Termická analýza interakcí epidermálních lipidů VII.

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie Termická analýza interakcí epidermálních lipidů VII. RIGORÓZNÍ PRÁCE Autor: Mgr. Olga Wanková Školitel: RNDr. Marie Musilová, CSc. Hradec Králové 2012 Mgr. Olga Wanková

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.... Mgr. Olga Wanková

3 Děkuji vedoucí rigorózní práce RNDr. Marii Musilové, CSc. za odborné vedení, hodnotné rady a veškerý čas, který mé práci věnovala.

4 OBSAH ABSTRAKT..5 ABSTRACT ZADÁNÍ PRÁCE.7 2. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Kůže Stavba kůže Význam a funkce kožní bariéry Ceramidy Pseudoceramid 14S Cholesterol Diferenční skenovací kalorimetrie Přístrojové vybavení Princip Využití DSC Chování cholesterolu při DSC EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Seznam použitých surovin Seznam použitých zkratek Seznam použitých přístrojů Pracovní postup Příprava vzorků Kalorimetrické měření VÝSLEDKY MĚŘENÍ A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

5 ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmaceutické technologie Kandidát: Mgr. Olga Wanková Konzultant: RNDr. Marie Musilová, Csc. Název rigorózní práce: Termická analýza interakcí epidermálních lipidů VII. Hlavní složku epidermálních lipidů tvoří ceramidy a cholesterol. V této práci je pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) hodnocena interakce cholesterolu a pseudoceramidu 14S24, syntetizovaného na Katedře anorganické a organické chemie Univerzity Karlovy v Praze, Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Hodnoceno bylo celkem jedenáct vzorků lišících se složením. Koncentrace jednotlivých komponent se ve vzorcích pohybovala v rozmezí 0% - 100%. Směs jednotlivých látek byla navážena přímo do měřících kelímků. Následně byla opakovaně zahřívána a chlazena na DSC, dokud následující záznamy vykazovaly změny teplotních charakteristik. Byly stanoveny teplotní charakteristiky jednotlivých směsí. Klíčová slova: ceramidy, DSC, epidermis, cholesterol, stratum corneum, pseudoceramid 14S24-5 -

6 ABSTRACT Charles University in Prague, Fakulty of Pharmacy in Hradec Králové Department of: Department of Pharmaceutical Technology Candidate: Mgr. Olga Wanková Consultant: RNDr. Marie Musilová, Csc. Title of Thesis: Thermal analysis of interaction of epidermal lipids VII. The main components of epidermal lipids are ceramides and cholesterol. Using differential scanning calorimetry (DSC), this dissertation explores the interaction between cholesterol and pseudoceramide 14S24, synthesized at the Department of Inorganic and Organic Chemistry of the Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Charles University in Prague. Eleven samples of different composition were analyzed. The concentrations of individual components in the samples ranged between 0% and 100%. The mixture of components was weighed in measuring cups. It was then heated and cooled in DSC until subsequent records showed changes in temperature characteristics. The temperatures characteristics of individual mixtures were determined. Key words: ceramides, DSC, epidermis, cholesterol, stratum corneum, pseudoceramide 14S24-6 -

7 1 ZADÁNÍ PRÁCE Tato práce je součástí skupiny prací zabývajících se problematikou interakcí epidermálních lipidů. Hlavní složku těchto lipidů tvoří cholesterol a různé ceramidy. Tyto dvě složky spolu s dalšími pak vytváří s vodou lipidické vrstvy, které jsou součástí kožní bariéry. Tato práce je zaměřena na hodnocení interakce cholesterolu a analogu ceramidů 14S24 syntetizovaného na Katedře anorganické a organické chemie Univerzity Karlovy v Praze, Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Vzorky se budou lišit složením. Zastoupení jednotlivých komponent bude v rozmezí 0% - 100%. Bude vyzkoušen způsob přípravy vzorků přímo v měřících kelímcích opakovaným zahříváním a chlazením do dosažení stabilních teplotních charakteristik všech vzorků. Výstupem bude teplotní charakteristika jednotlivých směsí

8 2 ÚVOD V moderní medicíně existuje několik způsobů podání léčiva do organismu. Jedním z nich je i aplikace transdermální, která má řadu výhod oproti ostatním. Aplikace je snadná, umožňuje kontinuální podávání léčiva a tím udržení systémových hladin. Mimo jiné dokáže zvýšit compliance pacienta. Kůže tvoří vnější povrch lidského těla. Je složena z několika vrstev, což představuje hlavní bariéru pro transdermální podání. Léčiva přes kůži prostupují velmi obtížně a důležitou roli v této cestě hraje lipidická matrix stratum corneum. Tato lipidická vrstva umožňuje penetraci léčiv, a proto je nutno respektovat její vlastnosti a složení. Lipidická matrix se skládá především z lipidů, které jsou uspořádány v lamelách. Zbytek tvoří jiné minoritní složky. Důležité je zastoupení vody ve stratum corneum, tedy její hydratace. Voda spolu s lipidy ovlivňuje plasticitu a pružnost kůže. Tato práce je zaměřena na hodnocení teplotních charakteristik lipofilních směsí. Navazuje tak na soubor rozsáhlých prací, týkajících se interakcí epidermálních lipidů. Pomocí diferenční skenovací kalorimetrie byly analyzovány směsi cholesterolu a analogu ceramidů 14S24. Na tuto práci v budoucnu naváže další, ve které budou vzorky podrobeny hydrataci

9 3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Kůže Stavba kůže Kůže (nebo-li cutis, derma) je jedním z největších orgánů lidského těla, který tvoří zevní povrch organismu. Skládá ze tří základních vrstev epidermis, dermis a tela subcutanea (viz obr. č. 1) 1, 2. Epidermis (pokožka) je nejsvrchnější část kůže, která se dělí na dalších pět vrstev (viz obr. č. 2). Stratum germinativum (zárodečná vrstva), která zahrnuje stratum basale a stratum spinosum. Dále stratum granulosum, stratum lucidum a stratum corneum (vrstva rohová), která představuje hlavní ochrannou bariéru. K pokožce jsou řazeny i její deriváty (tzv. deriváty epidermis), které z epidermis vznikají. Chlupy, nehty a kožní žlázy. Dermis (corium, škára) je vazivo, na jehož povrchu se epidermis nachází. Toto vazivo je tvořeno dvěma vrstvami. Stratum papillare (povrchová vrstva, přilehlá k epidermis) a stratum reticulare (hlubší, hustší vrstva), která dává kůži mechanickou pevnost 1. Dermis je vazivově spojena s další podkožní vazivovou vrstvou (tela subcutanea, subcutis, hypodermis). Je to nejhlubší a nejskrytější vrstva kůže, která se skládá z tukových buněk (adipocytů) a řídkého vaziva. Tato tuková vrstva v různých částech těla kolísá od minimální až po značně silnou (např. hýždě, stehna), kde vytváří tzv. tukový polštář 1, 2, 3. Obrázek č. 1 Stavba kůže 4-9 -

