UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Studijní obor: Molekulární biologie BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Vliv jednobodových mutací hemaglutininu na patogenní potenciál chřipkového viru Lucie Nitkulincová Školitel: RNDr. Alena Morávková, Ph.D. 2011/2012

2 Prohlašuji tímto, že jsem bakalářskou práci na téma Vliv jednobodových mutací hemaglutininu na patogenní potenciál chřipkového viru vypracovala samostatně s použitím odborné literatury a zdrojů uvedených v seznamu použité literatury. V Praze, dne... 1

3 Děkuji své školitelce RNDr. Aleně Morávkové PhD., za cenné rady, korektury a pomoc při zpracování bakalářské práce. 2

4 Obsah: Seznam použitých zkratek...4 Abstrakt Úvod Mutace Vznik Členění Chřipkový virus Proteinové složení Životní cyklus viru Vstup viru do buňky Transkripce, translace a replikace viru Formování a maturace nových virionů Pandemický potenciál Antigenní drift Antigenní shift Chřipkové pandemie Hemaglutinin Složení a struktura Role v cyklu viru Bodové mutace ovlivňující virulenci Léčba DRACO Závěr Seznam použité literatury

5 Seznam použitých zkratek: AK amino acid aminokyselina CS cleavage site místo štěpení dsrna double-stranded RNA dvouřetězcová RNA DRACO Double-stranded RNA dsrna aktivovaný Activated kaspázový Caspase Oligomerizer oligomerizér eif-2α eukaryotic translation eukaryotický initiation factor 2 iniciační faktor 2 ER endoplasmic reticulum endoplasmatické retikulum ESI electrospray ionization mass elektrosprejová ionizační spectrometry spektrometrie GA Golgi apparatus Golgiho aparát GAL galactose galaktóza GFP green fluorescent protein zelený fluorescenční protein H hemaglutinin hemaglutinin HIT hemaglutination inhibition hemaglutinačně inhibiční test test IVPI intravenous pathogenicity nitrožilní index patogenity index kda kilodalton kilodalton MAPK mitogen activated mitogenem aktivované protein kinases protein kinázy MDCK cells Madin-Darby canine buňky psích ledvin kidney cells MS/MS tandem mass spectrometry tandemová hmotnostní spektrometrie N neuraminidase neuraminidáza NEP nuclear export protein jaderný exportní protein NLS nuclear localization signal jaderný lokalizační signál NMR Nuclear magnetic nukleární magnetická resonance rezonance 4

6 OIE World organization for Světová organizace pro zdraví animal health zvířat PKC protein kinase C protein kináza C PKR protein kinase protein kináza R RNA-activated (R) PMF peptide mass fingerprinting metoda peptidového mapování RBS receptor binding site receptor vazebné místo SA sialic acid sialová kyselina SNARE soluble NSF attachment SNAP receptor protein receptor SRP signal recognition particle signál rozpoznávající částice ssrna single-stranded RNA jednořetězcová RNA TMD transmembrane domain transmembránová doména vrna viral RNA virová RNA vrnp viral ribonucleoprotein virový ribonukleoprotein WHO World Health Světová zdravotnická Organization organizace 5

7 Abstrakt Chřipkový virus v posledních letech vzbudil hned několikrát celosvětové obavy ze vzniku pandemie. Nejzávažnějším problémem v boji proti tomuto viru je jeho schopnost neobvykle rychle měnit antigenní specifitu jednak přeskupením genových segmentů, jednak pomocí bodových mutací, a to především v povrchových glykoproteinech hemaglutininu a neuraminidáze. V této práci jsem se zaměřila na bodové mutace zasahující hemaglutinin chřipkového viru, které způsobují změnu vazebné preference. Tato změna následně umožňuje chřipkovému viru jednak přenos mezi různými hostiteli a také neomezené šíření v jejich tkáních. Neustálá změna aminokyselinové sekvence a tím i povrchu hemaglutininu také do značné míry znemožňuje imunitnímu systému hostitele virus efektivně zlikvidovat a dostatečně rychle rozpoznat při další nákaze. Každý ze subtypů hemaglutininu má ovšem jiné pozice aminokyselin ovlivňující jeho vazebnou preferenci. Jejich souhrn je obsažen v této práci. Klíčová slova: chřipka, jednobodové mutace, pandemie, patogenita, hemaglutinin Abstract Influenza virus caused several times the global concerns about the emergence of pandemics, in recent years. The most serious problem, in the fight against this virus, is its ability to quickly change its unusually antigenic specificity by reassortment and point mutations, especially in surface glycoproteins - haemagglutinin and neuraminidase. In this thesis I focused on point mutations in the hemagglutinin of influenza virus causing change in binding preference, which enables both influenza virus transmission between different hosts and unlimited proliferation in their tissues. The permanent change in amino acid sequence and thus the surface of hemagglutinin also largely prevents the host's immune system to destroy the virus efficiently and quickly enough to recognize when another infection. Each of the haemagglutinin subtypes has a different amino acid positions affecting its binding preference. Their summary is included in this thesis. Key words: influenza, single nucleotide mutations, pandemia, patoghenicity, hemagglutinin 6

8 1. Úvod Chřipkové onemocnění je mnohdy bagatelizováno a vnímáno pouze jako každoroční nepříjemná záležitost postihující především malé děti a seniory. Je tomu tak hlavně ve vyspělých zemích, kde lidé nejsou v dostatečně úzkém kontaktu s hospodářskou drůbeží a dobytkem, a kde je relativně velmi dobrá dostupnost lékařské pomoci. Dalším důvodem tohoto mylného vnímání je častá záměna onemocnění způsobeného chřipkovým virem, tedy chřipky, za onemocnění, která jsou způsobena jinými viry. Tyto viry se vyskytují ve shodném ročním období, ale průběh onemocnění je ve srovnání s chřipkovým virem mnohem mírnější, vyvolávají nachlazení či rýmu patří mezi ně např. Rhinovirus či Adenovirus (WHO, 2010). Jak dokládají historické záznamy, chřipka je velmi závažným onemocněním, na jehož následky každoročně zahyne několik set tisíc lidí po celém světě (Tumpey and Belser, 2009). Během pandemií, které jsou ve většině případů způsobeny nově adaptovanou formou viru, jde dokonce až o miliony lidských životů (Batakova, 2007). A právě vzniku těchto pandemických událostí lze přímo zabránit nebo přinejmenším výrazně snížit jejich dopad, pouze důkladným prostudováním životního cyklu chřipkového viru a jeho interakcí s hostitelskými buňkami. Tyto znalosti následně umožňují výrobu účinných vakcín a také predikci vzniku nových pandemií. Jedním z důvodů, proč proti chřipkovým virům neexistuje jednotná vakcína, zabraňující každoročnímu propuknutí onemocnění, je existence bodových mutací v povrchovém glykoproteinu chřipkového viru hemaglutininu, a tím i vznik variant viru rezistentních, vůči vakcíně (Boltz et al., 2010). Bodové mutace neustále mění strukturu tohoto, povrchového antigenu a neumožňují tak imunitnímu systému hostitele produkovat protilátky, účinné při dalším setkání s virem. Díky tomuto jevu tedy není, při použití současných metod, možné vyvinout vakcínu, která by byla účinná vůči všem subtypům chřipkového viru cirkulujícím mezi obyvatelstvem. Chřipkový virus nenapadá pouze člověka, ale i široké spektrum dalších savců a ve velké míře také ptactvo (Baigent and McCauley, 2003). Tento velmi rozsáhlý přirozený rezervoár chřipkových virů, převážně kmene A, je základem pro vznik antigenního shiftu (viz ), který ještě více komplikuje vědcům a lékařům již tak složité předpovědi sezónního i pandemického vývoje chřipkového onemocnění. V této práci shrnuji dosavadní známé poznatky o vlivu jednobodových mutací hemaglutininu na vznik pandemického potenciálu chřipkového viru. 7

