UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Studijní program: Speciální chemicko-biologické obory Studijní obor: Molekulární biologie a biochemie organismů Nela Klímová Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS) Mechanism of secretion of adenylate cyclase toxin from Bordetella pertussis via Type I secretion system (TISS) BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Školitel: Mgr. Ladislav Bumba, Ph.D. Praha, 2013

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze,

3 Poděkování: Ráda bych poděkovala svému školiteli Mgr. Ladislavu Bumbovi, Ph.D. za cenné připomínky a rady při vypracování bakalářské práce.

4 ABSTRAKT: Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle. KLÍČOVÁ SLOVA: sekreční aparát typu I, ABC přenašeče, RTX proteiny, adenylátcyklázový toxin, Escherichia coli, Bordetella pertussis ABSTRACT: Type I secretion system in Gram-negative bacteria translocates proteins from the cytoplasm to the extracellular medium in a single step across both membranes. The membrane-spanning channel is made up of just three proteins an ATPase in the inner membrane, a membrane fusion protein and a specific outer membrane protein. This work provides a summary of current knowledge concerning the structure of the secretion system, as well as the assembly of the trans-envelope complex and the mechanism of protein secretion. The role of substrate folding on secretion is highlighted. It deals to some extent with the properties of the substrates translocated by the type I secretion system, with emphasis on the adenylate cyclase toxin of Bordetella pertusis, the agent causing whooping cough. KEY WORDS: Type I secretion system (TISS), ABC transporters, RTX proteins, adenylate cyclase toxin, Escherichia coli, Bordetella pertussis

5 Seznam zkratek ABC AC ADP ATP ATP-binding cassette adenylate cyclase adenosine diphosphate adenosine triphosphate ATP-vazebný protein adenylátcykláza adenosindifosfát adenosintrifosfát camp CLD FHA GSP HlyA MFP NBD NK OMP RTX SDR TISS adenosine 3',5'-monophosphate C39 like domain filamentous hemagglutinin General secretory pathway alpha-haemolysin membrane fusion protein nucleotide binding domain natural killer cell outer membrane protein repeats in toxin structurally diverse region type 1 secretion system cyklický adenosin monofosfát doména podobná C39 peptidáze filamentózní hemaglutinin obecná sekretorická dráha alfa-hemolysin fúzní protein, adaptér doména vázající nukleotid přirozený zabíječ protein vnější membrány protein s výskytem repetic strukturně variabilní oblast sekreční aparát typu I

6 Obsah 1. ÚVOD SEKREČNÍ APARÁT TYPU I (TISS) Přehled sekrečních aparátů gramnegativních bakterií Struktura a funkce sekrečního aparátu typu I HlyB ABC přenašeč NBD doména HlyB a katalytický cyklus hydrolýzy ATP Transmembránová doména HlyB CLD doména N-koncový,,přívěšek HlyB HlyD-fúzní protein TolC Formování sekrečního aparátu Mechanismus sekrece Substráty TISS Obecná charakteristika substrátů TISS Sekrece nesbalených proteinů Charakteristika sekrečního signálu Adenylátcyklázový toxin Struktura adenylátcyklázového toxinu Mechanismus působení adenylátcyklázového toxinu na buňky Sekrece adenylátcyklázového toxinu bakterií Bordetella pertussis ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...25

7 1. Úvod Gramnegativní bakterie jsou obaleny dvěma membránami. Jejich složení je rozdílné vnitřní membránu tvoří jednoduchá fosfolipidová dvojvrstva, vnější je komplexnější a kromě fosfolipidů obsahuje také transportní bílkoviny a lipopolysacharidy, které jsou odpovědné za antigenicitu gramnegativních bakterií. Prostor mezi membránami, zvaný periplasmatický, obsahuje dále buněčnou stěnu, tvořenou tenkou vrstvou peptidoglykanu. Gramnegativní bakterie vyvinuly rozličné mechanismy, jak překonat bariéru dvou membrán a periplasmy při přenosu molekul do vnějšího prostředí, či z něj do buňky. Různé cesty jsou využívány k přenosu hydrolytických enzymů, adhezinů nebo proteinů, vychytávajících živiny v prostředí. Sekreční aparáty jsou klíčové pro virulenci bakterií. Toxiny, které přenášejí, způsobují akutní i chronické infekce, dokáží zmást buněčnou signalizaci a uniknout imunitnímu systému. Příkladem takového toxinu je adenylátcyklázový toxin z bakterie Bordetella pertussis, který je do prostředí sekretován sekrečním aparátem typu I. Struktura a funkce toho sekrečního aparátu jsou hlavním tématem této literární rešerše. Adenylátcyklázový toxin je důležitým faktorem virulence gramnegativní bakterie Bordetella pertussis, mezi její další faktory virulence patří například filamentózní hemaglutinin (FHA), pertusový toxin či dermonekrotický toxin (Weiss and Hewlett, 1986). Bakterie Bordetella pertussis je původcem černého kašle (jinak též pertuse nebo dávivého kašle), onemocnění dýchacích cest, charakteristického opakovanými záchvaty kašle. Černý kašel je závažný převážně pro děti. Podle zprávy Světové zdravotnické organizace (WHO) zemřelo v roce 2008 na toto onemocnění dětí ve věku do pěti let, a bylo registrováno 16 milionů případů nemoci, drtivá většina z nich v rozvojových zemích, ovšem současným trendem je zvýšení jeho výskytu i v dobře rozvinutých zemích u populace proočkované bezbuněčnou vakcínou. Ta nahradila v devadesátých letech vakcínu celobuněčnou. Bezbuněčná vakcína sice nezpůsobuje nežádoucí vedlejší účinky, ale nevyvolává ani dostatečnou imunitní ochranu (Redhead et al., 1993). Studium mechanismu patogeneze bakterie Bordetella pertussis, a tedy i mechanismu sekrece jejích faktorů virulence, je stále aktuálním problémem. 1

8 2. Sekreční aparát typu I (TISS) 2.1. Přehled sekrečních aparátů gramnegativních bakterií Sekreční aparát typu I je jedním z šesti dosud známých sekrečních aparátů gramnegativních bakterií (Obr. 1). V roce 1993, kdy byla zavedena numerická klasifikace sekrečních systémů (Salmond and Reeves, 1993), byly známy celkem tři takové systémy. Sekreční aparát typu II (T2SS z angl. Type 2 Secretion System) používá při průchodu proteinu cytoplasmatickou membránou do periplasmy tzv. GSP dráhu (z angl. General secretory pathway), tvořenou produkty sec genů a rozpoznávající N-koncovou signální sekvenci, přičemž protein následně v periplasmě zaujme nativní konformaci. Ostatní dva sekreční aparáty typu I a III jsou na GSP dráze nezávislé a nevytvářejí periplasmatický intermediát. Proteiny T3SS jsou homologní k sekrečním komponentám účastnícím se biogeneze bičíku. Tento aparát zprostředkovává transport proteinu,,jehlou přímo do cytoplasmy hostitelských buněk (Macnab, 1999). Sekreční aparát typu IV se kromě transportu proteinů účastní také přenosu DNA (například Ti-plazmidu při infekci rostlinných buněk bakterií Agrobacterium tumefaciens) a je homologní ke konjugačnímu aparátu. Transport proteinů přes cytoplasmatickou membránu je závislý na sec proteinech, následně protein prochází kanálem, spojujícím obě membrány a energii dodává několik membránových ATPáz (Christie and Vogel, 2000). V sekrečním aparátu typu V využívají tzv. autotransportéry GSP dráhu k přenosu přes cytoplasmatickou membránu, ovšem transport přes vnější membránu si již katalyzují samy. Beta-doména v C-terminální oblasti samotného proteinu vytvoří beta-barelový pór, kterým je sekretována katalytická podjednotka proteinu (Henderson et al., 1998). Mechanismus sekrece T6SS probíhá podobně jako infekce bakterie bakteriofágem. Připomíná,,vpich injekční jehlou, a to přímo do cytoplasmy hostitelské buňky, kterou může být jak savčí buňka, tak bakterie jiného druhu. Poprvé byl popsán v roce 2006 (Pukatzki et al., 2006). 2