10 Obrázek č. 2 Epidermis 2 Nejsvrchnější vrstvou kůže je stratum corneum (SC). Tato vrstva vzniká v konečném stádiu diferenciace epidermálních buněk a je zodpovědná za bariérovou funkci kůže 5. SC má unikátní strukturu. Skládá se z odumřelých buněk, tzv. korneocytů, které jsou naplněné keratinem, a intercelulární hmoty, která je tvořena specifickými lipidy. Korneocytů bývá vrstev. Nejsvrchnější vrstva těchto bezjaderných buněk se průběžně dělí v jednotlivé zbytky, které následně odpadávají 1, 5, 6, 7. Struktuta SC je často označována jako CIHLY a MALTA (viz obr. č. 3). Korneocyty, mrtvé zploštělé buňky tvaru šestiúhelníku, představují cihly, které zajišťují mechanickou stabilitu SC. Lipidová vrstva v mezibuněčných prostorech představuje tzv. maltu a umožňuje prostup různých látek do lidského těla. SC tímto svým složením připomíná postavenou zeď 5, 6, 7, 8. Obrázek č. 3 Model cihly malta

11 SC se skládá především z proteinů a lipidů. Zbytek tvoří jiné organické sloučeniny a voda spolu se zvlhčujícími faktory (aminokyseliny, močovina, laktamy aj.), které udržují kůži vláčnou a poddajnou 5. SC má velmi nízkou propustnost, čímž se vymyká jiným biomembránám. Intercelulární prostor SC je vyplněn lipidy a malým množstvím vody. Lipidy jsou uspořádány v lamelách, složených z několika dvojvrstev (viz obr. č. 4). Hydrofobní částí směřují dovnitř a hydrofilní vně 5. Lipidické lamely jsou složeny především ze směsí ceramidů (CER), cholesterolu (CH) a volných mastných kyselin. Zbytek tvoří estery CH, cholesterol sulfát a glukosylceramidy. CER tvoří 45 50%, CH 25% a volné mastné kyseliny 10-15%. Největší část lipidů SC tedy představují CER. Složení a uspořádání lipidů spolu s vodou výrazně ovlivňuje plasticitu SC, a tak i permeabilitu kůže 5, 7, 10, 11, 12. Díky svému složení je SC mimořádně odolná vůči fyzikálně-chemickým vlivům 5. Obrázek č. 4 Lamelární uspořádání lipidů SC

12 3.1.2 Význam a funkce kožní bariéry Fyziologické funkce kůže přímo souvisí s její strukturou, jelikož tvoří hraniční orgán mezi vnitřním a vnějším prostředím 2. Kůže je hlavní mechanickou bariérou. Je pevná, pružná a soudržná. Tuto ochranu zajišťuje hydratovaná a promaštěná rohová vrstva. Chrání zejména před ultrafialovým zářením 2. Představuje primární ochranu vůči fyzikálním, chemickým a mikrobiologickým noxám z okolí. Je termoregulačním systémem, který řídí tepelné ztráty pomocí potních žláz 1. Kůže je důležitým rezervoárem vody. Brání její ztrátě z organismu tím, že zajišťuje její rovnováhu v kůži, a tak zamezuje jejímu vysušování 1, 2, 7. V kůži jsou přítomny potní a mazové žlázy, díky nimž je kůže také orgánem exkrečním. Předpokládá se, že v kůži dochází k tvorbě protilátek. Tím se podílí na tvorbě imunitního systému. Podkožní tuk má především ochrannou a izolační funkci při termoregulaci. Na některých místech těla má však i mechanický význam 1. V kůži se nachází mnoho nervových zakončení 3. Vzhled a stav kůže ovlivňuje chování a postavení člověka ve společnosti Ceramidy CER tvoří nejdůležitější a nespecifičtější část lipidů SC. Jsou nezbytné pro zajištění ochranné bariéry kůže. Mechanismus, kterým CER zajišťují ochranu membrán, není zcela znám. Předpokládá se však, že mění jejich fyzikální vlastnosti 5, 6, 13. CER jsou významné sfingolipidy. Základem struktury CER je mastná kyselina a aminoalkohol, které jsou spojeny amidickou vazbou na uhlíku č. 2 alkoholu. Vzniklý amid se nazývá CER (viz obr. č. 5) 7, 13. Délka uhlíkového řetězce CER se pohybuje v rozmezí uhlíků. Bází může být sfingosin, fytosfingosin nebo 6-hydroxysfingosin

13 Mastná kyselina může obsahovat polární hydroxylovou skupinu (α-hydroxykyselina, ω-hydroxykyselina), nebo je bez přítomnosti této skupiny. Mastné kyseliny se mohou lišit jak délkou řetězce, tak i stupněm nasycení. Nejčastěji obsahují mastné kyseliny v řetězci 24 uhlíků 5, 7, 13. Z různých kombinací mastných kyselin a bazických alkoholů tak mohou vznikat různé CER. Tím se liší i jejich klasifikace. V současnosti již existuje jedenáct typů CER. Devátý typ může být izolován z lidské kůže 6, 7, 8. Obrázek č. 5 A) Struktura ceramidů SC, B) Struktura syntetických ceramidů 14 Nižší obsah CER je pozorován v kůži suché nebo u starých lidí. Pokles těchto lipidů může způsobit vážná kožní onemocnění, jako je atopická dermatitida a lupénka. Takové narušení kožní bariéry umožňuje prostup různých alergenů, mikrobů a iritantů, které následně vyvolávají zánětlivou reakci

14 V současnosti je ve stádiu vývoje topická suplementace CER nebo lipidních směsí, které by mohly v budoucnu nahradit tento nedostatek s minimem nežádoucích vedlejších účinků. Přirozené CER jsou však velmi drahé, proto se výzkum zaměřuje na vývoj jejich analogů 15, Pseudoceramid 14S24 Pseudoceramid 14S24 (pseudoceramid) má podobné stérické parametry jako přirozené CER, které se nachází v lidské kůži. Rozdíly v hydrofóbních vlastnostech těchto látek jsou minimální. Mimo jiné je syntéza pseudoceramidu snadná a levná 16. V předběžných studiích bylo zjištěno, že pseudoceramid je vysoce efektivní analog v reparaci prasečí kůže. Tento efekt byl srovnatelný i s lipidy SC kůže lidské 15. Obrázek č. 6 Pseudoceramid 14S Cholesterol CH je významná složka buněčných membrán eukaryotických buněk. V membránách zajišťuje řadu důležitých funkcí. Udržuje jejich mechanickou pevnost, redukuje pasivní permeabilitu vody a plynů, čímž reguluje fluiditu membrán. Ve SC funguje jako stabilizátor lipidů 5, 17, 18. Kromě důležitých funkcí v membránách slouží CH také jako prekurzor aktivní formy vitaminu D, steroidních hormonů v eukaryotických buňkách a žlučových kyselin v hepatocytech 19. CH se v membránách živočišných buněk nachází v koncentraci mol%. V membránách červených krvinek je jeho obsah okolo 50 mol% a v membráně oční čočky může být v koncentraci až 70 mol% 18. CH je steroidní alkohol. Jeho struktura se skládá ze steroidního kruhu, který obsahuje hydroxylovou skupinu na uhlíku č. 3, dvojnou vazbu mezi uhlíkem č. 5 a 6 a