9 2. Mutace Mutacemi v úzkém slova smyslu nazýváme změny vnukleotidových sekvencích nukleových kyselin, které jsou fixovány a následně přeloženy do sekvence aminokyselin v peptidech. Příliš častý vznik mutací by byl pro buňku i celý organizmus letální, zároveň je však nenulový vznik mutací nezbytným zdrojem variability, ze které přírodním výběrem projdou pouze mutace výhodné pro daný organizmus, v daném prostředí. Vzhledem k velmi dlouhému evolučnímu vývoji všech organizmů na Zemi přítomných, mají mutace většinou negativní vliv na funkci proteinu, přeloženého z mutovaného genu. V případě virů však vzhledem k chybějící reparační schopnosti virových polymeráz a značné nadprodukci potomstva dochází k rychlejšímu vzniku a fixaci, pro virus, pozitivních mutací (Snustad, 2009) Vznik Mutace mohou vznikat jak indukovaně po působení fyzikálními či chemickými mutageny, tak spontánně. Spontánní vznik mutací je způsoben především navázáním špatné dusíkaté báze např. vlivem keto/enol (v případě tyminu a guaninu) a amino/imino (v případě cytozinu a adeninu) formy. Díky těmto tautomerním přesmykům může dojít k párování AC a GT. Pokud k tomu dojde při replikaci, v následujícím cyklu replikace dojde k záměně párů bází AT za GC, případně GC za AT (Brown et al., 1986). Dalším zdrojem mutací může být nesprávný průběh meiózy (nondisjunkce), především pak poruchy funkce dělícího vřeténka a centromery, tímto způsobem vznikají hlavně aneuploidie (viz. 2.2.). Četnost vzniku spontánních mutací je podpořena nedostatečnými či, v případě virů, chybějícími opravnými schopnostmi enzymů a přesností mechanizmu replikace nukleové kyseliny. U prokaryot se rychlost vzniku spontánních mutací odhaduje na , u eukaryot na nukleotidový pár za generaci (Snustad, 2009) Členění Mutace můžeme rozdělit do několika skupin podle různých hledisek. Mutace v širším slova smyslu lze rozdělit na genomové, chromozomové a bodové. Mezi genomové mutace řadíme polyploidie, tedy přítomnost nadpočetné sady chromozomů a aneuploidie zahrnující zmnožení či ztrátu chromozomu. Aneuploidie můžeme dále dělit na nulizomie (ztráta chromozomového páru), monozomie (ztráta některého chromozomu z karyotypu diploidního organizmu) a trizomie (nadpočetný chromozom v karyotypu diploidního organizmu). Mezi chromozomové mutace patří delece (ztráta), inzerce (vložení), duplikace (zdvojení), inverze (převrácení o 180 ) a translokace (přemístění) části chromozomu. V této 8

10 práci se budu podrobněji zabývat mutacemi bodovými, mezi které řadíme změny na úrovni párů bází substituce (transice, transverze) a posunové mutace (inzerce a delece) způsobující svým vznikem posun čtecího rámce. Při tautomerním přesmyku (viz. 2.1.) může dojít k záměně purinové báze za jinou purinovou bázi (respektive pyrimidinové báze za pyrimidinovou bázi), takovouto záměnu pak označujeme jako tranzici, nebo k záměně purinové báze za pyrimidinovou bázi (či naopak) transverze (Natarajan, 2002; Snustad, 2009). Obr.1: Znázornění členění chromozomových mutací. Převzato z Wikimedia (2012) Díky degenerovanosti genetického kódu však záměna nukleotidu nemusí nutně znamenat zařazení špatné aminokyseliny. Podle projevu ve výsledném proteinu tedy rozlišujeme tzv. mutace neměnící smysl, mutace neutrální a mutace měnící smysl. Mutace beze změny smyslu má za následek změnu kodonu, který ale kóduje tutéž AK jako kodon nemutovaný. Mutace neutrální sice způsobí změnu AK, ale tato aminokyselina bude mít velmi podobné strukturní i funkční vlastnosti (např. záměna leucinu za izoleucin). Nejvážnější rizikem pro organizmus jsou mutace měnící smysl, kdy se kodon buď změní na jeden ze STOP kodonů (UGA, UAG, UAA) nebo mutace v kodonu způsobí záměnu aminokyseliny za velmi odlišnou AK (např. leucin za fenylalanin). Častěji mutovanými úseky genů jsou ty, u nichž se výsledný úsek proteinu přímo nepodílí na jeho funkci, případně geny duplikované. Úseky, na nichž funkce proteinu přímo závisí, jsou mnohem konzervovanější a mutace v nich jsou velmi často letální. Takovouto závislost najdeme i ve vazebných místech řady proteinů, včetně hemaglutininu nebo uvnitř 9

11 iontového kanálu, jehož selektivita je dána přímo interakcemi AK uvnitř kanálu s procházejícími molekulami. Dalším ze základních dělení je rozdělení na mutace somatické a gametické. Somatické mutace postihují pouze somatické buňky, mutovaný genotyp tedy získají pouze buňky následně z této mutanty vzniklé. Pro evoluční vývoj jsou mnohem cennější mutace gametické vzniklé v zárodečné linii buněk, které se mohou projevit u potomků daného organizmu u diploidních organizmů v případě dominantní mutace u heterozygota i homozygota a v případě recesivní mutace pouze u homozygota (Snustad, 2009; Stone et al., 2011). 3. Chřipkový virus Chřipkový virus patří do čeledi Orthomyxoviridae, která je charakteristická segmentovaným lineárním negativním ssrna genomem, který se, jako zatím jediný známý virový RNA genom, replikuje v jádře hostitelské buňky. Dále patří mezi viry obalené a cytolytické, které napadenou buňku zabíjí. Způsobuje onemocnění zvané chřipka, které je nejčastějším infekčním onemocněním respiračního traktu lidí způsobené virem. K přenosu viru dochází převážně kapénkovou nákazou respiračními sekrety při reflexním kýchání a kašli, které jsou vyvolány vreakci na zánět vzniklý mrtvými epiteliálními buňkami dýchacího traktu. Díky malé velikosti kapének a velkému množství virů, mohou infikovat jak horní, tak i dolní cesty dýchací. Nákaza je také možná přímým kontaktem s virem kontaminovanými předměty, na kterých virus přežije i několik dní. Je však velmi citlivý na detergenty, důkladná dezinfekce rukou a povrchů je v boji proti tomuto onemocnění proto velmi důležitá (Sompayrac, 2002; Tumpey and Belser, 2009). Virion je obalený, má helikální nukleokapsidu a dosahuje velikosti nm (Nayak et al., 2009; Payungporn et al., 2010). Podle antigenní variability nukleoproteinu a matrix proteinu dělíme chřipkový virus na typy A, B a C (WHO, 2009, Acute Respiratory infections). Typy A a B mají shodně po osmi segmentech RNA a dva povrchové glykoproteiny - hemaglutinin (H) a neuraminidázu (N). Viry typu C jsou nejodlišnější, mají pouze sedm RNA segmentů a pouze jeden povrchový glykoprotein hemaglutinin, funkci neuraminidázy zde přebírá acetylesteráza. Typy B a C infikují převážně člověka a běžně nezpůsobují pandemie, typ B je ovšem schopen vyvolat lokální epidemie. Chřipkové kmeny typu A infikují mnoho ptačích i savčích druhů včetně lidí (Suzuki et al., 2000; Sompayrac, 2002), díky trvalému přirozenému zvířecímu rezervoáru, schopnosti antigenního shiftu a tím dané menší antigenní stabilitě, mají pandemický potenciál 10

