CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2016

Transkript

1 CELOSTÁTNÍ PŘEHLÍDKY SÝRŮ 2016 Výsledky přehlídek a sborník příspěvků konference Mléko a sýry Praha leden 2016

2 Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah příspěvků odpovídají autoři. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 2016 ISBN

3 OBSAH Celostátní přehlídky sýrů Výsledky 16. ročníku Celostátních přehlídek sýrů. Čurda L., Štětina J Využití bakteriofágů pro eliminaci patogenních bakterií v sýrech. Plocková M., Mühlhansová A., Horáčková Š Přednášky konference Mléko a sýry Faktory ovlivňující vnímání aroma u mléčných výrobků. Panovská Z., Leitnerová D., Ilko V Faktory ovlivňující texturu polotvrdých sýrů a metody hodnocení. Štětina J., Čurda L Kravské kolostrum a jeho potenciál pro vývoj doplňků stravy v kombinaci se synbiotiky. Hyršlová I., Mühlhansová A., Bártová J., Staňková B., Krausová G., Čurda L., Vanucci L., Kolesár L Screening biologické aktivity vysokomolekulárních frakcí mleziva na mikrobiologických a buněčných kulturách. Skalka V., Darmostuk M., Kosová M., Remišová S., Ruml T., Čurda L Konjugovaná kyselina linolová v mléčných výrobcích. Kyselka J., Thomes L., Skalka V., Remišová S., Filip V Oxidační stabilita mleziva. Hrádková I., Berčíková M., Čurda L., Fránková A Příprava jogurtů s přídavkem mleziva a s hydrolyzovanou laktosou. Remišová S., Skalka V., Kołorzová A., Čurda L Využití vícečetných emulzí v mléčných výrobcích. Klojdová I., Štětina J Mikrobiologické aspekty elektromembránových procesů. Ečer J., Merkel A., Tichovský P Aplikácia novej metódy pre kontrolu mikrobiálnej kvality potravín založenej na detekcii spotreby kyslíka. Lehotová V., Petruláková M., Valík Ľ., Karolyi L Vhodnosť kukuričných subtrátov pre kyslomliečne fermentácie. Matejčeková Z., Liptáková D., Pelikánová J., Valík Ľ Kvantitativní stanovení probiotických laktobacilů ve fermentovaných mléčných výrobcích. Mühlhansová A., Horáčková Š., Plocková M Ověření bakterií s antiklostridiálním účinkem v poloprovozních výrobách sýrů eidamského typu. Havlíková Š., Kvasničková E., Němečková I

4 Plakátová sdělení: Složení mléka a profil mastných kyselin mléčného tuku nosorožce dvourohého černého (Diceros bicornis michaeli). Kouřimská L., Rada V., Vokálová H., Nový P Vybrané ukazatele syrového kozího mléka a jejich změny v průběhu laktace. Kalhotka L., Šustová K., Kuchtík J., Dostálová L., Detvanová L., Dvořák L., Sýkora V., Pytel R Změny ve výtěžnosti čerstvého sýra v závislosti na kvalitě mléka. Kala R., Kořán J., Samková E., Bártová Z Vliv pasterace a přídavku chloridu vápenatého na syřitelnost mléka a jakost vznikající sýřeniny. Pytel R., Valíčková J., Sýkora V., Přibyla L., Šustová K Stanovení živatoschopných probiotických laktobacilů pomocí qpcr s využitím propidium monoazidu. Mühlhansová A., Houšková K., Horáčková Š., Plocková M Identifikace bakterií rodu Acinetobacter, izolovaných z mlékárenských surovin, výrobků a výrobního zařízení, pomocí metody PCR s originálně navrženými rodově specifickými primery. Šviráková E., Műhlhansová A., Purkrtová S., Jelínková M., Felberg J Antifungální aktivita laktobacilů. Horáčková Š., Nováková T, Sluková M., Mühlhansová A., Olšanská E., Plocková M Inhibičný účinok baktérií mliečneho kysnutia na rast Staphylococcus aureus a Escherichia coli pri výrobe syrov zo surového mlieka. Mančušková T., Medveďová A., Matejčeková Z., Valík Ľ Kombinovaný efekt teploty a aktivity vody na radiálny rast druhu Geotrichum candidum. Koňuchová M., Matejčeková Z., Liptáková D., Dubská K., Valík Ľ Hodnocení mikrobiálních biofilmů pomocí DART/TOF-MS. Hrubá M., Prchalová J., Rajchl A Využití statististických metod při senzorickém hodnocení mléka a mléčnych výrobků. Ilko V., Koštejnová D., Panovská Z., Doležal M Senzorické vlastnosti experimentálne vyrobených syrov s probiotickými kultúrami. Dudriková E., Lovayová V., Vrabec M Senzorické hodnotenie ovčích a kravských kyslomliečnych výrobkov počas skladovania. Semjon B., Dudriková E., Výrostková J., Maľová J., Maľa P Sledování úbytku laktózy během fermentace mléka s použitím HPLC-RI. Bubelová Z., Chodáková K., Pachlová V., Buňka F Dekarboxylázová aktivita mikroorganizmů izolovaných z výroby tvarohů. Pachlová V., Buňková L., Flasarová R., Havlíková Š., Němečková I., Buňka F Produkce biogenních aminů u bakterií s probiotickým potenciálem. Lorencová E., Buňková L., Kavková M., Buňka F Porovnanie fyzikálnych a fyzikálnochemických vlastností slovenských a gréckych syrov. Dičáková Z., Dudriková E

5 Viskoelastické vlastnosti a mikrostruktura tavených sýrů s různým obsahem sušiny a tuku v sušině. Černíková M., Řiháčková L., Salek R. N., Nebesářová J., Buňka F Možnosti optimalizace balení sýrů eidamského a ementálského typu v modifikované atmosféře. Vápenka L., Slezáková A., Šviráková E Příprava potravinářských emulzí pomocí cross-flow mebránové jednotky. Klojdová I., Štětina J Využití vlákniny v technologii mléčných produktů. Šustová K., Kilián L Nízkotučné syry v Dánsku. Sudzina F Rejstřík autorů

6 6

7 CONTENS Results of 16 th National Cheese Competition Čurda L., Štětina J Use of bacteriophages for elimination of bacterial pathogens in cheeses. Plocková M., Mühlhansová A., Horáčková Š Conference Milk and Cheeses Lectures Factors influencing aroma perception for dairy products. Panovská Z., Leitnerová D., Ilko V Factors influencing texture of semihard cheeses and method for their evaluation. Štětina J., Čurda L Bovine colostrum and its potential for developing a food supplement with synbiotics. Hyršlová I., Mühlhansová A., Bártová J., Staňková B., Krausová G., Čurda L., Vanucci L., Kolesár L Screening of biological activity of high molecular weight fractions of colostrum on microbial and cell cultures Skalka V., Darmostuk M., Kosová M., Remišová S., Ruml T., Čurda L Conjugated linoleic acid (CLA) in dairy products. Kyselka J., Thomes L., Skalka V., Remišová S., Filip V Oxidation stability of the colostrum. Hrádková I., Berčíková M., Čurda L., Fránková A Preparation of yogurts with added colostrum and hydrolysed lactose. Remišová S., Skalka V., Kołorzová A., Čurda L Application of multiple emulsions in dairy products. Klojdová I., Štětina J Microbiological Aspects of Electromembrane Processes. Ečer J., Merkel A., Tichovský P Application of a new method to control microbial quality of foods based on the detection of oxygen consumption. Lehotová V., Petruláková M., Valík Ľ., Karolyi L Suitability of corn substrates for lactic acid fermentation. Matejčeková Z., Liptáková D., Pelikánová J., Valík Ľ Quantitative determination of probiotic lactobacilli in fermented milk products. Mühlhansová A., Horáčková Š., Plocková M The exploitation of bacteria with the anticlostridial effect in the pilot plant manufacturing of Edam cheese. Havlíková Š., Kvasničková E., Němečková I

8 Posters: Composition of Milk and Fatty Acid Profile of Fat from the Eastern Black Rhinoceros (Diceros bicornis michaeli) Kouřimská L., Rada V., Vokálová H., Nový P Selected indicators of raw goat milk in two farms with different style of breeding and their changes during lactation. Kalhotka L., Šustová K., Kuchtík J., Dostálová L., Detvanová L., Dvořák L., Sýkora V., Pytel R The changes in yield of fresh cheese depending on the quality of milk. Kala R., Kořán J., Samková E., Bártová Z Influence of pasterization and of addition calcium chloride on rennet coagulation properties and curd quality Pytel R., Valíčková J., Sýkora V., Přibyla L., Šustová K Determination of viable probiotic lactobacilli using qpcr with Propidium Monoazide Mühlhansová A., Houšková K., Horáčková Š., Plocková M Identification of Acinetobacter spp. isolated from dairy raw materials, dairy products and production facilities using the PCR method with the originally designed genus-specific primers. Šviráková E., Műhlhansová A., Purkrtová S., Jelínková M., Felberg J Antifungal activity of lactobacilli. Horáčková Š., Nováková T, Sluková M., Mühlhansová A., Olšanská E., Plocková M Lactic acid bacteria inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Escherichia coli during manufacturing of raw milk cheese. Mančušková T., Medveďová A., Matejčeková Z., Valík Ľ Combined effect of temperature and water activity on the radial growth of Geotrichum candidum. Koňuchová M., Matejčeková Z., Liptáková D., Dubská K., Valík Ľ Evaluation of microbial biofilms by DART/TOF-MS. Hrubá M., Prchalová J., Rajchl A Use of statistical methods for sensory evaluation of milk and dairy products. Ilko V., Koštejnová D., Panovská Z., Doležal M Sensory properties of experimentally manufactured cheeses with probiotic culture. Dudriková E., Lovayová V., Vrabec M Sensory evaluation of sheep and cow s fermented milk products during storage. Semjon B., Dudriková E., Výrostková J., Maľová J., Maľa P Monitoring of lactose decline during milk fermentation using HPLC-RI. Bubelová Z., Chodáková K., Pachlová V., Buňka F The decarboxylation activity of isolates from acid cheese production. Pachlová V., Buňková L., Flasarová R., Havlíková Š., Němečková I., Buňka F Biogenic amines production by bacteria with probiotic potential. Lorencová E., Buňková L., Kavková M., Buňka F Comparison of physical and physicochemical properties of selected Slovak and Greek cheeses. Dičáková Z., Dudriková E

9 Viscoelastic properties and microstructure of processed cheeses with different dry matter and fat in dry matter content. Černíková M., Řiháčková L., Salek R. N., Nebesářová J., Buňka F Optimisation options for packaging of Edam and Emmentaler types of cheeses in modified atmosphere. Vápenka L., Slezáková A., Šviráková E Preparation of food emulsions by the cross-flow membrane unit. Klojdová I., Štětina J The use of fibre in ice cream technology. Šustová K., Kilián L Low-fat cheese in Denmark. Sudzina F Author index

10 10

11 Celostátní p ehlídky sýr

12

13 VÝSLEDKY 16. RO NÍKU CELOSTÁTNÍCH P EHLÍDEK SÝR urda Ladislav, Št tina Ji í Ústav mléka, tuk a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Results of 16 th National cheese competition Summary: The 16 th National Cheese Competition was organized traditionally by Department of Dairy, Fat and Cosmetics (University of Chemistry and Technology Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 14 and 19 of January 2016 in Prague. 53 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 15 producers competed in this year s competition. Registered samples of cheeses were divided into 9 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from four or five members assessed each cheese. More than 150 evaluators worked in public commissions. The competitive cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (10 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the competition. The National Cheese Competition was accompanied by a conference called Milk and Cheeses with a scientific programme involving 13 lectures and 22 poster presentations. Ve dnech 14. a 19. ledna se v Praze uskute nil 16. ro ník Celostátních p ehlídek sýr, tradi n organizovaný Ústavem mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha. Spoluorganizátorem je eskomoravský svaz mlékárenský a Odborná skupina pro potraviná skou a agrikulturní chemii eské spole nosti chemické. Záštitu nad p ehlídkami sýr i navazující konferencí Mléko a sýry p evzal již pot etí rektor VŠCHT prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. 16. ro ník Celostátních p ehlídek sýr zahájilo odborné hodnocení 14. ledna na VŠCHT v Praze. Do hodnocení bylo za azeno 53 vzork sýr od 15 eských výrobc, což je po et pon kud nižší než v p edchozím ro níku (59 sýr, 17 výrobc ). Ozna ení kategorií a po ty sýr v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. I. Tabulka I Rozd lení sýr do kategorií. Kategorie Po et vzork 1 Polotvrdé sýry 20-30% t.v s. 4 2 Polotvrdé sýry % t.v s. 6 3 Sýry s tvorbou ok 5 4 Polotvrdé a tvrdé sýry s delší dobou zrání 8 5 Sýry s plísní na povrchu 5 7 M kké sýry zrající 6 8 erstvé a termizované sýry 6 10 Tavené sýry 7 12 Speciality 6 Celkem 53 Nejvíce sýr na hodnocení poskytla MADETA a.s., která p ihlásila 11 sýr do 8 kategorií z 9 hodnocených. Z dalších sýráren byly výrazn zastoupeny závody Savencia Fromage & Dairy (9 sýr z obou závod v P ibyslavi a v Sedl anech), dále Lacrum Velké Mezi í í s.r.o., Orrero a.s. (Brazzale Moravia a.s.), Litovel a Mlékárna Polná s.r.o., které p ihlásily 4 až 5 sýr. Sýry byly rozd leny do 9 kategorií, každá obsahovala 4 až 8 vzork minimáln od dvou výrobc. S ohledem na skladbu p ihlášených sýr bylo nutné n které vyhlášené kategorie upravit nebo slou it. Ochucené erstvé a tavené sýry byly proto hodnoceny spole n s neochucenými, uzené vzorky byly hodnoceny spole n s neuzenými sýry a jediný p ihlášený sýr s plísní v t st byl za azen mezi speciality. Upravena byla rovn ž p vodní kategorie sýr s mazem na M kké sýry zrající. Nov byla vytvo ena kategorie Polotvrdé a tvrdé sýry s delší dobou zrání, odráží to pozitivní tendenci 13

14 rozši ování sortimentu sýr asto zrajících pod nát rem nebo pod k rou a ur ené pro náro n jší konzumenty. Tato kategorie m la nejv tší po et vzork, naopak bylo problematické obsadit kdysi silnou základní kategorii Polotvrdé sýry 20-30% t. v s. Bylo rovn ž hodnoceno 10 zahrani ních sýr, rozsáhlou kolekci sedmi sýr poskytla spole nost Lactalis CZ, dva sýry Savencia Fromage & Dairy a jeden vzorek byl ze Slovenska (MILK-AGRO s.r.o). Za zajišt ní v tšiny zahrani ních sýr pat í pod kování panu Ladislavu Liklerovi. Všechny zú astn né sýrárny a p ihlašovatele sýr uvádí tab. II. Tabulka II P ehled p ihlašovatel sýr a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. P ihlašovatel Po et Kategorie sýr eská republika A.W. s.r.o., Loštice 1 1 Agricol s. r. o., Poli ka 1 1 BEL Sýry esko a.s., Želetava 2 2 Kromilk s.r.o., Krom íž Lacrum Velké Mezi í í s.r.o Madeta a.s., eské Bud jovice Lactalis Mlékárna Klatovy a.s Mlékárna Olešnice, RMD 1 1 Mlékárna Polná s.r.o Moravia Lacto a.s., Jihlava Orrero a.s. (Brazzale Moravia a.s.), Litovel Polabské mlékárny a.s., Pod brady Savencia Fromage & Dairy, závod P ibyslav Savencia Fromage & Dairy, závod Sedl any TANY, s.r.o., Nýrsko 1 1 TAURUS družstvo, Protivanov 3 3 Vzorky z R celkem Dovozce zahrani ních sýr Lactalis CZ, s.r.o 7 MILK-AGRO spol. s r.o., Prešov 1 Savencia Fromage & Dairy Czech Republic, a.s. 2 Sýry z dovozu celkem 10 Zp sob hodnocení sýr byl jen mírn modifikován. P i odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní komise složené ze 4 až 5 len. Každá komise má nezávislého p edsedu a je dopln na dalším nezávislým hodnotitelem a zástupci výrobc. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvo í 40 %) a chu a v n (60 %). Tuzemským sýr m bylo na základ tohoto hodnocení ud leno celkem 13 diplom. V každé kategorii byly diplomem ocen ny jeden až dva sýry v závislosti na po tu p ihlášených sýr, protože je dodržováno pravidlo, podle kterého na jeden diplom musí být v kategorii alespo 3 sýry. Na rozdíl od p edchozích ro ník se organiza ní výbor rozhodl ud lovat navíc estná uznání sýr m, které v odborném hodnocení získají více než 80 bod. estným uznáním byly ocen ny také sýry 14