9 Obr. 1: Přehled sekrečních aparátů gramnegativních bakterií. A F sekreční aparát I VI. OM vnější membrána bakterie, IM vnitřní membrána bakterie. Převzato a upraveno z (Kapitein and Mogk, 2013; Sharff et al., 2001) 3

10 2.2. Struktura a funkce sekrečního aparátu typu I TISS katalyzuje jednokrokový transport proteinu přes obě membrány a periplasmu gramnegativních bakterií, bez periplasmatického intermediátu. Sekreční signál je lokalizován v C-terminální části proteinů (Gray et al., 1986), proto jsou sekretovány posttranslačně. Obecně se skládá ze tří proteinů. OMP (z angl. Outer Membrane Protein) je lokalizován ve vnější membráně bakterií. Další dva proteiny jsou zanořeny v cytoplasmatické membráně: ATPáza z rodiny ABC (z angl. Adenosine triphosphate-binding Cassette) přenašečů dodává energii pro transport, fúzní protein či adaptér z rodiny MFP proteinů (z angl. Membrane Fusion Protein) vyčnívá z vnitřní membrány do periplazmatického prostoru a spojuje vnitřní a vnější membránu. Společně tyto proteiny tvoří kanál, který prostupuje oběma membránami i periplasmou gramnegativních bakterií. Vazba substrátu je nezbytná pro formování celého sekrečního aparátu (Letoffe et al., 1996). Jedním z nejvíce prostudovaných sekrečních aparátů typu I je aparát Escherichia coli. Vnějším proteinem je zde protein TolC, ATPázou protein HlyB a fúzním proteinem je HlyD (Obr. 2.). Strukturní gen pro hemolysin HlyA, dva geny hlyb a hlyd pro sekreční aparát a gen pro protein HlyC, který aktivuje HlyA (Nicaud et al., 1985a), se nachází v operonu hlycabd (Felmlee et al., 1985b; Goebel and Hedgpeth, 1982; Welch and Pellett, 1988). Gen pro protein TolC je kódován mimo hly operon (Wandersman and Delepelaire, 1990). Protein HlyC aktivuje HlyA acylací dvou lysinových zbytků (Stanley et al., 1994), která je důležitá pro funkci proteinu, ale nehraje žádnou roli v jeho sekreci (Nicaud et al., 1985b). Obr. 2: Schéma architektury sekrečního aparátu typu I. ABC přenašeč HlyB je zobrazen modře, jeho CLD doména červeně, fúzní protein HlyD zeleně, TolC ve vnější membráně oranžově. Znázorněny jsou také příslušné struktury: A CLD doména HlyB (Lecher et al., 2012) B Dimer NBD domén HlyB s navázaným ATP (Zaitseva et al., 2005) C TolC (Koronakis et al., 2000). Převzato z (Kanonenberg et al., 2013) 4

11 HlyB ABC přenašeč Protein cytoplasmatické membrány HlyB patří do rodiny ABC přenašečů dodává energii pro transport hydrolýzou ATP a je odpovědný za rozpoznání HlyA a zahájení sekrece (Gentschev and Goebel, 1992; Zhang et al., 1998). Jeho N-terminální doména prochází osmkrát membránou (Wang et al., 1991). C-terminální NBD doména (z angl. Nucleotide Binding Domain), vázající ATP, vyčnívá do cytoplasmy. HlyB navíc obsahuje N-terminální přívěšek dlouhý 123 aminokyselin, tzv. CLD doménu (z angl. C39-like domain), viz kapitola CLD doména N-koncový,,přívěšek HlyB. ABC přenašeče vždy fungují jako dimery s dvěma doménami, vázajícími ATP, a dvěma doménami transmembránovými. HlyB patří mezi tzv. poloviční transportéry, protože jeho gen kóduje jediný polypeptid obsahující zároveň transmembránovou a NBD doménu. Funkční jednotkou HlyB je pak homodimer z těchto polypeptidů. Pro generování energie z ATP byl po souhrnu různých strukturně-biochemických dat navrhnut následující katalytický cyklus: bez ATP je NBD doména v otevřené, monomerní formě. Po navázání ATP dojde ke konformačním změnám, vedoucím k dimerizaci. Následná hydrolýza ATP způsobí rozpad dimeru a molekuly ADP opouští monomer, který opět zaujme otevřenou konformaci (Oswald et al., 2006). Struktury celých ABC přenašečů, např. importéru vitaminu B12 BtuCD, naznačují, že i NBD monomerů jsou díky transmembránovým doménám navzájem velice blízko, téměř jako u dimerů, přesto jsou v otevřené konformaci, schopné přijmout ATP (Locher et al., 2002) NBD doména HlyB a katalytický cyklus hydrolýzy ATP V NBD doméně svírají dvě ramena úhel 90. Tzv. rameno I má katalytickou úlohu, váže a hydrolyzuje ATP. Je tvořeno β skládanými listy obklopenými α helixy. Rameno II sestává pouze z α helixů a jeho úlohou je přenos signálu na transmembránovou doménu. Podle sekvenčních analýz jsou NBD domény vysoce konzervované mezi různými přenašeči. Ve všech NBD doménách se vyskytují například charakteristické sekvenční motivy, zvané Walker A, Walker B, a C-smyčka. Po navázání ATP dojde ke konformační změně signálního ramena II a následné dimerizaci. Homodimer HlyB tvoří dvě ATP-vazebná místa tak, že se k sobě ramena dvou NBD domén natočí protichůdně: každou molekulu 5