12 (Downard et al., 2008). Z těchto důvodů se v této práci budu zabývat výhradně kmeny typu A. Nomenklatura chřipkových virů byla pro snadnou přehlednost upravena stanovami WHO. U lidských onemocnění obsahuje: kmen izolátu, místo první izolace, rok první izolace, identifikační číslo izolátu, subtyp H a N, např. A/Panama/2007/99(H3N2) (WHO, 2009, Acute Respiratory infections). Často je ale možné setkat se s různými zkrácenými a odlišnými formami tohoto označení, které mohou ztěžovat orientaci např. California/04/2009 nebo Cal0409 (Xie et al., 2011). Chřipkový virus typu A je možno dále členit na základě struktury povrchových glykoproteinů hemaglutininu (H) a neuraminidázy (N). V současné době je popsáno 16 variabilních H a 9 N a všechny tyto kmeny se vyskytují u volně žijících vodních ptáků (Olsen et al., 2006). Fylogenetické studie prokázaly u H i N existenci dalšího členění na 2 skupiny podle konformačních změn, které u nich nastanou ve fuzogenním ph a odlišnostech v aktivních místech glykoproteinů. Skupina 1 hemaglutininů obsahuje H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, a H16, do skupiny 2 pak řadíme H3, H4, H7, H10, H14, a H15, skupina 1 neuraminidáz zahrnuje N1, N4, N5, a N8, skupina 2 pak N2, N3, N6, N7, a N9 (Gamblin and Skehel, 2010). Subtypy hemaglutininu i neuraminidázy chřipkového viru A se mohou libovolně kombinovat a procházet antigenním driftem a shiftem (viz a ). Variabilní kombinace H a N glykoproteinů na povrchu viru tvoří sérotyp, který se vyznačuje podobnými antigenními vlastnostmi, např. sérotyp H1N1 nebo H3N2. Lidé se mohou nejčastěji nakazit viry nesoucími typy hemaglutininu H1, H2, H3 a H5 a neuraminidázy N1 a N2. Možná, ale ne tak častá, je také nákaza sérotypy H7N7 a H9N2 (Payungporn et al., 2010). Obr. 2 Fylogenetický vývoj subtypů hemaglutininu. Převzato z Gamblin (2010) 11

13 Podle frekvence výskytu a pandemického potenciálu rozlišujeme sezónní a pandemické kmeny. Sezónní viry se projevují vysokými horečkami (až 40 C), silnými bolestmi svalů, kloubů a hlavy. Nejenom pandemické, ale i sezónní chřipkové viry mohou být velmi nebezpečné pro děti, seniory a imunosuprimované osoby, u kterých se v mnoha případech průběh onemocnění komplikuje sekundárními bakteriálními infekcemi, způsobujícími např. zápal plic. Během každoročních chřipkových sezón v USA zahyne zhruba lidí a osob musí být hospitalizováno (Downard et al., 2008; Tumpey and Belser, 2009). Pandemické kmeny mají velmi podobné symptomy, jsou však častěji provázeny komplikacemi v podobě zvracení, silných bolestí břicha, zápalu plic či respiračního selhání a především mají velkou virulenci s potenciálem ke vzniku pandemie (3.3.3.) (Acheson, 2007) Proteinové složení Genomové segmenty, chřipkového viru typu A, 1-6 kódují každý jeden protein - tři podjednotky polymerázového komplexu (PA, PB1, PB2) RNA dependentní RNA polymeráza, dva obalové glykoproteiny hemaglutinin a neuraminidázu (H, N) a nukleoprotein (NP). Segmenty 7 a 8 mohou být sestřiženy a každý tak dává vznik dvěma proteinům. Sedmý segment kóduje matrix protein (M1) a třetí obalový protein (M2). Osmý segment kóduje dva nestrukturní proteiny (NS1 a NS2 možné označení NS2 proteinu také NEP). Jak sestřižené, tak nesestřižené formy jsou exportovány zjádra do cytoplazmy. Virová lipidová dvojvrstva obsahuje jak membránové mikrodomény s cholesterolem (zde jsou kotveny H a N), tak úseky bez vyšší koncentrace cholesterolu (zde je ukotven protein M2) (Scheiffele et al., 1999; Takeda et al., 2003; Barman and Nayak, 2007). NS1 protein není součástí virových partikulí, po napadení chřipkovým virem se translatuje z chřipkového genomu a zůstává v napadených buňkách. Jeho hlavní funkcí je regulace životního cyklu viru (RNA sestřih, translace atd.), hraje také důležitou roli při potlačení hostitelské antivirové obrany. NS1 protein obsahuje na svém C konci AK sekvenci ESEV (kyselina glutamová serin kyselina glutamová - valin), která se váže na buněčné PDZ (postsynaptic density protein, Drosophila disc large tumor suppressor, a zonula occludens -1 protein). Viry obsahující ESEV motiv jsou řazeny do kategorie vysoce virulentních virů (např. španělská chřipka H1N1 nebo ptačí chřipka H5N1). Sérotyp H1N1 z roku 2009 tuto sekvenci neobsahuje (Payungporn et al., 2010). Polymerázový komplex se účastní transkripce a replikace. PB2 protein reguluje rychlost virové replikace. Bodovými mutacemi lze tuto rychlost výrazně ovlivnit. U některých subtypů chřipky A byl nalezen PB1-F2 protein, který je přepisován 12

14 z alternativního otevřeného čtecího rámce (+1) vrna segmentu kódujícího PB1. Svou vazbou do mitochondriální membrány a narušením membránového potenciálu způsobuje apoptózu buněk a je tedy znakem vysoké patogenity viru. Lidská pandemická chřipka H1N1 z roku 2009 produkuje zkrácený PB1-F2 protein, který díky STOP kodonu obsahuje pouze 11 AK a není tak schopen vyvolávat apoptózu buněk, což snižuje patogenitu tohoto subtypu. (Schmolke et al., 2011; Payungporn et al., 2010). Obr. 3: Znázornění proteinového a genomového složení chřipkového virionu. Osm negativních RNA segmentů genomu kóduje povrchové glykoproteiny (H a N), iontový kanál, matrix protein, nestrukturní protein a polymerázový komplex. Převzato z Xie (2011) 3.2. Životní cyklus viru Životní cyklus chřipkového viru se skládá z 3 zásadních kroků, kterými jsou přichycení a vstup viru do hostitelské buňky, vlastní replikace, transkripce a translace genomu a v neposlední řadě maturace, uvolnění nových virionů z apikální strany epiteliálních buněk do okolí buňky a následné přichycení na receptory sousedních buněk. 13