15 v kategorii specialit, kde se neur uje po adí. estné uznání tak letos získalo 18 sýr. Nejvíce diplom (3) získala v letošním ro níku Mlékárna Polná a Savencia Fromage & Dairy. Nejvíce ocen ní celkem získaly sýry spole nosti MADETA (1 diplom a 6 estných uznání), výborn hodnocené však byly sýry i dalších výrobc, nap. ORRERO a.s., Kromilk a.s. nebo Moravia Lacto a.s.). Nejvyšší po et bod (90) získal letos Eidamský sýr 45 % tvs z Mlékárny Polná. Zahrani ní sýry jsou posuzovány odd len, hodnotí je všichni lenové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Absolutním vít zem se stal sýr Volovec (MILK-AGRO s.r.o.), který získal 32 návrh na diplom z 32 možných. Diplomy byly dále ocen ny sýry Président Le Crémiot (Lactalis CZ, s.r.o.) a Boursault (Savencia Fromage & Dairy). Ve ejné hodnocení se konalo 20. ledna v kongresovém sále Masarykovy koleje a zú astnilo se ho na 150 osob. Celkové výsledky p ehlídek jsou shrnuty v tab. III, hodnocení vzork z dovozu je uvedeno v tab. IV. Shoda mezi odborným a ve ejným hodnocením byla tentokrát pon kud horší než v p edchozích ro nících. P estože z 13 sýr ocen ných diplomy by podle po adí ve ve ejném hodnocení diplom rovn ž získalo 6 vzork, ve 3 kategoriích byl poslední sýr z odborného hodnocení se na ve ejném hodnocení umístil jako první. Vyhodnocení ve ejného hodnocení podle sou tu po adí vylou ilo vliv extrémního hodnocení na po adí sýr v kategorii, protože bylo zcela shodné s po adím podle prostého pr m ru. V odborném hodnocení jsou extrémní hodnoty vylou eny nutnou shodou v rámci komise i mezi paralelními komisemi, nebylo však pozorováno nadhodnocení vlastních vzork nebo naopak podhodnocení ostatních sýr ani v rámci povolené tolerance. I p es toto zjišt ní organiza ní výbor zvažuje nahradit stávající odborné hodnocení hodnocením komisemi, které budou složeny pouze z nezávislých expert. Rozd lení sýr do kvalitativních kategorií je v tab. V. Byla zavedena kategorie vynikajících vzork s bodovým hodnocením vyšším než 90 bod - žádný z hodnocených sýr této hodnoty nedosáhl, avšak n kolik vzork se jí t sn p iblížilo. Nadpolovi ní v tšina sýr byla hodnocena odbornou komisí jako výborné, ve ejné hodnocení bylo p ísn jší a p evážná ást sýr tak byla hodnocena jako velmi dobré. Porovnání etností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nej ast ji objevilo hodnocení mezi 80 a 90 body. Pr m rné hodnocení lišilo pouze o 0,8 bodu (77,1 a 76,3 bodu). Medián pro odborné hodnocení je 80 bod, pro ve ejné 76 bod. P ed zahájením odborného programu p išel ú astníky p ehlídek osobn pozdravit rektor VŠCHT prof. Ing. Karel Melzoch, CSc. Odborný program p ehlídek zahrnoval t i p ednášky. Tradi ní p ednáška Sou asné sýra ství ve sv t a v eské republice Ing. J. Kopá ka, CSc. byla dopln na p ednáškou o afinaci sýr, která m že být inspirací i pro naše výrobce. P ednáška doc. Ing. Milady Plockové, CSc. byla v nována využití bakteriofág pro eliminaci patogenních bakterií v sýrech. Odborné p ednášky byly dopln ny informací Martina Kamaráda - starosty m sta P ibyslav o p ipravovaném 25. ro níku mlékárenského dne. Na navazující konferenci Mléko a sýry 20. ledna bylo prezentováno 13 p ednášek a 22 poster. estným hostem letošní konference byla dr. Monika Johansson ze Swedish University of Agricultural Sciences v Uppsale. P ehlídky i konferenci svou ú astí dále podpo ilo 13 firem, jejichž innost se dotýká p edevším p ístroj a pot eb pro analýzu mléka a mlé ných výrobk a vybavení mlékáren (Asiral GmbH & Co.KG, Axonlab, s.r.o., Fisher Scientific, s.r.o., Hanna Instruments Czech s.r.o., Chr. Hansen Czech Republic, s.r.o., Maneko, s.r.o., MILCOM servis, a. s., Milcom, a. s. - VÚM, Nicolet CZ s. r. o., O.K. Servis - BioPro, s.r.o., Pacovské strojírny, a.s., Pragolab, s.r.o., VWR International, s.r.o.). Tradi ní sou ástí Celostátních p ehlídek sýr i konference je též výstava sýr. Organiza ní výbor Celostátních p ehlídek sýr a konference Mléko a sýry d kuje všem podnik m, které poskytly vzorky sýr nejen na p ehlídky ale i na výstavu. Jejich seznam uvádí tab. VI. 15

16 Tabulka III Výsledky Celostátních p ehlídek sýr Kategorie Po adí odborného hodnocení Po adí ve ejného hodnocení Sýr Výrobce (p ihlašovatel) tvs suš [%] [%] Odb. hodnocení Pr m rné hodnocení Interval spolehlivosti Ve ejné hodnocení Pr m rné hodnocení Interval spolehlivosti Eidamský sýr 30 % tvs Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,8 5,4 80,0 2,5 2* 4 Eidamská cihla KROMILK a.s ,3 5,4 73,2 3,9 3* 2 Jiho eský Eidam 20 % MADETA a.s ,0 4,2 77,1 4,3 4 3 Eidam cihla Agricol s.r.o ,8 4,3 74,7 3,0 1 2 Eidamský sýr 45 % tvs Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,0 4,6 78,9 3,6 2 4 Krásná Haná - Gouda KROMILK a.s ,0 3,2 74,8 3,6 3* 6 Kozí Gouda 48 % Polabské mlékárny a.s ,3 2,4 71,4 4,0 4* 3 Verena ORRERO a.s ,5 4,8 75,4 4,1 5 5 Président L edam Mlékárna Klatovy a.s ,8 71,6 3,6 6 1 Eidamský salámový sýr Lacrum Velké Mezi í í s.r.o ,0 4,5 79,6 3,7 1 2 Madeland uzený 44 % MADETA a.s ,0 4,6 77,5 2,8 2* 4 Montana Moravia Lacto a.s ,2 12,0 72,5 3,3 3 3 Président Léger Mlékárna Klatovy a.s ,4 4,1 76,1 3,5 4 5 Pernštejn 45 % Lacrum Velké Mezi í í s.r.o ,2 9,1 68,9 3,0 5 1 Primátor MADETA a.s ,4 3,7 79,9 3,2 1 2 Herold Moravia Lacto a.s ,8 3,2 81,7 3,3 2 3 Zlatá Praha Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,8 4,3 79,7 3,1 3* 6 Taurus - Salašnický sýr 4 m síce TAURUS, družstvo ,4 4,1 71,1 4,2 4* 1 Gran Moravia ORRERO a.s ,0 3,8 85,4 4,0 5* 5 Tylžský sýr archivní MADETA a.s ,8 5,2 76,3 2,9 6 4 Moravský bochník 45 % Lacrum Velké Mezi í í s.r.o ,6 5,7 79,1 3,2 7 8 Taurus - Salašnický sýr 7 m síc TAURUS, družstvo ,0 4,2 67,3 4,5 8 7 Taurus - horský sýr TAURUS, družstvo ,2 1,7 68,2 3,8 1 1 Král sýr Krémový Savencia Fromage & Dairy, P ibyslav ,3 5,9 81,2 2,9 2* 2 Král sýr Hermelín Savencia Fromage & Dairy, P ibyslav ,8 3,2 79,5 3,4 3 4 Kamadet s pep em MADETA a.s ,3 2,3 75,8 3,7 4 5 Sedl anský Selský Savencia Fromage & Dairy, Sedl any ,5 5,5 62,9 4,1 5 3 Sedl anský Hermelín p vodní Savencia Fromage & Dairy, Sedl any ,5 1,9 76,3 3,3 1 1 Král sýr Hermadur Savencia Fromage & Dairy, P ibyslav ,3 3,5 80,7 3,5 2 3 Sedl anský Zlatý Savencia Fromage & Dairy, Sedl any ,3 2,2 76,7 3,8 3* 2 Jiho eský syre ek MADETA a.s ,8 5,1 77,8 4,1 4* 6 Hanácké ohe A.W. spol. s r.o ,5 4,8 72,2 3,9 5 5 Sedl anský Romad žek Savencia Fromage & Dairy, Sedl any ,3 1,9 74,3 3,0 6 4 Král sýr Charakter Savencia Fromage & Dairy, P ibyslav ,3 3,7 76,4 3,1 1 5 Giuncata con la rucola ORRERO a.s ,5 2,9 75,4 3,2 2 2 Mozzarella fresca Ciliegine ORRERO a.s ,0 3,7 79,8 3,6 3* 4 Jiho eský Cottage Ma arská zelenina MADETA a.s ,3 4,7 78,9 3,6 4* 3 Zálesák KROMILK a.s ,0 2,7 79,4 3,4 5* 1 Lu ina Savencia Fromage & Dairy, Sedl any ,5 2,4 82,8 3,1 6 6 Žervé s kozím tvarohem Polabské mlékárny a.s ,8 6,8 75,3 3,2 1 4 Želetava Active BEL Sýry esko a.s ,6 2,4 71,7 3,7 2 3 DELICATO tavený sýr smetanový TANY, spol. s.r.o., Nýrsko ,8 5,8 72,4 4,0 3 2 Président Cheddar tavený sýr Mlékárna Klatovy a.s ,8 5,2 77,2 4,0 4 6 Tavený sýr s uzeným masem Lacrum Velké Mezi í í s.r.o ,8 4,3 71,3 3,4 5 7 Veselá kráva Smetana BEL Sýry esko a.s ,8 2,1 66,5 3,9 6 5 Tavený sýr smetanový Lacrum Velké Mezi í í s.r.o ,4 4,3 71,6 4,0 7 1 Jiho eské Lipno extra smetanové MADETA a.s ,6 3,0 79,2 3,9 * Jiho eská Zlatá Niva 60 % MADETA a.s ,3 6,4 89,9 3,0 * Balkánský sýr Mlékárna Polná, spol. s.r.o ,0 5,6 80,2 4,1 * Tavený sýrový dort s olivami MADETA a.s ,3 3,9 82,2 4,3 * Vina ský sýr Mlékárna Olešnice, RMD ,3 2,4 75,0 3,9 Bla ácké Zlato MADETA a.s ,3 2,6 86,8 3,1 Caciotta Diavoletto ORRERO a.s ,0 7,1 73,1 3,2 Tu n jsou vyzna ené vzorky, které obdržely diplom, * ozna ené vzorky byly ocen ny estným uznáním 16

17 Tabulka IV Výsledky Celostátních p ehlídek sýr zahrani ní vzorky Sýr Dovozce tvs [%] suš. [%] Návrhy na diplom Volovec MILK-AGRO s.r.o Président Le Crémiot Lactalis CZ, s.r.o Boursault Savencia Fromage & Dairy Le Brebiou Savencia Fromage & Dairy Président Carré Gourmet Lactalis CZ, s.r.o Galbani Mozzarella Mini di latte di Bufala Lactalis CZ, s.r.o Président 6 Petits Chevres Doux s medem Lactalis CZ, s.r.o Président Saint Morgon Lactalis CZ, s.r.o Président 6 Petits Chevres Doux s bazalkou Lactalis CZ, s.r.o Président 6 Petits Chevres Doux Lactalis CZ, s.r.o Tabulka V Rozd lení sýr do kvalitativních kategorií Kvalitativní kategorie Bodové hodnocení Odborné hodnocení [% vzork ] Ve ejné hodnocení [% vzork ] Vynikající ( Výborný (ideální typ) ( ,7 18,9 Velmi dobrý ( ,6 79,2 Pr m rný (standardní kvalita) ( ,7 1,9 Podpr m rný (min. 30 b. od každé komise) ( Nevyhovující < Obr. 1. Porovnání relativních etností hodnocení expert a p i ve ejném hodnocení. 17

18 Tabulka VI Seznam sýr vystavených v pr b hu Celostátních p ehlídek sýr a konference Mléko a sýry ( ) a) eské sýrárny (výrobci) Sýrárna A.W. s.r.o. Loštice BEL Sýry esko a.s. Želetava Kromilk s.r.o., Krom íž Lacrum Velké Mezi í í s.r.o. Lactalis CZ Mlékárna Klatovy a.s. Sýr Hanácké ohe Olomoucké tvar žky Matador light Smetanito klasik Smetanito s pažitkou Smetanito s uzeným sýrem Smetanito se šunkou Smetanito se zeleninou a šunkou Syrokrém s esnekem Syrokrém se šunkou Syrokrém se šunkou a cibulí Syrokrém smetanový Veselá kráva smetana Veselá kráva šunka Želetava active Želetava s klobásou Želetava se smetanou Želetava smetanový s pažitkou Želetava Tomik Blaník - Smetanový sýr lahodný Blaník - Smetanový sýr se šunkou a k enem Blaník - Smetanový sýr Zálesák pikantní Blaník - Smetanový sýr S Pažitkou erstvý sýr Ananas erstvý sýr Pažitka - esnek erstvý sýr Pikant erstvý sýr Raj e-bazalka erstvý sýr Steakové ko ení Eidamská cihla 30% Kromík minigouda Zálesák jemný se zeleninou Zálesák klasik pikantní se zeleninou Zálesák lah dkový Zálesák s p íchutí nivy Eidam salámový sýr 40% Pernštejn 45% Smetanový Tavený sýr uzený L edam plátky Président Léger plátky 18

19 Tabulka VI a - pokra ování Sýrárna Madeta a.s., eské Bud jovice Mlékárna Polná s.r.o. Moravia Lacto a.s., Jihlava Orrero a.s. (Brazzale Moravia a.s.), Litovel Polabské mlékárny a.s., Pod brady Savencia Fromage & Dairy, závod Sedl any Sýr Bla ácké zlato se zeleným pep em Caesar Bleu Kamadet Královský sýr Kamadet s pep em Madeland - Fitness pouze 10 % tuku Madeland Klasik Madeland uzený Niva Premium Syre ek jiho eský zrající Tylžský sýr archivní erstvý smetanový sýr Eidamský blok 30 % Eidamský blok 45 % Jadel pa ený Jadel s ko ením Jadel uzený Zlatá Praha Herold Montana Caciotta Gran Moravia Mozzarella Fresca Ciliegine Verena Kozí Gouda 48% Žervé z Pod brad s kozím tvarohem Lu ina Sedl anský Hermadur Sedl anský Character Sedl anský Krémový Sedl anský P vodní Sedl anský Romad žek Sedl anský Selský Sedl anský Zlatý Pepin Tabulka VI b) Zahrani ní spole nosti (dovozci/výrobci) Sýrárna Lactalis CZ, s.r.o. Praha (dovozce) MILK AGRO s.r.o. Prešov, SR (výrobce) Savencia Fromage & Dairy Czech Republic, a.s. (dovozce) Fjällbrynt (Švédsko, výrobce) Norrmejerier Burträsk (Švédsko, výrobce) Sýr Galbani Mozzarella Mini di latte di Bufala Président 6 Petits Chevres Doux Président 6 Petits Chevres Doux s bazalkou Président 6 Petits Chevres Doux s medem Président Carré Gourmet Président Le Crémiot Président Saint Morgon Volovec Le Brebiou des Pyrénées Boursault Messmör - syrovátkový sýr Västerbrottensost 19

