Kyselina askorbová a její role v reakcích rostlin na stres

Transkript

1 Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Kyselina askorbová a její role v reakcích rostlin na stres Martina Malinová Bakalářská práce Brno, Česká republika 2009

2 Na tomto místě bych ráda poděkovala paní Mgr. Haně Cempírkové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a vstřícný přístup během zpracování této práce. Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití pramenů a literatury uvedených v seznamu. V Brně 26. února

3 Abstrakt Kyselina askorbová je jedním z hlavních metabolitů v rostlinách. Je to důležitý antioxidant a ve spolupráci s ostatními složkami antioxidačního sytému chrání rostliny proti poškození reaktivními formami kyslíku, jejichž tvorba je důsledkem aerobního metabolismu rostlin, fotosyntézy a působení patogenů, sucha, extrémních teplot nebo dalších fyzikálních i chemických jevů. Kromě antioxidační funkce a funkce enzymového kofaktoru se kyselina askorbová podílí na buněčném dělení, na kontrole roztahování buněčné stěny, redukci iontů některých přechodných kovů, regeneraci α-tokoferolu a mimo jiné hraje také důležitou roli při absorpci NO 2. Biosyntéza kyseliny askorbové v rostlinách ještě nebyla zcela objasněna, ale poznatky týkající se pravděpodobné biosyntetické cesty byly shrnuty a sepsány. Člověk je jedním z mála živočichů, kteří si nedokáží kyselinu askorbovou syntetizovat, přestože je pro člověka tato látka naprosto nepostradatelná. Člověk je tedy závislý na příjmu kyseliny askorbové v potravě. Abstract Ascorbic acid is one of the main metabolites in plants. It is an important antioxidant, and in cooperation with other components of the antioxidant system, protects plants against damage caused by reactive oxygen species. Reactive oxygen species are produced during aerobic metabolism, photosynthesis and owing to pathogens, drought, extreme temperatures or the other physical and chemical factors. In addition to antioxidant function and the function as an enzyme cofactor, it has been implicated in cell division, the control of cell wall expansion, the reduction of some transition metal ions, the regeneration of α-tocopherol and it also plays an important role in the NO 2 uptake. The biosynthetic pathway of ascorbic acid in plants has not been identified yet and evidence for the proposed pathways is reviewed. Man is one of the few animals who are not able to synthesize ascorbic acid, although it is absolutely indispensable for humans. So man is dependent on the intake of ascorbic acid in the diet.

4 Obsah 1 ÚVOD CHEMICKÉ VLASTNOSTI A STRUKTURA KYSELINY ASKORBOVÉ SYNTÉZA KYSELINY ASKORBOVÉ BIOSYNTÉZA V ROSTLINÁCH BIOSYNTETICKÁ CESTA S VYUŽITÍM L-GALAKTONO-1,4-LAKTONU BIOSYNTETICKÁ CESTA S VYUŽITÍM D-GLUKOSONU A L-SORBOSONU BIOSYNTÉZA U OBRATLOVCŮ PRŮMYSLOVÁ VÝROBA VÝSKYT A SUBBUNĚČNÁ LOKALIZACE KYSELINY ASKORBOVÉ FUNKCE KYSELINY ASKORBOVÉ V ROSTLINÁCH KYSELINA ASKORBOVÁ V ROLI ENZYMOVÉHO KOFAKTORU FUNKCE KYSELINY ASKORBOVÉ PŘI BUNĚČNÉM DĚLENÍ VLIV KYSELINY ASKORBOVÉ NA RŮST ROSTLINY A OCHRANA PŘED OZÓNEM ROLE KYSELINY ASKORBOVÉ PŘI ABSORPCI NO KYSELINA ASKORBOVÁ JAKO PROOXIDANT KYSELINA ASKORBOVÁ A REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU A ZPŮSOB JEJICH ODSTRANĚNÍ ASKORBÁT-GLUTATIONOVÝ CYKLUS KYSELINA ASKORBOVÁ A JEJÍ REAKCE PŘI STRESOVÝCH SITUACÍCH TEPLOTNÍ STRES VLIV NESTRESUJÍCÍ TEPLOTY SVĚTELNÝ STRES VODNÍ STRES ZVÝŠENÉ MNOŽSTVÍ OZÓNU PATOGENY STRES ZNEČIŠTĚNÍM ROSTLIN PRACHEM VLIV LISTOVÉ APLIKACE KYSELINY ASKORBOVÉ PO STRESU ZASOLENÍM...22

5 9 KYSELINA ASKORBOVÁ A ČLOVĚK HISTORIE FUNKCE V TĚLE ZDROJE VITAMINU C VLIV ZPRACOVÁNÍ POTRAVIN NA VITAMIN C DENNÍ POTŘEBA ZÁVĚR LITERATURA... 31

6 Seznam zkratek ABA kyselina abscisová AO askorbátoxidasa APX askorbátperoxidasa CAT katalasa DHA dehydroaskorbová kyselina DHAR dehydroaskorbátreduktasa GAL L-galaktono-1,4-lakton GR glutationreduktasa GSH glutation GSSG glutation disulfid GUL L-gulono-1,4-lakton HP hydroxyprolin Km míra afinity enzymu a substrátu MDHA monodehydroaskorbát MDHAR monodehydroaskorbátreduktasa NAD(H) nikotinamid adenin dinukleotid NADP(H) nikotinamid adenin dinukleotid fosfát 1 O 2 singletový kyslík O 2 - OH OO PM ROS QC SOD soz-1 vtc-1 vtc-2 superoxidový anion-radikál hydroxylový radikál oxalátoxidasa plazmatická membrána reaktivní formy kyslíku klidové centrum superoxiddismutasa starší název pro vtc-1 mutant rostliny Arabidopsis thaliana se sníženým množstvím kyseliny askorbové mutant rostliny Arabidopsis thaliana se sníženým množstvím kyseliny askorbové

7 1 Úvod Většina rostlin získává energii pro své metabolické procesy ze slunečního záření a veškerý uhlík z oxidu uhličitého. Jsou to tedy fotoautotrofní organismy. Díky těmto schopnostem mají rostliny důležité postavení v celé biosféře, protože ostatní (heterotrofní) organismy, včetně člověka, využívají organické látky vytvořené rostlinami. Lidský organismus se od většiny živočichů odlišuje tím, že si nedovede sám syntetizovat kyselinu askorbovou. Rostliny tuto schopnost mají. Člověk je tedy odkázán na příjem kyseliny askorbové z potravy. Nejen z tohoto hlediska jsou pro člověka rostliny velmi významnou složkou potravy. Díky genetickému inženýrství je možné uměle zvýšit obsah kyseliny askorbové v rostlinách (Zhang et al., 2007). Kyselina askorbová je jedním z hlavních antioxidantů rostlin, k jejím dalším funkcím patří například regulace fotosyntézy. Kyselina askorbová dále hraje významnou roli při fotoprotekci a je i významným tzv. sekundárním antioxidantem redukujícím oxidovanou formu α-tokoferolu (Noctor et Foyer, 1998). U člověka vitamin C (název vitamin C je synonymum pro rovnovážnou směs kyseliny askorbové a dehydroaskorbové) zasahuje do řady biochemických a biologických dějů, které ovlivňuje různou měrou (Hlúbik, 2002). Kyselina askorbová navíc snižuje toxicitu řady xenobiotik, tedy sloučenin těžkých kovů, dusitanů a dusičnanů, a potlačuje některé typy rakoviny. Tato bakalářská práce shrnuje dosavadní poznatky o kyselině askorbové. Zaměřuje se hlavně na funkci této látky v rostlinách a na její reakci na stresové situace. Nemalou měrou se také tato práce zabývá významem kyseliny askorbové pro člověka. Bylo by přínosné této molekule lépe porozumět, protože je zapojena do velkého množství důležitých funkcí, od antioxidační ochrany a fotosyntézy, po regulaci růstu (Smirnoff, 1996). 1