12 ATP pak váže Walker A motiv jednoho a C-smyčka druhého monomeru (Obr. 3). (Oswald et al., 2006). Obr. 3: ATP-vazebná doména ABC přenašeče. A, B struktura HisP monomeru Salmonella typhimurium s vyznačenými strukturami významných motivů, ATP ve svém vazebném místě je znázorněno tmavě purpurově. C schéma vazby ATP prostřednictvím konkrétních motivů dimeru (monomery jsou zobrazeny vlevo a vpravo). Walker A interaguje s fosfátovými skupinami ATP, Walker B a Q-smyčka s γ fosfátem. Tyr 477 tvoří π-interakci s adeninem. C-smyčka druhého monomeru interaguje s γ fosfátem. Převzato a upraveno z (Oswald et al., 2006),(Zaitseva et al., 2005). Některé modely, vysvětlující mechanismus transformace chemické energie ATP na energii mechanickou, byly vytvořeny na základě strukturních analýz izolovaných NBD domén. Diskutovány budou dvě krystalografické struktury NBD domén HlyB a jejich příspěvky: i) monomeru samotné domény bez ATP (Schmitt et al., 2003); ii) mutací stabilizovaného dimeru s navázaným ATP a kofaktorem Mg 2+ (Zaitseva et al., 2005). i. Schmitt a kol. (2003) identifikovali ve Walker A motivu monomeru NBD domény HlyB 3 10 helix, přičemž dimer tvoří α helix. V 3 10 helixu jsou některé aminokyseliny, účastnící se katalýzy vazby a hydrolýzy ATP, v nevýhodných polohách. Přeměna 3 10 helixu na α helix může být indukována vazbou substrátu a dále umožňovat vazbu ATP. Dalším zjištěním této krystalografické studie je objev 6

13 ii. tzv. SDR (Structurally Diverse Region), což je oblast 30 aminokyselin, jedinečná pro každý ABC přenašeč. Jinak jsou NBD domény ABC přenašečů značně konzervované, viz výše zmíněné motivy. Funkce SDR oblasti, navrhnutá jejími objeviteli, je komunikace mezi NBD a transmembránovou doménou (Schmitt et al., 2003). Zaitseva a kol. (2005) určili strukturu dimeru NBD domény s navázaným ATP, neschopného jeho hydrolýzy kvůli bodové mutaci H662. Tato struktura ukázala klíčovou úlohu tohoto histidinu v hydrolýze, která spočívá v koordinaci molekuly vody, γ fosfátu ATP, Mg 2+ i aminokyselin obou monomerů (Zaitseva et al., 2005). Dalším zjištěním bylo vyvrácení obecné bazické katalýzy, zjištěné u ostatních ABC přenašečů (v té má glutamová kyselina E179 úlohu katalytické karboxylové skupiny, napadající molekulu vody (Moody et al., 2002)). Pro HlyB byla experimentálně potvrzena katalýza asistovaná substrátem SAC (Substrate-assisted catalysis). Při ní se po navázání ATP a dimerizaci změní hodnota pk a aminokyselin, které se účastní katalýzy, a ty se touto změnou aktivují. Mechanismus zaručuje, že k hydrolýze ATP dojde až po dimerizaci (Hanekop et al., 2006). Důležitý je také poznatek, že NBD doména neváže pouze ATP, ale také C-terminální sekreční signál molekuly substrátu, a je zodpovědná za jeho rozeznání (Benabdelhak et al., 2003) Transmembránová doména HlyB Topologické studie spolu s počítačovými predikcemi ukazují, že transmembránová část zahrnuje šest hydrofobních α-helixů mezi aminokyselinami , a navíc je možné, že ještě dva úseky směrem k N-konci HlyB jsou také zanořené do membrány. Cytoplasmatické smyčky mezi transmembránovými helixy jsou větší, než smyčky periplasmatické, a obsahují mnoho pozitivně nabitých zbytků (Gentschev and Goebel, 1992). Strukturní podobnost transmembránových domén mezi různými přenašeči je o mnoho menší, než u NBD domén. Účastní se totiž vazby a transportu substrátu, což požaduje vyšší specifitu. Posouzením nejnovějších struktur celých ABC přenašečů byl navrhnut mechanismus přenosu energie vazby a hydrolýzy ATP na transmembránovou doménu: vazba ATP, dimerizace a,,uzavření NBD domén způsobí přechod transmembránových helixů z konformace otevřené směrem dovnitř buňky na konformaci otevřenou ven, v tomto kroku je substrát vypuštěn z jimi tvořeného kanálu. Po uvolnění ADP se rozpadne dimer, 7

14 transmembránové helixy se opět otevřou dovnitř a do vazebných míst je navázán další substrát (Hollenstein et al., 2007). Navržený model odpovídá alosterickému modelu pro membránové pumpy, vytvořenému již v roce 1966 (Jardetzky, 1966) CLD doména N-koncový,,přívěšek HlyB CLD doména se podobá jiné, dříve objevené, doméně s funkcí C39 peptidázy, kterou nese jedna skupina ABC přenašečů TISS. C39 peptidáza odštěpuje speciální N-koncový peptid substrátu, a to za glycinovým motivem,,gg (ve směru od N- k C-konci). Proteiny tímto odštěpením maturují a jsou rovnou exportovány kanálem TISS. Substráty této skupiny ABC přenašečů jsou malé bakteriociny, tj. peptidy, které působí proti jiným bakteriím (Havarstein et al., 1995). Bodovými mutacemi byly identifikovány tři aminokyselinové zbytky, nejdůležitější pro proteolytickou aktivitu C39 peptidázy: histidin a cystein (Wu and Tai, 2004) a kyselina asparagová (Wu et al., 2012), přičemž první krystalografická struktura C39 peptidázy také potvrdila tuto katalytickou triádu (Ishii et al., 2010). Struktura izolované CLD domény HlyB, určená pomocí nukleární magnetické rezonance (Lecher et al., 2012) ukázala, že CLD je nejen sekvenčně, ale i strukturně velice blízká doméně C39 peptidázové (Ishii et al., 2010). Nemá však proteolytickou aktivitu, protože katalytická triáda je zde nefunkční: cystein je nahrazen tyrosinem, kyselina asparagová je zachována, histidin je přítomen, ale je z aktivního místa vytěsněn π-π interakcí s aromatickým cyklem tryptofanu, který v C39 peptidáze nebyl přítomen. HlyA navíc ani neobsahuje na svém N-konci žádný specifický peptid, který by byl odštěpitelný. Funkce CLD domény zatím není zcela objasněna, je však při sekreci nepostradatelná a interaguje s nesbaleným substrátem nezávisle na jeho sekrečním signálu, viz kapitola Sekrece nesbalených proteinů (Lecher et al., 2012). Třetí skupina ABC přenašečů neobsahuje žádnou podobnou doménu na svém N-konci, tyto potom mají jen transmembránovou a NBD doménu (Lecher et al., 2012). Ze srovnání sekvencí všech tří skupin a vytvořeného fylogenetického stromu vyplývá, že CLD doména se vyvinula z C39 domény, a že k tomu navíc došlo ještě před rozdělením bakterií na grampozitivní a gramnegativní. Tento fakt odpovídá přítomnosti C39 domény v ABC přenašečích jak gramnegativních, tak grampozitivních bakterií (Kanonenberg et al., 2013). 8

