Funkční vzorek. Přípravek pro léčbu MRSA infekcí. hospodářských zvířat s obsahem fágového lyzátu

Transkript

1 Funkční vzorek Přípravek pro léčbu MRSA infekcí hospodářských zvířat s obsahem fágového lyzátu

2 Autoři Bentley Czech s.r.o. Mgr. Jan Říha, Ph.D. Mgr. Hana Nejeschlebová Masarykova univerzita prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc., doc. RNDr. Roman Pantůček, Ph.D. Mgr. Martin Benešík, Ph.D. Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o. doc. RNDr. Marcela Klimešová, Ph.D. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D. MVDr. Ivana Koláčková, Ph.D. Funkční vzorek byl vytvořen v rámci projektu Mze NAZV KUS č. QJ Vydal Bentley Czech s.r.o. Počernická 272/96, Praha 10, , ČR, IČ , DIČ CZ

3 Obsah Úvod Cíl Popis funkčního vzorku Popis použitého fágového lyzátu Popis přípravku Postup výroby přípravku Testování účinnosti přípravku In vitro test 1 In vitro test 2 In vivo test Srovnání novosti postupů Popis uplatnění funkčního vzorku Ekonomické aspekty Literatura Dedikace

4 Úvod Staphylococcus aureus je nejčastěji citovaným patogenem vyskytujícím se v prostředí chovu hospodářských zvířat (1). Jeho výskyt byl potvrzen i u zdánlivě zdravých zvířat (2). V posledních letech je v popředí zájmu výskyt a zvyšující se prevalence meticilinrezistentních kmenů S. aureus (MRSA) a to nejen v humánní, ale i veterinární medicíně (3). Pro léčbu bakteriálních infekcí hospodářských zvířat se v současné době využívá převážně antibiotická léčba. V souvislosti s požadovaným snížením spotřeby antibiotik, jak ve veterinární, tak humánní medicíně, je patrná snaha o vývoj alternativních léčebných postupů (4). Antibiotická léčba bakteriálních infekcí má navíc řadu nedostatků. Jedná se zejména o nárůst bakteriálních kmenů rezistentních vůči antibiotikům a tedy neúčinnost antibiotické terapie na tyto rezistentní kmeny, nutnost stanovení citlivosti bakterií k antibiotikům před zahájením terapie, u potravinových zvířat např. také povinnost dodržet ochranné lhůty znemožňující další zpracování surovin (mléko a maso). Fágová terapie se proto v současné době jeví jako vhodná alternativa pro léčbu bakteriálních infekcí. Z důvodu vysoké lytické aktivity a širokého hostitelského rozmezí jsou k terapeutickým účelům využívány zejména polyvalentní fágy rodu Kayvirus čeledi Myoviridae (5-7). Fágová terapie odstraňuje zejména problém vzrůstající rezistence bakteriálních kmenů vůči antibiotickým léčivům, např. u MRSA, za zachování vhodné specificity působení, kdy bakteriofág působí lyticky pouze za předpokladu existence vhodného hostitele. Problémem využití fágové terapie u hospodářských zvířat je neexistence vhodné lékové formy, specificita vůči bakteriím vyskytujícím se v prostředí zemědělské prvovýroby a postup vhodné aplikace. Vhodné lékové formy a specificita jsou proto předmětem vývoje. Ve formě tzv. fágového lyzátu jsou komerčně dostupné prostředky např. PyoPhage (Eliava Institute), StapylococcusPhage (Microgen), Stafal (Bohemia Pharmaceuticals). Aplikační forma fágový lyzát je však náročná na skladování nutnost chlazení, vyznačuje se omezenou dobou použitelnosti, problematická bývá i samotná aplikace jedná se typicky o málo viskózní tekutinu filtrát fágového lyzátu v pufrovaném roztoku vhodný pro lokální kožní aplikace. Aplikaci takové lékové formy však může být omezená např. v případě nazálních infekcí hospodářských zvířat, ale také vnitřní infekce orální aplikace způsobí letální reakci fága působením žaludečních šťáv či funkcí trávicího traktu. Navíc bakteriofágy používané pro terapii infekcí člověka nemusí být účinné na bakteriální kmeny v prostředí zemědělské prvovýroby.

