jsou oproti kopolymerům PLGA s převahou poly(glykolových kyselin) (PGA) méně hydrofilní. Je to způsobeno přítomností postranní methylové skupiny v poly(mléčné kyselině) (PLA), ta je příčinou hydrofobních vlastností. Absorbují tím méně vody, a proto se rozkládají pomaleji. 20 Zastoupení PLA a PGA v polymeru PLGA je tak nejdůležitějším faktorem pro stanovení hydrofility a rychlosti degradace. 11

12 Obr. 4: Doba degradace PLA a PGA homopolymerů a kopolymerů implantovaných v tkáni krys. 21 DOBA DEGRADACE (MĚSÍCE) POMĚR PLA A PGA V KOPOLYMERU PLGA Obr. 5: Průběh degradace PLGA in vivo při různém zastoupení PLA a PGA. 20 STUPEŇ DEGRADACE [Napište citaci z dokumentu nebo shrnutí některého vlastního textu.] ČAS [DNY] Průběh degradace PLGA: V první fázi degradace je léčivo na povrchu v kontaktu s médiem a je uvolňováno v závislosti na jeho rozpustnosti a na schopnosti penetrace vody do polymerní matrice z okolního prostředí. Řetězce se náhodně štěpí a snižuje se podstatně molární hmotnost. K úbytku hmotnosti matrice nedochází u vysokomolekulárních polyesterů. V této fázi se totiž netvoří rozpustné monomerní produkty. 12

13 Ve druhé fázi dochází k hydrolýze řetězců na rozpustné oligomerní a monomerní produkty, které difundují k povrchu tělesa. Tím dochází k uvolnění léčiva difuzí a erozí do úplné solubilizace polymeru. Vlastnosti léčivé látky hrají také roli při průchodu vodné fáze do matrice. 20,22 K degradaci PLGA dochází hlavně pomocí hydrolýzy nestabilních esterových vazeb v řetězci polymeru, jedná se o takzvanou bulk degradation homogenní degradaci, kdy dojde k degradaci v celém objemu polymerní matrice, ta se rozloží na monomery, kyselinu mléčnou a glykolovou, které jsou vylučovány z těla. Při homogenní degradaci je rychlost penetrace vody do polymeru stejná nebo vyšší než rychlost difuze rozpustných degradačních produktů z polymeru. Toto bylo prokázáno v mnoha studiích in vivo a in vitro pro polyestery s odlišnými poměry PLA a PGA, jako například ve studii s ciprofloxacin hydrochloridem. 23 Dále kvůli nově vzniklým karboxylovým koncovým skupinám probíhá autokatalytická reakce. Je důležité si uvědomit, že degradace kopolymeru PLGA často není jen procesem homogenní, ale i heterogenní (surface) degradace a homogenní a heterogenní eroze. Rychlost uvolňování léčiva je často nepředvídatelná, protože existuje mnoho proměnných, které ji ovlivní. Jsou to molární poměr kyseliny mléčné a glykolové v polymeru, teplota skelného přechodu a stupeň krystalinity. Úloha enzymů při biodegradaci PLGA je stále nejasná. Většina výzkumů ukazuje, že degradace neprobíhá enzymaticky a jde pouze o hydrolýzu. Někteří vědci se ale domnívají, že na základě rozdílu v rychlosti degradace, která probíhá v in vivo a v in vitro podmínkách, lze prokázat vliv enzymů na biodegradaci. Polymer PLGA se rozkládá na kyselinu L-mléčnou a kyselinu glykolovou. V konečné fázi degradace jsou tyto monomery eliminovány. Kyselina L-mléčná vstupuje do citrátového cyklu, kde je metabolizována a z těla je poté vyloučena jako oxid uhličitý a voda. 24 PGA je degradována na monomer kyselinu glykolovou. Ta se buď eliminuje v nezměněné formě ledvinami močí, nebo reaguje na glycin, který je použit k syntéze serinu. Serin vstupuje jako kyselina pyrohroznová do citrátového cyklu a poté se vylučuje také jako oxid uhličitý a voda. 7 Polymery s vyšší molární hmotností mají obvykle nižší degradační rychlost. 25 M w má přímý vztah k velikosti řetězce polymeru. Polymery s vyšší molární hmotnostní mají delší polymerní řetězce a vyžadují delší čas k degradaci než malé polymerní řetězce. 13

14 Složení kopolymeru také ovlivňuje důležité vlastnosti jako je teplota skelného přechodu a krystalinita, které mají nepřímý vliv na rychlost rozkladu Větvící monomery a plastifikace Větvící složkou poly(mléčné) kyseliny, poly(dl-mléčné) kyseliny, poly(glykolové) kyseliny a kopolymerů kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové jsou nejčastěji vícesytné alkoholy a cukry, jako je např. polyvinylalkohol, pentaerythritol, mannitol, glukosa, dipentaerythritol a tripentaerythritol. Polykondenzační reakcí těchto α-hydroxykyselin s větvícími monomery je možné získat nízkomolekulární polyestery a oligoestery s větvenými molekulami. Větvené polymery mají oproti polymerům s lineárním řetězcem nižší viskozitu v tavenině či v roztoku. Zajišťují lepší zpracovatelnost a používají se pro získání větvených polyesterů jako nosičů léčiv s nižší molární hmotností, která je výhodná kvůli zkrácení doby biodegradace. Větvené polymery degradují kontinuálně, a tím je zajištěn výhodnější liberační profil oproti lineárním polymerům. Obr. 6: Mannitol 26 Obr. 7: Pentaerythritol 27 14