8 2 Chemické vlastnosti a struktura kyseliny askorbové Kyselina askorbová C 6 H 8 O 6 (2,3-endiol γ-laktonu kyseliny 2-oxo-L-gulonové) (obr. 1) tvoří bezbarvé, ve vodě rozpustné krystaly. Je to látka dosti nestálá, rychle se rozkládá a ztrácí účinnost. Patří mezi biochemické reverzibilní oxidačně-redukční systémy (2,3-endiol 2,3-dioxo). Rozklad kyseliny askorbové urychluje teplo, světlo, vzdušný kyslík a styk s některými kovy, zejména s Cu a Fe. Škodí mu i zásadité prostředí a vyluhování do vody. Příznivější je kyselé prostředí, neboť organické kyseliny, obsažené např. v ovoci, brání rozkladu vitaminu C. Působí většinou nepřímo jako nespecifický donor vodíku (zabraňuje např. oxidaci Fe 2+ na Fe 3+ v různých oxygenasách) ( Hampl et Paleček, 2002). Obrázek 1: Struktura molekuly kyseliny L-askorbové Redukující vlastnosti kyseliny askorbové vyplývají z reaktivní ene-diolové skupiny na uhlíku C2/3. Kyselé vlastnosti jsou způsobeny ionizací hydroxylové skupiny na uhlíku C3 (pka = 4,17). Oxidací kyseliny askorbové nejprve vzniká monodehydroaskorbátový radikál (MDHA). Z MDHA se tvoří kyselina askorbová a kyselina dehydroaskorbová (DHA) (obr. 2). DHA je nestabilní při ph vyšším než 7, takže je většina askorbátu udržována v redukovaném stavu jako obrana před jeho ztrátami. Veškerý askorbát je za normálních podmínek z 90 % v redukovaném stavu. To je způsobeno dvěma enzymy: monodehydroaskorbátreduktasou (MDHAR), která používá NAD(P)H jako redukční činidlo, a dehydroaskorbátreduktasou (DHAR), která používá jako redukční činidlo glutation. Glutation je dalším důležitým rozpustným antioxidantem v rostlinných buňkách. Tyto reakce společně představují askorbátglutationový (Foyer-Halliwell Asadův) cyklus. Oxidaci askorbátu katalyzují dva enzymy: askorbátoxidasa a askorbátperoxidasa. 2

9 Obrázek 2: Vztahy mezi kyselinou askorbovou a jejími oxidovanými formami (upraveno podle Smirnoff, 1996) MDHA i DHA jsou molekuly s bicyklickou strukturou, ve kterých uhlíky C3 a C6 1,4 laktonového cyklu tvoří poloacetaly. MDHA je primární produkt oxidace askorbátu a je to výjimečně nereaktivní volný radikál. Tato vlastnost je důležitá pro funkci askorbátu jako biologického antioxidantu. MDHA je přeměňován na DHA a kyselinu askorbovou. DHA je ve vodných roztocích nestabilní a přeměňuje se na 2,3-diketo-L-gulonovou kyselinu a další produkty (Smirnoff, 1996). Biochemické funkce kyseliny askorbové mohou být rozděleny do 4 kategorií: 1. Antioxidant: Kyselina askorbová velmi rychle reaguje se superoxidem, s kyslíkem v singletovém stavu, s ozónem a peroxidem vodíku. Kyselina askorbová se účastní odstraňování těchto reaktivních forem kyslíku, které jsou generovány během aerobního metabolismu a při vystavení látkám znečišťujícím prostředí a herbicidům. MDHA a DHA jsou během askorbát-glutationového cyklu redukovány na kyselinu askorbovou. Kyselina askorbová regeneruje lipofilní antioxidant α-tokoferol (vitamin E) z α-chromanoxylového radikálu. 2. Enzymový kofaktor: Kyselina askorbová je kofaktorem pro řadu hydrolas, například pro prolyl- a lysylhydroxylasy zapojené do hydroxyprolinové (HP) a hydroxylysinové syntézy. Glykoproteiny bohaté na HP, jako např. extensin, jsou proteiny strukturní tvořící stěnu buňky. Posttranslační úpravy prolylu zbylého v těchto proteinech jsou důležité pro vnitrobuněčnou kyselinu askorbovou, která hraje důležitou roli při růstu buněk. Kyselina askorbová je také důležitá in vitro pro enzym tvořící ethylen. Tento enzym má homologické sekvence s ostatními hydrolasami závislými na kyselině askorbové. 3

10 3. Elektronový transport: Kyselina askorbová in vitro je dobře známá jako elektronový donor pro fotosyntetický a mitochondriální transport elektronů. Výzkumy z poslední doby ukazují, že MDHA může působit jako akceptor elektronů z fotosystému II in vivo a že by mohl působit jako obojí jako donor elektronů i akceptor elektronů v transmembránovém elektronovém transportu. 4. Syntéza šťavelanu (oxalátu) a vínanu: Kyselina askorbová může být rozštěpena a může tvořit šťavelan a vínan. Na syntéze šťavelanu mohou mít podíl i jiné způsoby vzniku, ale kyselina askorbová je pravděpodobně hlavním zdrojem vínanu v hroznech (Smirnoff, 1996). 4

11 3 Syntéza kyseliny askorbové Biosyntéza kyseliny askorbové v rostlinách ještě nebyla zcela objasněna, ale poznatky týkající se pravděpodobné biosyntetické cesty byly shrnuty a sepsány (Smirnoff, 1996). Za obecně uznávanou biosyntetickou cestu platí výsledky vědecké skupiny kolem Smirnoffa. Ve prospěch této teorie hovoří i analýza rostliny Arabidopsis thaliana, konkrétně jejího mutantu s nedostatkem kyseliny askorbové, a následná analýza několika jejich genů (Hancock et al., 2003). 3.1 Biosyntéza v rostlinách Biosyntéza kyseliny askorbové probíhá v mitochondriích. Odtud se usnadněnou difúzí nebo protonovým elektrochemickým gradientem dostává do ostatních buněčných komponent (Shao et al., 2008 a). Protože nám chybí dostatek poznatků o biosyntéze kyseliny askorbové v rostlinách, nemáme ani mnoho informací o regulaci těchto pochodů (Smirnoff, 1996). Přestože se několik laboratoří intenzivně věnovalo problému biosyntézy kyseliny askorbové v rostlinách, klasické biochemické přístupy nám neposkytují dostatečné a uspokojivé informace. Je pravděpodobné, že průlom v řešení tohoto problému poskytnou další molekulárně-genetické výzkumy společně s výzkumy biochemickými. K těmto výzkumům se v poslední době používají mutanti s abnormálním množstvím kyseliny askorbové (a s tím související hypersenzitivitou nebo rezistencí vůči ozónu), jako například vtc-1 mutant Arabidopsis thaliana. Byly navrženy dvě pravděpodobné cesty biosyntézy kyseliny L-askorbové v rostlinách (obr. 3): 1. Biosyntetická cesta s využitím L-galaktono-1,4-laktonu 2. Biosyntetická cesta přes D-glukoson a L-sorboson Neexistuje však žádný nezvratný důkaz, že biosyntéza probíhá jednou z výše zmíněných cest (Smirnoff, 1996). 5