5 Cíl Cílem tohoto funkčního vzorku bylo vytvořit a ověřit účinnost přípravku s využitím fágového lyzátu stafylokokového bakteriofága 812h1 (CAPM V-689) při léčbě bakteriálních infekcí u hospodářských zvířat způsobených kmeny Staphylococcus aureus včetně meticilin-rezistentních variant.

6 Popis funkčního vzorku Popis použitého fágového lyzátu Funkční vzorek využívá purifikovaný či nepurifikovaný fágový lyzát o výsledném titru 108 PFU/ml připravený pomnožením stafylokokového bakteriofága 812h1 na bakteriálním kmeni Staphylococcus aureus CAPM 6630 (Sbírka zoopatogenních mikroorganismů VÚVeL, Brno). Bakteriofág 812h1 je mutanta standardního fága 812 z čeledi Myoviridae, rodu Kayvirus, která je charakterizovaná sekvencí genomové DNA dostupné v databázi GenBank pod přístupovým kódem MH a je deponován ve Sbírce zoopatogenních mikroorganismů (VÚVeL, Brno) pod číslem CAPM V-689. Bakteriofág 812h1 v titru alespoň 108 PFU/ml vykazuje účinnost proti 89 % z 92 testovaných kmenů MRSA vyskytujícím se v prostředí zemědělské prvovýroby (9). Popis přípravku Jako optimální forma pro začlenění fágového lyzátu, za předpokladu zachování jeho lytických schopností u vybraných bakteriálních kmenů, do lékové formy vhodné pro lokální aplikaci u hospodářských zvířat (např. v případě nazální infekce) se jeví forma gelu. Gel je schopen vytvořit a uchovat podmínky pro přežití fága v aktivní formě a zároveň poskytnout vhodné aplikační vlastnosti perzistence na místě aplikace, prodloužení účinku díky pomalejší degradaci prostředí pro přežití fága dehydrataci gelové struktury. Stejné výhody jsou pak zjevné při skladování takového přípravku. Gel může být proveden s využitím různých substancí např. hydroxyethylcelulosa, agaragar a proveden v různé výsledné hustotě. To rozšiřuje možnosti aplikačních forem např. aplikace hustého gelu na nazální sliznici, lokální infekční místo, či použití méně viskózní formy gelu např. ve formě spreje. Pro skladování popsaných přípravků, využívajících fágového lyzátu na gelové bázi je nutné využít chemicky inertní materiály např. sklo (nikoliv plast polypropylen, atd.). Jako vhodné konzervační látky jsou stanoveny nízké obsahy kyseliny citronové 0,01 % hmotn. případně stejné množství směsi metyl- a propyl- parabenu. Vyšší dávky konzervantů vedou k inhibici fágové aktivity. Postup výroby přípravku navážka (0,3 až 0,6 % hmotn. agaru (agar-agar, bakteriologický (Carl Roth)); přidání demineralizované vody - ad 100 % hmotn.; rozmíchání agaru v roztoku; bobtnání agaru v roztoku, 15 minut; rozvaření v autoklávu 121 C, 20 minut. vychladnutí na pokojovou teplotu, rozšlehání na homogenní hmotu bez hrudek min 600 ot./min po dobu 20 min; vmíchání fágového lyzátu fága 812h1 (= CAPM V-689), purifikovaného či nepurifikovaného, ve výsledném titru min PFU/ml, do výsledné koncentrace 15 % obj. v roztoku; případně vmíchání konzervačních/stabilizujících látek (kys. citronová nebo směs metylparabenu a propylparabenu) max. 0,01 % hmotn. Výsledný přípravek je ve formě gelu perzistujícím na místě aplikace, což umožňuje jeho snadnou aplikaci a skladování. Skladování ve sterilní skleněné nádobě a v temnu. Doba použitelnosti bez významného snížení titru bakteriofága byla stanovena na 6 měsíců při skladování v lednici při 4 C.