15 HlyD fúzní protein Protein HlyD má rozsáhlou periplasmatickou doménu, spojenou jediným transmembránovým helixem s krátkou N-terminální částí (Schulein et al., 1992). Jeho hlavní úlohou je propojit ostatní dva proteiny, HlyB a TolC, při tvorbě transmembránového kanálu. N-koncová část proteinu, exponovaná v cytoplasmě, je pouze 60 aminokyselin dlouhá, ale má důležitou roli v rozeznávání substrátu, přenesení signálu a v následném sestavení translokačního komplexu. Funkční úlohu zde přitom mají hlavně dva útvary amfipatický helix a shluk nabitých aminokyselinových zbytků (Balakrishnan et al., 2001). Periplasmatická doména je alfa-helikální. Na jejím konci identifikovali Lee a kol. (2012) motiv RLT (RxxxLxxxxxxT x je jakákoli aminokyselina) jako vazebné místo pro periplasmatické špičky alfa-helixů TolC. Bodové substituce v argininu 186, leucinu 190 a threoninu 197 znemožnily vazbu k této oblasti TolC i sekreci substrátu (Lee et al., 2012). Struktura proteinu HlyD zatím nebyla určena, informace o ní jsou získány ze sekvenčních a topologických analýz (Schulein et al., 1992). Symetrie HlyD byla navrhnuta jako trimerní (Thanabalu et al., 1998). Podařilo se však určit struktury jiných fúzních proteinů, účastnících se exportu chemických sloučenin, přičemž krystalografická struktura CusBA (Su et al., 2011) (jednalo se o kokrystalizaci proteinu vnitřní membrány a fúzního proteinu), ukázala, že zde je fúzní protein v komplexu ve formě hexameru, protein vnitřní membrány trimerní a OMP je predikován trimerní. Hexamerní uspořádání by se mohlo aplikovat i pro HlyD, který by pak ideálně propojoval dimerní HlyB a trimerní TolC, jehož symetrie je navíc v otevřeném stavu zdánlivě hexamerní, viz kapitola TolC (Koronakis et al., 2000). Hexamerní symetrii navrhuje a experimentálně potvrzuje skupina Lee a kol. (2012) TolC Název TolC je odvozen z mutovaného fenotypu, poskytujícího toleranci ke kolicinu (angl. colicin). Struktura proteinu TolC, určená v roce 2000 pomocí rentgenové krystalografie (za účelem krystalizace musel být deletován C-konec proteinu) (Koronakis et al., 2000), odhalila neobvyklou architekturu, která do té doby nebyla pozorována u žádného jiného proteinu. Tři TolC monomery vytváří 140 Å dlouhý a 30 Å široký kanál (jedná se o vzdálenost peptidových koster, vnitřní přístupný rozměr je 19,8 Å) (Koronakis et al., 9

16 2004). Kanál překlenuje vnější membránu a pravděpodobně i velkou část periplasmatického prostoru. Ve vnější membráně je protein ukotven beta-barelem a pokračuje dále do periplasmy rozsáhlým, 100 Å dlouhým válcem, formovaným z alfa-helixů. V místě přechodu z vnější membrány do cytoplasmy tvoří helixy specifickou, novou strukturu alfa-helikálního barelu. Obr. 4: Struktura TolC. Horní část je zanořena v membráně, spodní část je v periplasmě, viz A. A trimer TolC, tvořící kanál. Jednotlivé protomery jsou znázorněny různými barvami. B jeden protomer se dvěma strukturními repeticemi I, II. Sekundární struktura je rozlišena barevně červeně beta-skládaný list, modře alfa-helix. Orientace molekuly je stejná jako v A. C opět protomer se dvěma strukturními repeticemi, které jsou zobrazeny v překryvu pro zdůraznění jejich rozdílného ohybu. N-terminální, vnitřní repetice je zobrazena červeně, C-terminální, vnější, modře. Převzato z (Koronakis et al., 2000) a (Sharff et al., 2001) Protomery jsou tvořeny dvěma typy helixů delšími a kratšími, ty kratší jsou propojeny linkery vtzv. ekvatoriální doméně uprostřed válce. Ekvatoriální doména má důležitou úlohu v pohybech TolC. Jak je vidět na Obr. 4B a 4C, každý protomer prochází čtyřikrát nahoru a dolů celou strukturou, a je tvořen dvěma repeticemi shodnými jak sekvencí, tak strukturou, což pravděpodobně pramení z genové duplikace v rané fázi evoluce TolC, kdy předchůdce TolC mohl mít hexamerní strukturu (Koronakis et al., 2000). TolC tvoří ve vnější membráně beta-barelovou strukturu, kterou běžně obsahují také ostatní proteiny vnější membrány gramnegativních bakterií. Beta-barel je válec složený převážně z antiparalelních beta-skládaných listů, vždy zatočených pravotočivě (Buchanan 10

17 et al., 1999). Beta-barel TolC je také pravotočivý, ovšem navazující alfa-helikální barel v periplasmě je levotočivý (Koronakis et al., 2000). Elektronmikroskopická pozorování navrhovala, že TolC je trimer, ovšem každý monomer tvoří vlastní beta-barel (Koronakis et al., 1997). Krystalografická struktura potvrdila, že TolC je trimer, tvořící v membráně beta-barel, ovšem tento je dohromady tvořen třemi polypeptidy, což nebylo do té doby u žádného jiného porinu pozorováno. Každý monomer TolC přispívá do dvanáctivláknového beta-barelu čtyřmi vlákny (Koronakis et al., 2000). Většina ostatních porinů je navíc přechodně uzavřených do extracelulárního prostoru (Buchanan et al., 1999), zatímco beta-barel TolC je široce otevřený. Smyčky, propojující vlákna beta-skládaného listu v extracelulární části, jsou sice poměrně rozsáhlé, a mohly by beta-barel uzavírat, to bylo ovšem vzhledem k jejich značné pohyblivosti vyvráceno (Koronakis et al., 2000). Ještě zajímavější je struktura alfa-helikálního barelu. Nachází se v periplasmatickém prostoru, navazuje na beta-barel vnější membrány a je dlouhý 100 Å. Doménu alfa-helikálního barelu lze rozdělit na dvě části: i) v části přilehlé vnější membráně helixy tvoří válec, podobný beta-barelu; ii) v nejvzdálenější periplasmatické části se šest párů alfa-helixů páruje stylem,,coiled-coil. Coiled-coil je struktura, ve které se nejčastěji dva až tři alfa-helixy ovíjejí levotočivě kolem sebe za účelem skrytí hydrofobních zbytků a v jejich sekvenci se vyskytují charakteristické heptapeptidové repetice (Crick, 1952). Jak již bylo uvedeno, každý monomer TolC má dvě strukturní repetice, a každá tato repetice tvoří jeden pár coiled-coil helixů, které se liší mírou svinutí (Obr. 4C). Ve výsledku (Obr. 5) se v trimeru TolC tři vnitřní páry coiled-coil helixů (např. pár helixů H7,H8) na konci kanálu vtáčejí dovnitř, čímž blokují vstup a vytvářejí tak v uzavřeném stavu negativně nabitý (Koronakis et al., 2000), jen 3,9 Å široký vchod (Koronakis et al., 2004), kterým projdou pouze malé, kladně nabité ionty (Benz et al., 1993). V místě přechodu horní a spodní části objímá alfa-helikální barel ekvatoriální doména. Tato doména tvoří kruh z vnější strany kolem celého kanálu, má α/β strukturu a je důležitá při otevírání kanálu (Koronakis et al., 2000). Calladine a kol. (2001) zkoumali strukturu alfa-barelu v horní části periplasmatického kanálu TolC, kde je 12 helixů uspořádáno podobným stylem připomínajícím coiled-coil, zde ovšem helixy nejsou vzájemně svinuty, ale jsou natažené a přikládané podél sebe do plochy, tvořící válec. Tito autoři představili heptapeptidovou sekvenci, unikátní pro tuto strukturu (Calladine et al., 2001). S touto sekvencí prohledávali Sharff a kol. (2001) databáze a identifikovali několik známých i potenciálních strukturních homologů TolC, obsa- 11