15 Obr. 8: Dipentaerythritol 28 Obr. 9: Tripentaerythritol 29 Plastifikace Hlavní úlohou plastifikátorů je zlepšení pružnosti, zvýšení mechanické odolnosti a zpracovatelnosti polymerů díky snižování teploty skelného přechodu. Zvětšují vzdálenosti mezi řetězci polymeru a výsledkem jsou měkčí, snáze deformovatelné plastifikované polymery. 30 Dále zvyšují odolnost proti lomu a dielektrickou konstantu. Zároveň ale snižují modul pružnosti materiálu, hustotu, viskozitu taveniny, tvrdost a elektrostatický náboj polymeru. 31 Mají tedy vliv na viskozitu, adhezivitu a liberaci inkorporovaných léčiv. Usnadňují aplikaci lékových forem. Při výběru plastifikátoru pro konkrétní polyester se musí vždy zvážit několik kritérií: např. kompatibilita s polyesterem, toxicita, těkavost, vliv na životní prostředí, cena, efektivita plastifikátoru a mísitelnost s polyesterem, aby vznikla homogenní směs. Kompatibilita je optimální, pokud má plastifikátor podobné vlastnosti jako polyester (polaritu, rozpustnost, vodíkové vazby). Efektivitou je myšleno, jaké množství plastifikátoru je třeba přidat k polyesteru k dosažení požadovaných fyzikálních a mechanických vlastností. Plastifikátory by také neměly být příliš těkavé, aby nedošlo k odpaření za zvýšené teploty během zpracování do aplikační formy nebo při uchovávání. 32 Plastifikátory rozpustné ve vodě (např. triethylcitrát) jsou zcela rozpuštěny ve vodné fázi koloidní polymerní disperze, naopak ve vodě nerozpustné (např. acetyltributylcitrát) musí být emulgovány v disperzi polymerů. Nevýhodou ve vodě rozpustných plastifikátorů je, že se uvolňují z polymerní soustavy při jejím kontaktu s disoluční nebo fyziologickou kapalinou. Lipofilní plastifikátory zůstávají oproti hydrofilním v polymerní matrici a zajistí se tak stálejší podmínky během procesu uvolňování. 33 Plastifikátory jsou začleněny do amorfní části polymerů, zatímco struktura krystalické části zůstává neovlivněna. 15

16 Stupeň plastifikace polymeru závisí ve značné míře na množství plastifikátoru a na stupni interakce mezi polymerem a plastifikátorem. 34 Pouze několik plastifikátorů je schváleno pro použití ve farmacii oproti širokému spektru plastifikátorů, které se uplatňuje v chemickém průmyslu. Ve farmacii jsou jako plastifikátory užívané např. málo těkavé estery s molární hmotností g/mol a teplotou varu C, diestery odvozené od dikarboxylových kyselin, nebo od ethylenglykolu či propylenglykolu, triestery odvozené od kyseliny fosforečné, citronové nebo glycerolu. Strukturální voda ve zbotnalém polymeru plní také funkci plastifikátoru. Byla zkoumána celá řada plastifikátorů pro biodegradabilní polymery. Jedněmi z používaných jsou plastifikátory odvozené od kyseliny citronové. Už v roce 1980 byla plastifikována PLA estery kyseliny citrónové: triethyl-, tributyl-, acetyltriethyl- a acetyltributylcitrátem, takto plastifikovaný polyester se použil pro tvorbu vstřebatelných šicích materiálů, lékařských implantátů a pro výrobu přípravků s řízeným uvolňováním, kdy vysoká molární hmotnost citrátů snížila rychlost degradace PLA. 35 Pro polárnější polymery je vhodné využít pro plastifikaci citráty s nižší molekulovou hmotností, např. triethylcitrát, tributylcitrát. Naopak u méně polárních polymerů je lepší plastifikovat citráty s vyšší molekulovou hmotností, např. acetyl-tributhylcitrátem, acetyltrihexylcitrátem. 36 Polyoly jsou další skupinou plastifikátorů. Patří mezi ně např. glycerol, polyethylenglykol a propylenglykol. Uplatnění nenašel pouze glycerol, ale i jeho estery, např. tributyrin, tricaprylin a triacetin. 37 Ester glycerolu a kyseliny octové se nazývá triacetin. Je to kapalina s bodem varu 258 C, dobře rozpustná ve vodě. 38 Methylparaben je také plastifikátorem, častěji se ale využívá jako konzervans ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Ukázalo se, že může být použit k plastifikaci termostabilního akrylového polymeru Eudragitu

17 Obr. 10: Triacetin 40 Obr. 11: Methylparaben Liberace léčiv z biodegradabilních polymerů Český lékopis 2009 definuje lékové formy s řízeným uvolňováním jako léčivé přípravky, kde rychlost a/nebo místo uvolňování léčivé látky, jsou odlišné od lékové formy s neřízeným uvolňováním při podání stejným způsobem. Patří mezi ně podle lékopisu lékové formy s prodlouženým, zpožděným a pulzním uvolňováním. 42 Přípravky s řízeným uvolňováním přináší řadu výhod ve srovnání s konvenčními lékovými formami. Mohou mít lepší terapeutickou účinnost, nižší toxicitu, mohou dosahovat přesnější distribuce léčiva do místa účinku a zlepšovat compliance a pohodlí pacientů. 43 Dnes je většina klinicky užívaných léčivých látek nízkomolekulární (typicky pod 500 g/mol), s tím souvisí jejich rychlá difúze a rovnoměrná distribuce v těle, a v důsledku toho pouze poměrně malé množství léčiva dosáhne cílového místa, terapie je tak spojena s vedlejšími účinky. Toto je obzvlášť problematické u léčiv s úzkým terapeutickým indexem, jako jsou např. protinádorová, antirevmatická a imunosupresivní léčiva. Časté vedlejší účinky spojené s těmito látkami, např. nefrotoxicita, neurotoxicita, toxicita pro kostní dřeň, kardiotoxicita, záněty sliznic a gastrotoxicita, jsou limitované dávkou léčivé látky, a to brání v efektivní léčbě. Řada přípravků s řízeným uvolňováním je schopna omezit tyto problémy, a tím zvýšit léčebný potenciál léčivých látek. Lékové formy vyšší generace je vhodné také využít pro léčiva, která jsou po podání rychle metabolizována a eliminována z těla. Zajistí se dodávání léčiva po delší dobu v terapeutickém rozmezí, při použití konvenční lékové formy by docházelo ke kolísání hladin léčivé látky, kdy vyšší nebo nižší hladina léčivé látky v krvi, než je terapeutické optimum, může vést k vystupňování nežádoucích účinků léčiva na jedné a k neléčení pacienta na druhé straně, jak je vidět na obr

