RIGORÓZNÍ PRÁCE. Optimalizace diagnostických metod oxidačního stresu. Optimization of oxidative stress diagnostic methods

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE, FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE RIGORÓZNÍ PRÁCE Optimalizace diagnostických metod oxidačního stresu Optimization of oxidative stress diagnostic methods Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc. Vedoucí rigorózní práce: Ing. Kateřina Macáková, PhD. Školitel - specialista: doc. RNDr. Miroslav Pohanka, PhD. Hradec Králové, 2013 Mgr. Miroslava Mercová

2 Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Tento výstup vznikl v rámci projektu Specifického školského výzkumu (2013) Hradec Králové, 2013 Podpis

3 Na tomto místě bych ráda poděkovala především doc. RNDr. Miroslavu Pohankovi, PhD. za odborné vedení, trpělivost a čas, který mi věnoval v průběhu zpracování této práce. Mé díky patří i Ing. Kateřině Macákové, PhD. za cenné připomínky a podněty k úpravám.

4 SEZNAM ZKRATEK AGE CAT DMSO DPPH DTNB EDTA ESR FRAP GC-MS GR GSH GSHPx GSSG 4-HNE MDA NADPH NOS PBS RNS ROS SOD TAC TBA TBARS TCA TPTZ advanced glycation end-products katalasa dimethylsulfoxid 2,2'-difenyl-1-pikrylhydrazyl 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová) kyselina ethylendiamintetraoctová kyselina elektronová spinová rezonance ferric reducing antioxidant power plynová chromatografie s hmotnostní detekcí gutathionreduktasa redukovaný glutathion glutathionperoxidasa oxidovaný glutathion 4-hydroxynonenal malondialdehyd nikotinamid adenin dinukleotid fosfát syntasa oxidu dusnatého fosfátový pufr reactive nitrogen species reactive oxygen species superoxiddismutasa celková antioxidační kapacita thiobarbiturová kyselina thiobarbituric acid reactive substances trichloroctová kyselina 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazin

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL TEORETICKÁ ČÁST VOLNÉ RADIKÁLY ZDROJE VOLNÝCH RADIKÁLŮ ROLE PŘECHODNÝCH KOVŮ V RADIKÁLOVÝCH REAKCÍCH FYZIOLOGICKÉ FUNKCE VOLNÝCH RADIKÁLŮ ANTIOXIDAČNÍ OCHRANNÝ SYSTÉM OXIDAČNÍ POŠKOZENÍ ORGANISMU A ANTIOXIDAČNÍ TERAPIE OXIDAČNÍ STRES OXIDAČNÍ POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL ROLE OXIDAČNÍHO STRESU V PATOGENEZI VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ ANTIOXIDAČNÍ TERAPIE DETEKCE A KVANTIFIKACE OXIDAČNÍHO STRESU DETEKCE VOLNÝCH RADIKÁLŮ MĚŘENÍ PRODUKTŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL MĚŘENÍ ANTIOXIDANTŮ MĚŘENÍ CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST LABORATORNÍ ZVÍŘATA POUŽITÉ CHEMIKÁLIE POMŮCKY A PŘÍSTROJE PRŮBĚH EXPERIMENTU POUŽITÉ METODY METODA TBARS METODA FRAP DPPH-TEST STANOVENÍ REDUKOVANÉHO GLUTATHIONU STANOVENÍ AKTIVITY GLUTATHION REDUKTASY VÝSLEDKY METODA TBARS METODA FRAP DPPH-TEST STANOVENÍ REDUKOVANÉHO GLUTATHIONU STANOVENÍ AKTIVITY GLUTATHION REDUKTASY DISKUSE

6 7 ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY

7 1 ÚVOD Existence volných radikálů je známa již několik set let, jejich intenzivní výzkum byl však nastartován až v 50. letech dvacátého století. Od té doby byl v oblasti výzkumu těchto reaktivních částic s nepárovými elektrony učiněn velký pokrok. Podařilo se objasnit význam volných radikálů například při tvorbě energie v mitochondriích, při odstraňování cizorodých částic fagocytujícími buňkami, v metabolismu xenobiotik i tělu vlastních látek, stále hluboce studováno je uplatnění volných radikálů v signální transdukci. Kromě uvedených fyziologických funkcí mohou však mít volné radikály na organismus i negativní vliv. Dojde-li k vytvoření nerovnováhy mezi jejich tvorbou a odstraňováním antioxidačními systémy, dochází k oxidačnímu stresu, který je spojován s rozvojem celé řady onemocnění a patologických stavů. Do současnosti bylo nashromážděno ohromné množství důkazů prokazujících roli oxidačního stresu v patofyziologii aterosklerózy, neurodegenerativních chorob (Parkinsonova choroba, Alzheimerova demence), nádorových a zánětlivých onemocnění (revmatoidní artritida, Crohnova choroba), diabetu mellitu a spousty dalších. Vytvořil se zde velký prostor pro výzkum nových potencionálních léčiv především z řad antioxidantů. Informace o příznivých účincích volných radikálů se dostaly do podvědomí široké veřejnosti a v dnešní době je na trhu dostupná celá škála preparátů s antioxidačními účinky. I z těchto důvodů je dnes studium volných radikálů velice atraktivní. Základem úspěšného studia oxidačních dějů jsou kvalitní a reprodukovatelné metody. Tak velký posun v problematice volných radikálů, který byl učiněn za posledních několik desítek let, by bez precizních laboratorních metodik nebyl možný. I tato oblast se dynamicky rozvíjí, samozřejmě i v souvislosti s technickým pokrokem. V současnosti je možné sledovat oxidační děje na úrovni volných radikálů, antioxidantů a oxidačního poškození, které volné radikály způsobují. Ovšem žádná z dosud používaných metod není ideální. Často se diskutuje o nedostatečné sensitivitě či specifitě řady z nich. Rovněž dosud vědci postrádají metodu, která by byla schopná zachytit vzájemné vztahy v rámci oxidačních dějů komplexněji, nikoli jen na jednotlivých úrovních oxidačních procesů. Vzhledem ke stoupajícímu uvědomění si významu oxidačních dějů je však třeba se metodikám věnovat a neustále je zdokonalovat. 7

8 2 CÍL Cílem této práce bylo posouzení stability markerů standardně stanovovaných v biologických vzorcích při různé přípravě vzorků určených k měření. Tato práce má doporučit optimální postup úpravy vzorků a zhodnotit možná rizika v procesech předcházejících vlastnímu měření. V detailu se jedná o následující: a) změření hladin vybraných markerů oxidačního stresu v pěti různých tkáňových homogenátech po pěti cyklech zmrazování rozmrazování, b) zjištění lineární závislosti mezi výše uvedenými proměnnými, c) zhodnocení výsledků měření. 8