18 hujících alfa-barel. Domnělá alfa-barelová strukturu byla nalezena dokonce i v databázi fúzních proteinů, včetně proteinu HlyD. HlyD by tak mohl vytvářet levotočivou válcovitou strukturu, která by objímala spodní coiled-coil doménu TolC a sahala by až k jeho ekvatoriální doméně. Zde se naskytlo vysvětlení mechanismu otevírání periplasmatického ústí TolC, nutného k transportu substrátu. Kontakt HlyD (v komplexu s HlyB a substrátem) s ekvatoriální doménou by vyvolal alosterickou změnu ve vnitřních párech coiled-coil helixů (H7, H8), které by se částečně rozvinuly, napřímily, zařadily se podél vnějších párů (H3,H4), a tím by způsobily rozšíření ústí TolC, a to až na kružnici o průmětu 30 Å. Zároveň by všech šest párů coiled-coil helixů v otevřeném stavu přechodně interagovalo s domnělým alfa-barelem HlyD, přičemž interakce by vyžadovala energii a po uvolnění ADP by se komplex rozpadl (Sharff et al., 2001). Tento model byl experimentálně potvrzen (Andersen et al., 2002; Eswaran et al., 2003). Obr. 5: Otevírání kanálu TolC. Pohled na ústí coiled-coil domény zespoda z periplasmy. A uzavřený stav, vnitřní páry coiled-coil helixů H7 a H8 uzavírají vstup do kanálu, a B otevřený stav, kdy jsou již všechny páry coiled-coil H7, H8, H3 i H4 rozprostřeny po obvodu ústí kanálu. Jeden z monomerů je vybarven. Vazby jsou znázorněny čárkovaně. Uzavřený stav je originální krystalografickou strukturou, otevřený stav je pouze model, obojí vytvořeno (Koronakis et al., 2000). Obrázek převzat a upraven z (Koronakis et al., 2004). TolC, protein vnější membrány Escherichia coli, se neúčastní pouze sekrece proteinů sekrečním aparátem typu I. Tvoří komplex s různými proteiny ve vnitřní membráně, například v komplexu s proteiny AcrA/AcrB vylučuje toxické látky (detergenty, antibiotika, těžké kovy) z cytoplasmy (Fralick, 1996). 12

19 Formování sekrečního aparátu HlyB je při tvorbě sekrečního kanálu ve formě dimeru (Zaitseva et al., 2005), HlyD je trimer (Thanabalu et al., 1998) či hexamer (Lee et al., 2012), TolC je trimer (Koronakis et al., 2000). HlyB společně s trimerickým HlyD tvoří komplex ve vnitřní membráně i bez přítomnosti TolC a substrátu. Po interakci substrátu s oběma proteiny HlyB i HlyD dochází k navázání proteinu vnější membrány TolC. Tvorbu transmembránového kanálu doprovázejí konformační změny všech tří proteinů. Jak HlyD, tak TolC tvoří kanál ve formě trimerů. Hned po translokaci substrátu dochází k odloučení TolC od komponent ve vnitřní membráně. K asociaci komponent kanálu stačí pouze navázání substrátu a ATP, probíhá i při blokaci jeho hydrolýzy. V takovém případě je ovšem sekrece HlyA v průběhu procesu zastavena (Thanabalu et al., 1998). K interakci HlyD se substrátem slouží jeho N-terminální cytosolická doména. Byly vytvořeny nejrůznější deleční mutanty v této doméně, a zjišťován jejich vliv na formování sekrečního aparátu. Delece místního amfipatického helixu zastavila export, ale nezměnila schopnost vázat substrát a TolC. Deleční mutanta v oblasti nabitých aminokyselin vázala substrát, ale už ne TolC. HlyD bez celé této domény ani nenavázal substrát, stále však trimerizoval a vázal HlyB (Balakrishnan et al., 2001). Stabilita HlyD byla výrazně snížena v nepřítomnosti jednoho z partnerů, buď HlyB nebo TolC, což svědčí o konformační změně HlyD, vyvolané po jejich navázání. Bez obou proteinů HlyB i TolC zároveň je totiž HlyD mnohem stabilnější. Zároveň je HlyD velmi rychle degradován, když je modifikován C-konec proteinu (Pimenta et al., 1999). Ačkoli je zřejmé, že HlyD interaguje s TolC, informace o tom, v jakém místě k tomu dochází, se liší. Lee a kol. (2012) ukázali, že jde o kontakt periplasmatických špiček alfahelixů TolC a alfa-helikálního vrcholu HlyD, kdežto Koronakis a kol. (2000) a Sharff a kol. (2001) navrhují kontakt coiled-coil helixů HlyD s ekvatoriální doménou TolC, ze které by se následně alostericky přenášela změna konformace na špičky coiled-coil helixů v ústí TolC. 13

20 Mechanismus sekrece HlyB a HlyD tvoří v membráně komplex a oba postupně interagují se substrátem, sekvence událostí však není známa. Konformační změna HlyD po navázání substrátu vyvolá připojení TolC a zformování sekrečního komplexu (Thanabalu et al., 1998). Také NBD doména HlyB v cytoplasmě rozezná C-terminální sekreční signál na molekule substrátu. Následně NBD doména naváže molekulu ATP, který vytěsní substrát HlyA a tím zahájí jeho transport (Benabdelhak et al., 2003). Hydrolýza ATP je nezbytná pro transport (Koronakis et al., 1995). Sekrece je mimo hydrolýzy ATP poháněna také protonovým gradientem, který je potřebný pouze v časné fázi sekrece, na úrovni vazby substrátu či průchodu cytoplasmatickou membránou (Koronakis et al., 1991). Není známo, zda je kanál tvořen HlyB nebo HlyD. HlyD je možná jenom spojka, která váže TolC, a indukuje otevření jeho periplasmatického ústí, ale netvoří vlastní kanál. Substrát je velmi rychle transportován a možná už v průběhu sekrece a určitě po ní postupně zaujímá správnou konformaci. Obr. 6: Mechanismus sekrece sekrečním aparátem typu I. HlyB je zobrazen modře, jeho CLD doména červeně, HlyD zeleně, TolC oranžově, substrát černě, sekreční signál červeně, vazebná místa pro Ca 2+ v RTX (Repeats-in-toxin) doméně jsou znázorněna kroužky. A HlyB a HlyD tvoří ve vnitřní membráně za nepřítomnosti substrátu stabilní komplex. B Sekreční signál substrátu HlyA interaguje s NBD doménami HlyB a s fúzním proteinem HlyD, ke komplexu se přidává TolC, a je vytvořen translokační kanál, procházející oběma mebránami. C rychlá translokace nesbaleného substrátu. D sbalení HlyA vlivem Ca 2+ v extracelulárním prostoru a disociace sekrečního aparátu. Převzato z (Kanonenberg et al., 2013). 14