18 Podání léčiva konvenční injekcí je v obrázku značeno tenkou čarou, podání přípravku s řízeným uvolňováním léčiva je zvýrazněno tučnou čarou. Obr. 12: Plazmatická koncentrace léčiva v místě účinku 44 Koncentrace léčiva v místě působení Injekce Toxická hladina Terapeutické rozmezí Přípravek s řízeným uvolňováním Injekce podávané každých 6 hodin Hodiny Přípravek s řízeným uvolňováním léčiv podávaný od t= 0 hodin Osud polymeru po uvolnění léčiva v těle je důležitým faktorem v navrhování, které polymery budou využity v přípravku s řízeným uvolňováním. Přednost se dává nejčastěji těm, které se přirozeně vylučují z těla. Tyto polymery mohou být eliminovány, např. přímo ledvinami, nebo jsou biologicky rozloženy na menší molekuly, které se už dají vyloučit. Nedegradabilní polymery jsou přijatelné jako nosiče léčiv pouze pro aplikace, kdy se po uvolnění léčiva dají lékové formy odstranit (např. sejmutí náplasti nebo vyjmutí insertu), nebo se používají pro orální aplikace, po kterých polymer projde gastrointestinálním traktem bez vstřebání. 45 Většinou musí být molekuly léčivých látek v těle rozpuštěny ve vodném prostředí, aby mohly působit na cílový receptor. Polymerní systémy pro řízené uvolňování léčiv brání po určitý čas v přístupu vodného prostředí k léčivu. Mezi tyto lékové formy s řízeným uvolňováním léčiv patří např. lékové formy se zpožděným uvolňováním (Obr. 13a), kdy se polymer rozpouští nebo rozkládá pomalu a uvolní léčivo teprve, až když dojde 18

19 k erozi polymeru. U těchto lékových forem se používá buď potažení polymerem, nebo je polymer nosičem léčiva. Na obr. 13b je znázorněno řízené uvolňování léčiv difúzí, kdy molekuly léčiva pomalu difundují přes póry v matrici. Polymerní řetězce v takovémto zesítěném hydrogelu tvoří bariéru pro difúzi, ta může být snížena bobtnáním hydrogelu. U této lékové formy je polymer buď nosičem, ve kterém je léčivo rovnoměrně dispergováno, anebo je polymerní membránou řídící rychlost liberace. Na Obr. 13c je zobrazen průnik vody přes polymerní membránu do lékové formy s řízeným uvolňováním léčiv kvůli koncentračnímu spádu. Molekuly léčiva se rozpustí ve vodě a pronikají řízenou osmózou z matrice přes póry. 46 Obr. 13: Příklady lékových forem s řízeným uvolňováním léčiv a) b) c) Termín Sustained release je určen pro léčivé přípravky s postupným uvolňováním léčiv, které po aplikaci uvolní potřebnou iniciální dávku léčivé látky a pak po prodlouženou dobu postupně uvolňují zbylou léčivou látku. Lékové formy se zpožděným uvolňování a opožděným účinkem léčiva jsou výhodné v případě, že se má léčivá látka absorbovat až ve střevním traktu nebo v jeho určitém místě anebo tehdy, když se má oddálit působení léčiva, což je výhodné u některých onemocnění např. doprovázených nočními záchvaty (astma), problémy s nespavostí s předčasným probouzením, nebo ranními potížemi (artritida, Parkinsonova choroba). Tyto lékové formy se zpožděným uvolňováním tedy zahrnují enterosolventní léčivé přípravky