20 20

21 VYUŽITÍ BAKTERIOFÁG PRO ELIMINACI PATOGENNÍCH BAKTERIÍ V SÝRECH. Plocková Milada, Mühlhansová Andrea, Horá ková Šárka Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Use of bacteriophages for elimination of bacterial pathogens in cheeses. Summary: Bacteriophages represent one of the most abundant biological entities in nature and have long been recognized for their potential use as biotherapeutic agents. In recent years research was aimed at possibility of their application for elimination of undesirable bacteria in food. The objective of this presentation was to mention the risk of pathogens in cheese and the possible use of bacteriophages for selective elimination of Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and enteropathogenic Escherichia coli from them. A special interest was given to application of fages for reduction of Listeria monocytogenes in soft smear and soft white mould cheeses. Furthermore, the factors determining the efficacy of bacteriophages action and commercial phage based preparations for dairy application were mentioned. V ekosystému za alo p ibývat patogenních bakterií se širokým spektrem antibiotické (ATB) rezistence jako d sledek nadužívání antibiotik ve veterinární i humánní medicín. Rizika výskytu patogenních bakterií s ATB rezistencí jsou zvlášt závažná pro malé d ti, starší lidi a jedince se sníženou aktivitou imunitního systému. Z tohoto d vodu vzrostl zájem o alternativní postupy potla ování patogenních bakterií v etn kmen s ATB rezistencí a jedním z ú inných postup se ukázala tzv. fágová terapie 1. Aktuáln jsou experimenty zam eny rovn ž na využití bakteriofág k eliminaci patogen z potravin a z povrch prost edí výroben potravin, nebo dosud rutinn používané postupy fyzikální, fyzikáln -chemické a mikrobiologické asto nejsou dostate n ú inné pro eliminaci standardních kmen patogen i kmen patogen s ATB rezistencí 2. Využití bakteriofág p edstavuje atraktivní zp sob potla ování patogenních bakterií v potravinách bez ovlivn ní d ležitých parametr (organoleptické vlastnosti, nutri ní hodnota nebo probiotický charakter) bez použití konzerva ních prost edk nebo bakteriocin bakterií mlé ného kvašení, které mohou potla ovat technologicky pot ebnou mikroflóru d ležitou pro výrobu potravin. P estože jsou sýry v celosv tovém m ítku považovány za relativn bezpe né potraviny, existuje ur itý nízký po et p ípad zdravotních problém spojených s výskytem patogenních bakterií zvlášt Listeria monocytogenes, Salmonella spp., enteropatogenní Escherichia coli a Staphylococcus aureus v m kkých sekundárn zrajících sýrech s mazem nebo s plísní na povrchu, u nichž ph b hem zrání roste z p vodních hodnot kolem 5,5 na hodnoty blížící se 7,5 až 8 ph 3. Bakteriofágy jsou nejobvyklejší viry vyskytující se v p írodním prost edí. Obecn se rozlišují dva typy životních cykl bakteriofág - cyklus virulentní (lytický) a cyklus lysogenní. Fágy virulentní b hem virulentního cyklu napadají bakterie, vstupují do jejich cytoplasmy a využívají genetickou informaci hostitelské bakterie pro svou replikaci, což vede ke smrti bakteriální bu ky a uvoln ní množství zralých fágových ástic schopných atakovat další bakteriální bu ky do prost edí. Fágy mírné v rámci lysogenního cyklu vstupují do bakteriální bu ky, integrují svou nukleovou kyselinu do bakteriálního chromozomu (vzniká tzv. profág) nebo z stávají v bakteriální bu ce ve form plasmidu, ale nezp sobují smrt hostitelské bakteriální bu ky. Pro ú ely eliminace nežádoucích patogenních bakterií z potravin se používají fágy virulentní 4. Bakteriofágy se vyzna ují extrémní specifitou pro své hostitele, jsou široce rozší ené v prost edí a tvo í sou ást p írodní mikrobiální flóry p ítomné v potravinách. To je p edur uje pro dokonalou eliminaci patogen bez jakéhokoli ovlivn ní mikroflóry sýr v etn zákysových kultur nebo ostatních mikroorganism podílejících se na výrob a zrání sýr 5. Ú innost bakteriofág je závislá na koncentraci fág a cílové patogenní bakterie a na n kolika vnit ních a vn jších faktorech prost edí. D ležitý je typ potraviny, v níž je redukce po tu nebo úplná eliminace patogenu požadována. Bylo prokázáno, že po et L. monocytogenes v tekutinách (mléko, solný roztok, v n mž je uložena mozzarella) ošet ených bakteriofágovým preparátem m že být snížen pod mez detekce. V pevných potravinách (sýry, dr beží maso, uzeniny, zelí) lze po et L. monocytogenes snížit až o 5 ád 6. Dále závisí ú innost bakteriofágových 21

22 preparát také na momentu aplikace preparátu a teplot skladování potraviny ošet ené preparátem. Lytická aktivita bakteriofág je obvykle studována p i optimální teplot r stu patogenu. Pro reálné posouzení ú inku je t eba prov it ú innost i p i konkrétní teplot zrání sýra. Co se tý e asu aplikace, nejvhodn jší je okamžik, kdy je možná kontaminace produktu patogenem. Jestliže je bakteriofág aplikován p íliš pozd, když již došlo k pomnožení patogenu, je jeho ú innost snížena 1. Na trhu jsou již komer ní p ípravky na bázi bakteriofág proti L. monocytogenes použitelné v mlékárenství. P ípravek s ozna ením LMP 102 List Shield (výrobce Intralytics, Inc., USA) obsahuje sm s 6 bakteriofág s aktivitou proti L. monocytogenes. P ípravek Listex TM P100 (Micreos, BV, Holandsko) obsahuje virulentní bakteriofág P100. Oba preparáty mají GRAS status. Oba typy bakteriofágových preparát jsou široce využívány p i výrob potravin v USA. Jsou povoleny FDA (Food and Drug Administration) a USDA (U.S. Department of Agriculture) pro p ímou aplikaci do potravin a k ošet ení povrch výrobního za ízení. V Kanad je pro výrobu potravin se zvýšeným rizikem výskytu L. monocytogenes možno využít Listex P100. V Evrop je povoleno používat Listex P100 jako potraviná ské aditivum ve Švýcarsku. Krom p ípravku LMP 102 List Shield, dodává firma Intralytics, INC bakteriofágové p ípravky proti Escherichia coli (Eco Shield) a Salmonella spp. (Salmo Shield). V zemích EU není dosud oficiální legislativní rámec pro využití bakteriofágových preparát, uvažuje se o využití Sm rnice 89/107 EEC o sbližování p edpis týkajících se p ídatných látek v potravinách 7. V následujících obrázcích 1-2 jsou uvedeny výsledky pokus dokumentující ú innost fágu A511 pro potla ení L. monocytogenes v sýrech s plísní na povrchu a v sýrech s mazem na povrchu 5. Z obrázk je z ejmé, že v sýrech s mazem na povrchu byly lepší podmínky pro rozvoj L. monocytogenes než v sýrech s plísní na povrchu. V sýrech s plísní na povrchu bylo možné pozorovat bakteriostatický efekt bakteriofágového preparátu v i L. monocytogenes p i její p vodní koncentraci 10 3 KTJ/cm 2 povrchu sýra na po átku zrání. U sýr s mazem na povrchu p i p vodní koncentraci 10 3 KTJ/cm 2 povrchu sýra bylo pozorováno snížení po tu L. monocytogenes o 3 až 4 ády ve srovnání s kontrolou bez p ídavku fága po 21 dnech zrání sýra p i C bez ohledu na cílový kmen L. monocytogenes i režim aplikace fágového preparátu na povrch sýra (1 h po výrob, 1 h po výrob a po 6 dnech zrání, 1 h po výrob, po 3 a 6 dnech zrání sýra). Záv rem možno uvést, že využití bakteriofágových preparát v sýra ství je možné jako integrální sou ást hygienicko-sanita ního režimu, ne jako jeho náhrada. Bakteriofágové preparáty jsou vhodné pro povrchové ošet ení sekundárn zrajících sýr s o ekávanou nízkou kontaminací patogenních bakterií (experimentáln prokázáno pro L. monocytogenes). Do budoucna bude nezbytné provést studie bezpe nosti pro konzumenty pro každý komer n aplikovaný bakteriofágový preparát a dlouhodobé studie nebezpe í vzniku rezistentních mutant cílových patogenních bakterií. 22

23 povrchové ph kontrola + fág A511 Obr. 1. Vliv aplikace fágu A511 (3 x 10 8 PTJ/cm 2 ) na r st L. monocytogenes (10 3 KTJ/cm 2 ) v sýru s plísní na povrchu. A: p ídavek fágu za 1 h po výrob ; B: 3 x 10 8 PTJ/cm 2 za 1 h a 20 h; C: 1 x 10 9 PTJ/cm 2 za 1 h (p evzato dle Guenther, Loessner, 2011) 5 Obr. 2. Vliv aplikace fágu A511 (3 x 10 8 PTJ/cm 2 ) na r st L. monocytogenes (10 3 KTJ/cm 2 ) v sýru s mazem na povrchu. A, C a D: kmen L. monocytogenes Scott A; B: kmen kmen CNL 103/2005; A a B: p ídavek fágu A511 za 1 h po výrob ; C: za 1 h po výrob a 6 dnech zrání; D: za 1 h po výrob a po 3 a 6 dnech zrání (p evzato dle Guenther, Loessner, 2011) 5. Ozna ení ar viz obr

24 Použitá literatura: 1. Mahony J., Mc. Auliffe O., Ross R. P., Van Sinderen D.: Bacteriophages as biocontrol agents of food pathogens. Current Opinion in Biotechnology, 22 (3), (2011). 2. Pietracha D., Misiewicz A.: The use of products containing phage in the food industry as a new method for Listeria monocytogenes elimination from food. Czech Journal of Food Sciences 34, 1-8 (2016). 3. Mc Sweeney P.L.H.: Pathogens and food poisoning bacteria. V knize: Cheese problems solved (Mc Sweeney P.L.H. Ed.) Woodhead Publishing Limited, Cambridge England, p , Chibani-Chennoufi S., Bruttin A., Dillmann M.L., Brussow H. Phage-host interactions: an ecological perspective. Journal of Bacteriology 186, (2004). 5. Guenther S., Loessner M.J. : Bacteriophage biocontrol of Listeria monocytogenes on soft ripened white mold and red smear cheeses. Bacteriophage, 1(2), (2011). 6. Carlton R.M., Noordman W.H., Biswas B., De Meester E.D., Loessner M.J.: Bacteriophage P100 for control of Listeria monocytogenes in foods: genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study and application. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 43, (2005). 7. Sm rnice 89/107 EEC o sbližování p edpis týkajících se p ídatných látek v potravinách ze dne 21. prosince Kontaktní adresa: Milada Plocková, Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT, Technická 5, Praha 6-Dejvice milada.plockova@vscht.cz 24

25 MLÉKO a SÝRY P ednášky

26

27 FAKTORY OVLIV UJÍCÍ VNÍMÁNÍ AROMA U MLÉ NÝCH VÝROBK Zde ka Panovská, Dobromila Leitnerová, Vojt ch Ilko Ústav analýzy potravin a výživy, VŠCHT Praha Factors influencing aroma perception for dairy products Summary: Flavorings agents are widely used in dairy industry. New Regulations about flavoring agents were published in 2012 and 2013 (Regulation 1 and 2). The legislation clarify and harmonies the use of flavoring substances. The list of authorized flavoring substances has 2,100 substances and EFSA concludes evaluation of others. The flavor substances are often applied for flavored milk products or yoghurts. The survey which were conducted on the ICT showed that 72% of 150 respondents preferred the milk with flavor. The most favorite aroma was strawberry and others berries. The substances with flavor could be mixture of compounds, which are different in their structure and the perception. Sensory analysis studies the detection thresholds of the substances and their perception. Perception of flavor depends on the concentration of flavor, composition of matrix and many other factors such as temperature, quantity of saliva in mouth and so on. The influence of major nutrients (fats, proteins, carbohydrates) are discussed. V potraviná ském pr myslu velkou roli hrají aromata, látky p sobící na ichové a chu ové receptory lov ka. Používají se hlavn ke zlepšení nebo úprav v n i chuti výrobku tak, aby vyhovoval požadavk m spot ebitele. Jejich používání je dáno legislativou. Aromata a složky potravin s aromatickými vlastnostmi lze používat do potravin pouze tehdy, pokud na základ dostupných v deckých d kaz nep edstavují žádné bezpe nostní riziko pro zdraví spot ebitele, a jejich použití neuvádí spot ebitele v omyl. V lednu 2009 vešel v platnost dokument Na ízení (ES). 1334/2008 o látkách ur ených k aromatizaci a n kterých složkách potravin vyzna ujících se aromatem pro použití v potravinách nebo na jejich povrchu, který mimo jiné popsal zm ny v terminologii a používání aromat. Nap. byl zaveden spole ný termín aromatické látky, místo kategorie um lé aromatické látky a aromatické látky p írodn identické. Podle Na ízení Evropského parlamentu a Rady (ES). 1334/2008 a Na ízení Evropského parlamentu a Rady (ES). 1169/2011 musejí být aromata ozna ovaná jako: 1. aroma m že obsahovat jak p írodní, tak syntetické látky s aromatickými vlastnostmi 2. p írodní aroma musí obsahovat jen p írodní aromatické látky nebo aromatické látky p írodního p vodu (kde došlo ke zm n procentuální zastoupení aromatické složky z 90% na 95% hmotnostních). P írodní jahodové aroma nebo p írodn identické aroma se na obalech nesmí uvád t (tato kategorie aromat byla zrušena) V dalším na ízení EU (Na ízení 872/2012/EU) byl p ijat pozitivní seznam aromat a vložen do na ízení 1334/2008/ES, p íloha - ást A. Tento seznam obsahuje 2450 p írodních a syntetických aromatických látek, které m ly být prov eny do konce roku ást (zhruba 400 látek dosud pln prov eno nebylo, ale n které dosud používané látky byly vy azeny (nap. 1-methylnaftalen, furfuryl(methyl)ether, difurfurylsulfid, difurfurylether, ethyl(furfuryl)ether). Dalí na ízení vyšlo 10. února 2016, Na ízení Komise (EU) 2016/178 ze dne kterým se m ní p íloha I na ízení Evropského parlamentu a Rady (ES). 1334/2008, pokud jde o odstran ní n kterých aromatických látek ze seznamu Unie. Je povoleno zhruba 7x více látek než je látek p ídatných. Laická ve ejnost se za ala v poslední dob o aromatické látky více zajímat, poté co se vy erpaly možnosti kritiky látek p ídatných tzv. é ek. Na internetu kolují varování p ed aromaty a objevují se v ty typu 1 : Slovní spojení p írodní aroma zdaleka neznamená, že je to vyrobeno z toho, po em to má von t. Znamená to pouze to, že je to vyrobeno z p írodních surovin piliny, ušlechtilá plíse, houba, d evo trouchniv jící za kontrolovaných podmínek a podobn. 27