15 Obr. 4: Shrnutí životního cyklu chřipkového viru. Naznačeny jsou základní kroky vstup viru receptorem zprostředkovanou endocytózou, vlastní replikace, transkripce a translace viru, maturace nových virionů a uvolnění viru z buňky. Převzato z Arias (2009) Vstup viru do buňky Vstup chřipkového viru do hostitelské buňky se odehrává přes receptorem zprostředkovanou endocytózu, v tomto ději hraje zásadní roli hemaglutinin (viz. 3.4.). Po endocytóze je virus obalen do clatrinového váčku a uzavřen do endozómu (Weissenhorn et al., 1999; Rimmelzwaan et al., 2007). M2 protein je ve virovém obalu nezbytný pro formování vysoce selektivního transmembránového iontového kanálu (tetrametry 4 transmembránových alfa helixů). Po aktivaci kyselým ph v endosomu (5-6) kanál umožní H+ iontům pronikat skrz membránu do virionu (Acheson, 2007). Změněné ph vyvolá uvnitř virionu konformační změny hemaglutininu (viz ) a disociaci M1 od nukleoproteinu. Tyto změny mají za následek fúzi s membránou endozómu a uvolnění vrnp (vrna navázaná na NP) do cytoplazmy. M2 protein vykazuje velmi vysokou AK homologii mezi všemi lidskými, ptačími i prasečími chřipkovými viry. (Batakova, 2007). Následně vrnp putují přes jaderné póry do buněčného jádra. 14

16 Transkripce, translace a replikace Protože je genom chřipkového viru kódován negativní vrna, je nutné nejdříve přepsat informaci do komplementárního vlákna RNA. Pro zahájení transkripce je nezbytný primer obsahující cap strukturu a několik nukleotidů, k tomu virus využívá hostitelské premrna nacházející se v jádře, kterým pomocí PB2 proteinu odštěpuje tyto struktury. K transkripci je pak využit vlastní virový polymerázový komplex, který navíc na 3 konci RNA dodává poly A, nutné k tomu, aby mohla mrna opustit jádro. V cytoplazmě jsou z této mrna následně translatovány proteiny za využití hostitelských enzymů (Mikulasova et al., 2000; Liu et al., 2009). Membránové proteiny M2, H a N jsou syntetizovány v ER. Procházejí přes Golgi, kde jim je na C-konec připojena MK, do membrány jsou invertovány přes SRP mechanizmus. H je syntetizován jako prekurzor a je štěpen buněčnými proteázami. Podjednotky HA 1 a HA 2 jsou kovalentně vázány disulfidickými můstky (Selimova et al., 1990). Ostatní proteiny jsou syntetizovány na volných ribozomech v cytoplazmě (viz. Obr. 4). Nukleoprotein, polymerázový komplex a NS1 se následně vrací zpět do jádra. NP svou vazbou na polymerázový komplex aktivuje replikaci virového genomu. Z vrna vznikne činností virové polymerázy (bez nutnosti primeru) +ssrna vlákno, které je následně replikováno a vzniká tak crna. Ta je po vazbě na M1 a další proteiny (viz ) exportována z jádra a zabalena do nově vznikajících virionů. Virový NP tak svou přítomností v jádře snižuje koncentraci utvářené mrna a zvyšuje tvorbu crna. Protein NS1 reguluje mnoho aktivit viru (časová regulace syntézy vrna, tak aby byla shodná s buněčným cyklem, morfogeneze virionů, suprese obranných mechanizmů buňky), včetně regulace alternativního splicingu segmentů 7 a 8. (Mikulasova et al., 2000; Liu et al., 2009). Ačkoliv jsou tyto procesy, vzhledem ke vzniku virulence chřipkového viru, naprosto zásadní, stále zůstává v této oblasti mnoho nejasností, které je potřeba pro plné pochopení těchto mechanizmů hlouběji prozkoumat Formování a maturace nových virionů Všechny složky virionu jsou přeneseny pod plazmatickou membránou do tzv. budding site neboli místa pučení, kde tvoří uspořádané struktury. Hemaglutinin a neuraminidáza obsahují ve svých TMD značky, které je směřují do určité části cytoplazmy, pučení se odehrává mechanizmem buněčné exocytózy, které je ovlivněno činností virových proteinů (viz. dále). Velká část uvolněných virionů neobsahuje plnou sestavu vrna a nejsou tedy infekční. Pro přenos vrnp z jádra do cytoplazmy a následně k plazmatické membráně je zásadní interakce vrnp s M1 proteinem, který obsahuje NLS a může tak 15

17 vstupovat do jádra (Arzt, 2004). V jádře se následně vytvoří komplex RanGTP-NEP-M1- vrnp, který je z jádra exportován. Vazba těchto proteinů brání transkripci vrna a ta tak může být exportována do místa pučení a zabudována do nových virionů. Studie Marjuki et al. (2006) naznačuje, že agregace hemaglutininu u plazmatické membrány hostitelské buňky aktivuje PKC a tím MAPK kaskádu, která v konečném důsledku iniciuje export RNP z jádra do cytoplazmy. Aktivace růstu pupene a regulace jeho velikosti není prozatím detailně známa, jisté však je, že se těchto dějů účastní i komponenty hostitelské buňky, především již zmíněné lipidové rafty a aktinová mikrofilamenta, která se podílí na růstu pupene a jejichž destrukce usnadní uvolnění virionu (Simpson-Holly et al., 2002; Noda et al., 2006; Nayak et al., 2009). Neuraminidáza štěpí vazbu na buněčnou SA, čímž virionům umožňuje buněčný povrch opustit a infikovat okolní buňky. Schopnost efektivního a rychlého uvolnění virionů z buněčného povrchu je významnou součástí virulence chřipkového viru, mutace v tomto enzymu tak mohou výrazně přispět vzniku pandemického subtypu chřipky (Parrish and Kawaoka, 2005; Rossman and Lamb, 2011) Pandemický potenciál Přechod od epidemie k pandemii není pevně určen počtem nakažených či zemřelých osob, z tohoto hlediska je možno sledovat více aspektů. Patří mezi ně i zmíněná úmrtnost a počet nově nakažených jedinců, ale také množství prodaných léků, pracovních neschopností apod. Za epidemii se obecně považuje situace, kdy je výskyt onemocnění danou infekční nemocí několikanásobně vyšší, než je každoročně očekávaný odhad, většinou na určitém území státu, případně v celém státu. Pandemie vzniká celosvětovým rozšířením infekčního onemocnění a pro její vyhlášení musí být splněna podmínka přenosu z člověka na člověka (nejen ojedinělé případy přenosu ze zvířete na člověka), pandemii vyhlašuje WHO (WHO, 2004). Pandemické kmeny (nejenom chřipkového onemocnění) většinou vznikají novými mutacemi kmenů, které způsobují každoroční nákazy. Takovéto kmeny často mají nové vlastnosti, na které není jejich hostitel evolučně připraven, a proto mají tak razantní dopad na celou populaci Antigenní drift S antigenním driftem se setkáváme u všech tří typů chřipkových virů (A, B i C). Vzniká především díky chybějícím kontrolním a reparačním (proofreading) mechanizmům virové RNA dependentní RNA polymerázy, která zařadí přibližně jeden chybný nukleotid na správně zařazených nukleotidů. Takto vzniklé mutace mohou způsobit změny ve 16