20 Jiným typem přípravků s řízeným uvolňováním léčiv jsou přípravky, u kterých se uvolňování označuje jako pulzní, jsou to přípravky s přerušovaným nebo opakovaným uvolňováním. Pulzní uvolňování léčiv je vhodné např. při potřebě fyziologické opakované denní aplikace léčiva (inzulin) a oproti kontinuálnímu podávání je výhodné v tom, že nevede tak často k snížené citlivosti receptorů na léčivo a rozvoji tolerance na léčivou látku (nitráty). 48 U nových Multi-pulsatile přípravků s řízeným uvolňováním jsou předem určeny periody v cyklu, kdy nedochází k uvolňování žádného léčiva, následované rychlým uvolňováním léčiva, dokud nejsou tyto lékové formy degradovány. Takovéto léčivé přípravky se také ukázaly být schopné uvolňovat více léčivých látek v určitém pořadí v cyklu. Kopolymer PLGA se jeví jako vhodný polyester pro využití v multi-pulzních přípravcích s řízeným uvolňováním obsahujících několik léčivých látek. Lze například vytvořit jeden biodegradabilní polymerní nosič, kdy je PLGA a/nebo PLLA v kombinaci s několika léčivými látkami. A z tohoto nosiče se pulzně uvolňují léčivé látky v předem stanoveném sledu pulzů. 49,50 V oblasti přípravků s pulzním uvolňováním léčiv se zaměřuje mnoho vědců na vývoj lékových forem pro podávání inzulinu. Potřeba inzulínu totiž kolísá během celého dne podle příjmu potravy pacientem. V současné době používané formulace inzulinu vyžadují denně opakované injekce, a navíc ještě pečlivou kontrolu hladiny glukosy v krvi. Je snaha vytvořit přípravky s řízeným uvolňováním inzulinu citlivé na zvýšené hladiny glukosy v krvi, což by byl převrat v terapii diabetu. Obecně mají tyto citlivé přípravky s modifikovaným uvolňováním léčiv dvě hlavní složky: senzor detekující parametr, který stimuluje uvolňování léčivých látek, a druhou složkou je polymerní matrice, z které se uvolní léčivo. Pro terapii diabetu byl zvolen jako senzor enzym glukosa oxidasa. 51 Když se zvýší hladina glukosy v krvi, začne enzym glukosa oxidasa štěpit glukosu na kyselinu glukonovou, což vede ke snížení ph a tento pokles ph se využije jako signál pro uvolnění inzulinu. Uvolňování je dosaženo použitím phsensitivních polymerů, které buď nabobtnají, nebo degradují v kyselém prostředí. 52 Lékové formy vyšších generací umožňují, jak již bylo zmíněno, řízenou distribuci léčiv. Nejjednodušší metodou, jak toho dosáhnout, je implantovat přípravek s řízeným uvolňováním přímo do místa účinku. Tuto metodu lze použít, pokud je místo účinku přístupné bez ohrožení zdraví pacienta a léčivá látka v tomto určeném místě zůstává. Podávají se takto implantáty, kdy je nosičem léčivé látky PLGA. Implantát se vpraví 20

21 chirurgicky přímo na požadované místo, takže se léčivo (např. antibiotikum, protinádorová látka) uvolňuje pouze místně. 53 Pro část nemocí je nutné využívat tzv. targeting, což umožní cíleně přivádět léčivou látku do místa účinku. Této distribuce léčiv se může dosáhnout pomocí přípravků s řízeným uvolňováním. 54 Polymery jsou zde používány ve dvou typech přípravků s řízeným uvolňováním, buď se polymery uplatňují jako koloidní nosiče léčiv, nebo tvoří s léčivou látkou konjugáty. U koloidních formulací polymer enkapsuluje léčivé látky v mikročásticích nebo nanočásticích. 55 V případě konjugátů léčiva s polymerem je léčivo kovalentně vázané na polymer, zde má polymer pouze funkci nosiče, k targetingu se používají biologické molekuly, jako jsou např. imunoglobuliny, které se pak vážou na specifická místa cílových buněk na specifické antigeny nebo receptory. 56 Tyto léčivé přípravky se pak dají podat nitrožilně. 57 Ideální polymery pro přípravu konjugátů s léčivy by měly být rozpustné ve vodě, netoxické a neimunogenní a měly by být degradovány, anebo eliminovány z těla. 58 Biodegradabilní polymery jsou součástí lékových forem jako nosiče léčiv u celé řady léčivých látek, včetně malých molekul jako jsou protinádorové léčivé látky, 59 antikoncepční steroidy, 60 nesteroidní antiflogistika, 61 a stejně tak i u makromolekulárních biologických léčiv s krátkým biologickým poločasem 62. Znalost mechanismů uvolňování léčiv a fyzikálně-chemických procesů, které ovlivňují rychlost uvolňování, je nezbytná pro vývoj léčivých přípravků s řízeným uvolňováním. Na rychlost uvolňování léčiv z lékových forem vyšší generace a na degradační kinetiku má vliv mnoho procesů, např. interakce mezi léčivem a polymerem 63, interakce mezi více léčivými látkami 64, absorpce vody do matrice 65, uzavřenost pórů, fyzikálně chemické vlastnosti léčivé látky. 66 Rychlost uvolňování léčiva záleží především na vlastnostech polymeru: na jeho hydrofilitě, krystalinitě a molekulové hmotnosti, jak již bylo zmíněno. Kvantitativní předpověď profilu uvolňování léčiv je mnohdy problematická. Dále bylo zjištěno, že má vliv i velikost lékové formy. Studie na mikročásticích, polymerních filmech a implantátech o různé velikosti prokázaly, že se s velikostí zvětšuje rychlost degradace polymeru, dochází k větší hmotnostní ztrátě a kinetika je heterogenní. 67,68 Také byla vytvořena celá řada modelů pro řízené uvolňování léčiv z degradabilních implantátů a mikročástic, které demonstrují různý podíl difúze, anebo polymerní degradace v průběhu liberace léčiv. Profil uvolňování léčivých látek z těchto systémů je většinou multifázický kvůli homogenním procesům eroze polyesterů