28 Kdo by se trápil suchou destilací erstvých jahod, aby získal kapku pravého jahodového aromatu? Leda tak výrobce drahého parfému, ale rozhodn ne výrobce, který chce ušet it na levném jogurtu. Typické suroviny pro p írodní jahodovou nápodobu tedy budou piliny, ušlechtilá houba, a mletí ervci (barvivo E120, tyto potvory se op t používají proto, aby se to dalo nazvat p írodní, nebo alternativní š áva z ervené epy nemá tu správnou jahodovou barvu). Ve ejnost si úpln neuv domuje, že výhodou aromatických látek získaných chemickými postupy je krom ekonomického hlediska i to, že jsou dostupné v požadovaném množství a kvalit bez ohledu na ro ní období, navíc jsou stabilní a p i skladování potravin nedochází ke ztrát v n nebo chuti tak rychle jako je u látek p írodních. Použití aromatických látek je velmi rozsáhlé, nejvíc se uplat uje p i výrob cukrá ských výrobk, okolád, zmrzlin, žvýka ek, alkoholických i nealkoholických nápoj a ochucených mlé ných výrobk. Aromata v mlé ných výrobcích U mlé ných výrobk zhruba 80% všech aromatizací zahrnuje ty i chut, nejvíc používaná je vanilka (30%), okoláda, jahoda a banán (13,3%) a zbývajících 20% p ipadá na ostatní chut (ananas, kiwi, lesní plody, pod.). Vanilka je sv tov nejpopulárn jší její ro ní spot eba pro komer ní ú ely se odhaduje na tun. U banánové v n je zajímavé, že ást populace je na hlavní složku v n isoamylacetát necitlivá. Na VŠCHT prob hl pr zkum preferovaných aromat u mlé ných výrobk mezi 150 studenty. Ukázalo se, že 72% respondent up ednost uje ochucené mléko. Zastoupení jednotlivých aromat dle obliby ukazuje obrázek jahoda malina merunka broskev banán vanilka ananas ostatní Obrázek 1.: Obliba aromat u ochucených mlék Faktory ovliv ující vnímání aroma. Faktor ovliv ující vnímání aroma je mnoho. Nejvíce studované a diskutované jsou vlivy základních složek potravin, jako jsou sacharidy, lipidy a proteiny na uvol ování aroma, ale uplat ují se i další vlivy jako je vliv interakce mezi aromatickými slou eninami, teploty, vliv iont kov, barvy, vliv sycení, kulinárních úprav, v ku apod. 28

29 Vliv tuk Obsah tuku ovliv uje kvalitu potravin, jak z hlediska výživového, tak senzorického. A koliv je tuk podstatnou složkou lidské stravy, jeho velká spot eba vede k nežádoucím zdravotním ú ink m a je vyvíjen tlak na snižování jeho obsahu v potravinách. Avšak snížením množství tuku m že dojít krom zhoršení textury i ke zm n vzhledu (barva, lesk), pocitu v ústech ( mouthfeel ) a i vnímání aroma. Uvnit systému, kde je p ítomen tuk, dochází k delší zádrži t kavých látek a tím dochází k oddálení uvol ování aromatických slou enin. Protože aroma je v tšinou sm sí slou enin, je výzkum komplikován i tím, že se jednotlivé složky aroma v systémech uvol ují r zn. Nap. v práci Guyota a kol., byl testován diacetyl (butan-2,3-dion), máselná kyselina a dekalakton v r zných emulzích 2. V emulzích s vyšším obsahem tuku se rychleji uvol oval diacetyl a máselná kyselina, naopak hydrofobni dekalakton se uvol oval rychleji v emulzích s obsahem vody. Vliv sladidel Hlavní funkcí sladidel je dodat sladkou chu potravinám, krom toho ale ovliv ují texturu, mikrobiologickou stabilitu a barvu. Bylo zjišt no, že sacharóza je schopna zadržovat t kavé látky jako je aceton, kyselinu kaprylovou, a oktan -1-ol: p i porovnání schopnosti zadržovat t kavé látky sacharóza zadržovala t kavé látky více než glukóza a frukóza. Sledováním vlivu aroma na sladkou chu se zabývala ada studií, které jsou shrnuty v p ehledovém lánku Brossard a kol 3. Vliv zahuš ovadel B žnými složkami potravin jsou hydrokoloidní zahuš ovadla, která se v nízkých koncentracích používají ke zlepšení textury a aroma. Bylo prokázáno, že u okoládového pudingu vyšší viskozita vzorku souvisí s nižším vnímání chut a v n než u vzorku s nižší viskozitou p i stejném obsahu aroma. Na trhu roste spot eba mlé ných nápoj jako nap. jogurtových a kysaných mlé ných výrobk ale i syrovátkových nápoj. Nápoje se syrovátkou jsou v porovnání s fermentovanými nápoji více vodové, nebo u fermentovaných nápoj vznikají inností mikroorganism polysacharidy a tím je výrobek hustší. Do mlé ných nápoj se pro zahušt ní p idávají karboxymethylcelulosa, methoxypektin, alginát, xanthanová guma aj. Použitím pektinu se zabývala studie Nongonierma a kol., v které bylo sledováno chování 13 klí ových aromatických látek typických pro jahodové aroma v jogurtu v závislosti na obsahu tuku v matrici 4. Jednalo se následující slou eniny: ethylacetát, ethylbutanoát, ethyl isobutanoát, ethylhexanoát, ethyl oktatnoát, hexanal, 2 methylbutanová kyselina, linalool, furaneol, d- dekalakton, hmethylcinnamít. V pektinovém gelu existují interakce dipól dipól a hydrorofóbní interakce mezi pektinem a sacharózou, které zp sobují zádrž aromatických slou enin. Zvýšení p ídavku tuku snížilo koncentraci aroma v pektinovém gelu krom nejmén hydrofobní slou eniny, kterou byl ethylacetát. V gelu obsahujícím nejvíc tuku (5%) byla vnímána menší intenzita v n než u jiných gel s obsahem tuku nižším. V mlé ných gelech tuk upravuje uvol ování aroma a zp sobuje pokles t kavosti. U v tšiny t chto studií je nezastupitelná role senzorické analýzy, protože v ni nevnímá populace stejn a je proto d ležité sledovat koncentrace vnímaných látek, meze detekce a jejich prahy vnímání. Jde o velmi složitou problematiku, kdy nelze p enášet poznatky získané ze sledování jednoho aroma, na další, ani nelze zevšeobecnit poznatky podle použitého zahuš ovadla. Vždy je nutné znovu vnímání aroma p i zm n zahuš ovadla, obsahu tuku a dalších složek otestovat na panelu posuzovatel. V naší laborato i byl nap. hodnocen modelový vzorek na bázi pudingu, kdy byl použit tapiokový škrob a mléko o tu nosti 0,1 % a 3,5 %. Rozpis surovin v g/100g pudingu: 90g dehydratovaného mléka 3,5%, 5g sacharózy, 4g škrobu, 0,01g karagenanu 0,06g jahodové aroma. Z výsledku vyplynulo, že vzorek s karagenanem je hustší, ale má mén p íjemnou jahodovou chu. Výsledky senzorického hodnocení jsou ukázány na obrázku 2. 29

30 Obrázek 2.: Výsledky senzorického hodnocení (bez p ídavku karagenanu je tmavší vzorek, s p ídavkem sv tlejší vzorek). Vliv bílkovin Nejvíce studovaným proteinem v mléce je -laktoglobulin, který na sebe váže mnoho aromatických slou enin jako aldehydy, ketony estery. V mnoha p ípadech jsou vazby mezi bílkovinami a aromatickými slou eninami vratné a jedná se p evážn o vodíkové a hydrofobní vazby, ale alifatické aldehydy jsou s bílkovinami spojeny kovalentními nevratnými vazbami. V p ípad laktoglobulinu se nejvíce na vzájemných interakcích podílí polární skupina. U -laktoglobulinu byly zjišt ny vazby s ketony a aldehydy, ale se slabou schopností vázat aroma oproti bílkovinám syrovátky. Vliv iont kov Zajímavé práce ze senzorického hlediska jsou ty, které se zabývají vlivem kovových iont. Lidé vnímají chu a v ni kovových iont r zn a hlavn se liší v citlivosti na jejich vnímání, která se m že lišit až o t i ády. Ionty m di mohou ovliv ovat t kavost aromatických látek v ústech spolu se složkami slin, protože byla prokázaná závislost i s ph. Bylo zjišt no, že pro n které látky se t kavost m ní p i ph 6,5 a p i 7,5 nap. u hexanalu 5. P idáním zinku ke zralým jahodám, byla zjišt ná nižší sladkost zralých jahod a vyšší vnímání kyselé chuti. Snížení sladkosti jahod zp sobí zvýšení kyselosti a nep im enou kombinací kyselé chuti s v ní zralých jahod, což má za následek pokles celkové p íjemnosti chuti 6. Záv r: Uvol ování t kavých látek z matrice ovliv uje mnoho faktor. Mlé né výrobky jsou sm sí vody, sacharid, bílkovin, lipid a dalších organických a anorganických látek a všechny z uvedených látek mohou spolu vzájemn reagovat nebo se vázat na aroma. Uvol ování t kavých slou enin závisí na koncentraci t kavé látky, na tom zda se látka vyskytuje volná, vázaná nebo v komplexu, na složení matrice, množství slin v ústech, ale i na teplot, která má vliv na rozd lovací koeficient t kavé složky. N které faktory založené na interakci mezi aromatickými slou eninami a makro složkami (tuky, cukry, bílkoviny) byly v práci zmín ny jako p íklady složitosti celého problému, který musí technologové p i používání aromat a vývoji nových výrobk ešit. P i t chto studiích má senzorická analýza nezastupitelnou roli, protože pouze ta umožní sledování p íjemnosti dané koncentrace aroma. 30

31 Použitá literatura: 1. (staženo ) 2. Guyot C.G. a kol (1996). Effect of fat content on odour intensity of three aroma compounds in model emulsions J. of Agric. and Food Chem. 44 (8) Brossard Ch.D. a kol. (2006). Sweetness and aroma perceptions in model dairy desserts: an overview Flavor Fragr. Journal 21: Nongonierma A.B.a kol (2007). Influence of flavour transfer between different gel phases on perceived aroma. Food Chem 100 (1), Hong J. H. a kol (2006). Effect of copper on the voolatility of aroma compounds in a model mouth syste. Journal of Agricultuere and Foo Chemistry 54(24), Keast R.S.J. (2003). The effect of zinc on human taste perception. Journal of Food Science 68(5),

32 32

33 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ TEXTURU POLOTVRDÝCH SÝRŮ A METODY HODNOCENÍ Štětina Jiří, Čurda Ladislav (Ústav mléka, tuků a kosmetiky, VŠCHT Praha) Factors affecting the texture of semi-hard cheeses and evaluation methods. Summary: The term texture means all mechanical, geometrical and surface characteristics of the product perceptible by means of mechanical, tactile, or visual and auditory human receptors. Primarily for its evaluation must be used sensory methods, but these are material, time and personnel consuming and, therefore, they are replaced with instrumental methods that enable fast objective evaluation of the large number of samples. Depending on type of their design, the instrumental texture evaluation methods are distinguished to the fundamental, empirical and imitative. Hard and semi-hard cheeses have a character of solid elastic material. However during slow deformations, they exhibit viscoelastic properties. The basic method for evaluating of the mechanical properties of cheese is defined by standard ISO 17996: There are, however, number of imitative and empirical methods, such as the texture profile analysis and cutting, bending or puncture tests. The texture of cheese is determined by the contents of components forming structure (proteins and fats) and by their interactions, which are influenced by the conditions during milk coagulation and curd processing (e.g. acidity, temperature, content of NaCl and calcium) and during maturation (proteolysis and changes of acidity). The effect of temperature is then dependent on the fat content. The increasing of temperatures reduces the modulus of deformability and fracture stress, while increases the fracture strain. The extent of these changes is, however, dependent on the fat content. Textura je jednou ze základních složek senzorických vlastností potravin. Tímto pojmem se rozumí všechny mechanické, geometrické a povrchové vlastnosti výrobku, vnímatelné prostřednictvím mechanických, dotykových, případně zrakových a sluchových receptorů člověka (ČSN ISO 11036:1997) 1. Jedná se tedy o psychofyzikální veličinu, která je na jedné straně dána fyzikálními vlastnostmi materiálu a na druhé straně pak vlastnostmi hodnotitele, jako je například schopnost vnímat tyto vlastnosti, ale také jeho zkušenostmi a očekáváním. 2 V případě polotvrdých sýrů je textura pro senzorickou kvalitu výrobku velmi významná, i když ve většině případů se asi nejedná o dominantní faktor, kterým bude spíše chuť a vůně. Dá se říci, že dobrá textura je pro špičkovou kvalitu sýrů podmínkou nutnou, i když ne dostačující. Nicméně vážné vady textury obvykle vedou k celkově negativnímu hodnocení sýrů. 3 Z uvedeného vyplývá, že přímou metodou hodnocení textury je senzorické hodnocení. Ovšem vzhledem k jeho personální a časové náročnosti se často textura hodnotí pomocí instrumentálních metod pro stanovení mechanických vlastností. Přitom mechanické namáhání při vnímání textury bývá buď nedestruktivní (například při manipulaci se sýrem a při počáteční fázi vnímání textury, kdy určujeme např. tuhost vzorku), nebo destruktivní ať již při porcování (krájení vnímání např. pevnosti nebo lepivosti) nebo konzumaci (žvýkání - dle ČSN ISO 11036: jsou definovány deskriptory tvrdost, lomivost, pružnost, soudržnost, přilnavost, žvýkatelnost nebo gumovitost). 2 V případě polotvrdých sýrů převládají za normálních podmínek při malé deformaci mechanické vlastnosti tuhých elastických látek, tzn. napětí (síla vztažená na plochu působení) potřebné na deformaci je úměrné deformaci, výsledná deformace je okamžitá a vratná. Ve skutečnosti jsou ovšem sýry látky viskoelastické, uplatňuje se zde i viskózní složka struktury, u které je napětí úměrné rychlosti deformace, deformace je časově závislá a nevratná. Pro viskoelastické látky je proto typická časově závislá deformace před i po působení síly a částečně nevratná deformace. Přitom převažující charakter chování závisí na rychlosti deformace: při rychlé deformaci převažují elastické vlastnosti, zatímco při pomalé naopak vlastnosti viskózní. 4 Při velkých deformacích pak dochází k překonání pevnosti mikrostruktury sýrů za vzniku lomu a náhlému uvolnění energie elastické deformace. Destrukce mikrostruktury ovšem nenastává naráz, často k ní začne docházet již před mezí pevnosti materiálu. Na stanovené hodnotě meze pevnosti se pak nepodílí jen pevnost mikrostruktury, ale také disipace energie při tření mezi vzniklými částicemi a toku struktury v důsledku viskoelasticity materiálu. Z těchto důvodů je 33

34 hodnota deformace a napětí na mezi pevnosti závislá na rychlosti deformace při mechanickém namáhání (zvýšení rychlosti deformace má za následek jednak snížení deformovatelnosti a zvýšení napětí na mezi pevnosti), tzn. je závislá i na podmínkách měření. 5 Podle způsobu provedení se instrumentální metody stanovení mechanických vlastností dělí na základní (reologické), empirické a imititativní. 3 Základními metodami se se stanoví konkrétní reologické veličiny (např. modul pružnosti, mez pevnosti, viskozita). Vyžadují, aby po celou dobu měření byly dobře definovány napětí, tzn. síla a plocha vzorku, na kterou působí, deformace, resp. rychlost deformace (rozměry a tvar vzorku a jejich změny) a aby byly minimalizovány okrajové jevy. Empirické metody stanoví fyzikální veličinu, která má podle empirické zkušenosti dobrou korelaci s některým vybraným senzorickým deskriptorem textury. Jedná se o uzanční metody, kde je sledovaná veličina hůře definovaná a její hodnota je tudíž závislá také na podmínkách měření. Jejich výhodou je jednoduchost, snadnost a rychlost provedení, takže jsou vhodné pro rutinní provozní kontrolu. Imitativní metody stanoví mechanické vlastnosti za podmínek, které imitují způsob namáhání vzorku při senzorickém vnímání textury nebo manipulaci se vzorkem. Obvykle je zde vyhodnoceno současně více veličin, takže podávají komplexnější charakterizaci textury, ale jsou pracnější a je zde i složitější interpretace výsledků. Základní metodu pro hodnocení mechanických vlastností polotvrdých a tvrdých sýrů uvádí norma ISO 17996: 2013 Sýry - Stanovení reologických vlastností jednosměrným stlačováním s konstantní rychlostí pohybu. 6 Norma definuje způsob temperace sýra na standardní teplotu měření (15 C), způsob odběru vzorku, podmínky testu a způsob vyhodnocení stanovené zatěžovací křivky. Temperace by se měla provádět s celým bochníkem sýra minimálně 50 h, pokud měl teplotu vyšší než teplotu měření (nutná dlouhá doba pro krystalizaci tuku), resp. minimálně 12 h, pokud měl teplotu nižší. Temperace může být kratší, pokud bylo nutné vzorek odebrat při nižší teplotě před temperací, musí se ovšem zabránit osychání vzorku a deformaci vlastní vahou. Vzorek se odebírá vývrtem ve střední části bochníku (v polovině poloměru válcových bochníků, resp. v polovině delšího rozměru bochníků obdélníkových) v stejném směru, jak byl sýr lisován. Výřez se provádí speciálním korkovrtem jehož profil se volí podle textury sýra (lepivé nebo křehké). Ze střední části výřezu se pak strunou (průměr do 0,4 mm) odkrojí jeden až dva válcové vzorky o výšce 12,5 až 25 mm. Poměr průměru a výšky vzorku by měl být v rozmezí 1,1 až 1,5 (průměr válce tedy od cca 8,5 do 22,5 mm podle výšky). Měření by mělo být provedeno do 10 až 15 minut po odběru vzorku. Vlastní stanovení spočívá ve stlačování válcového vzorku mezi paralelními deskami rychlostí pohybu 50 mm/min. Základny válcového vzorku, které přicházejí do styku s deskami přístroje, se potírají nízkoviskózním minerálním olejem jako lubrikantem, aby se minimalizoval vliv tření na průběh stlačování, které by se projevilo nerovnoměrnou deformací vzorku a zvýšením potřebné síly. Rozsah stlačení se volí tak, aby se dosáhlo destrukce struktury, podle povahy vzorku to může být i více než 80 %. Při stanovení se získá závislost síly na době stlačování, resp. deformaci vzorku. Pro vlastní vyhodnocení se pak provádí transformace dat na závislost pravé napětí na pravé deformaci : [Pa] [1] 34