21 2.3. Substráty TISS Obecná charakteristika substrátů TISS Většina proteinů sekretovaných sekrečním aparátem typu I patří do rodiny RTX (z angl. Repeats-in-toxin) proteinů, které charakterizují následující znaky: i. v C-koncové oblasti proteinů se vyskytuje různý počet nonapeptidových repetic ii. s vysokým výskytem aminokyselin glycinu a aspartátu a typickou sekvencí N GGXGXDXUX C (X je jakýkoli aminokyselinový zbytek, U je hydrofobní zbytek (Leu, Ile, Phe) (Baumann et al., 1993), přesná skladba sekvence se však u různých autorů poněkud liší a při určování počtu repetic pak záleží na tom, jakou odchylku od dané sekvence autoři ještě tolerují. Analýzu velkého počtu bakteriálních genomů s vyhledáváním RTX repetic (konkrétně sekvence GGXGXDXXX) provedli například Delepelaire a kol. (2004). Zjistili, že repetic může být u RTX proteinů jen několik, ale i více než padesát, a hemolysin HlyA jich má 13 (Delepelaire, 2004). Repetice popsané v bodě i. váží vápenaté ionty, což je klíčové pro správné sbalení proteinu do unikátní tzv. β-roll či β-helixové struktury. Ta je tvořena pravotočivou šroubovicí, zavinutou z beta-skládaných listů, přičemž vždy prvních šest aminokyselinových zbytků nonapeptidové repetice tvoří smyčku, vázající vápník, a zbylé tři formují zmíněný beta-skládaný list (Obr. 7) (Baumann et al., 1993). iii. RTX proteiny jsou charakteristické vysokou kyselostí (pi okolo 4) a velmi nízkým až žádným výskytem cysteinových zbytků 2004). (Delepelaire, iv. Všechny jsou gramnegativními bakteriemi sekretovány do extracelulárního prostoru sekrečním aparátem typu I. v. RTX proteiny mají různé biologické funkce. Patří mezi ně strukturní proteiny ochranné S-vrstvy na povrchu bakterií, proteiny symbiotických bakterií účastnící se tvorby hlízek na rostlinách, bakteriociny škodící ostatním bakteriím (kolicin V Escherichia coli), 15 Obr. 7: Paralelní β-roll struktura RTX proteinů. Pohled svrchu A a zboku B na 3D model alkalické proteázy Pseudomonas aeruginosa vytvořený na základě dat (Baumann et al., 1993). Proteinová kostra je znázorněna šedě, krátké paralelní β listy modře a Ca 2+ ionty žlutě.

22 různé hydrolytické enzymy (proteázy, lipázy, fosfatázy, nukleázy), účastnící se kolonizace hostitele a tedy virulence, a v neposlední řadě přímo bakteriální cytotoxiny. Funkce většiny RTX proteinů, stále identifikovaných v nově sekvenovaných bakteriálních genomech, však zůstává neznámá (Delepelaire, 2004; Linhartova et al., 2010). Ne úplně všechny proteiny, sekretované TISS, však obsahují RTX repetice, výjimkou je například protein HasA z bakterie Serratia marcescens. Ten získává železo, potřebné pro metabolismus bakterie, a to ve volné formě či navázané na hem (Letoffe et al., 1994). Od ostatních substrátů TISS se liší také tím, že jeho C-terminální sekreční signál je v průběhu sekrece či po ní odštěpován (Izadi-Pruneyre et al., 1999). Substráty tohoto aparátu se velmi liší velikostí: povrchový protein biofilmů vytvářených Pseudomonas fluorescens, LapA, má okolo 900 kda (Hinsa et al., 2003), kdežto bakteriocin kolicin V má jen 5,8 kda (Gilson et al., 1990) Sekrece nesbalených proteinů Sekrece proteinů sekrečním aparátem typu I je inhibována jejich sbalením v cytoplasmě (Kenny et al., 1991). Všeobecný předpoklad, že proteiny jsou sekretovány v převážně nesbaleném stavu, byl definitivně potvrzen vyřešenou strukturou proteinu TolC, jímž tvořený kanál má v nejužším místě průměr 30 Å (Holland et al., 2005). V jiném review je naproti tomu uvedeno, že těchto 30 Å je dostatečně velký průměr na to, aby byl kanál TolC schopen pojmout proteiny se sekundární strukturou a dokonce i sbalené malé polypeptidy (Delepelaire, 2004). Substráty tedy pravděpodobně zaujímají sekundární strukturu, ovšem zcela jistě ne struktury vyššího řádu. Předpokládá se, že substráty TISS jsou v cytoplasmě drženy v nesbaleném stavu nějakým chaperonem (Holland, 2004), ovšem zatím jediný prokázaný případ je chaperon SecB, vázající a udržující vnesbaleném stavu protein HasA z bakterie Serratia marcescens (Delepelaire and Wandersman, 1998). V případě RTX proteinů zajišťují nesbalenou konformaci dvě skutečnosti: i. Zaprvé je to velice nízká koncentrace (<100nM) vápenatých iontů v buněčném cytosolu (Gangola and Rosen, 1987), při které je RTX doména v nesbaleném, hydratovaném stavu. Vlivem vazby vápníku v oblasti RTX repetic se protein 16

23 ii. v extracelulárním prostoru (kde je koncentrace vápníku okolo 2mM) sbaluje do kompaktní sekundární a terciární struktury a nabývá funkčnosti (Baumann et al., 1993; Chenal et al., 2009). Poměrně novým poznatkem je, že všechny ABC přenašeče, účastnící se sekrece RTX toxinů, obsahují CLD doménu. CLD doméně byla, vzhledem k její interakci s RTX repeticemi nesbalené molekuly substrátu, přiřazena funkce jakéhosi,,chaperonu, zabraňujícímu agregaci či degradaci proteinu v cytosolu. CLD doména pravděpodobně udržuje protein v nesbaleném stavu až do translace C-koncového sekrečního signálu, který je následně rozeznán, což způsobí rychlou sekreci proteinu (Lecher et al., 2012). Tato nečekaná funkce CLD domény vysvětluje, proč byla zachována v průběhu evoluce, ačkoli je vlastně proteolyticky inaktivní variantou C39 peptidázy (Kanonenberg et al., 2013). CLD doména je každopádně nepostradatelná pro sekreci (Lecher et al., 2012). Zda jsou pro sekreci nezbytné i RTX repetice, je sporné. Výsledky několika skupin ukazují, že k sekreci proteinů o větší molekulové hmotnosti, převážně hybridních, je zachování alespoň několika RTX repetic nezbytné (Delepelaire and Wandersman, 1990; Felmlee and Welch, 1988; Letoffe and Wandersman, 1992; Mackman et al., 1987). Naproti tomu k sekreci hybridního proteinu, obsahujícího pouze sekreční signál HlyA fúzovaný s alkalickou fosfatázou, došlo i v nepřítomnosti RTX repetic (Gentschev et al., 1990) a zkrácená 12 kda dlouhá forma HlyA, zcela pozbývající RTX repetice, je sekretována (Mackman et al., 1987). Sekrečního aparátu Escherichia coli je využíváno v biotechnologiích pro produkci cizorodých proteinů, fúzovaných se sekrečním signálem HlyA. Bylo zjištěno, že sekrece těchto proteinů je závislá na rychlosti jejich sbalování v cytoplasmě, rychle sbalené proteiny nebyly sekretovány. Bylo navrhnuto použití mutant, které se sbalují pomaleji, ovšem jejich schopnost nakonec zaujmout nativní konformaci zůstává neporušena (Bakkes et al., 2010). Neaktivní hemolysin byl sekretován v bakteriích s narušenou syntézou LPS molekul lipopolysacharidů ve vnější membráně. Tento fakt poukazuje na jejich roli ve sbalování proteinu. Molekuly hemolysinu byly v těchto pokusech agregovány. Následnou denaturací a opětným sbalením se aktivita hemolysinu navrátila (Bauer and Welch, 1997; Stanley et al., 1993). 17