22 Degradace polymeru: Především degradace polymeru je řídícím krokem určujícím rychlost uvolňování léčivých látek z lékových forem vyšší generace. Zjistilo se, že v první fázi degradačního procesu dochází k rychlému snížení molekulové hmotnosti polymeru bez odpovídajícího hmotnostního úbytku. Okamžitě po ponoření polymerního nosiče do vody, nebo po podání in vivo dochází k absorpci vody polymerem. Objem, který voda zabírá uvnitř polymerní matrice, může být považován za póry. Jsou však v této fázi degradačního procesu ještě příliš malé pro uvolňování léčiv. Počet a velikost pórů ale postupně narůstá. 70 Ihned po kontaktu s vodou dochází k hydrolýze esterových vazeb. Takto vznikají degradační produkty účastnící se autokatalytické reakce, ty jsou příčinnou heterogenního rozkladu, kdy uvnitř matric dochází k rychlejší degradaci než na povrchu matrice. 68 Velikost částic má vliv na rozklad tím, že v menších částicích mohou snadněji difundovat k povrchu degradační produkty vzniklé uvnitř částice, naopak u větších částic mají degradační produkty delší cestu k povrchu. Degradační produkty uvězněné uvnitř částice, pak mají potenciál katalyzovat degradaci zbývajícího polymerního materiálu. Během druhé fáze se pak degradační rychlost snižuje, mění se molekulový hmotnostní profil. V této fázi dochází k úbytku hmotnosti kvůli tomu, že částice ztrácí svou strukturu, stávají se vysoce porézní a degradační produkty tak mohou unikat do rozpouštědla. V této fázi degradace je relativní rozdíl mezi velikostmi částic (mikroa nanočástice) zanedbatelný z důvodu zvýšení pórovitosti systémů. Malé póry se zvětšují a splývají se sousedními v menší počet větších pórů, toto vše se děje díky erozi a disoluci polymerních degradačních produktů. Snižování hmotnosti polymerních systémů má odlišný profil oproti redukci molekulové hmotnosti. Počáteční nízký hmotnostní úbytek během prvních 24 hodin byl zaznamenán u všech mikro- a nanosfér kvůli disoluci nízkomolekulárních oligomerů, které vznikají během přípravy částic, nebo se nacházejí blízko povrchu částice. Po této fázi následuje perioda zanedbatelné ztráty hmotnosti po následujících 21 dnů a po ní pak dochází k prudkému snížení hmotnosti polymerní matrice. Profil snižování hmotnosti se totiž neshoduje s degradačním profilem, příčinou je to, že polymer musí projít dostatečně rozsáhlou degradací, při které se tvoří ve vodě rozpustné monomery a oligomer. Takže až do doby degradace nedochází k výraznému snížení hmotnosti. Toto popsali už i jiní autoři

23 V případě mikročástic a makroskopických disků s léčivými látkami se nesnižuje jen hmotnost polymeru, ale dochází současně i k uvolňování léčivé látky, toto je vyjádřené rovnicí homogenní degradace, protože degradace polymeru řídí krok určující uvolňování léčivých látek. Kinetika degradace čistých PLGA mikro- a nanočástic byla popsána Dunne et al. v roce Tento kolektiv autorů popsal rovnicí Prouta a Tomkonsona 72 kinetiku ztráty hmotnosti polymeru, která vyjadřuje bulk degradation - homogenní degradaci. K a t max jsou konstanty procesu homogenní degradace Rovnice homogenní degradace 72 X je dílčí ztráta hmotnosti polymeru, t je doba trvání k je rychlostní konstanta t max je čas, za který dojde k maximální ztrátě hmotnosti nebo čas dosažení 50% hmotnostní ztráty 23

24 7 Experimentální část 7.1 Použité přístroje Analytické digitální váhy KERN ABS, max 220g, d=0,1 mg Biologický termostat BT 120, Laboratorní přístroje Praha Digitální potenciometr s ph metrem MV 870 (metr HANNA ph 221) Digitální váhy KERN N, max 1000g, d=0,1 Horkovzdušná sušárna ULE 400, Memmert Spektrofotometr SPECORD 205, Analytik jena 7.2 Použité suroviny 1T polyester větvený 1 % tripentaerythritolu v reakční směsi (FaF UK HK) 3T polyester větvený 3 % tripentaerythritolu v reakční směsi (FaF UK HK) 5T polyester větvený 5% tripentaerythritolu v reakční směsi (FaF UK HK) Aceton čistý (Penta, výrobní divize Chrudim) Aciklovir (Pliva Lachema) Azid sodný (Merck, Schuchardt) Destilovaná voda (FaF UK Hradec Králové) Flukonazol (Pliva Lachema) Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát (Kulich Pharma, HK) Kyselina citronová monohydrát (Penta, výrobní divize Praha) Triacetin (Sigma - Aldrich, USA) 24

25 7.3 Měření hmotnostního úbytku plastifikátorů při zahřívání 3,000 g triacetinu bylo naváženo na analytických vahách do skleněné kádinky a zahříváno v horkovzdušné sušárně na teplotu 80 C. V časových intervalech 5, 10, 15 a 20 minut byla kádinka vyjmuta ze sušárny a zvážena. Hmotnost byla zaznamenána do tabulky a hmotnostní úbytek byl poté vyjádřen v procentech. Stejně bylo postupováno i v případě plastifikátoru hexylsalicylátu. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a Měření absorpčního maxima plastifikátorů Byl připraven 0,01% roztok ethylsalicylátu, tricaprylinu, triacetinu a hexylsalicylátu v 96% lihu. Byla měřena absorbance těchto roztoků při vlnových délkách v rozsahu 190 nm až 290 nm po 5 nm. Na základě naměřených hodnot byl sestrojen graf závislosti absorbance na vlnové délce a bylo určeno absorpční maximum. 7.5 Příprava matric pro disoluční testy Matrice byly složeny z polymerního nosiče, plastifikátoru o koncentraci 20 %, 30 % nebo 40 % a léčiva v koncentraci 4 %. Bylo připraveno množství 5,00 g. Jako nosič byly použity polyestery kyseliny DL mléčné a glykolové větvené tripentaerythritolem, který byl v reakční směsi použit v koncentraci 1 %, 3 % a 5 %. Od toho je pak označení 1T, 3T, 5T. Analýza nosičů byla provedena v Synpo Pardubice 73. Relevantní charakteristiky nosičů uvádí tab. 1: Tab. 1: Označení nosiče Poměr LA/GA/T [%] M n [g/mol] M w [g/mol] Tg [ C] 1T 49,5/49,5/1, ,3 0,42 3T 48,5/48,5/3, ,7 0,31 5T 47,5/47,5/5, ,2 0,34 g M n [g/mol] je číselně střední molární hmotnost M w [g/mol] je hmotnostně střední molární hmotnost Tg [ C] je teplota skelného přechodu g = η br /η lin je větvící poměr stanovený z vnitřní viskozity lineárního (lin) a větveného (br) polymeru při shodné molární hmotnosti (lineární PLGA má g =1,0) 25