12 Obrázek 3: Biosyntéza kyseliny L-askorbové v rostlinách (upraveno podle Smirnoff, 1996) 6

13 3.2 Biosyntetická cesta s využitím L-galaktono-1,4-laktonu Tato biosyntetická cesta, známá i pod názvem inverzní cesta, navrhuje za přímého prekurzora kyseliny askorbové L-galaktono-1,4-lakton (GAL) (Isherwood et Mapson, 1962). Analogií této reakce u zvířat je oxidace L-gulono-1,4-laktonu (GUL) na kyselinu askorbovou za účasti L-gulono-1,4-laktonoxidasy. Tato reakce je u rostlin podporována rychlou přeměnou vnějšího GAL na kyselinu askorbovou a také mitochondriálním enzymem (GAL dehydrogenasou), který katalyzuje oxidaci GAL na kyselinu askorbovou. Další podporou pro tento pochod je reakce lykorinu. Tento alkaloid dokáže u živočichů vyvolat kurděje a u rostlin snížit hladinu kyseliny askorbové. De Gara et al. (1994) předpokládá, že lykorin inhibuje GAL dehydrogenasu a GUL oxidasu. Účinek lykorinu byl testován in vivo a jeho vliv na čištěnou GAL dehydrogenasu nebyl prokázán (Smirnoff, 1996). Tato sloučenina musí být tedy i nadále zkoumána. 3.3 Biosyntetická cesta s využitím D-glukosonu a L-sorbosonu Druhá biosyntetická cesta je tzv. neinverzní cesta. Dochází při ní k oxidaci glukózy na uhlíku C2 a vzniká D-glukoson. Ten je dále epimerizací na uhlíku C5 převeden na L-sorboson. Následuje oxidace uhlíku C3 a laktonizace za vzniku kyseliny L-askorbové. Důkazem pro tuto biosyntetickou cestu je objevení enzymu sorbosondehydrogenasy, který s pomocí NADP převádí L-sorboson na kyselinu L-askorbovou. Tento enzym byl objeven ve špenátu a v listech fazolí. 7

14 3.4 Biosyntéza u obratlovců Narozdíl od rostlin, u obratlovců probíhá biosyntéza jednodušeji (obr. 4). Obrázek 4: Biosyntéza kyseliny askorbové u obratlovců a u rostlin (převzato z Lapčík, 2001) Zkratky: GDP guanosindifosfát, UDP uridindifosfát 3.5 Průmyslová výroba Průmyslová výroba kyseliny askorbové (obr. 5) vychází z D-glukosy, která se katalytickou hydrogenací převede na D-sorbitol. Ten mikrobiální oxidací (Acetobacter suboxidans) poskytne L-sorbosu. L-sorbosa s acetonem v přítomnosti kyseliny sírové poskytne 2,3:4,6-bis-(Oisopropyliden)-α-L-sorbofuranosu, jejíž oxidací manganistanem draselným se v alkalickém prostředí získá kyselina diaceton-2-oxo-l-gulonová. Ta následně po hydrolýze chránících skupin (ketalů) poskytne vitamin C (Hampl et Paleček, 2002). 8

15 Obrázek 5: Průmyslová výroba kyseliny askorbové (upraveno podle Hampl et Paleček, 2002) 9

16 4 Výskyt a subbuněčná lokalizace kyseliny askorbové Kyselina askorbová a askorbátperoxidasa (peroxidasa se specificitou ke kyselině askorbové jako reduktantu) se jeví jako univerzální sloučeniny ve fotosyntetizujících eukaryotech zahrnujících řasy a bryofyta. Askorbátperoxidasa se vyskytuje v některých cyanobakteriích patřících mezi prokaryota. Není známo, zda je u cyanobakterií přímá souvislost mezi nedostatkem askorbátperoxidasy a kyseliny askorbové. Kyselina askorbová se vyskytuje v cytoplazmě, v chloroplastech, ve vakuolách, v mitochondriích a v buněčné stěně (Smirnoff, 1996). Koncentrace v chloroplastech může být vysoká (ve špenátu až 50 mm) a je pravděpodobně spojená s jeho rolí při fotosyntéze. Výskyt v buněčné stěně není náhodný, protože na plazmatické membráně (PM) protoplastů listů ječmene je vysoká afinita přenašečů kyseliny askorbové (Km = 90 µm) i dehydroaskorbové (Km = 20 µm). Kyselina dehydroaskorbová (DHA) je přenášena do buňky rychleji než kyselina askorbová. Účinky ionoforů a blokátorů iontových kanálů na příjem kyseliny askorbové naznačují potřebu protonového elektrochemického gradientu skrze plazmatickou membránu. Naopak transport do izolovaných vakuol je pomalý a není zprostředkovaný přenašečem. Izolované chloroplasty špenátu vážou kyselinu askorbovou s překvapivě nízkou afinitou (Km = mm) skrze saturovatelného přenašeče. Příjem do chloroplastů je inhibován kyselinou dehydroaskorbovou. Vysoká afinita přenašečů na plazmatické membráně by mohla usnadnit pohyb kyseliny askorbové do buněčné stěny a povolit pohyb z buňky do buňky skrze apoplast. 10

17 5 Funkce kyseliny askorbové v rostlinách Kromě antioxidační funkce a funkce enzymového kofaktoru se kyselina askorbová podílí na buněčném dělení, na kontrole růstu a roztažitelnosti buněčné stěny, na stabilitě genomu a částečně také na syntéze hormonů a extracelulárních strukturních proteinů obsahujících hydroxyprolin (Smirnoff, 2005). Redoxní stav apoplastické kyseliny askorbové je kontrolován askorbátoxidasou, což může ovlivnit růst a rezistenci vůči ozónu. Kyselina askorbová se také může chovat jako prooxidant redukcí iontů přechodných kovů. 5.1 Kyselina askorbová v roli enzymového kofaktoru Jedna z nejlépe prozkoumaných funkcí kyseliny askorbové je její role při enzymatických reakcích (Davey et al., 2000). Mezi enzymy, které jsou ovlivňovány kyselinou askorbovou, patří například prolinhydroxylasa, lysinhydroxylasa, 2-oxoglutarát-3-dioxygenasa, cholesterol-7-αmonooxygenasa a další. Tyto enzymy jsou typicky mono- nebo dioxygenasy, které jako centrální kovový iont obsahují železo nebo měď a které vyžadují kyselinu askorbovou k dosáhnutí maximálního výkonu. Funkcí kyseliny askorbové je udržovat ion přechodného kovu v redukovaném stavu. V případě, že je přítomné nějaké jiné redukční činidlo ve vyšší koncentraci, může být kyselina askorbová tímto činidlem částečně nahrazena. Kyselina askorbová je také kofaktorem deepoxidasy, jejíž aktivita je stimulována silným zářením nebo nízkou teplotou (Smirnoff, 1996). Deepoxidasa enzymaticky převádí neúčinný violaxanthin a antheroxanthin na zeaxanthin. Zeaxanthin je nejúčinnější z xantofylů, které mají ochrannou funkci při přeměně nadbytku radiační energie na teplo (tzv. fotoprotekce). Zeaxanthin tedy vzniká postupnou deepoxidací violaxanthinu, což je součást xantofylového cyklu ve světlosběrných komplexech. 5.2 Funkce kyseliny askorbové při buněčném dělení Výzkumy kyseliny askorbové a dehydroaskorbové v buňkách tabáku ukazují, že DHA inhibuje buněčné dělení, zatímco kyselina askorbová tento děj stimuluje (Smirnoff, 2005). Klidové centrum (QC), oblast meristému s nedělivými buňkami v kořeni kukuřice, obsahuje pouze málo kyseliny askorbové a glutationu, ale velké množství askorbátoxidasy. To také souvisí se zvýšenou produkcí superoxidu a peroxidu vodíku v této oblasti meristému. Důkaz pro tvrzení, že buněčné dělení je bržděno oxidovanými formami kyseliny askorbové, se provádí odstraněním kořenové čepičky. Tímto procesem se zvýší koncentrace redukované formy kyseliny askorbové a glutationu a dojde k očividnému nárůstu buněčného dělení v QC. 11