24 Další studie ukazují, že ke sbalování HlyA napomáhají již komponenty sekrečního aparátu HlyD a TolC, jelikož mutace v těchto proteinech vedou k sekreci neaktivního HlyA. V případě mutací vtolc byla celkově také zpomalena sekrece. Defekt autoři vysvětlili u různých mutací buď ovlivněním pohybů helixů TolC při otevírání, narušením struktury beta-barelu TolC v membráně či nefunkční interakcí s HlyD/HlyB (Vakharia et al., 2001). Mutace v HlyD, pravděpodobně ovlivňující integritu jím tvořeného kanálu, vedou rovněž k sekreci inaktivního hemolysinu (Pimenta et al., 2005) Charakteristika sekrečního signálu Sekreční signál pro sekreční aparát typu I je lokalizován v C-koncové oblasti proteinů (jedinou výjimkou je kolicin V s N-koncovým signálem (Gilson et al., 1990)) a není odštěpován během sekrece ani po ní (Felmlee et al., 1985a). Sekreční signál hemolysinu A zahrnuje zhruba 50 aminokyselin na C-konci proteinu (Kenny et al., 1992). Fúzí C-koncové oblasti HlyA s jiným proteinem, ze kterého byl předtím odštěpen jeho původní N-koncový sekreční signál, byl vytvořen hybridní protein, sekretovaný do média sekrečním aparátem typu I (Mackman et al., 1987). Přestože každý TISS přirozeně slouží k sekreci jednoho konkrétního proteinu, bylo mnohokrát ukázáno, že specificita rozpoznání není tak veliká, a že může dojít také k rozpoznání do značné míry mutovaných proteinů (Kenny et al., 1992; Koronakis et al., 1989), či cizorodých proteinů z jiných organismů (Masure et al., 1990; Zhang et al., 1993). Co se týče in vivo rozeznání sekrečního signálu, Kenny a kol. (1992) nalezli několik aminokyselinových zbytků, které se pro něj zdají být nepostradatelné (Kenny et al., 1992). Obecně je konzervovanost aminokyselinových zbytků v C-koncové oblasti u různých substrátů TISS velice malá a zdá se, že na primární sekvenci příliš nezáleží, což přináší možnost, že k rozeznání signálu je využívána spíše více konzervovaná sekundární struktura, u hemolysinu jde o stukturu helixovou (Hui et al., 2000; Yin et al., 1995; Zhang et al., 1998). Naproti tomu studie s použitím nukleární magnetické rezonance a cirkulárního dichroismu ukazuje, že C-terminální oblast proteázy G z Erwinia chrysanthemi je ve vodném roztoku z velké části rozvolněná (Wolff et al., 1994), což může představovat skutečný stav in vivo (Holland et al., 2005). 18

25 2.4. Adenylátcyklázový toxin Struktura adenylátcyklázového toxinu Adenylátcyklázový toxin spojuje ve svých 1706 aminokyselinách dvě enzymové aktivity (Glaser et al., 1988). První aktivita je adenylátcyklázová, zprostředkovaná tzv. AC (Adenylate Cyclase) doménou, tvořenou 400 N-koncovými aminokyselinami. Tato doména obsahuje také čtyři regiony, vážící molekulu kalmodulinu, který adenylátcyklázu aktivuje (Guo et al., 2005; Ladant, 1988). Druhá je funkce klasického cytolysinu, způsobujícího póry vmembráně, obsažená ve zbylých 1306 aminokyselinách směrem k C-konci. Tato část, nazývaná RTX hemolysin, je členěna na několik dalších domén: i) hydrofobní doménu, tvořící póry v membráně (aminokyseliny ) (Benz et al., 1994); ii) aktivační doménu, která obsahuje lysiny K983 a K860, posttranslačně palmitoylované na ε-amino skupině, nezbytné pro správnou funkci toxinu. Modifikaci provádí produkt genu cyac (Hackett et al., 1994; Hackett et al., 1995; Masin et al., 2005); iii) RTX doménu, s okolo 45 vazebnými místy pro vápník v nonapeptidových repeticích (sekvence GGXGXDXLX) mezi aminokyselinami 1007 a 1706 (Rose et al., 1995). Na úplném C-konci proteinu se nachází sekreční signál (Sebo and Ladant, 1993). Obr. 8: Adenylátcyklázový toxin schéma molekuly. Převzato z (Kamanová, 2005). 19

26 Mechanismus působení adenylátcyklázového toxinu na buňky Adenylátcyklázový toxin kombinuje dvě strategie bakteriálních toxinů negativně ovlivňující buněčnou fyziologii: i) neregulovatelné zvyšování hladiny camp matoucí buněčnou signalizaci; ii) tvorba membránových pórů, poškozujících rovnováhu iontů vně a uvnitř buňky (Vojtova et al., 2006). Vápenaté ionty mají klíčovou úlohu v aktivitě adenylátcyklázového toxinu (Hanski and Farfel, 1985). Adenylátcyklázový toxin se inzertuje do membrány cílových buněk a rovnou translokuje AC doménu do cytosolu, nevstupuje do buňky endocytickou cestou (Gordon et al., 1988). Adenylátcyklázová doména po aktivaci eukaryotickým kalmodulinem katalyzuje nekontrolovatelnou přeměnu ATP na camp, který má toxický efekt na makrofágy a zastaví jejich imunitní odpověd: schopnost usmrcení pohlcených bakterií, oxidativní vzplanutí a chemotaxi (Confer and Eaton, 1982). Vytvořený camp kompletně změní buněčnou signalizaci napadených fagocytů (Hickey et al., 2008; Kamanova et al., 2008). Ve vyšších koncentracích způsobí apoptotickou (Khelef et al., 1993) či nekrotickou smrt a lyzi monocytů (Basler et al., 2006). Toxin dále vytváří malé kation-selektivní kanály (o průměru 0,6 0,8 nm) v membránách cílových buněk, což se projevuje jako hemolytická aktivita na erytrocytech. Póry způsobují únik draslíku z buněk. Pórotvorná funkce je obsažena v části hydrofobní domény a RTX hemolysinu a neúčastní se jí AC doména, a vyžaduje aktivaci lysinu 983 proteinem CyaC (Benz et al., 1994). Experimenty nasvědčují, že pór je tvořen oligomerem toxinu (Betsou et al., 1993; Szabo et al., 1994; Vojtova-Vodolanova et al., 2009). Receptorem na buněčném povrchu je integrin CD11b/CD18, nazývaný též α M β 2 integrin, komplementový receptor 3 (CR3) nebo Mac-1 (Guermonprez et al., 2001). Za vazbu je zodpovědná oblast toxinu vymezená aminokyselinami (El-Azami-El-Idrissi et al., 2003). Tento receptor obsahují neutrofily, monocyty a makrofágy, NK buňky a dendritické buňky. Mnohé experimenty ukazují nezávislost a oddělitelnost dvou membránových aktivit adenylátcyklázového toxinu tvorby pórů a translokace AC domény a jsou tak v souladu s modelem, který předpokládá dva různé konformery toxinu, které vytvoří po vazbě na buňky a inzerci do membrány různé konformace. První v membráně oligomerizuje a vytváří póry, jimiž uniká draslík. Druhý konformer zůstává v monomerní formě, způsobí 20