18 struktuře vazebných a antigenních místech viru. Následkem těchto změn však není imunitní systém hostitele schopen virus rozpoznat a efektivně zlikvidovat, i když už se s ním v minulosti setkal, což je klasický případ opakujících se sezónních nákaz (Sompayrac, 2002). Antigenní drift může být minoritně také příčinou překonání mezidruhové bariéry, jako se tomu zřejmě stalo při přenosu ptačí chřipky H5N1 na člověka (Payungporn et al., 2010; CDC, How the flu virus can change: drift and shift; Hensley et al., 2009) Antigenní shift Schopnost antigenního shiftu mají pouze chřipkové viry typu A, jejichž hostitelské spektrum je, na rozdíl od většinově lidských typů B a C, značně široké. Velkým rezervoárem nových kmenů typu A je divoké vodní ptactvo, především kachny (Batakova, 2007). Člověk se většinou nenakazí přímo od kachen, vhodným hostitelem ptačích i lidských kmenů je prase. Jeho buňky mohou být infikovány ptačími i lidskými kmeny chřipkového viru A. Protože prasečí receptory obsahují jak kyselinu sialovou připojenou na galaktózu α2,3-gal vazbou (preferováno hemaglutininem ptačích kmenů), tak vazbou α2,6- Gal (preferováno hemaglutininem lidských kmenů) (Gambaryan et al., 1997; Ito and Kawaoka., 2000; Payungporn et al., 2010). Každý z osmi ssrna segmentů kódujících proteiny tak může pocházet buď z ptačího, prasečího nebo lidského kmene, většina takto vzniklých virionů je neživotaschopná. Mohou však vzniknout i takové, jejichž pozměněný genom umožní mezidruhový přenos. Největší riziko vzniku reasortantů (reassortment neboli nepravá genetická rekombinace) je v oblastech, kde jsou kachny, prasata a lidé v těsném kontaktu, jako je tomu např. v Asii. (Sompayrac, 2002). Při překonávání mezidruhové bariéry musí být virové adaptace komplexnější, než pouhá změna vazebné preference. Velmi důležité je také přizpůsobení se odlišné tělesné teplotě, např. teplota lidského těla je o 3-5 C nižší než teplota ptačího těla, dále pak u vodního ptactva chřipkový virus napadá především intestinální trakt, kde buněčné receptory obsahují NeuGcα2,3Gal, zatímco u lidí způsobuje respirační infekce vazbou na receptory obsahující NeuAcα2,6Gal. Na komplexních adaptacích se samozřejmě podílejí i jiné proteiny, než pouze hemaglutinin, především pak polymerázový komplex a neuraminidáza (Parrish and Kawaoka, 2005; Ito et al., 2000). Příkladem takovéhoto reasortantu může být vysoce virulentní sérotyp H5N1, který byli prvně izolován v drůbeží populaci v Asii roku Znovu byl detekován roku 2003 ve východní Evropě v domácích i divokých ptačích populacích. Následně díky antigennímu shiftu získal schopnost přenosu na lidi a způsobil 200 úmrtí (Downard et al., 2008). Dalším příkladem vícenásobného reasortantu je lidská pandemická chřipka H1N1 z roku

19 Geny PB2 a PA pocházejí z ptačího chřipkového viru H1N1 izolovaného v S.Americe roku Gen PB1 byl převzat z lidského chřipkového viru H3N2. Geny pro H, NP a NS proteiny pochází z klasické prasečí chřipky H1N1 izolované v S.Americe. N a M geny se vyvinuly z Euroasijské prasečí chřipky H1N1. Dalším antigenním shiftem následně vznikl z lidské H1N1 a ptačí H2N2 chřipkové nákazy nejdříve lidský subtyp H2N2 a z něho pak reasociací s dalším ptačím kmenem, u kterého neznáme přesný subtyp neuraminidázy (H3N?), lidský subtyp H3N2 (Payungporn et al., 2010; Parrish and Kawaoka, 2005). Vzhledem k možnému vzniku pandemií, je nutné tomuto fenoménu věnovat dostatečnou pozornost, především ve vývoji účinných léčiv Chřipkové pandemie Největší novodobou pandemií chřipky typu A byla tzv. španělská chřipka, která vypukla v letech Byla způsobena subtypem H1N1 a zapříčinila úmrtí zhruba 50 milionů převážně mladých lidí (Batakova, 2007). Virus H1N1 se nadále vyskytoval mezi obyvatelstvem do roku 1957 ve formě každoročních nákaz, poté se znovu objevil až v roce 1977 jako tzv. ruská chřipka (Tumpey and Belser, 2009) - tento název je poněkud matoucí, protože byl již přiřazen pandemii chřipky z let , která byla nejspíše způsobena subtypem H3N8 (Valleron, 2010). V dubnu 2009 se objevil nový kmen H1N1 prvně izolovaný u prasat a onemocnění tak bylo nazváno prasečí chřipkou. Kmen se rychle šířil po celém světě a 12. června téhož roku WHO zvýšila pandemickou pohotovost na stupeň 6, tedy nejvyšší stupeň (WHO, 2009, Current WHO phase of pandemic alert for Pandemic (H1N1) 2009), což vedlo k velkým celosvětovým obavám z chřipkových pandemií (Xie et al., 2011). Další pandemie byly způsobeny subtypy H2N2 - asijská chřipka a H3N2 hong-kongská chřipka. Mortalita těchto epidemií nebyla tak vysoká, především díky již existujícím antibiotikům a fungujícímu varovnému systému WHO, přesto však během H2N2 pandemie zemřelo zhruba 20 milionů lidí a během H3N2 přibližně 1 milion. Oba tyto kmeny vznikly jako reasortanty ptačích a sezónních lidských kmenů H2N2 obsahuje ptačí H, N a PB1 geny, H3N2 pak H a PB1 geny (Kawaoka et al., 1989; Kilbourne, 2006; Smith et al., 2009). V roce 2003 vypukla celosvětová panika týkající se nově objeveného ptačího viru H5N1 i přesto, že projevy onemocnění byly u lidí relativně mírné a k obávané pandemii nakonec nedošlo. Celkem bylo potvrzeno 310 onemocnění lidí tímto subtypem, včetně 189 úmrtí (WHO, 2007). O to větší byl však ekonomický dopad tohoto sérotypu pro jednotlivé 18

20 země. V rámci preventivní kontrolní strategie byly po celém světě usmrceny desítky milionů ptactva, především v hospodářských chovech Hemaglutinin Hemaglutinin získal svůj název podle schopnosti aglutinovat erytrocyty, díky vazbě na zbytky sialové kyseliny obsažené na povrchu jejich receptorů, stejně jako na dalších buněčných typech. Této schopnosti se využívá při hemaglutinačně inhibičním testu (HIT), při kterém se stanovuje přítomnost protilátek proti hemaglutininu, které inhibují aglutinaci a sedimentaci erytrocytů. Toho lze využít při diagnostice některých virových onemocnění jako např. chřipky nebo zarděnek. Preference ptačích kmenů na SA vázanou α2,3 vazbou je způsobena konkrétními AK v receptor vazebném místě (RBS) molekuly hemaglutininu (v případě sérotypu H5N1 jsou to glutamin serin glycin neboli QSG), stejně tak jako preference lidských kmenů na SA vázanou α2,6 vazbou (Shinya et al., 2006). Důvodem proč i přes tuto bariéru může infekce ptačím kmenem H5N1 způsobit onemocnění i u lidí, může být přítomnost α2,3 receptorů v lidském dolním dýchacím traktu (Baum and Paulson, 1990). Hemaglutinin je 549 aminokyselin dlouhý transmembránový glykoprotein exprimovaný jako trimer. Je zodpovědný za vazbu virionů na buněčný povrch, vstup virového genomu do buňky procesem zvaným receptorem zprostředkovaná endocytóza a fúzi virové a endosomální membrány (Li et al., 2010). Primárním cílem hemaglutininu lidských kmenů typu A jsou endoteliální buňky tracheální tkáně horních cest dýchacích, které exprimují na svých receptorech α2,6 vázanou kyselinu sialovou. Za rozpoznání buněčných receptorů na povrchu buňky je zodpovědná HA 1 podjednotka hemaglutininu obsahující RBS. V buňce je hemaglutinin syntetizován z virové RNA jako první, přes endoplazmatické retikulum (ER) a Golgiho aparát (GA) je transportován do lipidických raftů plazmatické membrány, která je při maturaci inkorporována do virionů (Jayaraman et al., 2011). Místo štěpení (cleavage site) hemaglutininového prekurzoru HA 0 na podjednotky HA 1 a HA 2 (viz ) se může nacházet v různých pozicích molekuly. Chřipkové viry podle pozice CS můžeme rozdělit do 2 skupin, lišících se svojí patogenitou. Prvním typem jsou nízko patogenní ptačí kmeny (LPAI), jejichž hemaglutininový prekurzor (HA 0 ) je štěpen v místě s velmi konzervovaným argininem napříč subtypy H (Skehel and Wiley, 200) pomocí tkáňově specifických exoproteáz (tzv. trypsine-like proteáz), které se nacházejí pouze v dýchacím traktu. Druhým typem jsou vysoce patogenní ptačí kmeny (HPAI), které ve svém genomu obsahují AK inzerce (RRRKK), prekurzor H 0 je štěpen v GA 19