35 kde F síla (N), A plocha vzorku (m 2 ), h výška vzorku (m); index 0 značí počáteční hodnotu, index t hodnotu v čase t. Uvedená transformace (Obr. 1) je ovšem relevantní jen do dosažení meze pevnosti (lokální maximum na zatěžovací křivce), protože po jejím překonání již není v důsledku vzniku prasklin přesně definován rozměr vzorku. Obr. 1 Příklad zatěžovací křivky polotvrdého sýra při stanovení reologických vlastností jednosměrným stlačováním s konstantní rychlostí pohybu dle ISO 17996: A) naměřené hodnoty, B) transformace na závislost napětí na deformaci. Mechanické vlastnosti vzorku pak vyjadřují veličiny: Zdánlivý modul pružnosti, zvaný též jako modul deformovatelnosti (M D ), který je podle Hookova zákona dán směrnicí počáteční lineární části zatěžovací křivky (pro deformaci do 0,1). Zdánlivé napětí na mezi pevnosti ( F ) - napětí v lokálním maximu zatěžovací křivky (při překonání pevnosti struktury sýra) a tomu odpovídající deformace na mezi pevnosti ( F ). Zdánlivá lomová práce (W f ) celková práce vykonané při deformaci vzorku do dosažení meze pevnosti, ze zatěžovací křivky se získá numerickou integrací: (3) Jejich konkrétní hodnoty jsou pak dány jednak obsahem složek tvořící strukturu sýrů (obsahem bílkovin, resp. jejich poměrem s obsahem vody) a obsahem tuku, ale také uspořádáním těchto složek a jejich interakcemi. Určuje je tedy komplex navzájem se ovlivňujících faktorů, jako jsou podmínky v průběhu celé výroby sýra (při ošetření mléka, sýření a zpracování zrna, solení a zrání), průběh prokysávání (ph, vlastnosti použitým mikrobiálních kultur), obsah vápníku, soli (resp. koncentrace soli ve vodné fázi sýra) a v neposlední řadě podmínky a průběh zrání sýra (rozsah proteolýzy a změny ph, případně obsahu vody). 7 Mechanické vlastnosti jsou přitom samozřejmě závislé na teplotě sýra při hodnocení, při vyšší teplotě klesá modul deformovatelnosti, podobně jako napětí na mezi pevnosti, zatímco deformovatelnost (deformace na mezi pevnosti) se poněkud zvyšuje. Závislost na teplotě je ovšem ovlivněna obsahem tuku, mechanické vlastnosti sýrů s vysokým obsahem tvs jsou na teplotě podstatně více závislé v důsledku krystalizace, resp. tání mléčného tuku, takže při nízkých teplotách může být modul deformovatelnosti vyšší u vysokotučných sýrů (při stejném obsahu vody tukuprosté hmotě), zatímco při vyšších teplotách je tomu naopak. Dalším významným faktorem složení je pak obsah vody, respektive poměr vody a tukuprosté sušiny. Dle předpokladu zvýšením obsahu vody klesá významně modul 35

36 deformovatelnosti a napětí na mezi pevnosti, zatímco deformovatelnost sýra se mění velmi málo. Mechanické vlastnosti dále z hlediska složení ovlivňuje obsah NaCl, lépe řečeno koncentrace NaCl ve vodě v sýru. Zvýšení poměru NaCl k obsahu vody zvyšuje modul deformovatelnsoti, zatímco napětí na mezi pevnosti se mění jen slabě. Deformovatelnost sýra ovšem nejprve roste až do koncentrace 2,5 3,0 % NaCl ve vodě, kdy nastává prudký pokles, který je ale při koncentraci nad cca 4 % již dále jen pozvolný. Významným faktorem je též aktivní kyselost, jejíž vliv se ovšem mění v průběhu zrání sýra. Při vyšším ph klesá modul deformovatelnosti i mez pevnosti, zatímco deformovatelnost se zvyšuje až do cca ph 5,35 a pak následuje naopak snížení. Maximální hodnota je ovšem ovlivněna dobou zrání, na počátku zrání je maximální deformovatelnost při nižším ph a dosahuje vyšší hodnoty, zatímco v průběhu zrání se snižuje a maximum se posouvá do vyšších hodnot ph. V průběhu zrání tedy dochází k v důsledku proteolýzy k významným změnám textury, kdy se zvyšuje modul deformovatelnosti (rychlejší změny nastávají po 5 měsíci) a snižuje deformovatelnost (především prvních 5 10 měsíců). To má za následek nejprve snížení napětí na mezi pevnosti až do 2 3 měsíců zrání kdy dosahuje minima a pak jeho pozvolnému zvyšování. Přitom bylo zjištěno, že změny během zrání jsou větší a dlouhodobější u sýrů s ph 5,2 5,4 zatímco u sýrů s ph 4,8 5,0 jsou změny deformovatelnosti menší a probíhají především první 4 měsíce zrání. 7 Z uvedeného vyplývá značná provázanost faktorů určujících mechanické vlastnosti a tím texturu sýrů, přičemž řada uvedených parametrů je ovlivněna postupně prakticky všemi fázemi výroby. Proto ani není k dispozici model umožňující spolehlivou predikci mechanických vlastností sýra, nicméně jejich kontrola by umožnila zlepšit standardnost výrobků. Využití normalizované metody hodnocení mechanických vlastností sýrů umožňuje též přesnější specifikaci výrobků pro obchodní jednání. Uvedená metoda dle ISO 17996: 2013 zdaleka ovšem není jedinou možností hodnocení. Pro hodnocení sýrů polotvrdých sýrů bývá využívána řada dalších především empirických nebo imitativních metod, jako je například texturní profilová analýza, nebo krájení ohýbání, natahování či vtlačování sondy různého tvaru. Texturní profilová analýza je typickým příkladem imitativní metody hodnocení textury. 2 Realizuje se podobně jako jednosměrné stlačování s tím rozdílem, že imituje hodnocení textury při žvýkání dvojím opakovaným stlačením vzorku. Ze zatěžovací křivky se pak vyjádří všechny deskriptory textury ČSN ISO 11036: Dalšími příklady jsou vtlačování kulové sondy imitující hodnocení tuhosti sýra stiskem palcem, nebo krájení různými typy nožů, které mohou také imitovat ukousnutí sousta předními zuby. 5 Použitá literatura: 1. ČSN ISO 11036:1997: Senzorická analýza Metodologie Profil textury. Český normalizační institut, Praha. 2. Bourne M.: Food texture and viscosity, 2 nd edition, Academic press, London. 3. Guinee T.P.: Cheese Rheology. In: Encyclopedia of Dairy Science (ed. McSweeney P.L.H., Fuquay J.W., Fox P.F.), Academic Press, London O Callaghan D.J., Guinee T.P.: Rheology and texture of Cheese. In: Cheese Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2 Major Cheese Groups (ed. Fox P.F., McSweeney P.L.H., Cogan T.M., Guinee T.P.) Third edition, , Elsevier Academic Press, London van Vliet T.: Inventory of test methods. In: Rheological and fracture properties of cheese (ed. Walstra P.), Bulletin of the International Dairy Federation No 268, 16-25, IDF, Brussels. 6. ISO 17996:2006: Cheese - Determination of rheological properties by uniaxial compression at constant displacement rate. International Organization for Standardization, Geneva. 7. Visser J. (1991): Factors affecting the rheological and fracture properties of hard and semi-hard cheese. In: Rheological and fracture properties of cheese (ed. Walstra P.), Bulletin of the International Dairy Federation No 268, 49-61, IDF, Brussels. Kontaktní adresa: doc. Ing. Jiří Štětina, CSc., Ústav mléka, tuků a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 36

37 KRAVSKÉ KOLOSTRUM A JEHO POTENCIÁL PRO VÝVOJ DOPL K STRAVY V KOMBINACI SE SYNBIOTIKY Hyršlová Ivana 1, Mühlhansová Andrea 4, Bártová Ji ina 2, Tatjana Janatová 2, Sta ková Barbora 3, Krausová Gabriela 1, urda Ladislav 4, Vanucci L 5, Kolesár Libor 6 1 VÚM Praha, 2 Stomatologická klinika, VFN Praha; 3 IV. Interní klinika, 1. LF UK, Praha; 4 Ústav mléka tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha, 5 Mikrobiologický ústav AV R, Praha 6 IKEM, Praha Bovine colostrum and its potential for developing a food supplement with synbiotics Summary: Colostrum is a rich source of essential nutrients for newborn infants. Therefore, our aim was to assess the possibility of combining bovine colostrum with probiotics and prebiotics. First, growth of selected probiotic strains from genera Bifidobacterium, Lactobacillus and Enterococcus in bovine colostrum were tested. Bacterial growth in colostrum was compared on the basis of cell counts to determine by agar plate technique after 24-hr cultivation. In other step, we investigated the immunomodulatory effect of bovine defatted or fatted colostrum by the 3-day in vitro stimulation of human peripheral blood mononuclear cells (hpbmcs). Luminex multiplex analysis was used to analyze cytokine production by the hpbmcs. A statistically significant difference of the effect of various bioactive substances on microbial growth has not been confirmed. Enterococcus faecium CCDM 922 grew best from all selected strains in bovine colostrum (P < 0,05). Our results has shown that bovine defatted colostrum stimulated the secretion of Th2 cytokines IL-10, IL4 and IL-5 which inhibited the production of Th1 cytokines. Úvod Kolostrum je obecn bohatým zdrojem esenciálních živin a bioaktivních látek d ležitých pro výživu a r st mlá at a také pro rozvoj jejich pasivní imunity 1. Mezi bioaktivní látky kolostra pat í r stové faktory (TGF- a, IGF, EGF), imunoglobuliny, laktoperoxidasa, laktoferin, lysozym, vitamíny (A, E a B 12 ), imunomodula ní peptidy a oligosacharidy. V sou asné dob je možné na trhu koupit isté kravské, nebo kozí kolostrum, nebo dopl ky stravy s jeho obsahem v lyofilizované, nebo tekuté form. Hlavním cílem této studie otestovat r st vybraného souboru probiotických bakterií v kravském kolostru a posoudit jeho imunomodula ní efekt na mononukleární bu ky izolované z krve zdravých dárc. Materiál a Metody Kolostrum a sušené mléko Pro testování r stu bylo použito 13 vzork kravského kolostra, které byly získány z prvního nádoje po otelení od krav ervenostrakatého skotu ze ZD Koj ice ( R). Po odebrání byly všechny vzorky zmraženy a skladovány p i teplot -20 C. Pro testování imunomodula ního efektu bylo použito lyofilizované kolostrum od firmy Ingredia ( R). Sušené kravského mléko (Gemermilk RS s.r.o., Rimavská Sobota; sušina 95,6 %) bylo vybráno po stanovení. Mikroorganismy K testování vlivu kravského kolostra na r st potenciáln probiotických bakterií bylo vybráno 10 kmen z rod Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus (Tab. I). Kmeny pocházejí ze sbírky mléka ských mikroorganism Laktoflora, sbírky Katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky eské zem d lské univerzity v Praze a biopsií z trávicího traktu d tí. 37

38 Testování bakteriálního r stu Vzorky kravského kolostra byly nejprve šetrn pasterovány p i teplot 62,5 C po dobu 30 minut. Po pasteraci byly vzorky kolostra zchlazeny na teplotu 37 C a inokulovány 10 % suspenzí bun k, které byly po 18 hodinové kultivaci v MRS bujonu odst ed ny (6000 g, 7 min) a následn roz ed ny v 9 ml fyziologického roztoku na koncentraci 10 3 ~ 10 4 KTJ/ml. Zao kované kolostrum bylo kultivováno p i teplot 37 C po dobu 24 hod za anaerobních podmínek. Po kultivaci bylo zm eno ph a stanoveny po ty testovaných mikroorganism plotnovou metodou dle podmínek uvedených v tabulce I. Tabulka. I: Seznam testovaných kmen a podmínky jejich kultivace Ozna ení Kmen Podmínky kultivace CCDM 151 L. acidophilus MRS agar (ph 5,7), anaerobn, 37 C, 72 hodin RL 25 L. fermentum DM1TA6-P L. casei subsp. paracasei CCDM 229 B. animalis subsp. animalis CCDM 562 B. breve AVNB3-P1 B. adolescentis JOV B. bifidum JKM B. bifidum CCDM 945 Enterococcus faecium M17 agar, aerobn, CCDM 922 Enterococcus faecium 37 C, 48 hodin MRS agar (ph 6,2) + 0,05 % cystein (MERCK), anaerobn, 37 C, 72 hodin Izolace mononukleárních bun k Mononukleární bu ky použité v této práci byly získány centrifugací krve od osmi zdravých pacient ve v ku let (Krevní transfuzní stanice, Všeobecná Fakultní Nemocnice, Praha) na Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich, Švýcarsko) gradientovou centrifugací. Mononukleární bu ky byly po separaci dvakrát promyty 50 ml média X-vivo (Cambrex, USA), poprvé p i 400 g po dobu 10 minut, po druhé p i 200 g také po dobu 10 minut. Po druhém promytí byly získané mononukleární bu ky resuspendovány v 5 ml média X-vivo. Po et mononukleárních bun k byl stanoven mikroskopicky s využitím Bürkerovy kom rky. Zbytek suspenze byl poté na ed n médiem X-vivo tak, aby finální koncentrace mononukleárních bun k byla 10 7 /ml. Stimulace Izolované mononukleární bu ky byly stimulovány 10 % odtu n ným/neodtu n ným kravským kolostrem nebo 10 % obnoveným mlékem po dobu t ech dn. Po stimulaci byly supernatanty odebrány a zamraženy p i 20 0 C do stanovení cytokin multiplexovou metodou na p ístroji LUMINEX 200 TM analyzer (Luminex Corporation, USA). Stanovení cytokin multiplexovou metodou Pro stanovení vybraných cytokin (IL-17, IL-4, IL-5, IL-6, TNF- a INF- ) byl použit kit Fluorokine MAP Human Base Kit A (R&D Systems, USA). Prvním krokem laboratorního postupu bylo navlh ení membrán v jamkách desti ky promývacím roztokem (100 μl do každé jamky) a následné odsátí obsahu vakuovou pumpou. Poté byly p idány na ed né a promíchané mikropartikule (50 μl) do každé jamky a b hem 15 minut bylo napipetováno 50 μl standardu a vzork. Desti ka byla p ekryta folií a inkubována p i laboratorní teplot 3 hodiny na horizontální orbitální t epa ce p i 500 rpm. Po inkubaci byla odsáta tekutina za pomoci vakuové pumpy a jamky 38