26 Polyestery 1T, 3T a 5T byly mechanicky fragmentovány na menší části pro snadnější vážení a rychlejší roztavení. Na analytických vahách pak bylo do skleněných kádinek naváženo požadované množství polyesteru a roztaveno v horkovzdušné sušárně při teplotě 80 C. K roztavenému nosiči byl přivážen triacetin v koncentraci 20 %, 30 % nebo 40 % a soustava byla důladně zhomogenizována. Poté bylo přiváženo vypočtené množství léčiva a opět důkladně zhomogenizováno. Tab. 2: Složení matric Polyester [g] 3,8 3,3 2,8 Triacetin [g] 1,0 1,5 2,0 Léčivo[g] 0,2 0,2 0,2 Celková hmotnost[g] 5,00 5,00 5,00 Na dno skleněných scintilačních lahviček byly pomocí kovových kopistek tvarovány vzorky o hmotnosti 150,0 mg. Byly připraveny duplicitně Příprava fosfát citrátového pufru o ph 7,4 Bylo připraveno 2000 ml fosfát citrátového pufru o ph 7,4 podle chemických tabulek. 74 Ten vznikl smísením 196 ml 0,1M roztoku kyseliny citronové monohydrátu (roztok A) a 1804 ml 0,2M roztoku hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (roztok B). Mikrobiální stabilita byla zajištěna pomocí azidu sodného v koncentraci 0,02 %. Roztok A: 4,12 g kyseliny citronové monohydrátu bylo doplněno destilovanou vodou na objem 196 ml. Roztok B: 129, 16 g hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu bylo doplněno destilovanou vodou na objem 1804 ml. Hodnota ph byla ověřena digitálním ph metrem. Odchylka ph od požadované hodnoty 7,4 se upravovala přidáním kyseliny citronové nebo hydrogenfosforečnanu sodného. Fosfát citrátový pufr o ph 7,4 sloužil jako liberační médium pro disoluční testy. Celkem bylo potřeba přibližně 4000 ml fosfát citrátového pufru. 26

27 7.5.2 Kalibrační přímka acikloviru Absorpční maximum acikloviru (ACV) ve fosfát citrátovém pufru o ph 7,4 je při 256 nm. Absorbance byla proto měřena při této vlnové délce. K sestrojení kalibrační přímky bylo připraveno šest roztoků o klesající koncentraci ACV (tab. 3). Vzorky byly proměřovány proti fosfát citátovému pufru ph 7,4. Z naměřených hodnot absorbance byla sestrojena kalibrační přímka. Dále byla zjištěna rovnice kalibrační přímky: y= 0,061x + 0,004 a hodnota korelačního koeficientu R 2, kdy R 2 = 1. Tab. 3: Naměřená absorbance roztoků acikloviru o narůstající koncentraci Koncentrace acikloviru [mg/l] A 25 1, , , , , ,067 Obr. 14: Kalibrační přímka acikloviru při 256 nm 27

28 7.5.3 Kalibrační přímka flukonazolu Absorpční maximum flukonazolu (FLU) ve fosfát citrátovém pufru o ph 7,4 je při 261 nm. Absorbance byla proto měřena při této vlnové délce. Opět bylo připraveno šest roztoků o rostoucí koncentraci FLU k sestrojení kalibrační křivky viz (tab. 4). Vzorky byly proměřovány proti fosfát citátovému pufru ph 7,4. Z naměřených hodnot absorbance byla sestrojena kalibrační přímka. Dále byla zjištěna rovnice kalibrační přímky: y = 0,002x + 0,010 a hodnota korelačního koeficientu R 2, kdy R 2 = 0,999. Tab. 4: Absorbance roztoků FLU o narůstající koncentraci Koncentrace flukonazolu [mg/l] A 600 1, , , , , ,193 Obr. 15: Kalibrační přímka flukonazolu při 261 nm 28

29 7.5.4 Disoluční test Do označených scintilačních lahviček, které obsahovaly matrice o hmotnosti 150 mg, bylo nalito 15,0 g fosfát citátového pufru ph 7,4. Lahvičky byly umístěny do termostatu nastaveného na teplotu 37 C. Disoluční kapalina byla odebírána v určitých časových intervalech, zvolených s ohledem na průběh liberace léčiva. Vždy byla ze scintilačních lahviček obsahujících matrice odlita veškerá disoluční kapalina do prázdných, přesně označených scintilačních lahviček. Disoluční kapalina byla nahrazena novým pufrem ph 7,4 o hmotnosti 15,0 g a vzorky byly vráceny do termostatu. Vzorky byly odebírány až do stádia, kdy se už neuvolňovalo žádné inkorporované léčivo. V této fázi se test disoluce ukončil Stanovení množství uvolněného léčiva Množství uvolněného ACV a FLU z matric se zjišťovalo měřením absorbance liberačních kapalin pomocí spektrofotometru. ACV byl proměřován při vlnové délce 256 nm, FLU při 261 nm. Jako slepý vzorek byl u FLU použit fosfát citrátový pufr. U ACV byla jako slepý vzorek využita liberační média z disolučního testu matric bez léčiva. Z rovnice kalibrační přímky byla vypočtena koncentrace uvolněné léčivé látky v mg/l (x 1 ). Vypočtená koncentrace (x 1 ) byla poté převedena na koncentraci léčivé látky v 15 ml disolučního média (x 2 ). Dále byl zjištěn procentuální podíl uvolněného léčiva z celkového množství léčiva v matrici (x % ). Z těchto hodnot byla počítána v průběhu celé liberace kumulativní procenta uvolněného léčiva. Průběh liberace byl zaznamenán také graficky jako závislost kumulativních procent uvolněného léčiva na čase. Rovnice kalibrační přímky acikloviru: Výpočet uvolněného acikloviru: 29