9 3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 VOLNÉ RADIKÁLY Volné radikály jsou částice obsahující v elektronovém obalu nejméně jeden nepárový elektron. Jsou schopné samostatné existence, přítomnost nepárového elektronu je však příčinou vysoké reaktivity a nestability těchto částic. Vznikají nejčastěji přijetím jednoho elektronu neutrální částicí (redukce), nebo naopak ztrátou jednoho elektronu (oxidace). Další možností je homolytické štěpení kovalentní vazby, což je však děj vysoce energeticky náročný, proto v biologických systémech prakticky neprobíhá. Volné radikály se snaží doplnit si nepárový elektron za vzniku stabilní elektronové konfigurace. Elektron získají při setkání s dalším radikálem nebo jeho vytrhnutím z jiné molekuly. Z té se tak stává radikál a dochází k řetězové reakci. V živých organismech probíhá celá řada těchto radikálových řetězových reakcí fyziologicky, často však také vede k poškození molekul (Racek, 2003). Nejčastěji se setkáváme s volnými radikály kyslíku (označovaných též jako ROS reactive oxygen species) a dusíku (tzv. RNS reactive nitrogen species). ROS Označení ROS se často používá nejen pro volné radikály kyslíku, ale i určité neradikálové sloučeniny, které jsou oxidačními činidly nebo snadno přechází na radikály (Halliwell a Whiteman, 2004). Zde je uveden přehled nejvýznamnějších z nich. Superoxid O. 2 Superoxidový radikál vzniká jednoelektronovou redukcí molekuly kyslíku: O 2 e O. 2 Je asi nejčastěji se vyskytujícím volným radikálem v živých organismech. Je produkován v průběhu dýchacího řetězce na vnitřní membráně mitochondrií a při fotosyntéze v chloroplastech, vzniká při autooxidačních reakcích (např. flavinů, hydrochinonů, thiolů) a činností řady enzymatických systémů (např. xanthinoxidasy, lipoxygenasy, cyklooxygenasy) (Auroma, 1998; Racek, 2003). Působí jako silné oxidační i redukční činidlo. Účastní se reakcí, při kterých mohou vznikat další reaktivní sloučeniny (např. singletový kyslík, peroxynitrit, kyselina chlorná, 9

10 hydroxylový radikál) (Babior, 1997). Tyto reakce probíhají buď přímo, nebo častěji s katalytickým působením enzymů či iontů přechodných kovů (Valko et al., 2006). Spontánně podléhá dismutaci, tedy reakci dvou molekul superoxidu za vzniku peroxidu vodíku a kyslíku: O H H O O Enzym superoxiddismutasa tuto reakci ještě urychluje (Babior, 1997). Peroxid vodíku H O 2 2 Vzniká dismutací superoxidu a kromě superoxiddismutasy může být tvořen i řadou jiných oxidasových systémů. Není volným radikálem, ale má oxidační vlastnosti. Ve srovnání s volnými radikály však oxiduje molekuly pomalu (Auroma, 1998). Jeho nebezpečí spočívá hlavně v možnosti podléhat přeměnám za vzniku mnohem reaktivnějších forem (např. kyseliny chlorné či hydroxylového radikálu) (Kohen a Nyska, 2002). Hydroxylový radikál OH. Je považován za nejvíce reaktivní volný radikál a tedy za nejvíce nebezpečný. Může vzniknout řadou reakcí, nejvýznamnější je reakce peroxidu vodíku v přítomnosti iontů železa, tzv. Fentonova reakce: H O2 Fe OH OH Fe Hydroxylový radikál interaguje extrémně rychle s molekulami pouze v okolí svého vzniku. Jako velmi silné oxidační činidlo je schopen reagovat s většinou organických i anorganických molekul (Auroma, 1998). Kyselina chlorná HClO Je produkována neutrofilními granulocyty pomocí enzymu myeloperoxidasy: H 2O2 Cl H HClO H 2O Tato reakce se uplatňuje při likvidaci bakterií fagocytujícími buňkami (Splettstoesser a Schuff-Werner, 2002). Kyselina chlorná není volný radikál, ale potenciální oxidační a chlorační činidlo. Může napadat řadu molekul, hraje roli například v chloraci cholesterolu (Carr at al., 1996). 10

11 Peroxylové radikály Jsou meziprodukty oxidačních reakcí lipidů. Reaktivita těchto látek se různí, závisí především na povaze R-skupiny a okolních podmínkách. Škála reakcí, kterých se tyto molekuly účastní, je velice rozmanitá, ovlivňují např. štěpení DNA (Valko et al., 2006). Singletový kyslík 1 O 2 Vzniká z molekuly kyslíku přemístěním jednoho elektronu do stavu s vyšší energetickou hladinou a změnou jeho spinu. Je velice reaktivní, slučuje se např. s nenasycenými mastnými kyselinami v lipidech (Štípek et al., 2000). RNS Do skupiny RNS patří reaktivní sloučeniny odvozené od dusíku. Opět se může jednat o volné radikály i neradikálové sloučeniny (Halliwell a Whiteman, 2004). Nejdůležitějšími představiteli jsou oxid dusnatý a peroxynitrit. Oxid dusnatý. NO Je velmi významnou látkou, v živých systémech zastává celou řadu fyziologických funkcí. Obsahuje nepárový elektron, je tedy také volným radikálem. Je syntetizován složitým mechanismem z aminokyseliny L-argininu za vzniku L-citrulinu a oxidu dusnatého. Reakce je katalyzována enzymem syntasa oxidu dusnatého (NOS), který je znám ve třech isoformách, lišících se především v regulaci exprese: neuronální, endoteliální a inducibilní NOS (Alderton et al., 2001). V závislosti na okolních podmínkách reaguje oxid dusnatý s řadou látek a radikálů za vzniku dalších reaktivních forem (Dröge, 2002). Peroxynitrit OONO Vzniká reakcí oxidu dusnatého se superoxidem:. NO O. 2 OONO Tato reakce probíhá v buňkách imunitního systému při zánětu (Valko et al., 2007). Peroxynitrit je reaktivnějším radikálem než. NO, ve své protonované formě je např. zodpovědný za depleci sulfhydrylových skupin, poškození DNA či proteinů (Kohen a Nyska, 2002). 11

12 3.1.1 ZDROJE VOLNÝCH RADIKÁLŮ Živé organismy jsou vystaveny působení ROS a RNS z okolního i vnitřního prostředí. K vnějším zdrojům patří ionizující (γ-paprsky, X-paprsky) i neionizující záření (UV-záření), vysoký obsah škodlivin ve vzduchu (cigaretový kouř, automobilové výpary, průmyslové znečištění), intoxikace chemickými látkami (alkohol, bleomycin, pesticidy aj.) a v neposlední řadě i potrava (volné radikály v ní vznikají při tepelné úpravě, vlivem světla atd.) (Kohen a Nyska, 2002; Racek, 2003). I když vnější prostředí představuje enormně vysokou oxidační zátěž, vnitřní zdroje jsou mnohem důležitější i rozsáhlejší. Významným místem produkce ROS je mitochondriální komplex III dýchacího řetězce, kde dochází k tvorbě superoxidu jednoelektronovou redukcí kyslíku (Fleury et al., 2002). V mitochondriích a na endoplazmatickém retikulu jaterních buněk je umístěn enzymový systém cytochromu P450. Enzymy tohoto systému - monooxygenasy - katalyzují oxidační reakce, při kterých dochází k zabudování atomu kyslíku do organického substrátu. Druhý atom kyslíku z původní molekuly je redukován na vodu (Meunier et al., 2004). Dále volné radikály v živých organismech mohou vznikat jako vedlejší produkty reakcí katalyzovaných některými enzymy (např. xanthinoxidasa) či přímo produkcí enzymy (např. NOS). Podstatou zneškodňování bakterií a jiných nežádoucích cizích těles v polymorfonukleárech jsou rovněž oxidační reakce. Tyto buňky jsou v organismu hlavním endogenním zdrojem volných radikálů (Kohen a Nyska, 2002) ROLE PŘECHODNÝCH KOVŮ V RADIKÁLOVÝCH REAKCÍCH Většina přechodných kovů obsahuje nepárové elektrony a definičně tedy odpovídá volným radikálům. Tranzitní kovy jako např. železo, měď, kadmium, chrom, nikl, rtuť se mohou účastnit radikálových reakcí a přeměňovat relativně stabilní látky na účinné oxidanty. Nejvíce prostudovány jsou železo a měď (Stohs a Bagchi, 1995). Nejvýznamnější reakcí katalyzovanou ionty Fe 2+ (příp. Cu + ) je Fentonova reakce, tedy přeměna peroxidu vodíku na vysoce toxický hydroxylový radikál. Přechodné kovy jsou však schopné zasahovat do radikálových reakcí pouze ve formě volné a redukované. Za fyziologických okolností se proto přechodné kovy v organismu vyskytují vázané v pevném chelátu, např. v transportním či skladovacím proteinu. Další možností ochrany před účinky přechodných kovů je udržování jejich iontů ve vyšším oxidačním stavu, než ve kterém mohou být nebezpečné (Racek, 2003). 12