15 uhlovodíkový řetězec v poloze 17 (viz obr. č. 7). V poloze 10 a 13 jsou dvě methylové skupiny 18, 19. Hydroxylová skupina v poloze 3 udává této molekule amfifilní charakter. Díky její přítomnosti je možná tvorba esterů 19, 20. Steroidní skelet má uspořádání trans, což dělá molekulu planární a rigidní. Struktrura CH ovšem symetrická není. Steroidní kruh má dvě strany α a β. Strana plochá, bez substituentů, bývá označována jako α strana. Strana, kde jsou navázány substituenty, nemá rovný povrch, a nazývá se β strana. Nerovnosti tvoří dvě methylové skupiny 17, 18, 19. Obrázek č. 7 Struktura cholesterolu Diferenční skenovací kalorimetrie Diferenční skenovací kalorimetrie (DSC, differential scanning calorimetry) je termoanalytická metoda, která měří energetické změny mezi měřeným vzorkem a vzorkem referenčním. Umožňuje stanovení teplotních charakteristik jak u pevných látek, tak i kapalin. Je velmi přesnou technikou, která pro analýzu potřebuje pouze malé množství vzorku 22, 23, Přístrojové vybavení Přístroj je vybaven stříbrnou pecí s cirkulací tepla, ve které je umístěn vzorek spolu s referenčním. V peci je diskový senzor, který monitoruje teplotu

16 Je zajištěn přívod a odvod chlazení. To se provádí buď tekutým dusíkem, nebo se používají stlačené plyny. Zbytek konstrukce tvoří izolační materiál 25. Obrázek č. 8 Detail měřící komory přístroje po vložení vzorku Princip Při této technice je navážen vzorek do speciálního kelímku (viz obr. č. 9), který se vkládá společně s referenčním vzorkem na kovovou pánev umístěnou v měřící komoře přístroje. Navážka vzorku se pohybuje v rozmezí 3-5 mg. Pánev musí být vyrobena z kovu, který má optimální vodivost a který minimálně reaguje se vzorkem. Nejčastěji se využívá stříbro, platina a hliník. Referenční vzorek je obvykle prázdný. Oba kelímky jsou následně zahřívány, chlazeny, nebo drženy v izotermické fázi podle předem nastaveného režimu 23, 24. Obrázek č. 9 - Kelímky pro DSC měření

17 Experimenty mohou být prováděny v maximálním teplotním rozmezí od -170 C až do 600 C 23. Energetické změny, ke kterým v průběhu měření ve vzorku dochází, jsou měřeny jako funkce času nebo teploty oproti referenčnímu vzorku. Tyto termální změny patří mezi základní endotermické a exotermické děje. Jedná se o tání, krystalizaci, oxidaci, skelný přechod, sublimaci, dehydrataci a další. Některé z těchto jsou znázorněny na obr. č , 28. Zahříváním a chlazením se mění struktura vzorku. Během chlazení dochází k exotermické reakci, při které sledovaný materiál uvolňuje teplo, což se může projevit rekrystalizací vzorku. Zahříváním je materiálu naopak teplo dodáváno. V tomto případě se jedná o endotermický děj a při určité teplotě vzorek taje 28. Tyto dvě základní energetické přeměny je možné sledovat během analýzy mnoha materiálů 28. Při využití řízeného teplotního programu (izoterma, ohřev, chlazení ) mohou být následně stanoveny kalorimetrické charakteristiky 23. Obrázek č. 10 DSC křivka

18 3.4.3 Využití DSC DSC je již mnoho let využívána pro analýzu mnoha farmaceutických materiálů. Lze ji využít pro charakterizaci polymerů, léčiv, kosmetiky i potravin. Slouží pro analýzu různých teplotních změn, jako je tání, krystalizace, polymorfismus, stupeň krystalinity, skelný přechod, stanovení čistoty, hodnocení stability atd 23, 28, 29. Výhodou této metody je snadná manipulace, rychlá analýza a velký teplotní rozsah měření Chování cholesterolu při DSC DSC je metodou, která umožňuje detekovat změny ve struktuře CH. Při zahřívání je u CH typická přítomnost dvou píků na DSC záznamu. První pík má hodnotu Tp okolo 37 C. Při této teplotě dochází ke změně krystalické struktury CH. Druhý, mohutnější pík, se na záznamu zobrazí při teplotě okolo C, kdy dochází k tání cholesterolových krystalů. Při 86 C dochází u krystalického cholesterol monohydrátu k jeho dehydrataci. Jedná se o endotermický děj

19 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Seznam použitých surovin 1. Cholesterol (C 27 H 46 O, M = 386,66) čistota 99%, Sigma-Aldrich chemie 2. Pseudoceramid 14S24 (M = 650,09) (tetradecylester kyseliny (S)-2-tetracosanoylamino-3-hydroxypropionové) Katedra anorganické a organické chemie, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

20 4.2 Seznam použitých zkratek CER ceramid(y) DSC diferenční skenovací kalorimetrie CH cholesterol mol% molární procenta n navážka pseudoceramid 14S24 pseudoceramid SC stratum corneum Tp teplota píku teplota odpovídající tání/tuhnutí převážného množství látky w% hmotnostní procenta H teplo tání/tuhnutí, které odpovídá ploše vymezené píkem DSC křivky

21 4.3 Seznam použitých přístrojů NÁZEV TYP VÝROBCE Diferenční skenovací kalorimetr DSC 200 F3 Maia NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Germany Kelímek Al - 25/40 µl NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Germany Kelímek Lis pro uzavírání Al kelímků Lis pro uzavírání kelímků odolávajících vysokému vnitřnímu tlaku Váhy Digitální analytické váhy Cr - Ni ocel, dno: šestiúhelník, uzavírací podložka, objem 27 µl, odolávající vnitřnímu tlaku 10 MPa OHAUS Discovery CAHN 26, výr. č NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Germany NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Germany NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Germany Ohaus Corporation, Pine Brook, USA CAHN Instruments, USA

22 4.4 Pracovní postup Příprava vzorků Vzorky se skládaly z cholesterolu (CH) a pseudoceramidu 14S24 (CER). Složení vzorků bylo určeno tak, aby byl pokryt rozsah koncentrací od 0 do 100 % jednotlivých komponent. Celková hmotnost jednotlivých vzorků se pohybovala okolo 10 mg. Předpokládané složení jednotlivých vzorků je uvedeno v tabulce č. 1. Jednotlivé suroviny byly váženy přímo do příslušných měřicích kelímků. Skutečné navážené množství jednotlivých komponent a jejich procentuální molární a hmotnostní poměr je uveden v tabulce č. 2 a 3. Každý vzorek byl označen kódem, který udává přibližný poměr jednotlivých substancí CH a CER ve vzorku. Po navážení byly vzorky uzavřeny pomocí odpovídajícího lisu. Tabulka č. 1 Předpokládané složení vzorků pro DSC měření Označení vzorku CH/CER (mol%) CH1CER9 10/90 CH2CER8 20/80 CH3CER7 30/70 CH4CER6 40/60 CH5CER5 50/50 CH6CER4 60/40 CH7CER3 70/30 CH8CER2 80/20 CH9CER1 90/10 CH10 100/0 CER10 0/

23 Tabulka č. 2 Skutečné navážky výchozích surovin s mol% Označení vzorku n CH (mg) CH (mol%) n CER (mg) CER (mol%) CH1CER9 0,63 9,97 9,56 90,03 CH2CER8 1,41 20,23 9,35 79,77 CH3CER7 1,97 29,15 8,05 70,85 CH4CER6 2,96 41,55 7,00 58,45 CH5CER5 3,64 50,62 5,97 49,38 CH6CER4 4,71 60,00 5,28 40,00 CH7CER3 5,49 72,39 3,52 27,61 CH8CER2 6,90 79,56 2,98 20,44 CH9CER1 8,29 90,28 1,50 9,72 CH10 9,10 100,00 0,00 0,00 CER10 0,00 0,00 10,54 100,00 Tabulka č. 3 Procentuální molární a hmotnostní poměr CH a CER Označení vzorku CH (w%) CH (mol%) CER (w%) CER (mol%) CH1CER9 6,18 9,97 93,82 90,03 CH2CER8 13,10 20,23 86,90 79,77 CH3CER7 19,66 29,15 80,34 70,85 CH4CER6 29,70 41,55 70,30 58,45 CH5CER5 37,90 50,62 62,10 49,38 CH6CER4 47,10 60,00 52,90 40,00 CH7CER3 60,90 72,39 39,10 27,61 CH8CER2 69,80 79,56 30,20 20,44 CH9CER1 84,70 90,28 15,30 9,72 CH10 100,00 100,00 0,00 0,00 CER10 0,00 0,00 100,00 100,