27 translokaci AC domény do cytosolu a tato doména následně přeměňuje ATP na camp (Basler et al., 2007; Gray et al., 1998; Gray et al., 2001; Osickova et al., 2010; Osickova et al., 1999; Vojtova-Vodolanova et al., 2009). Událost translokace AC domény doprovází zvýšení intracelulární koncentrace Ca 2+, nezávislé na vytvořených kation-selektivních pórech ani na úniku vápníku ze zásob v rámci buňky (Fiser et al., 2007). Tento vápník aktivuje proteázu kalpain, která štěpí protein talin, spojující integrin CD11b/CD18 s cytoskeletem, a celý komplex translokačního konformeru i s jeho receptorem se přesune do prostředí lipidových raftů, kde molekuly cholesterolu asistují translokaci (Bumba et al., 2010). Obr. 9: Adenylátcyklázový toxin model mechanismu působení na buňky. Model ukazuje dva konformery adenylátcyklázového toxinu, které jsou v roztoku v rovnováze. Každý z nich po inzerci do membrány zaujme jinou konformaci. Translokační prekurzor zůstane v monomerní formě a spolu s indukcí vtoku vápenatých iontů do cytoplasmy translokuje do buňky AC doménu. Daší, pórotvorný prekurzor, oligomerizuje a způsobí vtok draslíku do buňky. Transmembránové segmenty jsou v obou případech shodné, pouze zaujímají jinou konformaci. Převzato a upraveno z (Osickova et al., 2010) Sekrece adenylátcyklázového toxinu bakterií Bordetella pertussis Hemolysin z Escherichia coli a adenylátcyklázový toxin z Bordetella pertussis jsou sekretovány stejným mechanismem. Geny cyab a cyad z Bordetella pertussis jsou vysoce homologní s geny hlyb a hlyd. Geny, kódující jak sekreční aparát typu I, tak adenylátcyklázový toxin, jsou soustředěny do operonu cyaabde (Glaser et al., 1988), gen cyac 21

28 sousedí s genem cyaa a je transkribován v opačném směru (Barry et al., 1991). V tomto operonu je na rozdíl od Escherichia coli zahrnut také gen pro protein vnější membrány cyae. Transkripce operonu je pod kontrolou Bvg dvousložkového regulačního systému (Scarlato et al., 1990). Adenylátcyklázový toxin může být sekretován systémem Escherichia coli pro sekreci HlyA (Masure et al., 1990). Obr. 10: Srovnání cya operonu Bordetella pertussis a hly operonu Escherichia coli. Homologními geny jsou cyaa/hlya, cyac/hlyc a dále cyab/hlyb a cyad/hlyd pro komponenty sekrečního aparátu. Gen pro OMP CyaE je zahrnut v operonu, na rozdíl od genu pro TolC Escherichia coli. Převzato a upraveno z (Glaser et al., 1988). Adenylátcyklázový toxin není na rozdíl od většiny RTX proteinů veškerý sekretován do média, ale zůstává na povrchu bakterie navázán na filamentózní hemaglutinin (FHA) (Zaretzky et al., 2002). FHA je adhesin, sloužící k uchycení bakterie na povrchu hostitelských buněk respiračního epitelu a přispívá k její virulenci (Watanabe and Nakase, 1982). Adenylátcyklázový toxin nově sekretovaný živou bakterií je nezbytný pro intoxikaci buněk, nepůsobí na ně toxin navázaný na povrchu bakterie (Gray et al., 2004). 22

29 3. Závěr V porovnání s ostatními sekrečními aparáty gramnegativních bakterií je sekreční aparát typu I poměrně jednoduchý, formovaný kanálem pouze ze tří proteinů, překlenujícím obě membrány a periplasmu. Transport proteinu je jednokrokový, bez periplasmatického intermediátu. Sekreční aparát Escherichia coli, složený z ATPázy HlyB ve vnitřní membráně, fúzního proteinu HlyD a proteinu vnější membrány TolC, je prostudován snad nejvíce, přesto zůstávají k zodpovězení i tak základní otázky, jako zda je kanál formován proteinem HlyB či HlyD, jaká je posloupnost událostí při formování aparátu, jakým způsobem pohání hydrolýza ATP transport molekuly kanálem, či v jakých oblastech spolu jednotlivé proteiny interagují. K pochopení mechanismu sekrece velmi přispívají vyřešené struktury proteinů, ze kterých se aparát skládá. Struktura téměř kompletního TolC posunula poznání nejvíce, na jejím základě byl navrhnut elegantní model otevírání, připodobňovaného k rozevírání clony ve fotoaparátu, a to v okamžiku, kdy komplex HlyB a HlyD naváže substrát a TolC z vnější membrány. Struktury NBD domén ABC přenašečů zase pomáhají pochopit katalytický cyklus hydrolýzy ATP, v případě HlyB se jedná o struktury monomeru a dimeru NBD domény. Strukturu HlyD k dispozici nemáme, existují dohady, zda je v membránovém komplexu trimerní či hexamerní. Substráty TISS mají různou velikost a funkci a většina z nich obsahuje RTX repetice. Často jde o faktory virulence bakterií. Sekreční signál je v drtivé většině C-terminální a velmi málo konzervovaný a vedou se spory o tom, zda je rozeznáván na základě jeho sekundární struktury či několika málo přítomných konzervovaných aminokyselin. Studium sekrečního aparátu typu I je důležité vzhledem k jeho přispívání k patogenezi bakterií. Protein TolC má dále nezávisle na TISS roli v rezistenci bakterií k antibiotikům, protože se účastní exportu léčiv z cytoplasmy bakterií. Navíc se TISS používá i v biotechnologiích, kdy plasmidy nesou geny pro sekreční aparát a požadovaný gen fúzovaný s oblastí genu pro sekreční signál HlyA (Gentschev et al., 1996) či k sekreci heterologních antigenů atenuovanými kmeny gramnegativních bakterií v živých vakcínách (Gentschev et al., 2002). Nejzajímavější je pro mě otázka sbalování proteinu až po sekreci. Veškeré evidence naznačují, že proteiny při průchodu aparátem nezaujímají strukturu vyšší než sekundární. U RTX proteinů je jejich nesbalený stav zajištěn nepřítomností vápníku v cytoplasmě, 23