13 3.1.3 FYZIOLOGICKÉ FUNKCE VOLNÝCH RADIKÁLŮ Oxidační reakce jsou podstatou aerobního metabolismu. Přeměna živin na energii v přítomnosti kyslíku probíhá v mitochondriích. Posledním funkčním enzymem dýchacího řetězce je cytochromoxidasa, která katalyzuje redukci kyslíku za vzniku vody a ATP. Reakce probíhá ve čtyřech stupních a jako vedlejší produkty vznikají peroxid vodíku a superoxid, které však zůstávají navázány na enzym. Nejsou tak schopny poškodit okolní molekuly. Obdobně vznikají volné radikály jako meziprodukty činností monooxigenas, které se uplatňují např. při syntéze cholesterolu ze žlučových kyselin nebo při odstraňování xenobiotik z organismu (Štípek et al., 2000). Likvidace cizorodých těles a bakterií fagocyty je založena na působení volných radikálů. Po pohlcení cizí částice dochází k aktivaci fagocytující buňky a redukci molekulárního kyslíku na superoxid prostřednictvím NADPH-oxidasy. Dochází k několikanásobnému zvýšení spotřeby kyslíku (tzv. respirační vzplanutí). Následnou dismutací se superoxid přeměňuje na peroxid vodíku a ten následně Fentonovou reakcí na hydroxylový radikál. Myeloperoxidasa katalyzuje tvorbu kyseliny chlorné, která je pak dalším zdrojem hydroxylového radikálu. Kromě již zmíněných radikálů dochází v aktivovaných makrofázích i k produkci singletového kyslíku a oxidu dusnatého (Splettstoesser a Schuff- Werner, 2002). V poslední době velmi studována je funkce volných radikálů v signálních drahách. Je známo, že volné radikály se uplatňují v dějích souvisejících s imunitními funkcemi, regulací buněčného cyklu a maligní transformací buněk. Popsáno bylo např. ovlivnění aktivity transkripčních faktorů NF-κB, TNF-α nebo aktivačního proteinu AP-1, které se ve zmíněných dějích uplatňují. Jedna z velmi důležitých signálních molekul je oxid dusnatý. Působí jako neurotransmiter v centrálním i autonomním nervovém systému, uplatňuje se v procesu relaxace hladké svaloviny a při vazodilataci cévního endotelu (Štípek et al., 2000). Nástrojem buněčné signalizace je i redoxní rovnováha buňky. Již malá změna v produkci reaktivních forem může zásadně ovlivnit buněčnou homeostázu a může hrát roli v iniciaci signální kaskády (Tarpey et al., 2004). 13

14 3.2 ANTIOXIDAČNÍ OCHRANNÝ SYSTÉM Antioxidační ochranný systém udržuje volné radikály pod kontrolou a zabraňuje tak jejich negativnímu působení. Jednotlivé prvky tohoto systému jsou navzájem úzce propojeny, doplňují se i potencují. Systém působí na třech úrovních prevence, zastavení oxidačního procesu a reparace již poškozených molekul (Sies, 1993). Velmi často se v souvislosti s antioxidační ochranou setkáváme s pojmem antioxidant, jehož definice je dosud nejednoznačná (Kohen a Nyska, 2002). V užším slova smyslu se jako antioxidanty označují jen látky vychytávající již vzniklé volné radikály, v širším slova smyslu se pod tento pojem řadí i látky zabraňující tvorbě volných radikálů. Antioxidanty tvoří velice různorodou skupinu látek, jejichž systematika je obtížná. Zahrnují látky endogenního původu i látky exogenní, přirozené i umělé (např. některé léky s antioxidačním účinkem). Některé z nich působí uvnitř buňky, jiné se vyskytují pouze extracelulárně (Racek, 2003). Působení antioxidační ochrany v organismu můžeme rozdělit na přímé a nepřímé. Nepřímé mechanismy o Zabránění vzniku radikálů např. ovlivněním aktivity enzymů, které volné radikály produkují (indukovatelná NOS, xanthinoxidasa), nebo chelatací přechodných kovů o Oprava již poškozených molekul reparaci či eliminaci oxidačně poškozených molekul zajišťuje systém enzymů i malých molekul. DNA je opravována reparačními endonukleasami, oxidované proteiny jsou rozloženy proteolyticky a oxidačně modifikované mastné kyseliny jsou z fosfolipidů odstraňovány fosfolipasami (Kohen a Nyska, 2002; Štípek et al., 2000). Přímé mechanismy o Přímo působí látky, které zachycují a odstraňují již vzniklé volné radikály. Podle chemického mechanismu, kterým působí, se označují také jako vychytávače, lapače či zhášeče volných radikálů (scavengers, trappers, quenchers) (Štípek et al., 2000). Reagují s radikálem přímo a samy se tak stávají radikály, ale ne už reaktivními. Scavenger podstupuje další oxidaci a nebo je regenerován do své redukované formy pomocí dalšího scavengeru (Kohen a Nyska, 2002). Přímo působící antioxidanty můžeme rozdělit do dvou velkých skupin nízkomolekulární antioxidanty a antioxidační enzymy. 14

15 Nízkomolekulární antioxidanty Nízkomolekulární antioxidanty jsou syntetizovány v organismu, získávány potravou (např. některé vitaminy) a nebo vznikají v buňkách jako odpadní produkty. Látek s antioxidačním účinkem je celá řada, nicméně jen některé mají v antioxidační ochraně praktický význam (Racek, 2003). Glutathion Glutathion je důležitým intracelulárním antioxidantem. Chemicky je to tripeptid γ- glutamylcysteinglycin. Vyskytuje se ve formě redukované (GSH), která převažuje, a ve formě oxidované (GSSG). Pro zachování optimálního oxidačně-redukčního prostředí v buňce je důležité udržování konstantního poměru těchto dvou forem glutathionu. Před volnými radikály chrání především sulfhydrylové skupiny proteinů, chrání i DNA v buněčném jádře. Je kofaktorem glutathionperoxidasy a glutathion-stransferasy. Regeneruje vitamin E a C. Přímo vychytává hydroxylový radikál a singletový kyslík (Valko et al., 2007). Vitamin E Označení vitamin E zahrnuje skupinu tokoferolů a tokotrienolů, z nichž nejvýznamnější je α-tokoferol. Molekula vitaminu E je lipofilní, uplatňuje se tedy v antioxidační ochraně lipidů biologických membrán a lipoproteinových částic plazmy. Reaguje s meziprodukty lipoperoxidace, zneškodňuje je a tím zabraňuje šíření řetězové reakce. Sám se přeměňuje na tokoferylový radikál, který může být nebezpečný. Regenerován do původní formy je prostřednictvím kyseliny askorbové (Herrera a Barbas, 2001). Vitamin C (kyselina askorbová) Vitamin C se v těle uplatňuje jako kofaktor řady enzymů (např. při syntéze kolagenu, při přeměně dopaminu na noradrenalin), redukuje Fe III+ na Fe II+ a Cu II+ na Cu +, čímž umožňuje vstřebávání těchto iontů. V antioxidační ochraně se uplatňuje jako scavenger superoxidu, hydroxylového radikálu, peroxylových radikálů, peroxynitritu, singletového kyslíku a kyseliny chlorné. Regeneruje vitamin E (Štípek et al., 2000). Askorbát je schopný poskytovat dva elektrony. Při odevzdání jednoho elektronu se mění na askorbylový radikál neboli semidehydroaskorbát, který může být dále oxidován na dehydroaskorbát nebo regenerován do redukované formy pomocí 15