18 Dalším důkazem pro tvrzení, že kyselina askorbová ovlivňuje dělení buněk, je barvení kořenového meristému cibule dusičnanem stříbrným (Smirnoff, 1996). Po nabarvení preparátu dokážeme určit, které oblasti meristému obsahují velké množství kyseliny askorbové. Části meristému s vysokým obsahem kyseliny askorbové (kyselina askorbová může pocházet například z vnějšího prostředí) rychleji postupují z G1 fáze do S fáze buněčného cyklu. 5.3 Vliv kyseliny askorbové na růst rostliny a ochrana před ozónem Vtc-1 (původně nazývaný soz-1) a vtc-2 jsou mutanti rostliny Arabidopsis thaliana, kteří jsou hypersenzitivní vůči ozónu. Vtc-1 obsahuje o 70 % méně kyseliny askorbové (a naopak o něco více DHA) v listech než divoký kmen. Nízký obsah kyseliny askorbové v mutantu vtc-1 je spojen nejen s citlivostí na ozón, ale také se sníženým růstem rostliny. To znamená, že tento mutant produkuje daleko méně biomasy než divoký kmen (Veljovic-Jovanovic et al., 2001). V rostlinách s nízkým obsahem kyseliny askorbové totiž dochází k peroxidativnímu zesíťování polysacharidů a proteinů buněčné stěny a k zvýšené lignifikaci (Smirnoff, 2005). Tyto pochody vedou ke snížené roztažnosti buněčné stěny. Další výsledky výzkumu pracovní skupiny Veljovic-Jovanovic poukazují na to, že je v mutantu vtc-1 vyvolána aktivita blíže neurčené peroxidasy a že rovnováha mezi chloroplastovou a cytoplazmatickou askorbátperoxidasou (APX) je u mutantu posunuta ve prospěch cytoplazmatické APX. Snížený růst rostliny však nemůže být jednoznačně přisuzován pouze nízkému obsahu kyseliny askorbové (Smirnoff, 2005). Je zajímavé, že vtc-1 obsahuje větší množství kyseliny abscisové (ABA) než divoký kmen (Pastori et al., 2003). Tento hormon obecně inhibuje růst. 5.4 Role kyseliny askorbové při absorpci NO 2 Oxid dusičitý (NO 2 ) je běžný plyn vyskytující se v atmosféře. Hraje mimo jiné důležitou roli při tvorbě ozónu, smogu a kyseliny dusičné v ovzduší. Regulace výměny tohoto plynu mezi listem rostliny a atmosférou je popsaná pouze u několika druhů rostlin (Teklemariam et Sparks, 2006). Mezi významné regulátory patří průduchy, ultrafialové záření a parciální tlakový gradient mezi vnitřním prostředím listu a jeho okolím. Teklemariam et Sparks (2006) zkoumali absorpci NO 2 u čtyř důležitých zemědělských plodin. Ověřovali hypotézu, že kyselina askorbová v listech funguje jako významný regulátor příjmu oxidu dusičitého. Díky tomuto výzkumu došlo k objevu, že existuje vztah mezi koncentrací kyseliny askorbové v listech a absorpcí i emisí NO 2. U rostlin s vyšším obsahem NO 2 dochází i k vyšší emisi NO 2. Rostliny s vyšším obsahem kyseliny askorbové prokazují vyšší absorpci NO 2. Tyto výsledky potvrzují, že obsah NO 2 i kyseliny askorbové v listech opravdu regulují další příjem atmosférického NO 2. Je totiž pravděpodobné, že rostliny s vyšším obsahem kyseliny askorbové mají větší 12

19 schopnost reagovat s NO 2 vznikajícím během dusíkaté redukce, čímž dojde k snížení emitovaného NO Kyselina askorbová jako prooxidant Kyselina askorbová redukuje ionty přechodných kovů (železa, mědi a manganu) (Smirnoff, 2005). Davey et al. (2000) v těchto souvislostech hovoří pouze o železe (Fe III ) a mědi (Cu II ). Takto redukované formy přechodných kovů mohou v přítomnosti peroxidu vodíku generovat hydroxylové radikály tzv. Fentonovou reakcí: Fe 3+ + kyselina L-askorbová Fe 2+ + monodehydroaskorbát Fe 2+ + H 2 O 2 OH + OH - + Fe 3+ Tyto hydroxylové radikály mohou způsobit oxidativní poničení DNA. Apoplastická kyselina askorbová reakcí s mědí produkuje hydroxylové radikály, které mohou porušit polysacharidy buněčné stěny. Tato skutečnost by se dala využít při změkčování a umělém dozrávání ovoce (Fry et al., 2001). 5.6 Kyselina askorbová a reaktivní formy kyslíku Kyselina askorbová může nejen reagovat se superoxidovým radikálem a hydroxylovým radikálem, ale je také schopna neenzymaticky redukovat další radikály (viz kapitola 6 a 7). Zvláštní význam je přisuzován regeneraci α-tokoferolu (vitaminu E) z α-chromanoxylového radikálu (Davey et al., 2000). α-tokoferol se ve vysokých koncentracích nachází ve fotosyntetických membránách, kde plní úlohu hlavního lipofilního antioxidantu, který reaguje s peroxidovými radikály lipidů a se superoxidy. Kyselina askorbová se v chloroplastech vyskytuje až o koncentraci mm. Proto může být využita pro odstranění vysoce škodlivých peroxyradikálů. 13

20 6 Reaktivní formy kyslíku a způsob jejich odstranění V rostlinách i živočiších reaguje kyselina askorbová se škodlivými radikály kyslíku a jeho deriváty, takzvanými reaktivními formami kyslíku (ROS) (Davey et al., 2000). Tyto detoxifikační reakce mohou být považovány za základní část hospodaření nutné pro aerobní existenci v eukaryotických buňkách. Vysoká intracelulární koncentrace kyseliny askorbové poukazuje na důležitost těchto funkcí v eukaryotickém organismu. Schopnost rostlinné kyseliny askorbové reagovat s fyziologicky vzniklými ROS má za následek změnu procesů, jako jsou lignifikace, buněčné dělení a hypersenzitivní reakce. Biologická důležitost antioxidativních účinků kyseliny askorbové je odlišná od ostatních nízkomolekulárních antioxidantů (α-tokoferol, kyselina močová, karotenoidy, flaviny...). Kyselina askorbová je schopná ukončit radikálové řetězové reakce převedením molekuly na netoxické, neradikálové produkty, například DHA a 2,3- diketogulonovou kyselinu. Kyselina askorbová je pouze mírně elektronegativní, takže může být donorem elektronů široké škále substrátů. Jeden z nejdůležitějších rysů neenzymatické antioxidační aktivity kyseliny askorbové je její účast na obnově lipofilních membránových radikálů. Reaktivní formy kyslíku zahrnují sloučeniny jako superoxidový anion-radikál (O 2 - ), singletový kyslík ( 1 O 2 ), peroxid vodíku (H 2 O 2 ) a vysoce reaktivní hydroxylový radikál (OH ) (Tabulka 1). Tabulka 1: Příklady aktivních forem kyslíku v rostlinách (upraveno podle Buchanan et al., 2000, laboranti.ic.cz/biochemie/dr%20(11.p%f8edn.).ppt) Název Zkratka Struktura superoxidový anion-radikál O 2 - singletový kyslík 1 O 2 peroxid vodíku H 2 O 2 hydroxylový radikál OH Reaktivní formy kyslíku jsou produkovány chloroplasty, mitochondriemi a peroxizómy. Jde o vedlejší produkty buněčného metabolismu, jejichž produkce je zvýšená při stresu. Jako stresová situace může být pro rostlinu například nedostatek vody (sucho), nedostatek živin v půdě, poranění rostliny, vysoká salinita, nadměrné záření, vystavení polutantům (např. ozónu) apod. Hlavní příčinou toxicity reaktivních forem kyslíku je jejich schopnost zahájit radikálovou řetězovou reakci, která vede k produkci hydroxyradikálů a dalších molekul s ničivými účinky (Davey et al., 2000). Tyto molekuly způsobují poškození bílkovin, peroxidaci lipidů, poškození 14