39 desti ky t ikrát promyty 100 μl promývacího roztoku. V dalším kroku do každé jamky bylo p idáno 50 μl p ipraveného biotin - antibody mixu. Desti ka byla poté p ekryta folií a po dobu jedné hodiny probíhala inkubace na horizontální orbitální t epa ce p i 500 rpm. Po inkubaci byly op t jamky t ikrát promyty 100 μl promývacího roztoku. Po d kladném promytí bylo p idáno 50 μl p ipraveného streptavidinu PE a p ekryto folií. Inkubace probíhala po dobu 30 min na horizontální orbitální t epa ce. Následuje op t trojí promytí 100 μl promývacího roztoku. Poté byly mikropartikule s navázanými cytokiny resuspendovány ve 100 μl promývacího roztoku a inkubovány 2 min na t epa ce a do 90 minut analyzovány p ístrojem LUMINEX 200 TM analyzer (Luminex Corporation, USA). Výsledky V testovaných vzorcích kravského kolostra byl také sledován r st vybraných kmen z rod Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus. P i porovnání r stu zmín ných rod byly stanoveny statisticky významné rozdíly (P < 0,05) v r stu enterokok v porovnání s bifidobakteriemi a laktobacily. Z vybraného souboru probiotických bakterií nejlépe v testovaných vzorcích kravského kolostra rostl kmen E. faecium CCDM 922 v porovnání s ostatními kmeny (P < 0,05; Obr. 1). Rozdíly v r stu testovaných kmen mohl být zap í in n citlivostí na bioaktivní látky kolostra, jako jsou laktoferin, lysozym a laktoperoxidasa. Vliv zmín ných látek na r st vybraných kmen bude p edm tem dalších studií. 1,E+09 1,E+08 log KTJ/ml 1,E+07 1,E+06 1,E+05 1,E+04 RL DM1 JOV JKM AVN Lactobacillus Bifidobacterium Enterococcus testované kmeny Obr. 1 Porovnání r stu vybraného souboru kmen v kravském kolostru Kolostrum je d ležitým zdrojem protektivních a imunomodula ních látek pro novorozence, kte í ješt nemají pln vyvinutý imunitní systém po narození. 2 Mezi imunomodula ní 3 látky kolostra se obecn adí cytokiny, chemokiny, imunoglobuliny a r stové faktory. V posledních n kolika letech velmi vzrostl zájem o rozvoj nových postup a metod pro stanovení celé ady biologických faktor. Mezi úsp šné metody k široké detekci protein se adí proteomika a antibody-based protein arrays. Hlavními výhodami zmín ných antibody-based protein arrays je možnost stanovení širokého spektra protein a pot eba malého objemu vzorku. 4,5 Ke stanovení vybraných cytokin v této práci byla použita multiplexové reakce na mikrokuli kách (bead arrays), která je kombinací pr tokové cytometrie a imunoanalytického stanovení. Tato metoda poskytuje skute n kvantitativní ur ení koncentrace proteinu na rozdíl od proteinových ip (protein array), kde jsou výsledky asto pouze kvalitativní nebo semikvantitativní. 39

40 koncentrace (pg/ml) koncentrace (g/ml) 0 IL 10 IL 17 IL 4 IL 5 INF cytokiny 10 % kravské obnovené mléko 10% odtu n né kravské kolostrum 10 % kravské kolostrum TNF Obr. 2 Porovnání produkce IL-17, IL-4, IL-5, IL-6, TNF- a INF- mononukleárními bu kami po stimulaci kravském kolostrem a mlékem IL 6 0 Vyšší koncentrace cytokin (IL-1, IL-6, TNF-, INF- ) obsažená v kravském a kozím kolostrum m že ovliv ovat imunitní odpov stejn jako v lidském kolostru. 6,7 Kravské kolostrum obsahuje i další imunomodula ní látky jako laktoferin a insulin growth factors (IGF)-1), které mohou mít schopnost regulovat sekreci cytokin. 8,9 Imunomodula ní vlastnosti kolostra byly popsány v n kolika studiích. 10, 11, 12 Imunomodula ní efekt odtu n ného kravského kolostra na lidské mononukleární bu ky byl zkoumán v práci Biswas a kol. 10, kdy mononukleární bu ky izolované také z krve zdravých dárc jako v této studii byly stimulovány dv ma odlišnými koncentracemi kolostra (0,1 a10,1 g/ml) po dobu 18 a 24 hodin. Po stimulaci byly sledovány hladiny IL-12 a IFN-. Výsledky popsané práci poukazovaly na schopnost kravského kolostra podporovat produkci Th1 cytokin. 10 Toto zjišt ní m že být užite né v prevenci a lé b n kterých mikrobiálních infekcí. V p edložené studii byl imunomodula ní efekt odtu n ného a neodtu n ného kravského kolostra nebo mléka porovnáván na základ produkce interferonu-, interleukin 10, 17, 5, 6 a 4 a TNF- mononukleárními bu kami izolovaných z periferní krve osmi zdravých dárc. Po stimulaci lidských mononukleárních bun k kravským odtu n ným kolostrem došlo ke zvýšené produkci Th2 cytokin IL-10, IL4 a IL-5 v porovnání s kontrolou, které inhibují produkci Th1 cytokin (Obr. 2). Na záv r je nutné íci, že v rámci této studie byl sledován vybraný soubor cytokin, ale kravské kolostrum m že ovlivnit sekreci i dalších cytokin a chemokin, které mají vliv na imunomodulaci. Proto pro p esn jší pochopení mechanismu ovliv ování sekrece cytokin po stimulaci kravským kolostrem nebo jeho kombinací se synbiotiky je nutné provést další studii na dalších specifických bun ných populacích. Pod kování: Tato práce vznikla v rámci institucionální podpory VÚM s.r.o., rozhodnutí. RO 1416 a projektu Ministerstva Zem d lství. QJ

41 Použitá literatura: 1. Godhia, M. L., & Patel, N. (2013). Colostrum its Composition, Benefits as a Nutraceutical A Review. Curr. Res. Nutr Food Sci Jour, 1(1), Shing C. M., Peake J. M., Suzuki K., Jenkins D. G., Coombes, J. S. (2009). Bovine colostrum modulates cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells stimulated with lipopolysaccharide and phytohemagglutinin, J Interferon Cytokine Res vol. 29(1), pp Uruakpa F. O., Ismond M. A. H. and Akobundu E. N. T. (2002). Colostrum and its benefits: a review, Nutr Res. vol 22, pp Kverka M., Burianova J., Lodinova-Zadnikova R., Kocourkova I., Cinova J., Tuckova L. and Tlaskalova-Hogenova H. (2007) Cytokine profiling in human colostrum and milk by protein array, Clinical chemistry vol. 53(5), pp T. O. Joos T. O., Stoll D., Templin M. F. (2002). Miniaturized multiplexed immunoassays. Curr Opin Chem Bio vol. 6, pp Hagiwara K., Kataoka S., Yamanaka H., Kirisawa R. and Iwai H. (2000). Detection of cytokines in bovine colostrum, Vet Immunol Immunopathol vol. 76(3), pp Wan Z. X., Zhang F., Geng Q., Wang P. Y., Zhou H. and Zhang Y. M. (2010). Effect of orally administered bovine colostrum on cytokine production in vivo and in vitro in immunosuppressed mice, Int. dairy J. vol 20, pp Ginjala V. and R. Pakkanen R. (1998). Determination of Transforming Growth Factor- 1 (TGF- 1) and Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) in bovine colostrum Samples, J Immunoassay Immunochem, vol. 19, pp Stelwagen K., Carpenter E., Haigh B., Hodgkinson A. and Wheeler T.T. (2009) Immune components of bovine colostrum and milk. J Anim Sci vol 87, pp Biswas P., Vecchi A., Mantegani P., Mantelli B., Fortis C. and Lazzarin A., (2007). Immunomodulatory effects of bovine colostrum in human peripheral blood mononuclear cells. New Microbiol vol 30, pp Playford, R. J. (2000). Peptide therapy and the gastroenterologist: colostrum and milk-derived growth factors. Clinical Nutrition vol 20, pp Kontaktní adresa: Ing. Ivana Hyršlová (hyrslova@milcom-as.cz) 41

42 42

43

44

45

46

47 KONJUGOVANÁ KYSELINA LINOLOVÁ (CLA) V MLÉ NÝCH VÝROBCÍCH Kyselka Jan, Thomes Lukáš, Skalka Volodymyr, Remišová Simona, Filip Vladimír Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Conjugated linoleic acid (CLA) in dairy products Summary: Conjugated linoleic acid (CLA) represents minor fraction of milk fat lipids ( wt. %). Predominating isomers are (9Z,11E) a (10E,12Z)-octadecadienoic acids. (9Z,11E)-octadeca-9,11-dienoic acid, which forms % of total conjugated acids, is called rumenic. The first step of the linoleic acid biotransformation in rumen resulting in the formation of stearic acid is the isomerisation into rumenic acid. The next key intermediate is vaccenic acid. The present experimental study has focused on the distribution of conjugated linoleic acid derivatives in dairy products and colostrum lipids. The aim of the study was to develop the most suitable laboratory method for the preparation of conjugated linoleic acid with reduced levels of (9E,11E) and (10E,12E)-octadecadienoic acid isomers. Úvod Význam biohydrogenace v p írod Dietární p íjem polyenových mastných kyselin inhibuje r st bachorové mikroflóry. V p ípad kyseliny linolové byl prokázán vliv na d lení bakterií, proto se mikroorganismy adaptovaly r stovým podmínkám tzv. biohydrogenací polyenových mastných kyselin [1,2,3]. Anaerobní bakterie Butyrivibrio fibrosolvens je v tomto ohledu nejvíce tolerantním kmenem s nejvyšší aktivitou 9,11-izomerázy, která katalyzuje p em nu kyseliny linolové na (9Z,11E)- oktadeka-9,11-dienovou kyselinu (kyselinu rumenovou). Enzymatická izomerace je prvním krokem p em ny polyenových mastných kyselin na zcela nasycené deriváty, transformace pokra uje sérií biohydrogenací. Klí ovými intermediáty v p em n na kyselinu stearovou jsou kyselina rumenová a kyselina vakcenová [1,2,3,4,5,6]. Mechanismus enzymové izomerace Enzymov katalyzovaná polohová a geometrická izomerace (Linoleic acid 12 -cis, 11 -trans isomerase, EC ) pentadienylového systému je unikátní, nebo probíhá bez p edchozí aktivace funk ními skupinami. Analogické izomerázy polyenových mastných kyselin byly popsány u celé ady bakterií (Lactobacillus acidophilus, Propionibacterium acnes, Bifidobacterium) a také u ervených as (Ptilota filicina). P edpokládá se, že mechanismus biotransformace, je i p es odlišnou organizaci aktivního místa izomeráz, obdobný [1,3,6]. Vlastním aktivním místem je hydrofobní kavita složená ze t í domén, které obsahují nekovalentn vázaný flavin adenin dinukleotid (FAD). Jediným vhodným substrátem jsou volné polyenové mastné kyseliny, které se uvol ují z esterových vazeb triacylglycerol a fosfolipid hydrolýzou. Izomerace probíhá protickým mechanismem, nebo p i experimentech v D 2 O dochází k regiospecifické adici deuteria. Prvním krokem je odšt pení protonu v bis-allylové poloze na uhlíku C-11 (pk a = 35) [3,4,5,6,7]. Dietární p íjem konjugované kyseliny linolové V literatu e byly popsány antikarcinogenní ú inky konjugované kyseliny linolové, dále je spojována s inhibicí adipogeneze. Nejvýznamn jším zdrojem CLA je z hlediska výživové politiky tuk p ežvýkavc (0,29 1,13 hm. % z celkových mastných kyselin) obsažený v p edevším mléce, mlé ných výrobcích a v mase [8,9,10,11,12]. Obvyklý dietární p íjem mlé ného tuku je v p ípad pr m rného Evropana kolem 30 g za den [9]. Mlé ný tuk je sou asn bohatým zdrojem transnenasycených mastných kyselin, které jsou považovány za zdravotní riziko, nebo ovliv ují rizikové faktory, zejména hladinu LDL cholesterolu v krvi. Proto byly hledány alternativní zdroje dietárního p íjmu CLA, jež byly získány alkalickou izomerací slune nicového i sv tlicového oleje. Poda ilo se vyrobit potravinové dopl ky s vysokým obsahem (9Z,11E)-oktadeka-9,11-dienové kyseliny a (10E,12Z)-oktadeka-10,12-dienové kyseliny. Využití CLA p ípravk v boji s obezitou je p i nejmenším sporné [8,9,10,11,12]. 47

48 Materiál a metody P íprava geometrických a polohových isomer mastných kyselin alkalickou izomerací kyseliny linolové v etylenglykolu Analytické standardy geometrických a polohových izomer metylesteru kyseliny linolové nebyly komer n dostupné, proto byly p ipraveny alkalickou izomerací kyseliny linolové v etylenglykolu (IUPAC Standard method 2.206, 1987) [13]. Izomerace probíhala ve speciáln upravené izomera ní zkumavce (výška: 254 mm, vnit ní pr m r: 25 mm) opat ené sklen nou kapilárou pro p ívod argonu (Ar 4.8; istota: %, obsah kyslíku < 3 ppm). Do zkumavky bylo p evedeno 25 g roztoku KOH v etylenglykolu (6,5 6,6 hm. %) a po odstran ní reziduálního kyslíku vhán ným argonem bylo p idáno 250 mg kyseliny linolové (Sigma Aldrich, 99%). Reakce probíhala 13 hodin p i teplot 180 C. Vzniklé izomery byly extrahovány n-hexanem po okyselení vodné fáze. Mastné kyseliny byly p evedeny na metylestery podle normy SN EN ISO 5509 [14]. P íprava metylester mastných kyselin podle normy SN EN ISO 5509 K 0,5 g oleje bylo p idáno 10 ml metanolického KOH (0,5 mol l -1 ) a sm s byla va ena 30 minut pod zp tným chladi em. Poté bylo p idáno 3 5 kapek metanolického roztoku methyloranže (konc. 1 % hm.) a sm s byla neutralizována koncentrovanou kyselinou sírovou. Po zneutralizování byl p ikapán nadbytek kyseliny (5 kapek). Vznikl r žov - ervený roztok, který se va il pod zp tným chladi em 30 minut. K ochlazenému roztoku bylo p idáno 20 ml nasyceného roztoku NaCl a roztok byl kvantitativn p eveden do d lící nálevky. Metylestery byly dvakrát extrahovány 25 ml hexanu. Spojené extrakty byly t ikrát promyty 50 ml destilované vody do neutrální reakce na metyloranž. Hexanová fáze byla vysušena p es bezvodý síran sodný. Stanovení metylester mastných kyselin metodou plynové chromatografie s plamenov -ioniza ní detekcí (GC/FID) Vzorek metylester mastných kyselin p ipravených podle normy SN EN ISO 5509 byl analyzován pomocí kapilární plynové chromatografie (GC). K analýze byl použit plynový chromatograf Agilent Technology 6890 s plamenov -ioniza ním detektorem (FID). Byla použita kolona SP TM 2560 (Supelco, Bellefont, USA) s rozm ry 0,25 mm x 100 m a tlouš kou filmu 0,2 m, která je schopna stanovit cis a trans izomery MK. Nosným plynem bylo He o pr toku 1 ml min -1. Detekce plamenov -ioniza ním detektorem probíhala p i teplot 220 C, pr toku vodíku 45 ml min -1, vzduchu 450 ml min -1 a jako make up plyn byl použit N 2 o pr toku 45 ml min -1. Nást ik na kolonu byl proveden autosamplerem Agilent Technology 7683 p i teplot 220 C v množství 1 l. Split pom r byl 1:50. Získaná relativní procenta obsahu metylester MK byla p epo tena na skute ná hmotnostní procenta MK. Mlé ný tuk byl analyzován podle modifikované metody dle prof. Christie [15]. Stanovení konjugovaných dien a trien podle modifikované metody IUPAC Konjugované dieny a trieny byly stanoveny na p ístroji Varian Cary 50, UV-Vis spektrofotometru. Po navážení mg vzorku alkalicky izomerovaného oleje byla 25 ml odm rná ba ka dopln na po rysku n-hexanem. Následovalo m ení absorbance konjugovaných trien p i vlnových délkách 262, 268 a 274 nm. Z p vodního roztoku bylo odebráno 10 ml do 25 ml odm rné ba ky, která byla dopln na n-hexanem po rysku. Poté byly stanoveny konjugované dieny p i vlnové délce 233 nm [13]. Výsledky a diskuze P íprava konjugované kyseliny linolové alkalickou izomerací V tšina geometrických a polohových izomer nebyla komer n dostupná, proto byly laboratorn p ipraveny alkalickou izomerací v etylenglykolu podle metody (IUPAC standard method 2.206, 1987). Metodou plynové chromatografie byly identifikovány dva dominantní izomery metylester cis,trans-oktadeka-9,11-dienové a trans,cis-oktadeka-10,12-dienové kyseliny. Alkalickou konjugací v etylenglykolu bylo dosaženo vysoké konverze kyseliny linolové - 97,36 %. 48