24 4.4.2 Kalorimetrické měření Vzorek byl vložen do kalorimetru. Jako referenční vzorek byl použit prázdný kelímek stejného typu. Přístroj byl naprogramován na příslušný teplotní režim. Všechny vzorky byly měřeny za stejných podmínek. Měření každého vzorku probíhalo ve třech fázích. Teplotní program pro 1. fázi měření je uveden v tabulce č. 4. Teplotní program 2. a 3. fáze je uveden v tabulce č. 5. Tabulka č. 4 - Teplotní program 1. fáze DSC měření

25 Tabulka č. 5 - Teplotní program 2. a 3. fáze DSC měření Vysvětlivky: - teplota v měřící komoře při vložení vzorku - izoterma - ohřev - chlazení

26 5 VÝSLEDKY MĚŘENÍ A DISKUZE Metodou DSC byl nejprve proměřen vzorek samotného CH. Pro toto měření byl použit hliníkový kelímek. Vzorek byl označen kódem jako CH-Al. Pro toto prvotní měření byl nastaven teplotní režim 1. fáze (viz tabulka č. 4). Průběh měření a detaily detekovaných píků jsou znázorněny v grafu č. 1. Graf č. 1 - Vzorek CH-Al n = 8,437mg a) Záznam průběhu měření

27 b) Schéma hodnocených píků OHŘEVŮ a CHLAZENÍ c) Detail prvního píku OHŘEV

28 d) Detail druhého píku OHŘEV e) Detail prvního píku CHLAZENÍ

29 f) Detail druhého píku CHLAZENÍ g) Detail třetího píku CHLAZENÍ třetí chlazení neměřeno

30 V následujících tabulkách č. 6 a 7 jsou uvedeny kalorimetrické charakteristiky tání a tuhnutí CH při měření v Al-kelímku. Na základě výsledků DSC byly stanoveny následující parametry: Tp teplota píku teplota odpovídající tání/tuhnutí převážného množství látky H teplo tání/tuhnutí, které odpovídá ploše vymezené píkem DSC křivky Počátek/konec teplotního efektu odpovídající pozici píku Vyhodnocen byl každý detekovaný ohřev i chlazení u píků znázorněných v grafu č. 1. Tabulka č. 6 - Kalorimetrické charakteristiky tání CH-Al PÍK PARAMETR 1. OHŘEV 2. OHŘEV 3. OHŘEV 1 Tp 1 ( C) 41,3 34,1 33,9 H 1 (J/g) 7,1 7,5 7,3 Počátek teplot. efektu ( C) Konec teplot. efektu ( C) 36,4 29,5 30,3 53,2 37,1 36,6 2 Tp 2 ( C) 151,2 150,1 150,1 H 2 (J/g) 65,5 59,9 59,8 Počátek teplot. efektu ( C) Konec teplot. efektu ( C) 148,2 144,5 145,2 153,8 152,9 152,9-30 -

31 Tabulka č. 7 - Kalorimetrické charakteristiky tuhnutí CH-Al PÍK PARAMETR 1. CHLAZENÍ 2. CHLAZENÍ 3. CHLAZENÍ 1 Tp 1 ( C) 126,1 128,5 125,1 H 1 (J/g) -51,7-51,4-50,0 Počátek teplot. efektu ( C) Konec teplot. efektu ( C) 126,4 128,7 125,4 124,3 126,3 123,0 2 Tp 2 ( C) 118,0 117,9 114,7 H 2 (J/g) -1,1-0,8-1,0 Počátek teplot. efektu ( C) Konec teplot. efektu ( C) 118,1 118,1 114,8 116,6 116,7 113,3 3 Tp 3 ( C) 14,9 14,5 neměřeno H 3 (J/g) -6,3-5,3 neměřeno Počátek teplot. efektu ( C) Konec teplot. efektu ( C) 17,6 16,9 neměřeno 11,3 10,9 neměřeno

32 V následujících grafech č jsou znázorněny průběhy DSC měření s detekovanými píky při ohřevech a chlazení jednotlivých vzorků. V této fázi byly pro všechna měření použity Cr-Ni ocelové kelímky. Šipkou jsou v grafech pro lepší přehlednost označeny malé píky. Graf č. 2 Souhrnný graf prvních ohřevů všech vzorků

33 Graf č. 3 Souhrnný graf druhých ohřevů všech vzorků

34 Graf č. 4 Souhrnný graf třetích ohřevů všech vzorků

35 Graf č. 5 Souhrnný graf čtvrtých ohřevů všech vzorků CH5CER5 uveden samostatně CH5CER5-35 -

36 Graf č. 6 Souhrnný graf pátých ohřevů všech vzorků CH4CER6 neměřen, CH5CER5 uveden samostatně CH5CER5-36 -

37 Graf č. 7 Souhrnný graf šestých ohřevů všech vzorků

38 Graf č. 8 Souhrnný graf sedmých ohřevů všech vzorků

39 Graf č. 9 Souhrnný graf prvního chlazení všech vzorků

40 Graf č. 10 Souhrnný graf druhého chlazení všech vzorků

41 Graf č. 11 Souhrnný graf třetího chlazení všech vzorků

42 Graf č. 12 Souhrnný graf čtvrtého chlazení všech vzorků CH5CER5 uveden samostatně CH5CER5-42 -

43 Graf č. 13 Souhrnný graf pátého chlazení všech vzorků CH4CER6 neměřen, CH5CER5 uveden samostatně CH5CER5-43 -

44 Graf č. 14 Souhrnný graf šestého chlazení všech vzorků

45 Graf č. 15 Souhrnný graf sedmého chlazení všech vzorků V následujících grafech č jsou znázorněny veškeré ohřevy i chlazení konkrétních vzorků. Křivky jsou vždy řazeny vzestupně podle toho, jak probíhaly jednotlivé fáze DSC měření. V tabulkách č jsou uvedeny hodnoty Tp píků, které byly detekovány během tání a tuhnutí jednotlivých vzorků. Hlavní, mohutné píky v dané oblasti, jsou označeny tučně

46 Graf č. 16 Souhrnný graf ohřevů vzorku CH1CER9 Tabulka č. 8 Tání vzorku CH1CER9 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,1 - II ,9 81,2 - III ,6 67,8 - IV ,1 60,8 - V ,2 65,0 - VI ,3 64,1 - VII ,5 63,

47 Graf č. 17 Souhrnný graf chlazení vzorku CH1CER9 Tabulka č. 9 Tuhnutí vzorku CH1CER9 s hodnotami Tp Detekované píky OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 59,6 46,4 60,0 61,8 58,1 39,7 36,3 2 27,1 29,3 44,5 46,9 41,7 13, ,9 35,7 36, ,