21 DNA a mohou způsobit i smrt celé buňky. Aerobní organismy mají proto vyvinuté množství účinných mechanismů, které slouží k detoxikaci, a to buď enzymatickou nebo neenzymatickou cestou. Nízkomolekulární antioxidanty, jako glutation, kyselina L-askorbová, α-tokoferol (vitamin E), karotenoidy a fenolické molekuly, jsou schopné neenzymaticky interagovat přímo s reaktivními formami kyslíku. Mezi enzymatické mechanismy detoxikace patří například askorbátperoxidasa, glutationperoxidasa a superoxiddismutasa (SOD) katalyzující dismutaci superoxidového anion-radikálu na peroxid vodíku: 2 O H + H 2 O 2 + O 2 Schopnost odstranění H 2 O 2 vyžaduje synchronní činnost několika antioxidačních enzymů současně. V organelách, jako jsou například chloroplasty, dochází k rychlé redukci O 2 - přímo, díky vysoké hladině kyseliny askorbové. Katalasy (CAT) převádí H 2 O 2 na vodu a molekulární kyslík. Tyto enzymy mají nízkou afinitu k substrátu, a tak reakce vyžaduje současný přístup dvou molekul H 2 O 2 k aktivnímu místu. Jiný způsob odbourání H 2 O 2 je prostřednictvím peroxidas, které nacházíme ve všech částech buňky a které mají mnohem větší afinitu k H 2 O 2 než CAT. Fotosyntetizující organismy jsou aktivními formami kyslíku zranitelné obzvláště v bezprostřední blízkosti oxidačně redukčního systému schopného redukce O 2 na O 2 -. Příčinou produkce reaktivních forem kyslíku chloroplasty vyšších rostlin je přenos elektronů o vysoké energii z redukované formy ferredoxinu na kyslík místo na NADP (Davey et al., 2000). Tato fotoredukce kyslíku ve fotosystému I se nazývá Mehlerova reakce. Po vzniku superoxidového anion-radikálu (O 2 - ) reakce pokračuje za účasti SOD jako katalyzátoru a vzniká H 2 O 2. Tato jednoduchá přeměna jedné reaktivní formy kyslíku v druhou a její následná detoxikace H 2 O 2 je životně důležitá podmínka pro normální funkci chloroplastů. Pro chloroplasty s nedostatkem katalas (tedy chloroplasty, které se nacházejí v peroxizómech a glyoxyzómech) je kyselina L-askorbová esenciální. Slouží jako substrát pro askorbátperoxidasu, která zneškodňuje H 2 O 2 vzniklý v tylakoidech: H 2 O L-kyselina askorbová 2 H 2 O + 2 MDHA 15

22 7 Askorbát-glutationový cyklus Askorbát-glutationový cyklus, zvaný také Foyer-Halliwell-Asadův cyklus, je sled reakcí, při kterém dochází k přeměně nebezpečného peroxidu vodíku na vodu (obr. 6). Obrázek 6: Askorbát-glutationový cyklus (upraveno podle Noctor et Foyer, 1998) Zkratky: AA kyselina askorbová, APX askorbátperoxidasa, DHA dehydroaskorbová kyselina, DHAR dehydroaskorbátreduktasa, GR glutationreduktasa, GSH glutation, GSSG glutation disulfid, MDHA monodehydroaskorbát, MDHAR monodehydroaskorbátreduktasa, NADP(H) - nikotinamid adenin dinukleotid fosfát, SOD superoxiddismutasa. V rostlinných buňkách je kyselina askorbová nejdůležitějším substrátem zajišťujícím odstranění H 2 O 2 (Noctor et Foyer, 1998). Askorbátperoxidasa (APX) je prvním enzymem cyklu a používá dvě molekuly kyseliny askorbové k redukci H 2 O 2. Následně vznikají dvě molekuly mono- 16

23 dehydroaskorbátu (MDHA). Radikál MDHA, pokud není zpětně redukován, se přeměňuje na kyselinu askorbovou a dehydroaskorbovou (DHA). V plazmalemě nebo na tylakoidní membráně může být poté MDHA redukován přímo na kyselinu askorbovou. Donorem elektronu pro redukci MDHA může být cytochrom b, redukovaný ferredoxin nebo NAD(P)H. Jestliže je kyselina askorbová oxidována v listech a ostatních tkáních, nějaký DHA je vždy produkován, o čemž značí rychlá disproporcionace MDHA radikálu. DHA je redukován na kyselinu askorbovou pomocí DHA-reduktasy za použití glutationu (GSH) jako redukčního činidla. Tato reakce probíhá za vzniku glutation disulfidu (GSSG), který může být pomocí NADPH zpětně převeden na GSH. Tato reakce je katalyzována glutationreduktasou (GR). Kyselina askorbová a glutation nejsou touto cestou spotřebovávány, pouze se účastní cyklických redoxních reakcí za použití 4 enzymů, které dovolují redukci H 2 O 2 na vodu s využitím elektronů získaných z NAD(P)H. Obrázek 7: Vztahy mezi askorbátem, monodehydroaskorbátem a dehydroaskorbátem v cytoplazmě a buněčné stěně (upraveno podle Smirnoff, 1996) Zkratky: AO askorbátoxidasa, APX askorbátperoxidasa, Asc askorbát, Cyt b cytochrom b, DHA dehydroaskorbát, DHAR dehydroaskorbátreduktasa, GR glutationreduktasa, GSH glutation, GSSG oxidovaný glutation, MDA monodehydroaskorbát, MDHAR monodehydroaskorbátreduktasa, NAD(H) nikotinamid adenin dinukleotid, NADP(H) nikotinamid adenin dinukleotid fosfát, OO oxalátoxidasa, PM plazmatická membrána. 17

24 V rostlinných buňkách může být kyselina askorbová transportována pomocí přenašečů dovnitř buněčné stěny. Askorbátoxidasa (AO) katalyzuje oxidaci askorbátu a vzniká tak monodehydroaskorbátový radikál (MDHA) (obr. 7). MDHA přijímá elektrony z cytochromu b. Cytoplasmatický askorbát je pravděpodobně donorem elektronu. Depolarizace membrány způsobená transmembránovým transportem elektronů stimuluje H + -ATPasu a vede k roztahování buněčné stěny (Smirnoff, 1996). Askorbát inhibuje peroxidativní zesíťování polysacharidů stěny a polymerizaci ligninu odklízením peroxidu vodíku a monolignolových radikálů. Dehydroaskorbát (DHA) může reagovat s aminokyselinovou stranou řetězců polypeptidů buněčné stěny a předejít zesíťování polysacharidů matrix. DHA (nebo askorbát) vede k oxalátu, který podporuje roztahování buněčné stěny vázáním vápníku. DHA je transportován přenašeči do cytoplazmy, kde je DHA-reduktasou (DHAR) redukován na kyselinu askorbovou v askorbát-glutationovém cyklu. Oxalát je odstraněn oxalátoxidasou (OO) a uvolnění peroxidu vodíku a vápníku může prospět pevnosti buněčné stěny. Ostatní cesty tvorby H 2 O 2 buněčné stěny nejsou v tomto schématu zobrazeny. Askorbát v buněčných stěnách také detoxikuje ozón. Askorbát-glutationový cyklus a MDHA-reduktasa spolu s askorbátperoxidasou se také vyskytují v chloroplastech a složky cyklu byly zaznamenány i v mitochondriích a peroxizómech. 18