21 endoproteázou furinem. Furin se ale vyskytuje ve většině tkání, tyto viry tak mohou infikovat různé buněčné typy a způsobit závažné systémové infekce. Zmíněná inzerce však byla prozatím zjištěna pouze u ptačích kmenů chřipky A (Decha et al., 2008; Payungporn et al., 2010) dělení na HPAI (např. A/Hong Kong/483/97) a LPAI (např. A/Hong Kong/486/97) (Kat zet al., 2000), lze tedy použít pouze u subtypů H5 a H7. Rozdělení ptačích chřipkových virů na nízko a vysoce patogenní se řídí také nitrožilním indexem patogenity (IVPI) popsaným Světovou organizací pro zdraví zvířat (OIE) aby byl virus zařazen do typu HPAI musí být letální pro 6-8 z 8 infikovaných kuřat do 10 dní po infekci, mít již zmíněnou inzerci v místě štěpení (CS) nebo schopnost růstu a replikace v buněčné kultuře v nepřítomnosti trypsinu (Tumpey and Belser, 2009). Obr. 5: Přehled aminokyselinových sekvencí receptor vazebných a štěpících míst lidských a ptačích chřipkových virů kmene A. Mezi vysoce patogenní kmeny tzv. HPAI řadíme z hlediska AK sekvencí pouze takové, které obsahují inzerci RRRKK, daná inzerce se v tomto zkoumaném vzorku vyskytuje pouze u ptačího kmene H5N1. Převzato z Payungporn (2010) Hemaglutinin je velmi cennou molekulou a ideálním modelem především při výzkumu fúzí membrán, sbalování (folding) proteinů při sekreci a vlivu samotné glykosylace na funkci glykoproteinů. V tomto směru byl velmi důležitý přenos objeveného glykosylačního systému z Campylobacter jejuni do E. Coli, který umožňuje zkoumání mechanizmů těchto dějů u eukaryot, jejichž proteiny jsou hojně glykosylovány. Až 70% 20

22 terapeuticky využívaných proteinů u člověka je glykosylováno (Farahmand et al., 2012). Velké pokroky by tento rekombinant mohl také přinést ve vývoji účinných protilátek proti H chřipkového viru Složení a struktura Na obr. 6 je znázorněn H monomer a jeho podjednotky zakotvené v membráně, jak je uvedeno dále, monomer hemaglutininu vzniká štěpením společného biosyntetického prekurzoru HA 0 a vzniklé podjednotky jsou u sebe následně drženy disulfidickými vazbami. Hemaglutinin exprimovaný na povrchu virionů se skládá ze 3 stejných monomerů (homotrimer). HA 1 podjednotky tvoří globulární část molekuly a plní především funkci vazby na receptor a v endozómu následně disociují. HA 2 podjednotky jsou naopak velmi důležité při tvorbě fúzního póru. (Skehel and Wiley, 2000). Obr. 6: Hemaglutininový monomer se skládá ze 2 podjednotek HA 1 a HA 2 vázaných disulfidickou vazbou. Podjednotka H 1 (36 kda) obsahuje SA vazebnou doménu, HA 2 (27 kda) obsahuje fúzogenní N-koncový peptid, a je svým C - koncem zakotvena ve virovém obalu. Obě podjednotky jsou spojeny disulfidovým můstkem. Převzato z Acheson (2007) Role v cyklu Zásadní role hemaglutininu v cyklu chřipkového viru jsou rozpoznání buněčného receptoru, vstup viru do buňky mechanizmem receptorem zprostředkované endocytózy a v neposlední řadě fúze virové a endosomální membrány. 21

23 Specifita různých typů hemaglutininu pro SA α2,3 nebo α2,6 vázané receptory je dána především interakcemi aminokyselin, nacházejících se v okolí vazebného místa a kyslíkovým atomem SA. Vazebné místo samotné je sekvenčně i strukturně vysoce konzervované. Dříve se pro výzkum vazebných preferencí H využívaly především receptorové analogy a glykanová micro-array analýza, tyto přístupy však neumožňovaly zobrazení interakcí molekuly hemaglutininu s buněčným receptorem in vivo. Nativní pozorování umožnila až aplikace metod genového inženýrství a možnost sestrojení viru označeného GFP a s definovaným složením povrchových glykoproteinů na povrchu (Rimmelzwaan et al., 2007). Podmínkou infektivity viru je proteolytické štěpení HA 0 prekurzoru buněčnými proteázami na podjednotky HA 1 a HA 2, které zůstanou propojeny disulfidickými můstky. Po receptorem zprostředkované endocytóze se virus dostává do endozómu. Nízké ph v endozómu následně indukuje konformační změny. Dojde k ionizaci aminokyselin v polohách 1-10 na fúzním peptidu, kyseliny asparagové 109 a 112 na dlouhém alfa helixu a histidinu 17 v podjednotce HA 1, které tvoří vodíkové můstky s amino skupinami fuzního peptidu při neutrálním ph. Následkem protonace těchto AK dojde k elektrostatickému odpuzování převážně kladně nabité HA 1 a převážně negativně nabité HA 2 domény. Díky konformačním změnám hemaglutinin zaujme tyčkovitou strukturu, která je pro fúzní proces esenciální. Hemaglutinin splyne s endosomální membránou a v okolí fúzního místa začnou agregovat další H molekuly. Hlubší proniknutí do lipidové dvojvrstvy umožní nízké ph a rotace Glu15 a Asp19, které vytvoří hydrofobní kapsu. Střední část dlouhého alfahelixu (AK ) se konformačními změnami přemění na otočku (turn) a HA 1 podjednotka (obsahující RBS) disociuje, tento krok je obdobný mechanizmu funkce SNARE proteinů v buňce. Nevratným a rychlostně limitujícím krokem je ale až vznik fúzního póru pomocí fuzního proteinu na N konci HA 2 podjednotky. Pór je nejdříve velmi nestabilní a ph závislý (dochází k rychlým změnám v otevření a uzavření póru). Stabilitu získá až po dokončení trimerické hairpin formace. Aminokyseliny na N konci tvoří čepičku, která ukončuje jednotlivé alfa helixy a udržuje tak strukturu pohromadě. Prokazatelnou roli v iniciaci a rozšíření fuzního póru má také lipidové složení membrány cholesterolové mikrodomény podporují oba tyto zmíněné procesy (Weissenhorn et al., 1999; Skehel and Wiley, 2000; Xie et al., 2011). 22