48 Graf č. 18 Souhrnný graf ohřevů vzorku CH2CER8 Tabulka č. 10 Tání vzorku CH2CER8 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,6 - II ,1 80,1 - III ,6 66,0 - IV ,8 60,8 - V ,4 59,9 - VI ,7 57,7 - VII ,2 60,

49 Graf č. 19 Souhrnný graf chlazení vzorku CH2CER8 Tabulka č. 11 Tuhnutí vzorku CH2CER8 s hodnotami Tp Detekované píky OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 57,7 49,9 59,0 56,1 37,5 43,8 35,8 2-30,2 47,3 42,9 28,3 37,8 24, ,3 30,7-25, ,

50 Graf č. 20 Souhrnný graf ohřevů vzorku CH3CER7 Tabulka č. 12 Tání vzorku CH3CER7 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,1 - II ,3 78,4 - III ,4 64,7 - IV. - 20,2 35,7 58,4 75,6 - V. - 24,5 32,9 56,7 74,7 - VI ,2 46,2 62,4 - VII. - 26,9 33,7 49,4 58,

51 Graf č. 21 Souhrnný graf chlazení vzorku CH3CER7 Tabulka č. 13 Tuhnutí vzorku CH3CER7 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 55,8 49,9 58,7 58,3 56,4 41,6 28,9 2 28,2 30,3 47,3 45,0 41,7 33, ,4 31,4 29,

52 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH4CER6 pátý ohřev vzorku neměřen Tabulka č. 14 Tání vzorku CH4CER6 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,6 90,5 - II ,7 - III ,4 64,5 - IV ,2 37,8 60,9 - V. neměřeno VI ,2 36,2 62,0 - VII ,4 36,3 59,

53 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH4CER6 páté chlazení vzorku neměřeno Tabulka č. 15 Tuhnutí vzorku CH4CER6 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 57,4 47,0 45,9 54,7 56,1 37,8 2 51,3 29,2 29,2 35,3 neměřeno 42,4 31, ,

54 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH5CER5-54 -

55 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH5CER5-55 -

56 Tabulka č. 16 Tání vzorku CH5CER5 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,7 88,9 - II ,1 106,8 III ,1 64,1 73,4 102,3 IV. - 35,7 61,0 73,9 99,0 - V. - 33,0 58,3 74,0 94,4 - VI. 25,6 45,4 64,7 79,0 96,3 - VII ,3 65,5 93,9 - Tabulka č. 17 Tuhnutí vzorku CH5CER5 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 54,7 49,8 46,1 55,5 38,5 53,9 36,8 2 49,5-29,6 43,6-41, ,

57 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH6CER4 Tabulka č. 18 Tání vzorku CH6CER4 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,6 90,9 122,9 II ,1 79,3 116,9 III ,6 42,0 74,2 113,4 IV ,4 62,6 109,7 V. - 23,8 33,9 56,3 74,4 106,5 VI ,9 59,3 78,5 106,2 VII ,5 76,7 104,9-57 -

58 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH6CER4 Tabulka č. 19 Tuhnutí vzorku CH6CER4 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 69,7 60,6 47,3 45,0 39,9 52,9 36,3 2 60,2 50,9 30,0 29,5-40,1-3 50,9 28,

59 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH7CER3 Tabulka č. 20 Tání vzorku CH7CER3 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,0 89,2 129,5 II ,9 79,8 126,3 III ,1 76,3 124,7 IV ,1 65,2 73,5 123,9 V ,9 64,2 122,0 VI. - 22,1 36,7 59,8 78,4 119,9 VII. - 26,0 34,6 57,2 77,6 118,3-59 -

60 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH7CER3 Tabulka č. 21 Tuhnutí vzorku CH7CER3 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 93,0 82,7 79,2 71,9 62,2 68,1 54,4 2 61,2 54,4 50,6 46,1 41,7 60,0 40, ,5-44,5 26, ,

61 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH8CER2 Tabulka č. 22 Tání vzorku CH8CER2 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,0 88,5 138,0 II ,0 81,8 135,6 III ,3 79,5 134,7 IV ,9 78,1 130,6 V ,9 74,1 129,7 VI ,9 64,1 130,6 VII ,9 61,2 129,7-61 -

62 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH8CER2 Tabulka č. 23 Tuhnutí vzorku CH8CER2 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII ,0 104,6 100,2 94,5 89,1 94,2 87,4 2 64,2 58,4 54,2 44,4 42,9 60,3 54,3 3 6,9 5,7 4, ,0 39, ,

63 Graf č. 32 Souhrnný graf ohřevů vzorku CH9CER1 Tabulka č. 24 Tání vzorku CH9CER1 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH/CER Detekované píky - Tp ( C) I ,6 86,8 143,8 II ,9 80,1 143,0 III ,6 78,8 142,7 IV ,8 77,4 142,3 V ,4 75,7 141,8 VI ,3 74,8 141,8 VII ,7 72,8 141,4-63 -

64 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH9CER1 Tabulka č. 25 Tuhnutí vzorku CH9CER1 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CH/CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII ,5 118,1 112,6 116,7 114,7 113,3 114,6 2 63,3 60,8 56,6 54,2 48,5 46,8 47,6 3 10,0 8,9-8,9-7,

65 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CH10 Tabulka č. 26 Tání vzorku CH10 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CH Detekované píky - Tp ( C) I ,6 151,3 II ,9 150,9 III ,6 150,7 IV ,1 151,8 V ,1 151,7 VI ,7 151,2 VII ,2 151,2-65 -

66 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CH10 Tabulka č. 27 Tuhnutí vzorku CH10 s hodnotami Tp Detekované píky OBLAST TUHNUTÍ CH - Tp ( C) Chlazení č ,9 124,1 124,2 127,4 121,9 124,5 122,2 2 12,7 12,2 12,6 11,2-12,

67 Graf č Souhrnný graf ohřevů vzorku CER10 Tabulka č. 28 Tání vzorku CER10 s hodnotami Tp OHŘEV OBLAST TÁNÍ CER Detekované píky - Tp ( C) I ,0 II ,0 82,0 III ,0 68,0 IV ,0 65,2 V ,3 66,1 VI ,0 53,4 66,1 VII ,4 54,0 65,6-67 -

68 Graf č Souhrnný graf chlazení vzorku CER10 Tabulka č. 29 Tuhnutí vzorku CER10 s hodnotami Tp OBLAST TUHNUTÍ CER - Tp ( C) Detekované píky Chlazení č. I. II. III. IV. V. VI. VII. 1 62,7 46,4 46,2 47,0 37,5 39,6 35,8 2 29,0 30,1-37,7-15, ,

69 Tabulka č. 30 znázorňuje tání CH při jednotlivých ohřevech. U vzorků, které vykazují na záznamu DSC velký cholesterolový pík, je uvedena hodnota Tp. Tabulka č. 30 Hodnoty Tp cholesterolových píků při ohřevech VZOREK OBLAST TÁNÍ CH - Tp ( C) OHŘEV I. II. III. IV. V. VI. VII. CH1CER CH2CER CH3CER CH4CER CH5CER5-106,8 102, CH6CER4 122,9 116,9 113,4 109,7 106,5 106,2 104,9 CH7CER3 129,5 126,3 124,7 123,9 122,0 119,9 118,3 CH8CER2 138,0 135,6 134,7 130,6 129,7 130,6 129,7 CH9CER1 143,8 143,0 142,7 142,3 141,8 141,8 141,4 CH10 151,3 150,9 150,7 151,8 151,7 151,2 151,2 CER