16 NADH-semidehydroaskorbat reduktasy za přítomnosti GSH. (Kohen a Nyska, 2002). Karotenoidy Karotenoidy jsou rostlinné pigmenty, patří mezi terpeny. Zahrnují celou skupinu lipofilních látek, z nichž nejvýznamnější jsou β-karoten, α-karoten, lykopen, lutein a zeaxanthin. V antioxidační ochraně mají význam při odstraňování peroxylových radikálů a singletového kyslíku (Stahl a Sies, 2003). Pravděpodobně reagují s vitamínem E a C a regenerují je (Grune et al., 2005). Koenzym Q 10 Koenzym Q 10 patří mezi deriváty benzochinolu, v molekule obsahuje 10 isoprenových jednotek. Uplatňuje se jako přenašeč elektronů v dýchacím řetězci v mitochondriích. Jako lipofilní molekula se však vyskytuje ve všech membránách a v lipoproteinech, kde podobně jako vitamin E tlumí radikálové reakce. Podílí se také na regeneraci vitaminu E a kyseliny askorbové v mimobuněčném prostředí (Crane, 2001). Kyselina močová Kyselina močová vzniká v organismu jako odpadní produkt metabolismu purinů. Je nejhojnějším antioxidantem plazmy. Přímo vychytává hydroxylový radikál, peroxylové radikály a singletový kyslík a váže železo a měď (Glantzounis et al., 2005). Vzniklý urátový radikál je pak regenerován vitaminem C (Racek, 2003). Polyfenoly Skupina polyfenolů zahrnuje rozlišné sekundární metabolity rostlin (flavonoidy, tanin, lignin). Kromě přímého antioxidačního účinku jsou schopné chelatovat ionty přechodných kovů a měnit fluiditu membrán, čímž stéricky brání difúzi volných radikálů a zamezují tak oxidačním reakcím (Blokhina et al., 2003). Antioxidační enzymy Superoxiddismutasa (SOD, EC ) Aktivita tohoto enzymu spočívá v urychlování reakce přeměny superoxidu na molekulární kyslík a peroxid vodíku. SOD je obsažena téměř ve všech aerobních organismech. Rozeznáváme několik druhů tohoto enzymu lišících se kofaktorem 16

17 (atomem kovu) a strukturou: Mn-SOD - je přítomna v prokaryotických organismech a v mitochondriích vyšších eukaryot Fe-SOD - nachází se v prokaryotických buňkách pouze u rostlin Cu/Zn-SOD - vyskytuje se v cytoplazmě vyšších eukaryot (Kohen a Nyska, 2002) Extracelulární SOD vyskytuje se mimo buňky a to pouze u živočichů, v katalytickém centru obsahuje zinek a měď (Štípek et al., 2000). Glutathionperoxidasa (GSHPx, EC ) Patří do rodiny peroxidas, které redukují peroxid vodíku za současné oxidace dalšího substrátu. V případě GSHPx, která se vyskytuje u živočichů, je tímto substrátem glutathion. U rostlin se setkáváme nejčastěji s askorbatperoxidasou, využívající kyselinu askorbovou. GSHPx odstraňuje peroxid vodíku přítomný již v nízkých koncentracích: H 2O2 2 GSH 2H 2O GSSG K regeneraci glutathionu je nutná návaznost reakce na glutathionreduktasu. Rozlišujeme tři formy GSHPx - cytosolová, extracelulární a fosfolipidová. Posledně zmiňovaný enzym se vyskytuje v buněčné membráně, kde redukuje lipidové hydroperoxidy, čímž chrání fosfolipidy buněčných membrán a přerušuje řetězovou reakci přímo v membránách (Racek, 2003). Je klíčovým enzymem v antioxidační ochraně membrán. Jako ostatní peroxidasy redukuje i peroxid vodíku, ale velmi pomalu (Blokhina et al., 2003). Všechny formy GSHPx se liší strukturou a molekulovou hmotností. Jsou to selenoproteiny, tzn. že obsahují v aktivním centru aminokyselinu selenocystein (Štípek et al., 2000). Glutathionreduktasa (GR, EC ) Regeneruje oxidovanou formu glutathionu (GSSG) jeho redukcí za přítomnosti NADPH: GSSG NADPH H 2 GSH NADP NADPH pochází z pentosového cyklu (Štípek et al., 2000). 17

18 Katalasa (CAT, EC ) Katalasa štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík: 2H H O O 2O Na rozdíl od peroxidas však působí na peroxid jen ve vysokých koncentracích. Nejvyšší aktivita katalasy je u člověka v mitochondriích a peroxisomech hepatocytů a v cytoplazmě erytrocytů (Racek, 2003). 18

19 3.3 OXIDAČNÍ POŠKOZENÍ ORGANISMU A ANTIOXIDAČNÍ TERAPIE OXIDAČNÍ STRES Mezi tvorbou volných radikálů a antioxidační ochranou je v organismu vytvořena dynamická rovnováha. Udržení stálého oxidoredukčního stavu je nesmírně důležité pro zachování buněčných a biochemických funkcí a podléhá tedy v organismu neustálé kontrole a přísné regulaci. Narušení rovnováhy ve prospěch volných radikálů se označuje termínem oxidační stres a může vést k potencionálnímu poškození biomolekul. I převaha antioxidační ochrany může mít na organismus negativní dopad. Dochází k blokaci těch účinků volných radikálů, které jsou pro organismus příznivé. V literatuře se označuje termínem redukční stres (Kohen a Nyska, 2002) OXIDAČNÍ POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL Volné radikály jsou schopny napadnout prakticky kteroukoli molekulu v organismu a způsobit tak její poškození. Nejzávažnější je oxidační poškození lipidů, DNA a proteinů. Produkty oxidačních reakcí těchto biomolekul se velmi často využívají jako markery oxidačního stresu. Lipidy podléhají oxidaci snadno díky přítomnosti nenasycených vazeb v řetězcích mastných kyselin. Proces oxidace lipidů se označuje jako lipoperoxidace či peroxidace lipidů a je poměrně dobře prozkoumaný. Konečnými produkty lipoperoxidace jsou hydroperoxidy, které se mohou dále rozkládat na aldehydy (např. malondialdehyd (MDA), 4-hydroxynonenal (4-HNE)) nebo vytvářet cyklické endoperoxidy, isoprostany a jednoduché uhlovodíky (Kohen a Nyska, 2002). Výše popsaný děj probíhá v organismu patologicky a škodí. Existuje však i enzymová peroxidace lipidů, která probíhá např. na aktivních centrech cyklooxygenasy či lipoxygenasy, kdy dochází k produkci biologicky aktivních látek (prostaglandiny, leukotrieny). Volné radikály v těchto reakcích vznikají jako meziprodukty, nejsou však uvolňovány z enzymu, proto nejsou pro organismus nebezpečné (Štípek et al., 2000). Proteiny podléhají různým oxidačním modifikacím. Volnými radikály jsou napadány především postranní řetězce aminokyselin. Dochází ke vzniku celé řady derivátů, z nichž význam mají především karbonylové deriváty (aldehydy a ketony), oxidované, hydroxylované či nitrované aminokyseliny (např. 3-nitrotyrosin). Nejvíce citlivé vůči 19