25 8 Kyselina askorbová a její reakce při stresových situacích Jednou z nejrychlejších odpovědí rostlin na vliv patogenů, sucha, extrémních teplot nebo fyzikálních i chemických jevů je akumulace reaktivních forem kyslíku. Takto vzniklý oxidativní stres je rozšířeným jevem, který je dobře prozkoumán v pšenici a dalších rostlinách, které jsou vystaveny většině biotickým a environmentálním stresům (Shao et al., 2008 b). V závislosti na velikosti oxidativního poškození může dojít k aklimatizaci na stres nebo až k buněčné smrti. Stresem nazýváme situaci, kdy na rostlinu působí nějaké nepříznivé faktory. V přírodě na rostlinu obvykle působí více stresorů současně. Stresorem neboli stresovým faktorem označujeme určitou odchylku od optimálních podmínek pro růst rostliny. Stres může být u rostlin vyvolán abiotickými nebo biotickými faktory. Mezi biotické faktory patří vliv patogenních organismů, býložravců a také konkurence jiných rostlin. Naopak mezi abiotické faktory ovlivňující rostliny zahrnujeme například změnu vlhkosti vzduchu a množství srážek, změnu teploty, změnu slunečního záření, ph půdy a toxicitu prostředí. 8.1 Teplotní stres Odezva rostliny na stres vysokou teplotou je u každého rostlinného druhu odlišná a je závislá na fyziologických předpokladech daného druhu (Zavorueva et Ushakova, 2004). Na teplotní stres jsou obzvláště citlivé například fotosyntetické pochody, neboť dochází ke zvýšenému fotooxidativnímu poškození. Guo et al. (2006) zkoumali vliv vysoké teploty na růst dvou druhů citrusovníků. Po stresu vysokou teplotou (38 C) byly rostliny ošetřeny kyselinou askorbovou, čímž došlo k opětovnému navýšení chlorofylů, superoxiddismutasy (SOD), askorbátperoxidasy (APX), dehydroaskorbátreduktasy (DHAR) a ke snížení množství reaktivních forem kyslíku (ROS). Příznaky oxidativního stresu způsobeného růstem rostliny mimo optimální teplotu zkoumali také Kaminska-Rozek et Pukacki (2005). Tato skupina pracovala se semenáčky norské jedle, které byly po 45 dní vystaveny teplotám -3 C a -10 C. Vlivem stresu došlo ke zvýšené produkci reaktivních forem kyslíku a ke snížení množství kyseliny askorbové. K opačným výsledkům se dopracovali Keles et Oncel (2002). Ve své práci uvádějí, že v klíčních rostlinách Triticum durum po prodělaném stresu nízkou teplotou (5 C) došlo ke zvýšení množství kyseliny askorbové. Dále uvádějí, že v rostlinách, které prodělaly stres vysokou teplotou (40 C), nedošlo k žádné větší změně množství kyseliny askorbové. Kumar et al. (2008) zkoumali vliv aplikace kyseliny abscisové na stres nízkou teplotou a na množství kyseliny askorbové. Po vnějším ošetření kyselinou abscisovou došlo k výraznému 19

26 zmírnění poranění způsobených tímto teplotním stresem. Rostliny ošetřené kyselinou abscisovou prokazovaly menší oxidativní poškození a vyšší množství kyseliny askorbové než rostliny takto neošetřené. 8.2 Vliv nestresující teploty Paolacci et al. (1997) ve své studii porovnávali stav antioxidantů a fotosyntézy u rostlin rostoucích při optimální teplotě 25 ± 0,4 C a při mírně zvýšené teplotě 30 ± 0,3 C, vždy za úměrného světla a dostatku zálivky. Rostliny rostoucí při 30 ± 0,3 C nevykazovaly symptomy typické pro odezvu na stres vysokou teplotou, jako bývá zrychlený vývoj, snížený růst, ztráta fotosyntetických pigmentů a redukce fotochemických schopností fotosystému II. Tato mírně zvýšená teplota způsobila % navýšení obsahu kyseliny dehydroaskorbové a glutation disulfidu. Výsledky zjištěné v tomto experimentu dokazují, že fotosyntetický výkon zkoumaných rostlin může být negativně ovlivněn dokonce i mírně zvýšenou nestresující teplotou, která by mohla vést k upřednostňování fotooxidativního uhlíkatého cyklu nad fotoreduktivním cyklem. To by dále mohlo vést k nadprodukci reaktivních forem kyslíku (ROS), kde působí jako antioxidační ochrana kyselina askorbová a glutation. Podobné výsledky byly dosaženy s dřívějšími daty týkajícími se stejného rostlinného materiálu a teplot pro růst nestresujících, jen mírně snížených. 8.3 Světelný stres Bartoli et al. (2006) zkoumali vliv extrémního osvětlení na množství kyseliny askorbové v rostlinách. Rostliny vyrůstaly za nízkého (50 µmol fotonů m -2 s -1 ) a intenzivního osvětlení (250 µmol fotonů m -2 s -1 ). Množství kyseliny askorbové v rostlinách rostoucích ve tmavším prostředí bylo nižší než v rostlinách, které rostly za intenzivního osvětlení. Podobných výsledků dosáhli i Smirnoff et Pallanca (1996), kteří publikovali, že množství kyseliny askorbové v listech se zvyšuje při růstu za větší sluneční intenzity a nízké teploty. Touto problematikou se zabývali i Cano et al. (2006). Ve své studii se pokusili monitorovat změny antioxidantů nastávající v rostlinách Avena sativa L. a Triticum aestivum L. po prodělání stresu nadměrným osvětlením. Stres rostliny byl vyvolán 2800 µmol fotony m -2 s -1 a způsobil snížení množství kyseliny askorbové v rostlině, obzvláště v mladých listech. Množství kyseliny askorbové se vrátilo do původního stavu po 60 minutách ve tmě. 8.4 Vodní stres Augusti et al. (2001) zkoumali množství kyseliny askorbové v listech poikilohydrické rostliny Ramonda serbica Panc. (Gesneriaceae) během dehydratace a následné rehydratace. Bylo zjištěno, že snížením relativního množství vody v rostlině dojde k značnému zvýšení množství kyseli- 20