7 Testování účinnosti přípravku In vitro test 1 Gelové přípravky s obsahem 15 % obj. purifikovaného nebo nepurifikovaného lyzátu byly testovány in vitro na 11 kmenech S. aureus. Výsledky testování vykázaly mírné rozdíly mezi oběma přípravky. U přípravku s obsahem purifikovaného fágového lyzátu byly zjištěny pozitivní reakce s testovacími kmeny i v ředění 10-4, a to u 72 % sledovaných kmenů. U přípravku s obsahem nepurifikovaného lyzátu byly v tomto ředění pozitivní reakce zaznamenány pouze u 2 kmenů (18 %) (Tabulka 1 a 2). Tabulka 1. Výsledky in vitro testování přípravku s obsahem purifikovaného fága Označení kmene MLST/spa typ Původ Ředění fágového přípravku neředěný SAV113 ST398/t011 prase SAV139 ST398/t011 prase CL SAV337 ST398/t034 skot CL CL SAV342 ST398/t034 prase CL CL SAV719 ST398/t2346 prase CL SAV721 ST398/t1255 skot SCL SAV729 ST398/t034 prase SCL SAV753 ST398/t011 skot SCL SA1098 ST8/t064 koza CL CL SCL SA2094 ST361/t315 skot CL CL SA2171 ST398/t011 skot SCL CL (konfluentní lýza), SCL (semi- konfluentní lýza), +++ (více než 10 plak), ++ (5 až 10 plak), + (2 až 5 plak), - negativní reakce. Tabulka 2. Výsledky in vitro testování přípravku s obsahem nepurifikovaného fága Označení kmene MLST/spa typ Původ Ředění fágového přípravku neředěný SAV113 ST398/t011 prase SAV139 ST398/t011 prase SCL SAV337 ST398/t034 skot CL SCL SAV342 ST398/t034 prase CL CL SAV719 ST398/t2346 prase CL SAV721 ST398/t1255 skot SCL SAV729 ST398/t034 prase SCL SAV753 ST398/t011 skot SCL SA1098 ST8/t064 koza CL CL SA2094 ST361/t315 skot CL CL SA2171 ST398/t011 skot CL SCL CL (konfluentní lýza), SCL (semi-konfluentní lýza), +++ (více než 10 plak), ++ (5 až 10 plak), + (2 až 5 plak), - negativní reakce

8 In vitro test 2 Stanovením účinnosti přípravků na bázi agaru a hydroxyethylcelulosy s 15 % adicí fágového lyzátu bakteriofága 812h1 se dále zabývá např. práce (10), která popisuje využití metody testování účinnosti přípravků pomocí detekce změny vodivosti a vhodný design experimentu pro toto stanovení, včetně provedení pozitivní a negativní kontroly. V rámci experimentu byla testována účinnost samotného lyzátu bakteriofága 812h1 (7,5 x 10 9 PFU) (ÚEM, MU, Brno) a dále s označením G1 (obsahuje agar jako bázovou recepturu) a S1/G2 (obsahuje hydroxyethylcelulosu jako bázovou recepturu) s 15% obsahem tohoto bakteriofágového stafylokokového lyzátu, u kterých byla prokázána inhibice růstu kontrolního kmene Staphylococcus aureus CCM 3953 (Česká sbírka mikroorganismů, MU, Brno) (Obrázek 2). Inhibiční aktivita fágového lyzátu na kontrolní kmen je patrná z Obrázku 1. Užité bázové receptury pro oba přípravky (agar a hydroxyethylcelulosa) neinhibují aktivitu fágového lyzátu, a tudíž se jeví jako vhodné pro výrobu fágových přípravků. V rámci tohoto experimentu proběhlo také testování vhodného obalového materiálu pro oba přípravky. Polypropylen, jako materiál použitý pro uskladnění přípravků, inhibuje podle výsledků experimentu aktivitu fágového lyzátu, a nelze ho proto doporučit pro skladování přípravků s obsahem fágového lyzátu. Vhodnějším materiálem pro tyto účely je sklo A2 A4 A5 400 Relative Conductivity change (ms) Time (min) Obrázek 1. Růstové křivky vzorků pro testování účinnosti lyzátu (vzorek A4, A5) a pozitivní kontrola (vzorek A2) A2 A8 B6 400 Relative Conductivity Change (ms) Time (min) Obrázek 2. Růstové křivky vzorků přípravků obsahujících fágový lyzát (vzorek A8, B6) a pozitivní kontrola (vzorek A2).