70 V tabulce č. 31 jsou uvedeny hodnoty H vybraných ohřevů vzorků. Pro výchozí suroviny, CH a pseudoceramid, jsou uvedeny hodnoty H i pro I., II. a III. ohřev. Tučně jsou zvýrazněny hodnoty H, kde do hodnocení byly zahrnuty i píky CH. Tabulka č. 31 Hodnoty H při ohřevech VZOREK HODNOTY H IV. - VII. OHŘEVŮ (J/g) IV. V. VI. VII. CH1CER9 106,9 108,7 109,5 108,7 CH2CER8 71,5 79,1 110,7 111,5 CH3CER7 93,5 95,5 86,4 85,7 CH4CER6 62,7 neměřeno 87,7 83,9 CH5CER5 CH6CER4 CH7CER3 CH8CER2 CH9CER1 CH10 60,3 74,7 35,2 50,9 32,9 54,9 25,7 40,2 5,1 44,8 nevyhodnotitelné 48,3 60,6 32,1 44,1 28,2 46,9 24,2 40,4 6,1 44,7 40,8 47,9 39,7 59,8 24,7 34,3 23,1 66,4 6,9 59,4 29,9 38,6 40,9 59,1 21,2 29,7 21,3 58,9 6,9 59,4 CER10 105,0 105,0 86,0 90,7 VZOREK HODNOTY H I. - III. OHŘEVŮ (J/g) I. II. III. CH10 6,9 64,7 6,2 59,9 6,2 59,9 CER10 167,2 135,9 110,2-70 -

71 Tato práce je zaměřena na hodnocení teplotních charakteristik směsí CH a pseudoceramidu. CH a CER tvoří až % obsahu lipidické vrstvy ve SC. Pseudoceramid 14S24 je synteticky připravený analog přírodního CER, který by v pokusech in vitro mohl nahradit přirozený CER, jehož pořizovací cena je značně vysoká. Na tuto práci bude navazovat následující, ve které bude zkoumána možnost hydratace této lipofilní směsi za účelem přípravy lipidické membrány. Tyto membrány se připravují tak, že se směs lipidických látek hydratuje opakovaným zahříváním a chlazením s vodou. Počet opakovaných cyklů zahřívání a chlazení je značný. Z tohoto důvodu nás zajímá chování těchto lipidických látek při opakovaných ohřevech a chlazení. Pokud jsou charakterizovány výchozí suroviny, tak se většinou udává pouze první a druhý ohřev. Na základě těchto údajů však není možné posoudit, zda teplotní změny, ke kterým ve vzorcích dochází, jsou způsobeny přítomností vody, nebo opakovaným zahříváním a chlazením vzorku. V první fázi jsme se zaměřili na charakterizaci chování CH po teplotní zátěži. U této látky je v literatuře uváděna přítomnost dvou píků při ohřevu. Hlavní, mohutný pík, kdy dochází k tání látky, je uváděn při teplotách okolo 150 C. Kromě tohoto mohutného píku však řada autorů uvádí ještě existenci velmi malého píku při teplotě kolem 37 C. V první části jsme se tedy zaměřili na to, zda se při opakovaných ohřevech a chlazení na záznamu DSC projeví existence tohoto malého píku. První měření bylo provedeno v hliníkových kelímcích. Záznam o průběhu měření spolu s výsledky je uveden v grafu č. 1. Výřez ze záznamu DSC, týkající se prvního (malého) píku, je znázorněn v grafu č. 1 c). Ze záznamu je patrné, že při všech ohřevech měřící zařízení zaznamenává existenci tohoto píku, přičemž teplota tání a průběh tání je u druhého a třetího ohřevu shodný. Totéž můžeme konstatovat pro velký (hlavní) pík, charakterizující teplotu tání CH. Na grafech č. 1 e) g) jsou uvedeny záznamy chlazení. Z těchto záznamů lze konstatovat, že ke krystalizaci nedochází vždy při stejné teplotě, nicméně rozdíly jsou malé (pouze v jednotkách C). Na následující tání vzorku tyto rozdíly nemají žádný vliv. V tabulkách č. 6 a 7 jsou uvedeny kalorimetrické charakteristiky vzorku CH-Al. V závěru této části můžeme konstatovat, že námi použité zařízení je schopno zaregistrovat existenci všech teplotních změn, které u CH během všech tání a chlazení probíhají. Následující část byla zaměřena na zjištění chování jedenácti vzorků různého složení, které obsahovaly CH a pseudoceramid. Přesné složení vzorků je uvedeno v tabulce č. 2 a 3. Při vlastní prezentaci uvádíme grafy tání a tuhnutí. Hodnoty Tp jsou uvede

72 ny až následně v samostatných tabulkách, protože některé píky jsou značně rozsáhlé a skládají se z několika maxim. Vzorky byly opakovaně zahřívány a chlazeny podle teplotního režimu uvedeného v tabulkách č. 4 a 5. Nejprve byl vzorek třikrát zahříván a chlazen, potom byl ponechán zhruba dva dny v klidu, pak opět zahříván a chlazen, tentokrát dvakrát, přičemž druhé chlazení probíhalo jinou rychlostí. Poté následovala opět pauza dvou až tří dnů, přičemž ve třetím cyklu byl vzorek zahříván a chlazen za stejných podmínek jako v cyklu druhém. Z tohoto důvodu je možné na grafech č porovnávat teplotní charakteristiky ohřevů (i chlazení) jednotlivých vzorků, které byly prováděny za shodných podmínek. Hodnotíme změny během prvních tří ohřevů. Dále můžeme porovnávat změny mezi 4. a 6. ohřevem a také mezi 5. a 7. ohřevem. U všech vzorků předpokládáme, že při prvních ohřevech bude zcela shodný pík tání komponenty s nejnižší teplotou tání, tedy pseudoceramidu. Chování CH nelze předem určit. CH se může např. v tavenině rozpouštět. V tomto případě na záznamu DSC nebude vidět cholesterolový pík. Na grafech č je znázorněno tání a tuhnutí všech vzorků při konkrétním pořadí ohřevů. U prvních ohřevů vidíme u všech vzorků shodný pík pro pseudoceramid. Přítomnost píků, typických pro CH, již závisí na složení vzorků. U druhých ohřevů i třetích jsou na těchto přehledných grafech poměrně dobře vidět změny hodnot Tp pro píky v oblasti tání pseudoceramidu. Porovnáme-li ale hodnoty Tp uvedené u jednotlivých vzorků, vidíme, že tyto rozdíly nejsou příliš velké. U třetích ohřevů je stále ještě vidět separátní malý pík, typický pro tání CH, při teplotách kolem 35 C (viz graf č. 4). Od čtvrtého ohřevu výše se počátek procesu tání pseudoceramidu posouvá do nižších teplotních pásem tak, že zasahuje již do oblasti tání tohoto malého píku CH, který již na záznamu není zcela oddělený. U tohoto malého cholesterolového píku můžeme stále vyhodnotit hodnotu Tp, ale bez speciálního vyhodnocovacího programu již nemůžeme rozdělit hodhoty H příslušné pro pseudoceramid a tento malý pík. Hodnocení vzorku CH1CER9. Výsledky měření jsou uvedeny v grafech č. 16 a 17 a tabulkách č. 8 a 9. U všech ohřevů není na záznamech velký pík tání patřící CH. Rovněž u chlazení není na záznamech hlavní pík tuhnutí patřící CH. To svědčí o tom, že v tomto množství se CH v tavenině pseudoceramidu rozpouští. Od druhého tání je vidět malý pík CH při teplotách okolo 30 C. Z toho vyplývá, že v tomto složení se v tavenině obě komponenty mísí, v tuhém stavu však krystaluje i samotný CH (viz graf č