30 Rovnice kalibrační přímky flukonazolu: Výpočet uvolněného flukonazolu: Vysvětlivky: A hodnota naměřené absorbance c koncentrace uvolněného léčiva (mg/l) x koncentrace léčiva v 15 ml disolučního média (mg/ 15 ml) x% procentuální podíl uvolněného léčiva m n D navážka matrice (mg) ředění roztoku vzorku 30

31 8 Výsledky 8.1 Tabulky Tab. 5: Měření hmotnostního úbytku triacetinu Čas [min] Hmotnost [g] Hmotnostní úbytek [%] 0 3, ,9999 0, ,9995 0, ,9990 0, ,9985 0,20 Tab. 6: Liberace acikloviru z nosičů 1T plastifikovaných 20 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,481 7,90 0, ,804 13,56 10,73 10,73 5 hod 0, ,578 9,49 0, ,352 5,94 7,72 18,44 24 hod 0, ,532 8,72 0, ,231 20,77 14,75 33,19 3 dnů 0, ,335 21,91 0, ,409 6,90 14,40 47,60 6 dnů 0, ,939 15,41 0, ,322 22,31 18,86 66,45 11 dnů 0, ,076 17,67 0, ,338 22,58 20,12 86,58 18 dnů 0, ,637 10,45 0, ,660 11,13 10,79 97,37 25 dnů 0, ,092 1,54 0, ,088 1,49 1,51 98,89 31

32 Tab. 7: Liberace acikloviru z nosičů 1T plastifikovaných 30 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,628 10,27 0, ,600 9,70 9,98 9,98 5 hod 0, ,654 10,70 0, ,551 8,89 9,79 19,78 24 hod 0, ,790 12,92 0, ,951 15,36 14,14 33,92 3 dnů 0, ,887 14,51 0, ,886 14,31 14,41 48,33 6 dnů 0, ,329 21,75 0, ,328 21,45 21,60 69,93 11 dnů 0, ,143 18,70 0, ,124 18,15 18,42 88,35 18 dnů 0, ,437 7,15 0, ,480 7,75 7,45 95,80 25 dnů 0, ,174 2,80 0, ,183 2,95 2,88 98,68 32

33 Tab. 8: Liberace acikloviru z nosičů 1T plastifikovaných 40 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,510 8,49 0, ,590 9,81 9,15 9,15 5 hod 0, ,867 14,44 0, ,737 12,27 13,35 22,50 24 hod 0, ,500 8,33 0, ,418 6,95 7,64 30,14 3 dnů 0, ,172 2,86 0, ,411 6,84 4,85 34,99 6 dnů 0, ,514 25,20 0, ,584 26,34 25,77 60,76 11 dnů 0, ,393 23,19 0, ,316 21,89 22,54 83,30 18 dnů 0, ,585 9,73 0, ,499 8,29 9,01 92,31 25 dnů 0, ,157 2,60 0, ,208 3,46 3,03 95,35 33

34 Tab. 9: Liberace acikloviru z nosičů 3T plastifikovaných 20 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,000 0,00 0, ,132 2,15 1,08 1,08 5 hod 0, ,080 1,28 0, ,130 2,13 1,70 2,78 24 hod 0, ,000 0,00 0, ,241 3,94 1,97 4,75 3 dnů 0, ,372 5,97 0, ,288 4,70 5,33 10,08 6 dnů 0, ,895 14,37 0, ,570 9,32 11,84 21,93 11 dnů 0, ,667 42,83 0, ,422 39,57 41,20 63,13 18 dnů 0, ,865 29,94 0, ,923 31,42 30,68 93,81 25 dnů 0, ,286 4,68 0, ,292 4,77 4,72 98,53 34

35 Tab. 10: Liberace acikloviru z nosičů 3T plastifikovaných 30 %TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,000 0,00 0, ,000 0,00 0,00 0,00 5 hod 0, ,080 1,30 0, ,000 0,00 0,65 0,65 24 hod 0, ,020 0,32 0, ,182 3,10 1,71 2,36 3 dnů 0, ,485 7,89 0, ,502 8,53 8,21 10,56 6 dnů 0, ,849 13,81 0, ,864 14,69 14,25 24,81 11 dnů 0, ,394 38,94 0, ,238 38,06 38,50 63,31 18 dnů 0, ,474 23,97 0, ,554 26,43 25,20 88,51 25 dnů 0, ,592 10,07 0, ,610 10,38 10,23 98,74 35

36 Tab. 11: Liberace acikloviru z nosičů 3T plastifikovaných 40 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,152 2,47 0, ,088 1,43 1,95 1,95 5 hod 0, ,024 0,39 0, ,111 1,81 1,10 3,05 24 hod 0, ,110 1,79 0, ,069 1,12 1,45 4,50 3 dnů 0, ,185 3,00 0, ,287 4,65 3,83 8,33 6 dnů 0, ,573 9,31 0, ,684 11,12 10,21 18,54 11 dnů 0, ,326 37,79 0, ,364 38,41 38,10 56,64 18 dnů 0, ,107 34,23 0, ,108 34,24 34,24 90,88 25 dnů 0, ,369 5,99 0, ,394 6,40 6,19 97,07 36