9 In vivo test Testování probíhalo v souladu se schváleným projektem pokusu č /2015-MZE v experimentálních stájích Výzkumného ústavu veterinárnícho lékařství, v.v.i. K testování byla použita odstavená selata o hmotnosti 6 až 12 kg. Zvířata byla rozdělena do skupin: KONEG selata bez infekce MRSA (7 ks) KOPOZ selata s infekcí bez aplikace přípravku (6 ks) TEST 1 selata s infekcí MRSA a aplikací přípravku na bázi purifikovaného fágového lyzátu (6 ks) TEST 2 selata s infekcí MRSA a aplikací přípravku na bázi nepurifikovaného fágového lyzátu (6 ks) Infekce čelenžním kmenem MRSA S. aureus (SAV342) byla provedena u příslušných skupin na začátku pokusu (v den 0) intranazálně aplikací 1 ml bakteriální suspenze z kmene SAV342 o denzitě (2 x10 5 CFU/ml) a byla opakována až do 13. dne. Úroveň kolonizace byla sledována v kontrolních nazálních výtěrech odebíraných 4., 7., 11. a 13. den, kdy byla zjištěna průměrná denzita MRSA 5 x 10 3 CFU/ml ve skupině pozitivní kontrola a test 2, 3 x 10 2 CFU/ml ve skupině TEST 1. Od 14. dne pokusu byl zvířatům ve skupinách TEST 1,2 aplikován intranazálně příslušný přípravek (lehký gel) s obsahem nepurifikovaného fágového lyzátu (TEST 1) nebo purifikovaného fágového lyzátu (TEST 2) v dávce 2,5 ml do každé nozdry. Denzita MRSA na sliznicích byla sledována v kontrolní výtěrech odebíraných 14., 15., 16, 18., 19., 20., 21., 22. den pokusu. Bylo zjištěno, že ve skupině pozitivní kontrola (KOPOZ) došlo k navýšení počtu MRSA na finálních 1 x 10 4 CFU/ml. Ve skupině TEST 1 (přípravek s obsahem nepurifikovaného fágového lyzátu) došlo také k navýšení MRSA o 1 řád tj. 5 x 10 3 CFU/ml. U skupiny TEST 2, kde byl aplikován přípravek s obsahem purifikovaného fágového lyzátu, došlo ke snížení počtu MRSA na 5 x 10 2 CFU/ml. Současně byla také sledována schopnost přežívání bakteriofágů na nazální sliznici testovaných prasat a bylo prokázáno, že fágy je možné zpětně izolovat z nazálních výtěrů testovaných prasat za 24 h od aplikace obou přípravků. Pokus na zvířatech potvrdil schopnost přípravků s obsahem purifikovaného fágového lyzátu omezit výskyt kmenů S. aureus/mrsa, i když nedochází k jejich úplné eliminaci.

10 Srovnání novosti postupů Na trhu jsou dostupné přípravky s využitím fágového lyzátu, např. PyoPhage (Eliava Institute), StapylococcusPhage (Microgen), Stafal (Bohemia Pharmaceuticals). Ve srovnání s těmito přípravky nabízí funkční vzorek především tyto inovace: využití fágového lyzátu mutanty fága 812 (812h1), která se vyznačuje baktericidním účinkem proti kmenům MRSA vyskytujícím se v prostředí zemědělské prvovýroby a je tak cílena na podporu léčby MRSA infekcí u hospodářských zvířat; použití bázové receptury vhodné k adici lyzátu, která je zároveň vhodnou lékovou formou k aplikaci např. do nazální dutiny hospodářských zvířat, současně prodlužuje dobu skladování přípravku a snižuje množství použitého lyzátu v receptuře za zachování její účinnosti; účinnost přípravku ověřenou in vitro a in vivo testováním.