73 malý pík). Při ohřevu dochází k největším změnám v teplotních charakteristikách v průběhu prvních čtyř ohřevů. Od čtvrtého ohřevu se tyto charakteristiky výrazně nemění. Hodnocení vzorku CH2CER8. Výsledky měření uvádíme v grafech č. 18, 19 a tabulkách č. 10, 11. Na záznamech v grafu č. 18 chybí rovněž velký pík tání CH. Z toho důvodu opět můžeme konstatovat, že v této koncentraci se CH v pseudoceramidu rozpouští. Samostatně z taveniny nekrystaluje (viz graf č. 19). Krystaluje, až když se mění koncentrace vzorku v průběhu krystalizace pseudoceramidu. Z tohoto důvodu pozorujeme od druhého ohřevu malý pík, typický pro CH v oblasti kolem 30 C. Výrazné změny u vzorku jsou mezi prvním až čtvrtým ohřevem. Po čtvrtém ohřevu se teplotní charakteristiky vzorku dále výrazně neliší. Hodnocení vzorku CH3CER7. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 20 a 21 a tabulce č. 12, 13. Na záznamech není viditelný pík tání CH. Ten se opět zřejmě rozpouští v tavenině pseudoceramidu. Při tuhnutí vzorku není na záznamu zřetelná krystalizace CH. Zřejmě krystaluje až při tuhnutí pseudoceramidu, protože od druhého tání je na záznamech patrný malý pík, charakteristický pro CH. K největším změnám ve vzorku dochází během prvních čtyř ohřevů. Od čtvrtého ohřevu se již vzorek významně nemění. Hodnocení vzorku CH4CER6. Výsledky jsou uvedeny v grafu č. 22, 23 a tabulkách č. 14, 15. Na záznamech chybí pík tání i krystalizace CH u všech ohřevů i chlazení. Opět dochází k jeho rozpouštění. Při opakovaných ohřevech je však vidět slabý, malý pík, typický pro CH. K největším změnám dochází mezi prvním až čtvrtým ohřevem. Od čtvrtého ohřevu se vzorek nemění. Hodnocení vzorku CH5CER5. Výsledky jsou uvedeny v grafu č. 24 a 25 a tabulkách č. 16 a 17. U tohoto vzorku jsme z důvodu nastavení vstupních parametrů na přístroji nemohli znázornit všechny ohřevy v jednom grafu. Proto jsou jednotlivé cykly znázorněny separátně. Na záznamech není viditelný pík tání a krystalizace samotného CH. Na rozdíl od nižších koncentrací CH ve vzorku se nám ale na grafech objevují nižší píky s teplotou tání kolem 100 C. Na základě toho usuzujeme, že i u tohoto vzorku se CH rozpouští v tavenině pseudoceramidu, ale pravděpodobně již začíná samostatně krystalovat v oblasti tuhnutí pseudoceramidu. Jakmile z taveniny začne tuhnout pseudoceramid, mění se její složení. V tavenině se zvyšuje procentuální podíl CH a tento přestává být v dané koncentraci již rozpustný a začíná krystalovat. Toto se projeví při následujících ohřevech jako teplotní efekt při teplotách nad 100 C. Zřejmě se již blížíme k hranici rozpustnosti (vyšší koncentrace by se již nemusely rozpouštět). K největším

74 rozdílům zde dochází během prvních tří ohřevů. Od čtvrtého ohřevu se hodnoty již výrazně neliší. Hodnocení vzorku CH6CER4. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 26 a 27 a tabulkách č. 18, 19. U všech ohřevů jsou na DSC záznamu viditelné píky tání pseudoceramidu i CH. U tuhnutí opět nevidíme pík samostatného CH. K největším změnám dochází u vzorku v průběhu prvních čtyř ohřevů. Hodnocení vzorku CH7CER3. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 28, 29 a tabulkách č. 20 a 21. U toho vzorku jsou viditelné u všech ohřevů píky tání pseudoceramidu a oblasti teplotního efektu spojené s přeměnou CH. Veškeré množství CH se v této koncentraci nerozpouští. Při ochlazování vzorku CH z taveniny krystaluje samostatně (viz graf č. 29). Vzhledem k tomu, že samotný CH tuhne při teplotách kolem 124 C a hodnoty Tp se u toho vzorku pohybují v rozmezí C pro cholesterolovou oblast, může se jednat o tvorbu směsných krystalů tvořených CH a pseudoceramidem. Toto ovšem na základě údajů DSC nelze potvrdit ani vyvrátit. Může se rovněž jednat i o krystalizaci z důvodu snížení rozpustnosti CH v chladnější tavenině. K největším změnám u vzorku dochází během prvních čtyř ohřevů. Hodnocení vzorku CH8CER2. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 30, 31 a tabulkách č. 22 a 23. Při ohřevu tohoto vzorku jsou oddělené píky tání příslušné CH i pseudoceramidu při všech ohřevech. Veškeré množství CH se v této koncentraci nerozpouští. CH krystalizuje samostatně. Největší změny jsou patrné během prvních čtyř ohřevů. Hodnocení vzorku CH9CER1. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 32, 33 a tabulkách č. 24, 25. Při všech ohřevech jsou zřetelné píky teplotních efektů CH i pseudoceramidu. CH ve všech případech krystaluje samostatně s hodnotou teploty tuhnutí, která je blízká teplotě tuhnutí CH. Srovnáme-li teplotu tuhnutí samostatného CH (viz graf č. 35 a tabulka č. 27) a teploty tuhnutí, při kterých krystaluje CH v tomto vzorku, jsou téměř shodné. Změny teploty tání pseudoceramidu jsou podstatně menší než u vzorků s nižší koncentrací CH. Hodnocení vzorku CH10. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 34, 35 a tabulkách č. 26 a 27. V grafu č. 34 je znázorněn průběh tání samotného CH. Následně v grafu č. 35 tuhnutí CH při ochlazování taveniny. CH při zahřívání taje, při ochlazování kompletně tuhne. Následující ohřevy mají stejné hodnoty Tp. Hodnocení vzorku CER10. Výsledky jsou uvedeny v grafech č. 36 a 37 a tabulkách č. 28, 29. V grafu č. 36 je znázorněn průběh tání pseudoceramidu v závislosti