37 Tab. 12: Liberace acikloviru z nosičů 5T plastifikovaných 20 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,000 0,00 0, ,036 0,59 0,29 0,29 5 hod 0, ,020 0,34 0, ,032 0,51 0,42 0,72 24 hod 0, ,265 4,45 0, ,184 2,97 3,71 4,43 3 dnů 0, ,338 5,68 0, ,302 4,88 5,28 9,71 6 dnů 0, ,198 20,13 0, ,392 22,52 21,33 31,04 11 dnů 0, ,017 50,69 0, ,888 46,73 48,71 79,75 18 dnů 0, ,966 16,24 0, ,915 14,81 15,52 95,27 25 dnů 0, ,225 3,65 0, ,214 3,46 3,55 98,82 37

38 Tab. 13: Liberace acikloviru z nosičů 5T plastifikovaných 30 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,002 0,03 0, ,007 0,10 0,07 0,07 5 hod 0, ,260 4,22 0, ,180 2,91 3,57 3,63 24 hod 0, ,397 6,44 0, ,580 9,37 7,90 11,54 3 dnů 0, ,256 4,16 0, ,239 3,86 4,01 15,54 6 dnů 0, ,206 19,58 0, ,160 18,72 19,15 34,70 11 dnů 0, ,741 44,49 0, ,847 45,94 45,22 79,91 18 dnů 0, ,927 15,05 0, ,880 14,21 14,63 94,55 25 dnů 0, ,084 1,35 0, ,086 1,40 1,38 95,92 38

39 Tab. 14: Liberace acikloviru z nosičů 5T plastifikovaných 40 % TA čas A ředění ACV kumulativní ACV průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,039 0,63 0, ,009 0,14 0,39 0,39 5 hod 0, ,431 6,99 0, ,276 4,55 5,77 6,16 24 hod 0, ,413 6,69 0, ,393 6,47 6,58 12,74 3 dnů 0, ,399 6,46 0, ,347 5,72 6,09 18,83 6 dnů 0, ,930 15,08 0, ,005 16,56 15,82 34,65 10 dnů 0, ,383 38,64 0, ,293 37,79 38,21 72,86 17 dnů 0, ,122 18,20 0, ,141 18,80 18,50 91,36 25 dnů 0, ,493 8,12 0, ,431 7,11 7,61 98,97 39

40 Tab. 15: Liberace flukonazolu z nosičů 1T plastifikovaných 20 % TA čas A ředění FLU kumulativní FLU průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,580 25,28 0, ,664 27,27 26,28 26,28 5 hod 0, ,401 6,41 0, ,378 6,20 6,30 32,58 24 hod 0, ,755 44,09 0, ,592 26,10 35,10 67,67 48 hod 0, ,775 12,40 0, ,848 13,89 13,15 80,82 5 dnů 0, ,213 3,41 0, ,765 12,54 7,98 88,80 11 dnů 0, ,642 10,28 0, ,642 10,52 10,40 99,20 19 dnů 0, ,156 2,50 0, ,156 2,56 2,53 101,73 40

41 Tab. 16: Liberace flukonazolu z nosičů 1T plastifikovaných 30 % TA čas A ředění FLU kumulativní FLU průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,412 22,93 0, ,871 30,44 26,69 26,69 5 hod 0, ,527 8,56 0, ,535 8,70 8,63 35,32 24 hod 0, ,871 30,38 0, ,414 23,01 26,70 62,02 48 hod 0, ,801 13,01 0, ,762 12,40 12,71 74,73 5 dnů 0, ,837 13,60 0, ,614 10,00 11,80 86,52 11 dnů 0, ,405 6,58 0, ,255 4,15 5,36 91,89 19 dnů 0, ,055 33,38 0, ,980 32,23 32,80 98,00 41

42 Tab. 17: Liberace flukonazolu z nosičů 1T plastifikovaných 40 % TA čas A ředění FLU kumulativní FLU průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,449 24,25 0, ,404 23,08 23,66 23,66 5 hod 0, ,674 11,28 0, ,988 16,24 13,76 37,42 24 hod 0, ,364 39,56 0, ,295 37,72 38,64 76,06 48 hod 0, ,810 13,55 0, ,733 12,04 12,80 88,86 5 dnů 0, ,373 6,24 0, ,405 6,66 6,45 95,31 11 dnů 0, ,245 4,10 0, ,189 3,11 3,61 98,91 19 dnů 0, ,049 0,82 0, ,033 0,55 0,69 99,60 42

43 Tab. 18: Liberace flukonazolu z nosičů 3T plastifikovaných 20 % TA čas A ředění FLU kumulativní FLU průměr [%] [mg/15ml] % 1,5 hod 0, ,233 3,93 0, ,154 2,57 3,25 3,25 5 hod 0, ,001 0,01 0, ,032 0,53 0,27 3,52 24 hod 0, ,347 22,71 0, ,330 22,27 22,49 26,01 48 hod 0, ,097 18,48 0, ,979 16,39 17,44 43,45 5 dnů 0, ,877 31,63 0, ,738 29,10 30,37 73,81 11 dnů 0, ,836 14,08 0, ,836 13,99 14,04 87,85 19 dnů 0, ,405 6,83 0, ,405 6,78 6,80 94,65 25 dnů 0, ,237 3,96 0, ,237 3,96 3,96 98,62 43