20 oxidačnímu poškození jsou aminokyseliny cystein a methionin, obě obsahující sulfhydrylové skupiny. Proteiny mohou být poškozeny i nepřímo reakcí s produkty vznikajícími při lipoperoxidaci, s aminokyselinami a s cukry (Shacter, 2000). Molekula deoxyribonukleové kyseliny je sice dostatečně stabilní a velmi dobře chráněná, i přesto může být atakována volnými radikály. Za většinu poškození je zodpovědný hydroxylový radikál. Napadat může cukernou složku i purinové a pyrimidinové báze (především guanin) za vzniku oxoderivátů a hydroxyderivátů. Důsledkem je vznik produktů, z nichž nejvíce prostudovány jsou 8-hydroxydeoxyguanosin (8-OH-dG), 8- hydroxydeoxyadenosin (8-OH-dA), 5-hydroxycytidin (5-OH-dC) a 5,6- dihydroxydeoxythimidin (thymidinglykol-dtg) (Kohen a Nyska, 2002; Štípek et al., 2000). Poškození biomolekul vede k různým změnám v jejich struktuře. Jejich biologické důsledky jsou shrnuty v tabulce č. 1. Tabulka č. 1: Poškození biologických makromolekul volnými radikály a jeho následky (Štípek et al., 2000). Cíl Poškození Následky Lipidy Proteiny DNA Ztráta dvojných vazeb Tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy) Agregace a síťování Fragmentace a štěpení Modifikace thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin Reakce s hemovým železem Štěpení kruhu deoxyribosy Modifikace a poškození bází Zlomy řetězce Křížové vazby řetězců Změněná fluidita lipidů Změny v propustnosti membrán Vliv na membránově vázané enzymy Tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy Změny v transportu iontů Vstup Ca 2+ do cytosolu Změny v aktivitě enzymů Mutace Translační chyby Inhibice proteosyntézy 20

21 3.3.3 ROLE OXIDAČNÍHO STRESU V PATOGENEZI VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ Role oxidačního stresu byla prokázána v patogenezi celé řady nemocí (ateroskleróza, diabetes mellitus, revmatoidní artritida, neurodegenerativní onemocnění) i v rozvoji některých patologických procesů (nekrosa, apoptosa, ischemicko-reperfúzní poškození, zánět, proces stárnutí) (Valko et al., 2007). Volné radikály mohou být primární příčinou chorobných stavů, nebo zhoršují či komplikují jejich průběh. Příklady některých chorob a procesů, které jsou intenzivně studovány, jsou uvedeny níže. Zánět Zánět je reakce na místní porušení integrity organismu. Organismus aktivuje mechanismy vedoucí k odstranění podnětu a reparaci poškozené tkáně. Během tohoto procesu dochází ke zvýšené produkci volných radikálů. Jejich největším zdrojem jsou v tomto případě fagocyty, ve kterých dochází k aktivaci NADPH-oxidasy a následně k tvorbě radikálů důležitých pro mikrobicidní činnost fagocytů. NADPH-oxidasa může být aktivována i v jiných buňkách, např. buňkách endotelu. Zvýšená tvorba reaktivních forem vede k destrukci mikrobů, ale i vlastní tkáně. Při zánětu vznikají volné radikály v určitém množství také v respiračním řetězci a dále působením některých dalších enzymů (např. xanthinoxidasy, cyklooxygenasy, lipoxygenas a dalších). Kromě ROS se v patofyziologii zánětu uplatňují i reaktivní formy dusíku. Oxid dusnatý přímo přispívá k zabíjení intracelulárních patogenů, působí vazodilataci poškozené tkáně a vede tedy ke zvýšenému prokrvení zánětlivého ložiska, zároveň má i antiagregační působení (Štípek et al., 2000). Kromě zánětů akutních se volné radikály uplatňují i v zánětech chronických jako je např. ateroskleróza či revmatoidní artritida (Racek, 2003). Ischémie a reperfúze V důsledku ischémie jakékoli tkáně dochází k vyčerpání zásob ATP, začne se hromadit AMP a jeho oxidační produkt hypoxanthin. Zároveň stoupá v cytosolu koncentrace Ca 2+. Při následné reperfúzi dochází za přítomnosti kyslíku k produkci superoxidu a peroxidu vodíku především xanthinoxidasou. Navíc jsou k reperfundované tkáni přitahovány neutrofily, čímž dochází k další tvorbě ROS a rozvíjejícímu se zánětu. Intenzivní expozice ROS navodí nekrosu, mírnější a déle trvající nedostatek kyslíku navodí apoptosu. Masivní produkce ROS během ischémie-reperfúze vede 21

22 k tkáňovému poškození, které je klinicky relevantní a může způsobit komplikace při orgánové transplantaci, mozkové mrtvici, infarktu myokardu (Valko et al., 2007). Stárnutí Mnohobuněčné organismy podstupují v průběhu času kvalitativní změny. Vysvětlením těchto změn se zabývá řada teorií. Tzv. radikálová teorie stárnutí prohlašuje, že degenerativní proces související s věkem je z velké části důsledkem poškození organismu volnými radikály (Dröge,2002). Pro pravdivost teorie svědčí řada faktorů, nicméně i přes to zůstává tato teorie pouze jednou z hypotéz (Racek, 2003). Rakovina Poškození DNA volnými radikály může vést k mutacím a rozvoji nádorového bujení. I některé známé chemické karcinogeny poskytují při metabolické přeměně v organismu volné radikály (např. antracen, benzpyren). V patogenezi kancerogeneze se uplatňuje i oxidačním stresem podmíněné ovlivnění signálních drah, které se podílejí na řízení apoptosy a proliferace. Na druhé straně však volné radikály hrají důležitou roli při destrukci nádorů ozařováním či podáním řady cytostatik. Volné radikály jsou však zodpovědné i za některé závažné nežádoucí účinky cytostatické léčby (např. kardiotoxicita, pneumotoxicita) (Racek, 2003; Štípek et al., 2000). Diabetes mellitus U pacientů s diabetem byla zaznamenána prokazatelně vyšší tvorba reaktivních forem a snížená hladina antioxidačně působících látek. Volné radikály se uplatňují při vzniku diabetu i při rozvoji jeho pozdních komplikací. U diabetu I. typu dochází v důsledku autoimunitního procesu v β-buňkách Langerhansových ostrůvků k zánětlivým procesům, což vede i k produkci volných radikálů, které tyto buňky poškozují (Racek, 2003). U diabetu typu II se volné radikály pravděpodobně podílejí na rozvoji inzulinorezistence. Společným rysem diabetu I. i II. typu je hyperglykémie. Glukóza se váže na aminoskupiny proteinů a přes řadu meziproduktů vznikají tzv. produkty pokročilé glykace (advanced glycation end-products, AGE). AGE i sama glukóza mohou být oxidovány kyslíkem (autooxidace) za vzniku superoxidu i dalších ROS. Tyto produkty jsou zodpovědné za rozvoj pozdních diabetických komplikací (Štípek et al., 2000). 22