27 ny askorbové. Hladiny kyseliny askorbové se příliš neměnily, dokud rostlina nedosáhla pouze 40 % relativního množství vody. Následně došlo k pozvolnému zvyšování kyseliny askorbové, až rostlina dosáhla maximální dehydratace listů (kdy relativní množství vody představovalo 10 %). V počáteční fázi rehydratace bylo množství kyseliny askorbové stále poměrně vysoké, ale postupem času (zhruba během 10 hodin) došlo k opětovnému snížení množství až na původní hodnotu. Opačného výsledku dosáhli Sairam et al. (1998). Zkoumali roli kyseliny askorbové v listech tří různých genotypů pšenice (Triticum aestivum L.) při vodním stresu. Na listy působili během dvou různých etap po odkvětu. Podle výsledků této pracovní skupiny mělo sucho za následek snížení hladiny kyseliny askorbové v listech. 8.5 Zvýšené množství ozónu Vystavení rostlin zvýšeným koncentracím ozónu (O 3 ) je doprovázeno zvýšeným množstvím hydroxylových radikálů, superoxidových radikálů a H 2 O 2. K těmto pochodům dochází nejprve v apoplastu a později i v symplastu buněk listů rostlin (Robinson et Britz, 2000). Peroxidativní pochody v buněčné stěně způsobí značné snížení množství kyseliny askorbové v apoplastu a zvýšení monodehydroaskorbátu taktéž v apoplastu. Pokud není působení ozónu velmi intenzivní, jsou změny množství kyseliny askorbové pouze mírné. Je dokázáno, že rostliny s vyšším množstvím kyseliny askorbové v listech jsou více odolné vůči ozónu (Robinson et Britz, 2000). 8.6 Patogeny Paradoxní je, že vtc-1 mutant (se sníženým množstvím kyseliny askorbové) je hypersenzitivní vůči ozónu, ale daleko více odolný vůči patogenům (Smirnoff, 2005). Tato hypotéza byla testována za použití virulentní bakterie Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 a virulentní houby Peronospora parasitica pv. Noco (Conklin et Barth, 2004). Růst patogenů u vtc-1 mutantu byl značně nižší než u divokého kmene. Podobný pokus prováděli Barth et al. (2004), kteří zkoumali vtc-2 mutant (také mutant se sníženým obsahem kyseliny askorbové). Tento mutant byl taktéž infikován P. parasitica a opět byla prokázána větší rezistence vůči patogenům. Borbala et al. (2008) zkoumali vliv patogenu Blumeria graminis f. sp. hordei race A6 na různé genotypy ječmene (Hordeum vulgare). Celkové množství kyseliny askorbové nebylo u žádného genotypu naočkováním tohoto patogenu nijak ovlivněno. Kyselina jasmonová je důležitý rostlinný hormon uvolňovaný v rostlinách při stresu, včetně stresu napadením patogeny. Je dokázáno, že methyljasmonát (ester kyseliny jasmonové) vyvolává zvýšení syntézy kyseliny askorbové v rostlině (Wolucka et al., 2005). Důkazy byly provedeny 21

28 na Arabidopsis thaliana a Nicotiana tabacum Bright Yellow-2. Jde o první případ hormonální regulace syntézy kyseliny askorbové v rostlinách. Pokusy regulovat syntézu kyseliny askorbové za použití některých jednoduchých enzymů (zejména enzymů hrajících roli při biosyntéze) byly zatím neúspěšné (Ishikawa et al., 2006). Infekce listů Arabidopsis thaliana spórami patogenu Botrytis cinerea má za následek snížení množství kyseliny askorbové a tím i oxidativní poškození (Muckenschnabel et al., 2002). Tyto výsledky se shodují s výsledky Kuzniak et Sklodowské (2005), kteří studovali odezvu oxidativního stresu vzniklého infekcí Botrytis cinerea na Lycopersicon esculentum Mill. Vlivem tohoto patogenu došlo opět ke snížení množství kyseliny askorbové. 8.7 Stres znečištěním rostlin prachem Zhodnocení schopnosti různých druhů rostlin zachycovat prachové částečky je spojeno i s výzkumem účinku prachového povlaku na obsah kyseliny askorbové v listech rostlin. Prajapati et Tripathi (2008) ve svém experimentu zjistili, že u všech jimi zkoumaných druhů (Ficus religion, Ficus benghalensis, Mangifera indica, Dalbergia sissoo, Psidium guajava a Dendrocalamus strictus) dochází k maximálnímu ukládání nánosu prachu v zimním období. Obsah kyseliny askorbové se zvyšuje se zvýšeným ukládáním prachu. Jde tedy o vzájemný pozitivní vztah mezi obsahem kyseliny askorbové a stresem, který je způsobený prachem. Maximální schopnost zachycování prachu byla zjištěna u Dalbergia sissoo a minimální u Dendrocalamus strictus. Závěrem výzkumu bylo, že by se některé rostliny mohly využít k zachycování prachových částic, které jsou pro zdraví člověka škodlivé. 8.8 Vliv listové aplikace kyseliny askorbové po stresu zasolením Vysoká salinita je běžným abiotickým stresorem. V některých částech světa představuje vážný problém, neboť výrazně ovlivňuje úrodu (obzvláště v aridních a semiaridních oblastech). Při stresu zasolením, stejně jako při jiných stresech, dochází ke vzniku aktivních forem kyslíku (ROS). Mahmud et al. (1999) zkoumali rostliny Pak Choi (Brassica rapa ssp. Chinensis L.). Zjistili, že množství kyseliny askorbové v rostlinách, které prodělaly stres zasolením, je nižší. Dolatabadian et al. (2008) zkoumali vliv listové aplikace kyseliny askorbové na rostlinu po prodělaném stresu zasolením. Zajímali se především o vliv na množství proteinů, prolinu, chlorofylu, peroxidaci lipidů a aktivitu superoxiddismutasy (SOD), katalas a peroxidas. Čtyři týdny po zasetí byly rostliny vystaveny stresu zasolením aplikací roztoku chloridu sodného (200 mm). Rostliny byly takto stresovány po šest dnů a následujících šest dnů podstupovaly listovou aplikaci roztoku kyseliny askorbové (25 mm). 22

29 Výsledky výzkumu dokazují, že stres zasolením ovlivnil všechny sledované parametry, kromě chlorofylu b, aktivity SOD v listech a obsahu MDHA v kořenech. Stres zasolením způsobil zvýšení aktivity všech sledovaných antioxidačních enzymů kromě SOD v kořenech. Množství proteinů se po prodělání stresu v listech a kořenech snížilo. Aplikace kyseliny askorbové způsobila zpětné snížení aktivity antioxidačních enzymů v listech, ale na jejich aktivitu v kořenech neměla vliv. Množství proteinů se po ošetření kyselinou askorbovou opětovně zvýšilo, a to jak v listech, tak v kořenech. Měření ukazují, že během stresu zasolením (interakcí s ROS) došlo k zvýšené peroxidaci lipidů. Následným ošetřením kyselinou askorbovou došlo k poklesu peroxidace lipidů pouze v listech. Výsledky této studie ukazují, že kyselina askorbová snižuje škodlivé účinky zasolení a mohla by nadále zvyšovat toleranci k salinitě. 23