49 Strukturní analýza geometrických a polohových izomer metylesteru kyseliny linolové Geometrické izomery oktadekadienových kyselin byly identifikovány podle reten ních as standard metylester : trans,trans-, cis,trans-, trans,cis- a cis,cis-oktadeka-9,12-dienové kyseliny. (obr. 57). Uvedené po adí odpovídalo eluci na kolon SP TM 2560 (Supelco, Bellefont, USA, s rozm ry 0,25 mm x 100 m a tlouš kou filmu 0,2 m) a bylo ve shod s publikovanými údaji. Ostatní polohové a geometrické izomery byly minoritními slou eninami. Konjugované trans,trans-oktadekadienové kyseliny byly identifikovány podle ECN hodnot (obr. 1). Struktura trans,trans izomer v s-cisoidním uspo ádání byla potvrzena tvorbou cyklických adukt s 4- methyl-1,2,4-triazolin-3,5-dionem, anhydridem kyseliny maleinové a p-benzochinonem. Kvalitativní analýza produkt selektivní Diels-Alderovy reakce byla provedena na GC-MS [16]. Obr. 1. Chromatografický záznam alkalické konjugace kyseliny linolové v etylenglykolu. Konjugovaná kyselina linolová v mlé ných výrobcích Kyselina rumenová dominovala mezi geometrickými a polohovými izomery, jež vznikly p i izomeraci i biohydrogenaci polynenasycených MK (obr. 2). Jednalo se o derivát, kterému je dle p vodní asopisecké literatury p isuzována nejvyšší biologická aktivita. Obr. 2. Geometrické a polohové izomery linolové kyseliny v mlé ných výrobcích 49

50 Konjugovaná kyselina linolová byla vázána p edevším v triacylglycerolech, které se vyskytují v jádru tukových kuli ek (zjišt no v mlezivu). CLA byla doprovázena nenasycenými kyselinami s konfigurací trans (E), p edevším kyselinou vakcenovou a k. elaidovou. Nejvyšší obsah trans-nenasycených mastných kyselin (obr. 3, 4) byl stanoven v sýrech, následovalo máslo (smetana, mléko), podmáslí a mlezivo. Polohové isomery monoenových kyselin vznikají rovn ž biohydrogenací v bachoru (obr. 5). Obr. 3. Zastoupení trans-nenasycených mastných kyselin v mlé ných výrobcích Obr. 4. Geometrické izomery kyseliny olejové v mlé ných výrobcích 50

51 Obr. 5. Polohové izomery kyseliny olejové v mlé ných výrobcích Záv r Byla vyvinuta laboratorní metoda p ípravy konjugované kyseliny linolové s minimálním obsahem isomer (9E,11E) and (10E,12E)-oktadekadienové kyseliny. Ve vzorcích mleziva byl stanoven výrazn nižší obsah konjugované kyseliny linolové a trans-nenasycených mastných kyselin. Pod kování: Financováno z ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT. 20-SVV/2016). Použitá literatura: 1. Liavonchanka A., Feussner I.: Biochemistry of PUFA double bond isomerases producing conjugated linoleic acid. ChemBioChem, 2008, 9 (12), Jenkins T.C., Wallace R.J., Moate P.J., Mosley E.E.: Recent advances in biohydrogenation of unsaturated fatty acids within the rumen microbial ecosystem. Journal of Animal Science, 2008, 86 (2), Hunter W.J., Baker F.C., Rosenfeld I.S., Keyser J.B., Tove S.B.: Biohydrogenation of unsaturated fatty acids. Hydrogenation by cell-free preparations of Butyrivibrio fibrisolvens. Journal of Biological Chemistry, 1976, 251 (8), Kepler C.R., Tucker W.P., Tove S.B.: Biohydrogenation of unsaturated fatty acids. V. Stereospecificity of proton addition and mechanism of action of linoleic acid 12 -cis, 11 -trans-isomerase from Butyrivibrio fibrisolvens. Journal of Biological Chemistry, 1971, 246 (9), Devillard E., Andant N., Wallace R.J.: Increased expression of a molecular chaperone GroEL in response to unsaturated fatty acids by the biohydrogenating ruminal bacterium, Butyrivibrio fibrisolvens. FEMS Microbiology Letters, 2006, 262, Liavonchanka A., Hornung E., Feussner I., Rudolph G.: Structures and mechanism of the Propionibacterium acnes polyunsaturated fatty acid isomerase. PNAS, 2006, 103 (8), Okuyama T., Maskill H. (2014) Organic chemistry: a mechanistic approach, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom: Velisek J. (2002) Chemie potravin, OSSIS, Tabor: Akoh C.C., Lai O.-M. (2005) Healthful lipids, AOCS Press, Urbana, Illinois: Henry C.J.K. (2007) Novel food ingredients for weight control (1 st edition), Woodhead Publishing Ltd, Cambridge, England:

52 11. Leray C. (2015) Lipids: nutrition and health, Boca Raton: CRC Press, United States: Ha Y.L., Grimm N.K., Pariza M.W.: Anticarcinogens from fried ground beef: heat-altered derivatives of linoleic acid. Carcinogenesis, 1987, 8 (12), IUPAC (1987) Determination of di- and tri-unsaturated fatty acids by ultraviolet spectrophotometry, IUPAC Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives, Method SN EN ISO 5509: Živo išné a rostlinné tuky a oleje P íprava methylester mastných kyselin. NI, Praha Christie W.W. (1989) Gas Chromatography and Lipids: A Practical Guide, The Oily Press LTD, Ayr, Scotland: Dobson G.: Identification of conjugated fatty acids by gas chromatography mass spectrometry of 4- methyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione adducts. J Am Oil Chem Soc, 1998, 75 (2), Kontaktní adresa: Ing. Jan Kyselka, Ph.D. (jan.kyselka@vscht.cz), Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6. 52

53 OXIDA NÍ STABILITA MLEZIVA Iveta Hrádková, Markéta Ber íková, Aneta Fránková, Ladislav urda Ústav mléka, tuk a kosmetiky, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Oxidation stability of the colostrum Summary: Samples dried cow and goat colostrum were stored for 18 weeks at different temperatures (8, 25 and 30 C). Samples of goat colostrum were stored in open and closed atmosphere. During storage conditions increased volatile secondary oxidation products of lipids. These products are a sensory active substances (aldehydes and volatile acids). Secondary oxidation products were determined by gas chromatography with mass detection (GC / MS). Sample preparation was carried out by SPME (Solid Phase Microextraction ). During storage there was an increase of aldehydes (pentanal, hexanal, and heptanal) which were oxidized to volatile acids (pentanoic acid, hexanoic acid and heptanoic acid). Content of oxidation products of lipids increased with increasing temperature and open atmosphere. The extent of lipid oxidation is possible to determine by the content of volatile aldehydes and acids. Úvod: Kolostrum neboli mlezivo je první potrava mlá at savc. Jedná se o tekutinu nažloutlé barvy, která se tvo í okamžit po narození mlá at a její tvorba trvá jen pár dn, postupn se m ní v mléko p echodové cca 5 dn a poté se za ne uvol ovat mléko zralé. Mlezivo slouží jako zdroj živin, ale také jako zdroj pasivní imunity, takže zajiš uje b hem prvních dn života mlá at ochranu p ed možnou infekcí [1]. Kolostrum není pouze zdrojem živin, ale také biologicky aktivních látek. Mezi tyto látky pat í antimikrobiální a r stové faktory. Antimikrobiální látky zajiš ují ochranu mlád te, které nemá ješt dostate n vybudovaný imunitní systém a r stové faktory podporují r st a vývoj jedince. Mezi antimikrobiální látky pat í hlavn glykoproteiny imunoglobuliny, v mlezivu se jich vykytuje až stokrát více jak ve zralém mléce. Další antimikrobiální látky kolostra jsou laktoferin, lysozym a laktoperoxidása [2]. Jakým zp sobem bude probíhat oxidace lipid mlé ného tuku závisí na složení mastných kyselin. Polynenasycené mastné kyseliny podléhají nejsnadn ji oxidaci, dále následují mononenasycené mastné kyseliny a až p i vysokých teplotách oxidují nasycené mastné kyseliny [3]. Kravské mlezivo obsahuje 33,5 % nenasycených mastný kyselin a zralé kravské mléko obsahuje 32,1 % t chto kyselin [4]. Kozí mlezivo obsahuje 33,7 % nenasycených mastných kyselin a zralé kozí mléko 37,8 % [5]. Mlé ny tuk má tedy p evahu nasycených mastných kyselin. B hem oxidave nenasycených mastných kyselin dochází ke vzniku hydroperoxidu nenasycené mastné kyseliny, který dále oxiduje na sekundární oxida ní produkt aldehyd a ten se dále oxiduje na t kavou kyselinu [3]. Experimentální ást: V práci bylo použito sušené kozí mlezivo firmy Betula Pendula, vyrobené v 5. m síci v roce 2014 a kravské mlezivo firmy Ingredia s.r.o., vyrobené v 11. m síci v roce Lipidické složení použitého kravského a kozího mleziva bylo stanoveno pomocí plynové chromatografie s plamenoioniza ním detektorem (GC-FID). Ze vzorku mleziva byl pomocí metody Röse Gottlieba (IDF Standard ID (1996)) izolován mlé ný tuk, který byl následn p eveden na methylestery mastných kyselin (ME-MK). ME-MK byly analyzovány pomocí GC-FID za následujících podmínek: p ístroj: Agilent technology 6890 s kolonou SP TM (Supelco, Bellvnote, USA) o rozm rech 0,25 mm x 100 m x 0,2 μm. Nosný plyn: He o pr toku 1 ml min -1. FID detektor s nastavenou teplotou 250 C. Nást ik na kolonu byl proveden p i teplot 220 C. Programace pece byla následující: 60 C s výdrží 10 min, s násr stem teploty o 6 C min -1 na 88 C, nár st 8 C min -1 na kone nou 175 C. 53

54 Skladování vzork : 55 g sušeného mleziva (kozí i kravské) bylo naváženo do t ech Petriho misek (o pr m ru 17 cm) ve vrstv 1 cm. Misky byly umíst ny do teplot: 8, 25 a 37 C, v otev ené atmosfé e. Kozí mlezivo bylo skladováno i v uzav ené atmosfé e p i stejných teplotách. Uzav ená atmosféry byla zajišt na pomocí polyethylenového sá ku, který byl evakuován a zataven. Ve zvolených asových intervalech bylo odebráno 1,5 g vzorku do 15 ml vialky. P íprava vzork p ed analýzou: Vialka s 1,5 g vzorku byla 30 min temperována p i teplot 45 C, poté bylo p es septum zavedeno do vialky vlákno a 10 min probíhala sorpce t kavých oxida ních produkt na vlákno. K sorpci bylo použito vlákno se stacionární fází: divinylbenzen/carboxen/pdmd 50 m (Supelco). Desrorpce látek probíhala v injek ním portu GC MS 3 min p i 250 C (splitless mod). Podmínky analýzy pomocí GC-MS byly následující: kolona HP-5MS (0,25 mm x 30 m, 0,25 m), pr tok He jako nosného plynu 1,2 ml min, programace pece: 40 C 2 min, t = 5 C min do 180 C, 1 min výdrž p i 180 C. Aux teplota 280 C. Identifikace látek probíhala pomocí srovnání hmotnostních spekter s knihovnou NIST. Vybraný ion charakteristický pro aldehydy m/z = 44 a pro kyseliny m/z = 60. Pro kvantitativní vyhodnocení byly použity plochy pod k ivkami píku pro danou slou eninu. Tabulka I : složení mastných kyselin kravského a kozího mleziva Složení mastných kyselin (g MK/100g MK) Kozí mlezivo Kravské mlezivo Mastná kyselina zkratka ( % ) ( % ) Máselná C4 1,7 0,4 Kapronová C6 1,8 0,6 Kaprylová C8 2,9 0,6 Kaprinová C10 6,8 2,2 Laurová C12 3,0 2,9 Myristová C14 9,7 12,3 Myristolejová C14:1 cis 0,2 0,2 Pentadekanová C15 0,8 0,5 Iso palmitová C16r 0,2 0,3 Palmitová C16 27,8 38,3 Palmitolejová C16:1 cis 0,5 2,4 Heptadekanová C17 0,2 0,1 9 cisheptadekanová C17:1 0,6 0,4 Iso stearová C18r 0,9 0,1 Stearová C18 10,0 7,9 9 trans oktadecenová C18:1 trans 0,9 1,2 Olejová C18:1 cis 26,2 24,3 Linolová C18:2 cis 1,7 2,5 linolenová C18:3 cis 0,6 0,1 MUFA+PUFA 30,7 31,1 MUFA mononenasycené mastné kyseliny, PUFA..polynenasycené mastné kyseliny 54

55 Výsledky a diskuze: V práci byl sledován vznik oxida ních produkt u vzork kravského a kozího mleziva po dobu 18ti týdn p i t ech teplotách 8, 25 a 37 C. U kozího mleziva byl dále sledován vliv p ítomnosti kyslíku na oxidaci, vzorky byly skladovány v otev ené a uzav ené atmosfé e, p i teplot 8, 25 a 37 C. P i teplot 8 C byl zaznamenán pomalejší nár st sekundárních oxida ních produkt u kravského mleziva a jejich následný rozklad s maximem v týdnu (Obr.1). Na Obr.2 je možné vid t nár st vzniku a vývoje sekundárních oxida ních produkt kravského mleziva skladovaného p i 25 C. Nár st aldehyd je minimální, ale vznik t kavých kyselin je rychlejší Obr. 5. B hem oxidace lipid vznikají senzoricky aktivní aldehydy, které se dále oxidují na t kavé kyseliny (petanal kys. pentanová, hexanal kys. hexanová). Vzniklé kyseliny pravd podobn t kají do okolí. Z tohoto d vodu kvantitativní porovnání daného sekundárního oxida ního produktu není možné. V pr b hu oxidace vzniká celé spektrum aldehyd a z nich vzniklých t kavých kyselin, které m že být indikátorem oxidace lipid dekanal, kys. pentanová, hexanová, heptanová, oktanová (Obr.1-6). Obr.1: Obsah aldehyd v kravském mlezivu skladovaném p i 8 C v otev ené atmosfé e Obr.2: Obsah aldehyd v kravském mlezivu skladovaném p i 25 C v otev ené atmosfé e 55

56 Obr.3: Obsah aldehyd v kravském mlezivu skladovaném p i 37 C v otev ené atmosfé e Obr.4: Obsah t kavých kyselin v kravském mlezivu skladovaném p i 8 C v otev ené atmosfé e Obr.5: Obsah t kavých kyselin v kravském mlezivu skladovaném p i 25 C v otev ené atmosfé e 56