23 Alzheimerova demence Tato choroba je charakterizována výrazným úpadkem kognitivních funkcí a ztrátou neuronů v mozku. V centrálním nervovém systému dochází k hromadění toxického proteinového agregátu β-amyloidu a následné tvorbě amyloidních plaků. Primární příčiny onemocnění nejsou známy. V mechanismu vývoje choroby se však určitě uplatňují ROS. Pravděpodobně spouštějí či zesilují biochemické dráhy vedoucí k poškození neuronů (Pohanka, 2011). Parkinsonova choroba Parkinsonova choroba je neurodegenerativní onemocnění postihující neurony v substantia nigra. Klíčovým procesem vedoucím k poškození těchto buněk se ukazuje být oxidační stres. Je způsoben nejen zvýšenou přítomností reaktivních forem, ale i změnami v antioxidační ochraně a toxickým působením nadměrného obsahu železa (Olanow a Tatton, 1999) ANTIOXIDAČNÍ TERAPIE Význam oxidačních dějů v rozvoji chorobných stavů je nesporný. Otázkou však zůstává, jak tyto děje ovlivnit a zabránit jim. Současný výzkum se zabývá především studiem racionálního podávání antioxidantů u stavů s předpokládanou nadprodukcí volných radikálů (Racek, 2003). Úspěch závisí na stupni poznání úlohy volných radikálů v patogenezi dané nemoci. Cílem je prevence vzniku patologií či vhodná terapie pozitivně ovlivňující průběh onemocnění a rekonvalescenci (Štípek et al., 2000). Antioxidační terapie musí být navržena velmi pečlivě. Antioxidanty musí být podávány dostatečně dlouho, v potřebném množství a ve správném čase. Je třeba zvolit antioxidanty odpovídajících biologických a fyzikálně-chemických vlastností (např. hydrofilita a lipofilita, propustnost membránami), které jsou schopné proniknout do požadovaných kompartmentů a zneškodňovat tak volné radikály v místě jejich působení (Racek, 2003; Štípek et al., 2000). Jakýkoli zásah do oxidačních dějů by měl směřovat k obnovení oxidoredukční rovnováhy, neuvážené nadměrné množství antioxidantů může mít na organismus negativní dopad. Například vitamin C ve vysoké koncentraci je schopen uvolnit železo z vazby na transportní protein a redukovat ho na Fe 2+. V této formě může pak železo vstupovat do nebezpečné Fentonovy reakce (Racek, 2003). Celková převaha antioxidantů může způsobit 23

24 blokaci dějů pro organismus prospěšných, například zabránění fagocytózy a tím spuštění infekce (Kohen a Nyska, 2002). I přes veškeré poznatky v oblasti toxického působení volných radikálů jsou výsledky klinických studií zabývajících se prevencí vzniku onemocnění či terapií antioxidanty velmi často nepřesvědčivé či nejednoznačné. Řada studií skončila neúspěchem. Nejednoznačné výsledky částečně vysvětluje skutečnost, že hladiny antioxidantů v těle výrazně závisí na složení stravy. Proto se klinické studie prováděné v různých částech světa na různých národnostech s rozdílnými stravovacími návyky mohou svými závěry lišit. Nicméně současné znalosti o prospěchu či neprospěchu podávání antioxidantů jsou dosud nedostatečné, pro jejich běžné klinické využití je třeba další výzkum (Štípek et al., 2000). 24

25 3.4 DETEKCE A KVANTIFIKACE OXIDAČNÍHO STRESU Existuje několik přístupů, jak měřit hladiny volných radikálů a oxidační poškození. Přímá detekce volných radikálů je nesmírně náročná vzhledem k jejich vysoké reaktivitě a krátkému biologickému poločasu. Dává se proto přednost měření nepřímému, tedy kvantifikaci produktů oxidačního poškození biomolekul (Halliwell a Whiteman, 2004). Dále se ke sledování oxidační zátěže využívá stanovování hladin antioxidantů či měření celkové antioxidační kapacity. Velmi obtížná je detekce oxidačního stresu in vivo, především kvůli vysoké reaktivitě volných radikálů i skutečnosti, že se často vyskytují v subcelulárních kompartmentech, což vyžaduje specifické detekční metody. Většina měření se tedy provádí ve vzorcích tkání a tělesných tekutin či v buněčných kulturách. Měření probíhají v živočišných i rostlinných materiálech (Shulaev a Oliver, 2006). Metodik bylo vypracováno nespočet, existují v různých modifikacích. Dosud ovšem není k dispozici taková metoda, která by dávala komplexní obrázek o oxidačních dějích probíhajících v organismech. Zde jsou shrnuty základní, nejvíce rozšířené metodiky DETEKCE VOLNÝCH RADIKÁLŮ I přes potíže s nestabilitou volných radikálů byly vypracovány metody, kterými lze prokázat přítomnost volných radikálů a změřit jejich koncentraci ve vzorku. Tyto metody jsou však většinou technicky a ekonomicky velmi náročné (Štípek et al., 2000). Elektronová spinová rezonance (ESR) Je jediná metoda přímé detekce radikálů (Kohen a Nyska, 2002). Vzorek je vystaven působení mikrovlnného záření a zároveň silnému magnetickému poli. Změnou intenzity magnetického pole dochází k energetickým přechodům nepárových elektronů, což se projeví jako typický signál na osciloskopu. Nicméně ESR detekuje jen poměrně málo reaktivní radikály, protože ty více reaktivní nejsou přítomny v dostatečně vysokých koncentracích, aby je bylo možno měřit. Proto se velmi často využívá tzv. spin trapping, tedy přidání látek, které reagují s reaktivními radikály za vzniku stabilního radikálu detekovatelného pomocí ESR (Halliwell a Whiteman, 2004). Metoda přímo prokazuje přítomnost volných radikálů a jejich identitu (Štípek et al., 2000). Dá se použít in vivo na zvířatech, na lidech zatím ne, protože chybějí data o bezpečnosti (Kohen a Nyska, 2002). 25