30 9 Kyselina askorbová a člověk Vitamin C je pro lidský organismus naprosto nepostradatelná látka. Většina zvířat si dokáže vytvořit vlastní vitamin C v játrech nebo nadledvinkách z glukózy. To člověk nedokáže, chybí mu důležitý enzym L-gulonolaktonoxidasa, bez kterého přeměna glukózy ve vitamin C nemůže proběhnout. Lidé mají totiž poškozený gen pro tvorbu tohoto enzymu. Různí autoři odhadují, že k poškození genu retrovirem došlo u společného předka člověka a všech opic někdy před miliony let (Lapčík, 2001). V přírodě se tak nedokáže zásobovat vitaminem C pouze člověk, některé druhy primátů, morčata a indický netopýr. Mezi ptactvem pak červení bulbulové a z vodní říše pstruh duhový a losos (Čapek, 2005). Člověk je také spolu s opicemi jediným živočišným druhem, který trpí nachlazením (Lapčík, 2001). 9.1 Historie K jednomu z nejznámějších důsledků nedostatku vitaminu C patří kurděje (skorbut), jejichž následky byly pozorovány už na kosterních nálezech z doby kamenné a bronzové (Jebas, 2003). O možnosti chránit se před kurdějemi dietou vědí lékaři od 18. století. V roce 1754 James Lind vydal knihu s názvem A Treatise on Scurvy, v níž navrhl citrony jako prevenci proti kurdějím. Pánové Holst a Fröhlich použili v roce 1907 při studiu nemoci beri-beri morčata, která v důsledku chudé diety dostala kurděje (předtím se soudilo, že kurdějemi může onemocnět pouze člověk). O čtyři roky později přišel Kazimír Funk s hypotézou, že příčinou některých závažných chorob může být nedostatek určitých nezbytných stopových látek vitaminů ve výživě. Prvními nemocemi, jejichž příčina byla hledána v avitaminóze, byly xeroftalmie (šeroslepost), beri-beri a kurděje. Hypotetické vitaminy byly označeny A, B a C (Lapčík, 2001). Vitamin C jako první izoloval v roce 1927 v cambridgské biochemické laboratoři z hovězí nadledvinkové kůry maďarský biochemik Albert Szent-Gyšrgyi, který se zajímal o omezování mechanismů oxidace v lidském těle. Objevenou látku (se vzorcem C 6 H 8 O 6 ) pojmenoval kyselina hexuronická. Později se mu podařilo tutéž látku izolovat ze šťáv pomeranče a zelí. Za svůj objev získal, po několika neúspěšných nominacích, v roce 1937 Nobelovu cenu za medicínu. Ve stejné době jako Albert Szent-Gyšrgyi se o izolaci vitaminu z citronové šťávy snažilo za pomoci velkého množství pokusných zvířat hned několik skupin vědců. V roce 1932 ohlásil úspěch svého týmu Charles Glen King z Pittsburské univerzity a dodal, že jeho krystaly mají všechny vlastnosti, které Szent-Gyšrgyi oznámil u své kyseliny hexuronické. Maďar tedy dokázal izolovat vitamin C a po celá čtyři léta jej měl k dispozici, aniž si to vůbec uvědomil. V témže 24

31 roce, kdy dostal Nobelovu cenu za medicínu Albert Szent-Gyšrgyi, ji v oboru chemie obdržel Norman Haworth z britské Birminghamské univerzity, který dokázal vypracovat přesnou strukturu Szent-Gyšrgyiho krystalů a dokázal vyrobit vitamin C syntetickou cestou. K hlavním propagátorům užívání vysokých dávek vitaminu C v pozdější době patřil například dvojnásobný laureát Nobelovy ceny Linus Pauling (Čapek, 2005). 9.2 Funkce v těle Vitamin C hraje roli v životně důležitých funkcích všech žláz a orgánů. Posiluje pojivovou tkáň a je nutný pro řádnou funkci nadledvinek a štítné žlázy. Je nezbytný pro dobrý stav kolagenu, i pro vývin a uchování zdravých zubů, dásní a kostí. Vitamin C pomáhá při hojení ran, posiluje imunitní systém a chrání tělo proti infekcím. Zvlášť důležitou roli hraje v ochraně nervových buněk před poškozením volnými radikály. Vitamin C chrání proti všem formám stresu, jak fyzického, tak duševního. Působí jako všeobecné přirozené antibiotikum. Specificky pomáhá při horečkách, všech druzích infekcí a při trávicích problémech. Stimuluje tvorbu interferonu, což je látka narušující proces tvorby virů. Interferon rovněž napomáhá destrukci nádorů ( Magazine&file=article&emsid=615). Tvorba kolagenu - vitamin C je velice důležitý pro tvorbu kolagenu, který tvoří strukturu kostí, chrupavek, svalů a cévních tkání. Mimo to přispívá k dobrému stavu zubů a dásní, a také dopomáhá k rychlejšímu hojení pooperačních ran. Zjednodušeně se dá říci, že kolagen dává pevnost a pružnost potřebnou pro konstrukci lidských orgánů. Pokud není vitaminu C v těle dostatečné množství, trpí tím soudržnost a pohyblivost podpůrných tkání. To, že je kolagen potřebný k hojení ran, ukazují i symptomy kurdějí (např. krvácení z dásní), které po podání vitaminu C mizí. Metabolismus - vitamin C se účastní celé řady metabolických procesů v organismu, např. metabolismu žlučových kyselin, vápníku a železa, syntézy některých hormonů a neurotransmitérů, podílí se na metabolismu kyseliny listové, nadledvinových steroidů a některých aminokyselin. Imunitní systém - vitamin C je nepostradatelný pro správnou funkci imunitního systému. Nedokáže sice zabránit propuknutí nemoci, ale výrazně zkracuje dobu nemoci a zmírňuje průvodní příznaky. 25

32 Prevence kardiovaskulárních onemocnění - vitamin C působí v této oblasti (společně s vitaminem E a beta-karotenem) jako antioxidant. Jeho úkolem je chránit lipidy buněčných membrán před oxidací i regenerace vitaminu E. Prevence proti nitrosoaminům - vitamin C předchází tvorbě nežádoucích nitrosoaminů v žaludku. Nitrosoaminy jsou konečné produkty reakčního řetězce dusičnan - dusitan - nitrosoamin. Dusičnany jsou pro rostliny důležitou živinou a mohou se z nich za přítomnosti baktérií tvořit dusitany. Z těch se v kyselém prostředí žaludečních šťáv mohou (za přítomnosti aminů) tvořit nitrosoaminy, které se považují za rakovinotvorné. Vitamin C však může s dusitany reagovat rychleji než aminy, což v důsledku znemožní tvorbu nitrosoaminů (Jebas, 2003). Bílé krvinky - fagocytická aktivita bílých krvinek závisí na množství vitaminu C, které se nachází v krvi a ve tkáních. Při boji s infekcí se vitamin C ničí. Pokud je hladina kyseliny askorbové příliš nízká, bílé krvinky nenapadnou baktérie útočící na organismus a nedokáží je zneškodnit. Vstřebávání železa minerály, jako například vápník a fosfor, jsou skladovány v těle. Pokud není přítomen vitamin C, kostní tkáň nedokáže tyto minerály použít, a tak jsou ztraceny. Lidé, kteří pravidelně pijí pomerančovou šťávu, dokáží zvýšit vstřebávání železa až o 400 %, protože v ní obsažený vitamin C zvyšuje dostupnost železa ( /modules.php?name=emagazine&file=article&emsid=615). Zvýšení odolnosti proti chladu - při pokusech na zvířatech bylo dokázáno, že podáváním vitaminu C se zvyšuje odolnost vůči chladu. To je významné zjištění, protože nemoci z nachlazení jsou zapříčiněny většinou souběhem stresu z chladu a infekce. Těžké kovy - vitamin C chrání organismus před těžkými kovy. Má totiž schopnost vázat určité škodlivé látky, čímž je odstraní z koloběhu látek a organismus je následně vyloučí. Cigaretový kouř obsahuje vysoký podíl těžkých kovů, jedním z těchto toxických kovů je olovo. Vitamin C může toto olovo vázat a usnadnit jeho vyloučení. Stres - stresové situace jsou spojeny s vyšší spotřebou vitaminu C. To je částečně způsobeno zvýšenou tvorbou stresových hormonů, které jsou závislé na vitaminu C (Jebas, 2003). Ochrana oční čočky - kyselina askorbová je v oku hlavním antioxidantem (ve vodné složce tkáně a ve sklivci je kyseliny askorbové 160 a 360 mg/kg vlhké váhy). V očním lékařství se v poslední době ukazuje význam volných radikálů a antioxidantů u řady nemocí. Oko přijímá světlo včetně UV paprsků, které jsou absorbovány rohovkou a čočkou a jen jejich malé množství proniká do retiny. Spojivky jsou místem, kde krev není chráněna před světlem a do jisté míry ani před škodlivinami z okolního prostředí. To vše přispívá ke zvýšené tvorbě 26