11 Popis uplatnění funkčního vzorku Přípravek s využitím fágového lyzátu bakteriofága 812h1 byl vytvořen zejména za účelem řešení projektu MZe NAZV KUS č. QJ k zajištění in vitro a in vivo testů plánovaných v rámci projektu. Přípravek umožňuje další výzkumné aplikace v oblasti využití fágové terapie pro podporu léčby stafylokokových infekcí hospodářských zvířat prasata, skot, za předpokladu jeho potvrzené účinnosti a metodickému podkladu pro její další hodnocení. Funkční vzorek je možné využít přímo jako lékovou formu (za předpokladu splnění formálních požadavků) při podpoře léčby MRSA infekcí hospodářských zvířat. Funkční vzorek je podkladem pro předmět ochrany duševního vlastnictví, což umožní jeho komercializaci.

12 Ekonomické aspekty V rámci projektu MZe NAZV KUS č. QJ byla uplatněna certifikovaná metodika (SVS/2018/ G) výroby fágového lyzátu bakteriofága 812h1 v objemu a kvalitě umožňující průmyslové využití. Funkční vzorek spolu s touto metodikou, případně dalšími předměty pro ochranu duševního vlastnictví, představuje možnost přímého ekonomického uplatnění v případě výroby veterinárního léčivého přípravku. Bentley Czech s.r.o. jako přímý účastník řešení projektu deklaruje zájem na využití tohoto funkčního vzorku v oblasti přímé produkce léčiva založené na jeho bázi, případně v dalších aplikacích.

13 Literatura 1. Merz A, Stephan R, Johler S Staphylococcus aureus isolates from goat and sheep milk seem to be closely related and differ from isolates detected from bovine milk. Frontiers in Microbiology, 7, 319. doi: / fmicb Murphy BP, O Mahony E, Buckley JF, O Brien S, Fanning S Characterization of Staphylococcus aureus isolated from dairy animals in Ireland. Zoonoses Public Health, 57 (4), Bhattacharyya D, Banerjee J, Bandyopadhyay S, Mondal B, Nanada PK, Samanta I, Mahanti A, Das AK, Das G, Dandapat P, Bandyopadhyay S First report on vancomycin-resistant Staphylococcus aureus in bovine and caprine milk. Microbial Drug Resistance. DOI: /mdr EMA and EFSA (European Medicines Agency, European Food Safety Authority), EMA and EFSA Joint Scientific Opinion on measures to reduce the need to use antimicrobial agents in animal husbandry in the European Union, and the resulting impacts on food safety (RONAFA). EFSA Journal;15(1): Pantůček R, Rosypalová A, Doškař J, Kailerová J, Růžičková V, Borecká P, Snopková S, Horváth R, Götz F, Rosypal S The polyvalent staphylococcal phage phi 812: its host-range mutants and related phages. Virology 246: Vandersteegen K, Mattheus W, Ceyssens P-J, Bilocq F, Vos DD, Pirnay J-P, Noben J-P, Merabishvili M, Lipinska U, Hermans K, Lavigne R Microbiological and molecular assessment of bacteriophage ISP for the control of Staphylococcus aureus. PLoS One 6:e Leskinen K, Tuomala H, Wicklund A, Horsma-Heikkinen J, Kuusela P, Skurnik M, Kiljunen S Characterization of vb_saum-frusau02, a Twort-like bacteriophage isolated from a therapeutic phage cocktail. Viruses 9: Kvachadze L, Balarjishvili N, Meskhi T, Tevdoradze E, Skhirtladze N, Pataridze T, Adamia R, Topuria T, Kutter E, Rohde C, Kutateladze M Evaluation of lyticactivity of staphylococcal bacteriophage Sb-1 against freshly isolated clinical pathogens. Microb Biotechnol 4: Doškař J, Botka T, Karpíšková R, Koláčková I, Mašlaňová I, Růžičková V, Pantůček R. Spontaneous mutants of staphylococcal polyvalent bacteriophages with broad lytic host-range on Staphylococcus aureus strains are suitable for phage therapy. In 1 st German Phage Symposium, , Hohenheim (Germany). 10. Nejeschlebová H, Říha J. Metoda pro hodnocení účinku přípravků s obsahem bakteriofágového stafylokokového lyzátu na růst bakterií Staphylococcus aureus pomocí detekce změny vodivosti. Mlékařské listy zpravodaj, 2018, 166, 29 (1): 7-10.

14 Dedikace Funkční vzorek byl vytvořen v rámci projektu MZe NAZV KUS č. QJ

15