26 Spektrofotometrie Patří k často využívaným metodám. Měří buď přímo absorbanci radikálů v UV oblasti, nebo využívá reakce volných radikálů za vzniku barevného produktu, který je následně snadno detekovatelný. Takto lze stanovit např. superoxid, peroxid vodíku, peroxynitrit, nitrity a nitráty (Štípek et al., 2000). Fluorescenční metody Fluorescenční měření nachází uplatnění především při detekci peroxidu vodíku. Používá se látka 2,7-dichlorofluorescin, která je oxidována peroxidasovou reakcí na fluoreskující látku 2,7-dichlorofluorescein (Tarpey et al. 2004). K detekci řady dalších radikálů se používá např. dihydrorhodamin nebo dihydroethidium (Halliwell a Whiteman, 2004). Chemiluminiscenční metody Chemiluminiscence se využívá především pro detekci superoxidu. K jejím výhodám patří specifita reakce mezi chemiluminiscenční látkou a superoxidem, minimální celulární toxicita a vyšší senzitivita metody ve srovnání s chemickými měřeními. Nejhojněji používanou látkou pro detekci superoxidu je lucigenin (Tarpey et al. 2004) MĚŘENÍ PRODUKTŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL Tyto metody detekují specifické konečné produkty interakce volných radikálů a biologických makromolekul. Tento přístup studia oxidačního poškození se označuje také jako fingerprinting. Stanovovaný marker by měl jednoznačně kvantifikovat proces oxidačního poškození. Ovšem žádný z dosud používaných markerů není jednoznačně specifický, vzniká např. i jinými cestami než oxidačním poškozením dané molekuly nebo jsou jeho hladiny ovlivněny okolními faktory. Na problémy narážíme i s metodikami, které byly pro detekci těchto markerů vypracovány některé detekční metody nejsou dostatečně specifické (interagují i další složky systému) nebo jsou nedostatečně senzitivní (Montuschi et al., 2004). Nicméně tyto metody jsou v běžné laboratorní praxi často používané především pro jejich finanční dostupnost a nenáročnost. Jejich výhodou je i to, že detekují skutečné oxidační poškození, zatímco celkové množství jednotlivých volných radikálů nemusí být za určitých okolností relevantní (Halliwell a Whiteman, 2004). 26

27 A. Markery poškození lipidů a jejich měření Lipidy jsou poškozeny procesem lipoperoxidace, který sestává ze tří fází iniciace, propagace, terminace. Pro každou z těchto fází existují metodiky, které kvantifikují vývoj procesu a prokazují jeho existenci (Kohen a Nyska, 2002). Malondyaldehyd MDA je jeden z nejčastěji stanovovaných markerů, jedná se o konečný produkt neenzymové peroxidace lipidů. Běžně se využívá barevné reakce MDA s thiobarbiturovou kyselinou (TBA) s následnou spektrofotometrickou detekcí nebo detekcí pomocí HPLC. 4-hydroxynonenal Je dalším konečným produktem neenzymové peroxidace lipidů, detekuje se reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem na 2,4-dinitrofenolhydrazony, které se detekují spektrofotometricky. Je možné i přímé stanovení 4-HNE pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) (Štípek et al., 2000). Isoprostany Opět se jedná o produkty neenzymové peroxidace polynenasycených mastných kyselin. Největšího zájmu se těší tzv. F2-isoprostany, vznikající z arachidonové kyseliny. K jejich detekci se standardně využívá GC-MS, je to však metoda finančně nákladná a zdlouhavá. Z těchto důvodů byly vyvinuty imunochemické metody. F2- isoprostany se zdají být velmi spolehlivým ukazatelem oxidačního stresu podílejícího se na patogenezi lidských onemocnění (Montuschi et al., 2004). Detekce isoprostanů se uplatňuje především při studiu Alzheimerovy demence (Halliwell a Whiteman, 2004). Konjugované dieny Konjugované dieny jsou primárními produkty lipoperoxidace. Jejich hladiny se detekují nejčastěji spektrofotometrickými metodami (Kohen a Nyska, 2002). 27

28 Uhlovodíky ve vydechovaném vzduchu Kromě aldehydů a isoprostanů vznikají jako minoritní konečný produkt lipoperoxidace i jednoduché uhlovodíky. Jako potencionální biomarker oxidačního poškození lipidů se ukazuje být ethan. Vydechovaný vzduch je zachycen sorbentem, dále se desorbuje a analyzuje plynovou chromatografií. Stanovování uhlovodíků ve vydechovaném vzduchu je však náročné a nepatří k rutinním měřením (Halliwell a Whiteman, 2004). B. Markery poškození proteinů a jejich měření Stanovení karbonylových skupin proteinů Je nejběžnější metodou sledování oxidačního poškození proteinů. Výhodou karbonylových skupin je jejich stabilita. Nejčastěji se stanovují derivatizací karbonylové skupiny reakcí s 2,4-dinitrofenylhydrazinem za vzniku stabilních dinitrofenylhydrazonů, jejichž detekce se provádí spektrofotometricky (Shacter, 2000). Stanovení derivátů tyrosinu Aminokyselina tyrosin může být atakována volnými radikály za vzniku dityrosinu, 3- chlorotyrosinu, dyhydroxyfenylalaninu, 3-nitrotyrosinu. Stanovování těchto derivátů nepatří mezi hojně využívané metody jako karbonylové skupiny, ale tyto metody jsou specifické a jsou dobrými ukazateli oxidačního poškození proteinů. Nejčastěji se používá detekce hmotnostní spektrometrií (Halliwell a Whiteman, 2004; Shacter, 2000). Nejběžněji stanovovaným derivátem tyrosinu je 3-nitrotyrosin, který byl původně považován za specifický produkt reakce tyrosinu s peroxynitritem. Nicméně ukázalo se, že i další radikály jsou schopné nitrovat tyrosin. K detekci nitrotyrosinu se využívají imunohistochemické metody nebo HPLC (Tarpey et al. 2004). C. Markery poškození DNA a jejich měření Zdá se, že oxidační poškození DNA probíhá nepřetržitě, vytváří se jakási rovnováha mezi poškozením DNA a její opravou (Auroma, 1998). Nejčastěji stanovovaným markerem poškození DNA je 8-hydroxydeoxyguanosin. Měření probíhají ve tkáních a velmi často v moči (Halliwell a Whiteman, 2004). 28

29 HPLC a GC-MS jsou velmi často využívané metody, používají se k rozboru tkáňové DNA a ke stanovení modifikovaných bází v moči (Kohen a Nyska, 2002; Štípek et al., 2000) Kometový test Kometový test neboli gelová elektroforéza jednotlivých buněk je senzitivní metoda detekující jednořetězcové i dvouřetězcové zlomy v DNA. Tyto zlomy po elektroforéze a fluorescenční vizualizaci dávají obraz komet. Kometový test zaznamenává celkové poškození DNA (Dvořák a Matejovičová, 2008) MĚŘENÍ ANTIOXIDANTŮ Oslabení antioxidační ochrany může vést k oxidačnímu stresu. Naopak dlouhodobý oxidační stres může antioxidační ochranu oslabit nebo vyčerpat. Proto je sledování změn v hladinách antioxidantů prakticky významné. K měření hladin nízkomolekulárních antioxidantů se většinou používá spektrofotometrie v UV i viditelné oblasti a HPLC. Nejčastěji se stanovují glutathion, vitamin C, vitamin E, koenzym Q 10 a karotenoidy (Štípek et al., 2000). Ke stanovení aktivity enzymů se využívají různé metody, které jsou založené na sledování úbytku substrátu určitého enzymu s následnou vizualizací (SOD, CAT, GR, GSHPx) (Štípek et al., 2000). Jelikož se jedná o proteiny, často se uplatňuje i imunochemické stanovení (Kohen a Nyska, 2002) MĚŘENÍ CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY Celková antioxidační kapacita (TAC) je dána souhrnem všech látek s antioxidačním účinkem obsažených ve vzorku (Racek, 2003). Měření TAC ukazuje tedy na aktivitu systému jako celku, nikoliv jeho jednotlivých součástí. Tento přístup přináší řadu užitečných údajů, neboť antioxidanty pracují ve vzájemně propojeném systému a měřit hladinu jen jedné nebo několika málo molekul může být zavádějící (Kohen a Nyska, 2002). Nevýhodou však je, že výsledky různých metod se mezi sebou nedají srovnávat (Huang et al., 2005). Metodik je celá řada. Principielně jsou založeny na vytvoření takových podmínek, kdy vznikají volné radikály. Měří se pak schopnost systému radikálové reakce zastavit nebo zpomalit (Štípek et al., 2000). Detekce je nejčastěji spektrofotometrická nebo fluorescenční. 29