24 Obr.7: Na obrázku je znázorněna sekundární struktura HA 2 podjednotky. Pro úspěšnou fúzi virové membrány s membránou endozómu je zásadní ionizace AK v pozicích 1-10 fúzního peptidu, nacházejícího se na N-konci HA 2 podjednotky a také ionizace kyselin asparagových (v pozicích 109 a 112) v dlouhém alfa helixu. Následkem nízkého ph v endozómu dojde také ke konformační změně střední části dlouhého alfa helixu a tím k disociaci HA 1 podjednotky. Převzato z Xie (2011) Bodové mutace ovlivňující virulenci Hemaglutinin váže kyselinu sialovou přes hydrofobní interakce, vodíkové můstky a van der Waalsovy síly, a to díky atomům obsažených v postranních řetězcích aminokyselin (Gamblin and Skehel, 2010). Bodové mutace v oblasti vazebného místa hemaglutininu tedy mohou mít pro virus jak velmi pozitivní, tak i letální význam v souvislosti s tím, zda vazbu na receptor zesilují, případně umožňují vázat i jiné typy receptorů nebo zda tuto vazbu naopak zeslabují či dokonce znemožňují. Výzkumný tým Matrosovich et al. v roce 1997 identifikoval u chřipkových virů kmene A mírně odlišné pozice v okolí vazebného místa, jejichž aminokyselinové substituce mohou měnit receptorovou specifitu z ptačí na lidskou. Byly jimi aminokyseliny 138A a 194L, a také dále zmíněné substituce na pozicích 190, 225, 226 a 228. Důležitou metodou při charakterizaci proteinového složení virů se stala hmotnostní spektrometrie se svými četnými variacemi (ESI, MS/MS). Této metody bylo využito také při studiích výzkumné skupiny K.M. Downarda, která se mimo jiné zabývala odhalením antigenních determinant na molekule hemaglutininu. Do studie bylo zahrnuto 149 izolátů chřipkového kmene A H3N2 a 34 izolátů chřipkového kmene A H1N1. Metodou peptidového mapování (PMF) vznikají hmotnostní mapy, které poskytují jedinečné charakteristiky pro daný protein a umožňují tak stanovení rozdílu např. mezi 23

25 hemaglutininem s navázanou protilátkou a bez ní. Díky této metodě Downard et al. v roce 2008 zjistili, že AK v pozicích a molekuly hemaglutininu (zbytky jsou součástí globulární části HA 1 podjednotky) jsou hledanými úseky vážícími protilátky u subtypu H1N1. U subtypu H3N2 jsou to pak AK zbytky v pozicích a HA 1 řetězce. Jak naznačují výsledky Nagy et al., u lidských kmenů H3 jsou naopak vysoce konzervovanými AK 84W, 100Y, 149S, 153W, 180W, 234W, 281C a 320 M, jejichž mutace nebyly v přirozených formách virů nalezeny (Nakajima et al., 2005). V souladu s výsledky Downarda jsou také studie výzkumné skupiny A. Jayaramana. Ty odhalily, že bodová mutace v H1 (u uměle připraveného mutanta), která má za následek výměnu izoleucinu na pozici 219 za lyzin, způsobuje u kmene A/California/04/09 H1N1 (prasečí chřipka z roku 2009) zvýšenou afinitu hemaglutininu k α2,6 navázané kyselině sialové. Afinitu ovlivňují především stabilizace iontové interakční sítě zahrnující AK v pozicích 219, 227 a 186 v okolí vazebného místa pro SA (Doremalen et al., 2011). Přirozený kmen A/California/04/09 H1N1 je reasortantem ptačích, lidských a prasečích virů (Mak et al., 2011). Během jeho největšího šíření v letech bylo celosvětově diagnostikováno více než případů a úmrtí způsobených tímto kmenem. Dnes se kmen vyskytuje převážně v podobě sezónních a dispergovaných infekcí. Ačkoliv se počet úmrtí může zdát vysoký, pravdou je, že tento sérotyp má vzhledem k sérotypu obávané pandemické chřipky H1N1 z roku 1918 výrazně sníženou efektivitu přenosu, což je způsobeno mimo jiné i nižší afinitou H k lidským buněčným receptorům. Uměle vytvořený mutant CA/04/09mut1 (Ile219->Lys) měl nejenom 30x vyšší afinitu k α2,6 navázané kyselině sialové než přirozený kmen CA/04/09, ale byla také signifikantně prokázána vyšší efektivita jeho přenosu formou respiračních kapének u fretek (Jayaraman et al., 2011, Xie et al., 2011). Fretky jsou velmi často využívány jako model pro studium efektivnosti přenosu nákazy lidských chřipkových virů, protože jejich horní dýchací systém obsahuje receptory vázané SA α2,6, stejně jako tomu je u lidí (Tumpey and Belser, 2009). U mutací D222G, případně D222N v kmeni A/California/04/09 (H1N1) bylo zjištěno mírné oslabení vazby na SA α2,6 Gal receptory, ale výrazné zvýšení vazby na SA α2,3 Gal receptory, ve srovnání s týmž kmenem bez těchto mutací. Tyto výsledky podporují pozorování, která prokázala vyšší výskyt mutovaných subtypů (oproti nemutovaným) v lidských dolních dýchacích cestách, které u lidí obsahují také SA α2,3 Gal receptory. Oslabení imunitního systému a proniknutí viru do dolního dýchacího traktu usnadňuje pronikání dalších patogenů, které průběh chřipkového onemocnění výrazně ztěžují (Liu et al., 2010; Belser et al., 2011). 24