75 na pořadí opakovaných ohřevů. V průběhu prvních tří ohřevů se výrazně nemění charakter tání. Dochází pouze ke snižování hodnot Tp. Čtvrtý ohřev a následující pak vykazují oproti předchozím výraznou změnu. Pík tání je plochý, vzorek taje v širokém teplotním rozmezí, i když hodnoty Tp se výrazně nemění. Na záznamu tuhnutí je vidět, že počátek tuhnutí v podstatě nezávisí na pořadovém čísle ohřevu. Po prvním ohřevu jsou však píky krystalizace více ploché. K výrazným změnám ve vzorku dochází až po třetím ohřevu. Uspořádání našich pokusů předpokládalo zahřívání vzorku na vysokou teplotu 175 C. Tuto teplotu jsme volili proto, abychom zjistili, zda dochází u vzorků k samostatné krystalizaci CH. Z našich závěrů proto nemůžeme usuzovat, k jakým změnám by u pseudoceramidu docházelo, pokud by byl vzorek zahříván na teploty nižší. Na záznamech DSC ovšem není vidět u žádného vzorku zahřívaného do 175 C jeho rozklad. V tabulce č. 30 jsou uvedeny hodnoty Tp velkých cholesterolových píků pro všechny ohřevy. Z tohoto jednoduchého přehledu vyplývá, že do koncentrace 50 mol% (vzorek CH5CER5) se CH v roztaveném pseudoceramidu rozpouští. Ve všech vyšších koncentracích pak u všech ohřevů již pozorujeme píky teplotních změn, ke kterým u CH dochází. Pro eventuální další přípravu hydratovaných směsí by tedy koncentrace CH5CER5 byla nejvyšší možná, protože při vyšších koncentracích by ve vzorcích již byl přítomen cholesterol monohydrát, jehož píky, představující dehydrataci, by se kryly s píky hydratovaných směsí. V tabulce č. 31 jsou uvedeny hodnoty H pro čtvrté až sedmé ohřevy všech vzorků. Hodnoty H jsou souhrnné hodnoty všech píků na záznamu DSC křivky. Pro výchozí suroviny pseudoceramid a CH uvádíme hodnoty H prvních, druhých i třetích ohřevů. Vzhledem k tomu, že některé píky nebylo možné od sebe oddělit, nelze na základě těchto údajů určit žádný zásadní závěr

76 6 ZÁVĚR 1. Opakované zahřívání a chlazení nemá vliv na teplotní charakteristiky CH. 2. Opakované zahřívání pseudoceramidu na teplotu 175 C má vliv na průběh tání této látky. 3. Do koncentrace 50 mol% se CH v tavenině pseudoceramidu rozpouští. 4. Od čtvrtých ohřevů se výrazně nemění průběh tání vzorků. 5. Závěry této práce je možné vztahovat pouze na vzorky, které byly zahřívány na teplotu tání komponenty s nejvyšší teplotou tání (tedy CH). Chování vzorků zahřívaných na nižší teplotu je dále potřeba experimentálně ověřit

77 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] ČIHÁK, R., DRUGA, R., GRIM, M. Anatomie 3. Druhé, upravené a doplněné vydání. Praha: Grada, ISBN X [2] ŠTORK, J., et al. Dermatovenerologie. Praha: Galén, Karolinum, ISBN (Galén), ISBN (Karolinum) [3] LAI-CHEONG, J. E., McGRATH, J. A. Structure and function of skin, hair and nails. Medicine [online]. 2009, roč. 37, č. 5, s [vid ]. Dostupné z: [4] BOLZINGER, M. A., BRIANÇON, S., PELLETIER, J., et al. Penetration of drugs through skin, a complex rate-controlling membrane. Current Opinion in Colloid & Interface Science [online]. 2012, roč. 17, č. 3, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.cocis [5] HRABÁLEK, A., VÁVROVÁ, K. Lze překonat kožní bariéru? Praktické lékárenství. 2005, roč. 1, s [6] GLOMBITZA, B., MÜLLER-GOYMANN, C. C. Influence of different ceramides on the structure of in vitro model lipid systems of the stratum corneum lipid matrix. Chemistry and Physics of Lipids [online]. 2002, roč. 117, č. 1-2, s [vid ]. Dostupné z: [7] GARIDEL, P., FÖLTING, B., SCHALLER, I., et al. The microstructure of the stratum corneum lipid barrier: Mid-infrared spectroscopic studies of hydrated ceramide:palmitic acid:cholesterol model systems. Biophysical Chemistry [online]. 2010, roč. 150, č. 1-3, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.bpc [8] JANŮŠOVÁ, B., ZBYTOVSKÁ, J., LORENC, P., et al. Effect of ceramide acyl chain length on skin permeability and thermotropic phase behavior of model stratum

78 corneum lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta [online]. 2011, roč. 1811, č. 3, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.bbalip [9] MOSS, G. P., WILKINSON, S. C., SUN, Y. Mathematical modelling of percutaneous absorption. Current Opinion in Colloid & Interface Science [online]. 2012, roč. 17, č. 3, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.cocis [10] STAHL, J., NIEDORF, F., KIETZMANN, M. Characterisation of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics [online]. 2009, roč. 72, č. 2, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.ejpb [11] MAGHRABY, G. M., BARRY, B. W., WILLIAMS, A. C. Liposomes and skin: From drug delivery to model membranes. European Journal of Pharmaceutical Science [online]. 2008, roč. 34, č. 4-5, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.ejps [12] CHARALAMBOPOULOU, G. CH., STERIOTIS, TH. A., HAUSS, TH., et al. Structural alterations of fully hydrated human stratum corneum. Physica B: Condensed Matter [online]. 2004, roč. 350, č. 1-3, s. E603-E606 [vid ]. Dostupné z: doi: /j.physb [13] PINTO, S. N., SILVA, L. C., FUTERMAN, A. H., et al. Effect of ceramide structure on membrane biophysical properties: The role of acyl chain length and unsaturation. Biochimica et Biophysica Acta [online]. 2011, roč. 1808, č. 11, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.bbamem [14] JAGER, M. W., GOORIS, G. S., DOLBNYA, I. P., et al. Novel lipid mixtures based on synthetic ceramides reproduce the unique stratum corneum lipid organization. Journal of Lipid Research [online]. 2004, roč. 45, s [vid ]. Dostupné z: doi: /jlr.M JLR

79 [15] VÁVROVÁ, K., HRABÁLEK, A., MAC-MARY, S., et al. Ceramide analougue 14S24 selectively recovers pertubed human skin barier. British Journal of Dermatology [online]. 2007, roč. 157, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j x [16] VÁVROVÁ, K., ZBYTOVSKÁ, J., PALÁT, K., et al. Ceramide analogue 14S24 ((S)-2-tetracosanoylamino-3-hydroxypropionic acid tetradecyl ester) is effective in skin barrier repair in vitro. European Journal of Pharmaceutical Science [online]. 2004, roč. 21, č. 5, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.ejps [17] RÓG, T., PASENKIEWICZ-GIERULA, M. Cholesterol Effects on the Phosphatidylcholine Bilayer Nonpolar Region: A Molecular Simulation Study. Biophysical Journal [online]. 2001, roč. 81, č. 4, s [vid ]. Dostupné z: [18] RÓG, T., PASENKIEWICZ-GIERULA, M., VATTULAINEN, I., et al. Ordering effects of cholesterol and its analogues. Biochimica et Biophysica Acta [online]. 2009, roč. 1788, č. 1, s [vid ]. Dostupné z: doi: /j.bbamem [19] OHVO-REKILÄ, H., RAMSTEDT, B., LEPPIMÄKI, P., et al. Cholesterol interactions with phospholipids in membranes. Progress in Lipid Research [online]. 2002, roč. 41, č. 1, s [vid ]. Dostupné z: [20] MANN, R. K., BEACHY, P. A. Cholesterol modification of proteins. Biochimica et Biophysica Acta [online]. 2000, roč. 1529, č. 1-3, s [vid ]. Dostupné z: [21] BACH, D., WACHTEL, E. Phospholipid/cholesterol model membranes: formation of cholesterol crystallites. Biochimica et Biophysica Acta [online]. 2003, roč. 1610, č. 2, s [vid ]. Dostupné z: doi: /S (03)