30 TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) působením antioxidantů obsažených ve vzorku dochází k potlačení absorbance radikálového kationtu 2,2-azinobis(3- etylbenzothiazolin-6-sulfonát) (ABTS) (Cao a Prior, 1998). DPPH-test stabilní radikál 2,2'-difenyl-1-pikrylhydrazyl je po redukci antioxidantem nebo radikálem odbarven (Šulc et al., 2007) FRAP (Ferric reducing antioxidant power) v přítomnosti antioxidantů dochází k redukci bezbarvých železnatých komplexů, což se projeví změnou zbarvení do modra (Benzie a Strain., 1996) ORAC-test (Oxygen radical absorbance capacity) sleduje se termální rozklad azosloučenin, který inhibuje oxidaci navozenou peroxylovým radikálem (Prior et al. 2003) Kromě výše uvedených metod se k měření celkové antioxidační kapacity využívají i metody elektrochemické, např. cyklická voltametrie. Dalším z přístupů stanovení antioxidační kapacity je měření hladin redoxních párů. Nejvýznamnější je měření páru GSH/GSSG. Vyjadřuje se jako poměr hladin GSH a GSSG nebo jako redoxní potenciál vypočítaný Nernstovou rovnicí (Jones et al., 2000). 30

31 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 LABORATORNÍ ZVÍŘATA Experiment probíhal na samcích potkanů kmene Wistar o váze g, kteří byli dodáni firmou Anlab (Praha). Zvířata byla udržována v klimatizované místnosti (22 ± 2 C) s vlhkostí 50 ± 10 % a se světelným režimem 12 hodin světlo 12 hodin tma. Byli krmeni standardní stravou a vodou. 4.2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE Destilovaná voda: byla připravena reverzní osmózou millipore na Katedře toxikologie, Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové Všechny ostatní použité chemikálie byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich: Dimethylsulfoxid (DMSO, 99,9% (w/w)) 2,2'-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová) kyselina (DTNB, 98% (w/w)) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA, 99,0% (w/w)) Fosfátový pufr (PBS) Fyziologický roztok Hydroxid sodný (NaOH, 97,0% (w/w)) Chlorid železitý (FeCl 3, 97 % (w/w)) Chlorovodíková kyselina (HCl, 36,5-38,0% (w/w)) Methanol (99,8% (w/v)) Nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (NADPH, 95,0%, (w/w)) Oxidovaný glutathion (GSSG, 98% (w/w)) Thiobarbiturová kyselina (TBA, 98,0% (w/w)) Trichloroctová kyselina (TCA, 99,0% (w/w)) 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazin (TPTZ, 98% (w/w)) 31

32 4.3 POMŮCKY A PŘÍSTROJE Mikrozkumavky (Eppendorf) Zkumavky Kádinky Automatické pipety Špičky na pipety Kyvety Homogenizátor (Ultra-Turrax T 10 basic, IKA, Německo) Analytické váhy (CPA225D, Sartorius, Německo) Centrifuga (Universal 320/R, Schoeller, Německo) Ultrazvuk (Ema, Elmasonic, Německo) Blokový termostat (MBT 250, Kleinfeld Labortechnik, Německo) Spektrofotometr (Helios Zeta, Thermo Scientific, USA) 4.4 PRŮBĚH EXPERIMENTU Laboratorní zvířata byla usmrcena dekapitací, jako anestézie byl použit CO 2. Experiment byl schválen Etickou komisí Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové. Se zvířaty zacházeli pouze kvalifikovaní pracovníci. Usmrceným zvířatům byl odebrán mozek, játra, srdce, ledviny a slezina. Ze vzorku tkání bylo do zkumavky odebráno 300 mg tkáně a doplněno 3 ml PBS (0,1 mol/l fosfátový pufr s 0,15 mol/l NaCl ph 7,4). Byla provedena homogenizace pomocí homogenizátoru po dobu jedné minuty. Homogenáty byly vystaveny pěti teplotním cyklům zmrazování rozmrazování (-80 C laboratorní teplota), měření byla prováděna po každém cyklu. 32

33 4.5 POUŽITÉ METODY Metoda TBARS Příprava roztoků 10% roztok TCA ve vodě (w/v) TBA: 0,067 g TBA bylo rozpuštěno v 1 ml DMSO a doplněno vodou do 10 ml Blank: 200 μl fyziologického roztoku μl TCA Pracovní postup 200 μl vzorku bylo smíseno s 400 μl TCA a ponecháno inkubovat 15 minut v ledu. Vzniklý precipitát byl odstředěn (3000 ot./min, 15 min, 4 C). K 400 μl odebraného supernatantu bylo přidáno stejné množství TBA a směs byla zahřívána na vodní lázni při 100 C 10 minut. Po zchlazení na laboratorní teplotu byla měřena absorbance při 532 nm proti blanku Metoda FRAP Příprava roztoků 10mmol/l roztok TPTZ v 40mmol/l HCl 20mmol/l roztok FeCl 3 ve vodě 0,1mol/l acetátový pufr ph 3,6 FRAP reagents: 2,5 ml TPTZ + 2,5 ml FeCl ml acetátového pufru Blank: 200 μl FRAP reagens μl destilované vody Pracovní postup Čerstvě připravený roztok FRAP reagens byl zahříván 10 minut při teplotě 37 C. 200 μl FRAP reagens bylo napipetováno do mikrozkumavky a přidáno 30 μl vzorku a 770 μl vody. Směs byla ponechána inkubovat 10 minut při pokojové teplotě a následně centrifugována po dobu 10 minut při ot./min. Spektrofotometrické měření bylo prováděno se supernatantem při vlnové délce 593 nm proti blanku. 33

34 4.5.3 DPPH-test Příprava roztoků 0,2mmol/l roztok DPPH v methanolu Kontrolní roztok: 0,1mol/l fosfátový pufr ph 7,4 Pracovní postup 500 μl vzorku bylo smíseno se stejným množstvím roztoku DPPH a ponecháno inkubovat při pokojové teplotě 30 minut. Absorbance byla měřena při 517 nm. DPPH radical scavenging activity [%] byla vypočtena dle uvedeného vzorce: antioxidanta % 1 kontrolaa Stanovení redukovaného glutathionu Příprava roztoků 0,1mol fosfátový pufr ph 7,4 2,5% roztok TCA ve vodě (w/v) 7,5% roztok NaOH ve vodě (w/v) 0,1% roztok DTNB ve fosfátovém pufru (w/v) Blank: 400 µl fosfátového pufru μl DTNB Pracovní postup Tkáňový homogenát byl nejdříve pětkrát zředěn destilovanou vodou a centrifugován (3000 ot./min, 5 min, 21 C). K 200 µl odebraného supernatantu bylo přidáno 600 µl TCA a opět odstředěno (6000 ot./min, 5 min, 4 ºC). V dalším kroku proběhla neutralizace kyseliny pomocí 125 µl roztoku NaOH. K 400 µl této směsi bylo přidáno 400 µl roztoku DTNB. Po pětiminutové inkubaci při pokojové teplotě bylo provedeno spektrofotometrické měření při vlnové délce 412 nm oproti blanku. 34