26 Studie s rekonstruovaným virem španělské chřipky H1N1 z roku 1918 (především glykanová micro-array) prokázaly několik mutací v hemaglutininu, které mohly vést k vysoké virulenci a mortalitě tohoto viru. Byly provedeny studie zahrnující 2 známé hemaglutininy H1N1 z roku 1918 New York (NY) obsahující mutace Asp190 (D190E), Asp225 a South Carolina (SC) s jedinou mutací Gly225 (tedy D225G), která způsobuje, že se H tohoto sérotypu váže jak na receptory SA α2,6 Gal, tak SA α2,3 Gal (Stevens and Glaser et al., 2006; Tumpey et al., 2007; Xie et al., 2011). Mutace jediné aminokyseliny tak může výrazně rozšířit hostitelskou specifitu tohoto sérotypu. Pekosz a spolupracovníci v roce 2009 potvrdili, že pro rozlišení receptorů s α2,3 vázanou SA je zásadní AK v pozici 190. Výzkumná skupina Matrosovich a spol. se věnovala výzkumu mutací, které během vývoje kmene H1N1 umožnily vazbu na odlišné receptory a tím i změnu hostitele z původně ptačích, přes prasečí až po lidské subtypy. Jako kandidátní pozice aminokyselin, jejichž specifické mutace by mohly umožnit změnu vazby RBS ptačího typu hemaglutininu k buněčnému receptoru s koncovou SAα2,6Gal u prasat, byly identifikovány pozice 155, 159, 190 a 225. Většina zkoumaných prasečích H1N1 kmenů obsahovala substituce T155V, T159N a E190D. Velmi zajímavé je, že mutaci G225E, která je důležitá pro vazbu chřipkového viru na lidské receptory, měly pouze kmeny, které byly schopny vázat jak ptačí, tak prasečí receptory. Mutace G225E tak může být pro virus zásadní ve fázi adaptace na nového hostitele, ale ne tak významná při replikaci a šíření viru v hostiteli, na kterého je virus již adaptován. Mutace v pozicích 155 a 159 se naopak nevyskytují u chřipkových virů adaptovaných na lidské hostitele, což může být způsobeno tím, že pouze prasečí dýchací trakt obsahuje 5-Nglykolyl analog kyseliny sialové, pro jehož vazbu může být mutace T155I/V důležitá tvorbou kapsy, do které se analog váže. Pozice 159 pak tuto vazbu upevňuje interakcemi s dalšími sialyloligosacharidy receptoru. Většina lidských H1N1 virů obsahuje stejnou mutaci jako prasečí H1N1 viry E190D a z hlediska vlivu postranních řetězců aminokyselin podobnou mutaci G225D. Značná podobnost těchto mutací u řady prasečích a lidských H1N1 subtypů a absence u ptačích H1N1 subtypů naznačuje, že právě tyto mutace mohou být zodpovědné za adaptaci těchto virů na prasečí a lidské hostitele. Vysoká virulence subtypu H1N1 z roku 1918 může být dále způsobena také mutacemi, zvyšujícími fúzogenní ph nutné k úspěšnému splynutí virové membrány s membránou endozómu (Smeenk et al., 1996). Vysoký pandemický potenciál tohoto subtypu ale podle studií s rekonstruovaným virem nesouvisel pouze s mutacemi v povrchových glykoproteinech, ale zásadní roli hrál také gen pro protein PB2, který je součástí polymerázového komplexu. Studie také odhalují odlišnou mutaci u subtypu H1N1 způsobující pandemické onemocnění u lidí, a to mutaci na pozici 627, kterou je záměna 25

27 kyseliny glutamové za lyzin - E627K (Hoeven et al., 2009). I další výzkumy (Steel et al., 2009) podpořily vliv E627K mutace na přenos ptačích kmenů na lidi, navíc byla objevena další mutovaná pozice D701N v proteinu PB2. Tyto substituce v proteinu PB2, který je součástí polymerázového komplexu, nejspíše umožňují virovou replikaci za nižších teplot (zhruba 33 C), které jsou časté v savčím dýchacím traktu (Tumpey and Belser, 2009). Velká mortalita a virulence španělské chřipky tak byla zřejmě způsobena několika mutacemi v řadě proteinů, které vedly k adaptaci původně ptačího viru na lidi a také k jeho rychlému rozšíření mezi lidskou populací (Pappas et al., 2008). Všechny 3 velké pandemie (H1N1, H2N2 a H3N2) byly zřejmě způsobeny nebo při nejmenším velmi výrazně podpořeny, mutacemi v blízkosti receptor vazebného místa hemaglutininu, subtypů chřipkového viru postihujících původně především vodní ptactvo. Tyto mutace následně vedly ke změně vazebné preference z ptačí α2,3 vázané SA na lidskou α2,6 vázanou SA na receptorech pro vazbu hemaglutininu, čímž umožnily nejenom přenos ze zvířete na člověka, ale také efektivní šíření nákazy mezi lidmi. V případě H2N2 a H3N2 se jednalo u mutace Q226L a G228S (Connor et al., 1994; Xie et al., 2011), u subtypu H1N1 - A/New York/1/18 naopak mutace E190D a G225D (Laser et al., 2005; Xie et al., 2011). Obr.8: Zobrazení bodových mutací v různých genových segmentech chřipkových virů, kterými se odlišují ptačí a lidské viry. Převzato z Parrish (2005). Receptor vazebné místo lidské sezónní, ale i pandemické, chřipky H1N1 obsahuje sekvenci QEG (glutamin kyselina glutamová - glycin) vážící se na SA α2,6, má tedy kapacitu infikovat lidské buňky horních cest dýchacích. Kmeny lidské pandemické chřipky izolované v Ukrajině, Brazílii, Číně a Norsku však obsahují mutaci D225G (záměna 26

28 kyseliny asaparagové na pozici 225 za glycin), která umožňuje vazbu viru na SA α2,3 a tím také infekci dolních cest dýchacích, která průběh onemocnění značně komplikuje (Payungporn et al., 2010). Relativně málo pozornosti je věnováno hemaglutininu subtypu H2. Chřipkové viry H2N2 známe u lidí až od pandemické asijské chřipky z roku Jak prokázaly strukturní studie, lidský hemaglutinin H2 obsahuje aminokyselinové substituce Gln226Leu a Gly228Ser, které umožňují přednostní vazbu na lidské receptory obsahující α2,6 vázanou SA a svou hydrofobicitou znemožňují vazbu na α2,3 vázanou kyselinu sialovou. Zatímco původní sekvence Gln226 a Gly228 upřednostňuje vazbu na ptačí receptory s α2,3 vázanou SA (Parrish and Kawaoka, 2005). Lidský H2 je tak více podobný subtypu H3 než H1, který si zachoval původní sekvence - Gln226 a Gly228. Ptačí H2 si ponechal také původní aminokyselinovou sekvenci, ale zaujal konformaci velmi podobnou lidskému subtypu H2, což mu umožnilo vazbu na lidské buněčné receptory bez nutnosti změny aminokyselinové sekvence. V roce 2006 byl identifikován nový chřipkový kmen H2N3, který byl izolován z prasat a u kterého byla zjištěna potenciálně nebezpečná aminokyselinová substituce Gln226Leu. Tato substituce by mohla, v souladu s dalšími změnami původní aminokyselinové sekvence, znamenat schopnost vazby na lidské buněčné receptory a tím způsobit přenos z prasat na lidi a šíření virového onemocnění mezi lidmi (Xie et al., 2011). U kmenů H2N2 izolovaných v roce Davis/57 a Albany/57 znamenala mutace Q226L zhruba 10-ti násobné zvýšení vazby na lidské receptory (Matrosovich et al., 2000). Málo prozkoumaným subtypem je také lidský subtyp H3 u kterého byly zjištěny stejné vazebné preference ovlivněné mutacemi Leu226 a Ser228 jako u subtypu H2. Jak prokázaly výzkumy s mutanty, dostačující je pouze jediná bodová mutace navracející na pozici 226 glutamin a vazebná preference hemaglutininu je opět pozměněna na ptačí typ vazby kyseliny sialové (Matrosovich et al., 2000 a 2007). Strukturních analýz H3 je ale i přes jeho celosvětové rozšíření, relativně málo. V některých vzorcích virů pocházejících od lidských pacientů nakažených v r subtypem H2N2 byla nalezena ptačí mutace 228G a naopak u některých ptačích H3 virů byla po izolaci objevena lidská mutace 228S (Matrosovich et al., 2000). Tyto výsledky mohou naznačovat, že pro adaptaci ptačích subtypů H2 a H3 na lidské receptory je s největší pravděpodobností velmi významná aminokyselina v pozici 226, zatímco vliv mutace na pozici 228 zůstává prozatím ne zcela jasným. Matrosovich (2000) a spolupracovníci provedli řadu pokusů, v nichž zkoumali vazebné preference ptačích a lidských chřipkových virů subtypů H1, H2 a H3. Kromě již 27