57 Obr.6: Obsah t kavých kyselin v kravském mlezivu skladovaném p i 37 C v otev ené atmosfé e P i sledování vývoje sekundárních oxida ních produkt v otev ené atmosfé e u kozího mleziva, byly zaznamenány podobné výsledky jako u kravského mleziva. Majoritní byly stejn jako u kravského mleziva hexanal, pentanal, kyselina máselná, hexanová. Maximální hodnoty sekundárních oxida ních produkt byly zaznamenány v 8. týdnu skladování, p i teplot 8 C a p i 37 C ve 4. týdnu skladování. Kozí mlezivo bylo skladováno i v uzav ené atmosfé e a zjišt né výsledky potvrdily, že vzorek bez p ístupu kyslíku oxidoval pomaleji. Pod kování: Práce byla podpo ena z grantu Ministerstva zem d lství.: QJ Použitá literatura: 1. Przybylska J., Albera E., Kankofer M.:2007. Antioxidants in Bovine Colostrum. Reproduction in Domestic Animals, 42, Boundry, Ch., Dehoux J., Portetelle D., Buldgen A. 2008: Bovinecolostrum as a natural growth promoter for newly weane piglets. Biotechnology Agron. Soc. Environ., 12 (2), Velíšek J., Hajšlová J.: Chemie potravin, , OSSIS, Tábor Contariny G., Povolo M., Pelizzola V., Monti L., Bruni A., Passolungo L., Abeni F., Degano L.:2014. Journal of Dairy Science, 97 (8), Marounek M., Pavlata L., Mišurová L., Volek Z., Dvo ák R.: Changes in the composition of goat colostrum and milk fatty acids during the first month of lactation, Czech Journal of Animal Science, 57 (1), Kontaktní adresa: Ing. Markéta Ber íková, Ph.D., marketa.bercikova@vscht.cz, Technická 3, 16628, Praha 6 57

58 58

59 P ÍPRAVA JOGURT S P ÍDAVKEM MLEZIVA A S HYDROLYZOVANOU LAKTOSOU Remišová Simona 1, Skalka Volodymyr 1, Ko orzová Anna 2, urda Ladislav 1 1 Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha, 2 INGREDIA s.r.o. Frýdek-Místek Preparation of yogurts with added colostrum and hydrolysed lactose Summary The aim of this work was an application of dried colostrum into fermented dairy products using enzyme for lactose hydrolysis. Colostrum, due to its composition, is very promising substance for immunity improvement. Fermented dairy products with colostrum and reduced content of lactose make an attractive option for people with lactose digestion disorders. In this work, enzyme for hydrolysis with optimum activity in acidic ph, was used for the preparation of this product. Specifically, it is -galactosidase produced by Aspergillus oryzae. The effects of added enzyme with combination of colostrum on final texture and sensory properties of the products, growth of lactic acid bacteria and content of organic acids and saccharides, were evaluated. Nor growth of bacteria, neither texture properties were significantly affected, although regarding sensory properties, a positive influence on taste of product was proven. It was possible to make a product with the lactose content under 1 %, using this -galactosidase at a concentration of 0,25 g l -1. Úvod Kolostrum obsahuje krom základních živin pro mlád, také biologicky aktivní látky, minerály a vitaminy, díky nimž poskytuje imunologickou ochranu, stimuluje r st a rozvoj a také n které fyziologické funkce. Je jedním z nejvíce potenciálních imunitních prost edk, proto se stalo výjime ným výživovým dopl kem stravy, který chrání a podporuje zdraví 1,2. Mlé né produkty obohaceny kolostrem se však nemohou stát variantou pro lidi, kte í trpí laktosovou intolerancí, neboli nedostatkem enzymu -galaktosidasy, který ve st evech št pí disacharid laktosu na glukosu a galaktosu. Lidé trpící tímto onemocn ním mají n kolik možností zamezení potíží z mlé ných výrobk. Jednou z nich je konzumace výrobk se sníženým obsahem laktosy 3. Potraviny se sníženým obsahem laktosy jsou definovány jako potraviny obsahující maximáln 1 g laktosy ve 100 g (100 ml) výrobku ur eného pro p ímou konzumaci 4. Cílem této práce bylo zkombinovat benefit p ídavku kolostra do mlé ného fermentovaného produktu (probiotického jogurtu) a snížení obsahu laktosy. Redukce obsahu laktosy bylo dosaženo hydrolýzou pomocí -galaktosidasy s optimální aktivitou v kyselé oblasti ph, získané z Aspergillus oryzae. Materiál a metody Na výrobu jogurt se použil výrobek ESSENS Colostrum Probiotics (Ingredia, R), který obsahuje inulin jako prebiotikum, malé množství sušeného mleziva a lyofilizovanou sm snou kulturu (jogurtová Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a dopl ková probiotická kultura Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium animalis subsp. lactis). Tato sm s se rozmíchala v 1 l homogenizovaného UHT mléka s 1,5 % tuku, rozd lila po 100 ml a nechala fermentovat 8 hodin p i 43 C, po ukon ení kultivace byla vychlazena na 6 C. Vzorky na analýzu se odebíraly každých 30 minut, u každého z nich probíhala následná inaktivace enzymu p i 95 C po dobu 10 min. -galaktosidasa Maxilact A4 MG (DSM Food Specialities, Nizozemí), se p idala v takovém množství, aby koncentrace byla 0,25 g l -1 a mlezivo bylo p idáno tak, aby tvo ilo 2 % výsledného produktu. Analýza sacharid a organických kyselin metodou HPLC Sacharidy a organické kyseliny byly analyzované na kolon Polymer IEX H, 250 x 8 mm s p edkolonou 40 x 8 mm (Watrex), pomocí kapalinového chromatografu Agilent 1100 Series (N mecko). Mobilní fází pro sacharidy byla 0,1% TFA a pro organické kyseliny 9 mmol l -1 kyselina sírová. Detekce eluovaných sacharid prob hla pomocí ELS detektoru (55 C, 500 mv), organické kyseliny byli detekované UV detektorem p i 210 nm. P íprava vzork prob hla srážením ethanolem 5. 59

60 R st mikroorganism pomocí impedan ní metody Pomocí impedan ní metody byly hodnoceny efekty p ídavk enzymu i mleziva na rychlost r stu bakterií p ítomných ve sm si na výrobu jogurtu. Principem této metody je monitorování zm n elektrických vlastností r stového média, které jsou zp sobeny metabolickou aktivitou mikroorganism. Monitorování probíhalo pomocí impedan ních k ivek, což jsou k ivky závislosti relativní zm ny impedance (M-hodnoty) na ase 6. Sledovaná sm s na výrobu jogurtu se asepticky rozd lila po 10 ml do kyvet s elektrodami a pomocí p ístroje BacTrac 4100 (Sy-Lab, Rakousko) byly p i teplot 43 C v pr b hu 8 hodin analyzované zm ny impedance. Texturní profilová analýza Na hodnocení texturních vlastností jogurtu byla použita penetra ní metoda vtla ování válce o pr m ru 20 mm pomocí p ístroje TA.XT plus (Stable Micro Systems Ltd., UK). Bylo provád no opakované vtla ování válce do hloubky 15 mm s 15 sekundovou prodlevou p ed druhým vtla ením, p i emž rychlost sondy byla 5 mm s -1. Sledovaly se vlastnosti jako tvrdost, pružnost, soudržnost, p ilnavost a houževnatost. Senzorické hodnocení Pomocí senzorického hodnocení se zkoumal vliv p ídavku enzymu a mleziva na senzorickou jakost jogurtu. Použité metody byly preferen ní test a hodnocení pomocí stupnice. Panel hodnotitel poz stával ze student a zam stnanc Ústavu mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT, p i emž celkov jich bylo 12. Senzorická analýza a vyhodnocení byly v souladu s postupy v norm SN Výsledky a diskuse Analýza sacharid a organických kyselin metodou HPLC Na posouzení zm n ve složení výrobku, které jednak probíhají p i fermentaci díky metabolické aktivit baktérií mlé ného kvašení (BMK), jednak na základ aktivity p idané -galaktosidasy, byly sledovány zm ny koncentrace p ítomných sacharid (laktosa, galaktosa, glukosa) a kyseliny mlé né, která je tvo ena aktivitou BMK. Laktosa je disacharid složený z glukosy a galaktosy, spojený -glykosidickou vazbou. Enzym -galaktosidasa funguje tak, že tento disacharid rozšt pí na p íslušné monosacharidy. U výrobk s enzymem se tedy o ekává, že obsah laktosy bude signifikantn snížen a naopak vzroste obsah glukosy, což bude mít za následek i sladkou chu. Koncentrae (g l 1 ) Bez p ídavku 2 % mleziva Enzym Enzym + mlezivo as (h) Obr. 1. Zm ny koncentrace laktosy v pr b hu fermentace v r zných variantách výrobku. 60

61 Je možno pozorovat, že enzym za al p sobit tém okamžit a s postupným snižováním ph se jeho aktivita zvyšovala, tudíž hydrolýza laktosy probíhala rychleji. Mezi výrobky s p idaným enzymem (s mlezivem i bez n j) nebyly pozorovány markantní rozdíly. Vyhláška MZe. 54/2004 Sb. definuje potraviny s nízkým obsahem laktosy jako potraviny osahující nejvíce 1 g laktosy ve 100 g nebo 100 ml potraviny v stav ur eném k spot eb. Dále definuje bezlaktosové potraviny jako potraviny obsahující nejvíce 10 mg laktosy ve 100 g nebo 100 ml potraviny v stav ur eném k spot eb, a v kterých je p ítomnost volné galaktosy vylou ena. Kone ná hodnota laktosy v jogurtu s enzymem byla 0,1 %, tudíž podmínka na obsah laktosy, aby mohl být tento jogurt ozna en jako výrobek s nízkým obsahem laktosy, byla p i pracovní koncentraci enzymu 0,25 g l -1 spln na. 10 Koncentrae (g l 1 ) as (h) Bez p ídavku 2 % mleziva Enzym Enzym + mlezivo Obr. 2. Zm ny koncentrace glukosy v pr b hu fermentace v r zných variantách jogurtu. Ve variantách bez p idané -galaktosidasy byla glukosa detekovaná ve velmi nízkých koncentracích. Potvrzuje se, že enzym funguje okamžit, i ve vyšších hodnotách ph a se snižujícími hodnotami ph jeho aktivita nar stá. Kone né hodnoty glukosy se pohybují kolem 0,8 %, což zap í inilo zvýšení sladké chuti v jogurtu. Koncentrae (g l 1 ) as (h) Obr. 3. Zm ny koncentrace galaktosy v pr b hu fermentace v r zných variantách jogurtu. Zm ny koncentrace galaktosy mají zhruba o ekávaný pr b h. Jogurtová kultura galaktosu neutilizuje, z stává proto ve výrobku, také Lactobacillus acidophilus, v p ípad dostatku jiného dob e dostupného substrátu patrn galaktosu nevyužívá. Varianty s enzymem mají kone né koncentrace tém až 4x vyšší než bez enzymu. 61 Bez p ídavku 2 % mleziva Enzym Enzym + mlezivo

62 Podle Plockové (2011) je optimální teplota pro produkci kyselin C a obsah kyseliny mlé né vyprodukované jogurtovou kulturou, po dodržení optimálních podmínek na zaru ení správného pom ru laktobacil a streptokok, je 0,85 1,20 %. Pom r obou druh je nejvíce ovlivn n dobou kultivace, teplotou inkubace a velikostí inokula 8. V pr b hu m ení z výsledk vyplynulo, že finální koncentrace kyseliny mlé né v jogurtech byly celkem nízké (0,7 0,8 %). 0,8 Koncentrae (%) 0,6 0,4 0,2 Bez p ídavku 2 % mleziva Enzym Enzm + mlezivo 0, as (h) Obr. 4. Zm ny koncentrací kyseliny mlé né v pr b hu fermentace v r zných variantách výrobku. Z tohoto obrázku vyplývá, že p ídavek mleziva, i enzymu v tomto p ípade na produkci kyseliny mlé né nemn l tém žádný vliv. Výsledek však poukazuje na nízkou finální koncentraci kyseliny mlé né v porovnání s b žnými výrobky tohoto typu. R st mikroorganism pomocí impedan ní metody Vliv p ídavk kolostra, enzymu a jejich kombinace na r st BMK je nepatrný. Dalo by se íct, že p ídavek, i enzymu nebo kolostra, oproti základné variant vždy r st o n co zrychlil. U enzymu byl tento jev o ekávaný. U kolostra je to však závislé na celkovém p idaném množství. Aryana a kol. (2008) uvádí, že p ídavek sušeného kolostra 4 a 8 g na 228 g jogurtu (což odpovídá asi 9 a 18 %) zvýšil po ty laktobacil v jogurtu b hem skladování, ale p ídavek 12 g na 228 g jogurtu už r st t chto bakterií naopak snížil 9. Podle p edchozích m ení impedan ní metodou se dá konstatovat, že p ídavek 10 % tekutého kolostra, což zhruba odpovídá našemu p ídavku 2 % sušeného kolostra, byl r st bakteriální kultury pozitivn ovlivn n M hodnoty as (h) Bez p ídavku 2 % mlezivo Enzym Enzym + mlezivo Obr. 5. M - hodnoty pro r zné varianty jogurtu. 62

63 Texturní profilová analýza Pomocí texturní profilové analýzy bylo možné sledovat zm ny texturních vlastností finálního výrobku. Z následující tabulky I vyplývá, že p ídavek mleziva má nejv tší vliv na p ilnavost výrobku. Je možné pozorovat minimální rozdíly v tvrdosti. Ostatní parametry nejsou významn ovlivn ny. Zna né zm ny v textu e, hlavn v tvrdosti by však bylo možno o ekávat v p ípad, kdy by se sušené kolostrum vyskytovalo v mnohem v tších množstvích, jako nap íklad p i p ídavku až 30 % sušeného kolostra, kde byla pozorována hrudkovitost a p ílišná tvrdost 9. Tabulka I Sledované parametry p i texturní profilové analýze v r zných variantách jogurtu. Varianta výrobku Tvrdost Pružnost Soudržnost P ilnavost Houževnatost (N) (-) (-) (N.s) (-) Bez p ídavku 0,50 0,98 0,52-0,53 0,04 2 % mleziva 0,48 0,96 0,55-0,77 0,04 0,25 g l -1 enzymu 0,45 0,97 0,57-0,70 0,04 Enzym + mlezivo 0,54 0,97 0,59-0,76 0,04 Senzorická analýza Hodnotitelé ozna ili výrobek s enzymem za nejsladší, podobn byl hodnocen i výrobek s enzymem i mlezivem, jak bylo díky vysokému obsahu glukosy o ekávané. Jako nejkyselejší výrobek se ukázala být varianta s 2 % sušeného mleziva. V preferen ním testu nejlépe obstál výrobek s p idaným enzymem i mlezivem, další v po adí byl nejsladší výrobek s enzymem, s mlezivem, poslední základní varianta. Záv r Z hodnocení zm n koncentrace sacharid v pr b hu fermentace vyplynulo, že p ídavkem enzymu o koncentraci 0,25 g l -1 obsah laktosy klesne pod 1 %, výrobek by tedy potenciáln mohl být ozna en jako s nízkým obsahem laktosy. Finální koncentrace glukosy ve výrobcích s enzymem se pohybuje okolo 0,8 % a senzorické hodnocení potvrzuje jeho sladší chu. Kyselina mlé ná vzniklá aktivitou BMK se v jogurtech vyskytovala v nižších koncentracích, než je pro tento typ výrobku typické, ale žádný signifikantní vliv p ídavku enzymu i mleziva na produkci kyseliny potvrzen nebyl. Z detekce r stu BMK pomocí impedan ní metody se zjistilo, že p ídavek enzymu i mleziva ovlivnil r st smíšené kultury jen velmi nepatrn, ale spíše pozitivn. Texturní profilová analýza výrobk odhalila, že p ídavky enzymu a kolostra v pracovních koncentracích (0,25 g l -1 enzymu a 2 % mleziva) nemají významný efekt na texturu výrobku. Cílový výrobek s p idaným enzymem a kolostrem obstál nejlépe v preferen ním testu senzorické analýzy. Touto cestou je možná kombinace benefitu mleziva, sníženého obsahu laktosy a probiotik ve fermentovaném výrobku. Výhodou celého výrobku je, že všechny komponenty jsou v práškové form, a proto je možné použít atraktivní variantu v prášku, ze kterého si spot ebitel rozmícháním v mléce a fermentací vyrobí jogurt. Do budoucna je možnost variovat bakteriální kultury, i prebiotika, které zde konkrétn p edstavoval inulin. Pod kování Práce vznikla za finan ní podpory Ministerstva zem d lství (projekt QJ ) a za ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT (rozhodnutí. 21/2016) 63

64 Použitá literatura 1. Elfstrand L., Lindmark-Mansson H., Paulsson M., Nyberg L., Akesson B.: Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal 12, (2002). 2. Uruakpa F. O., Ismond M. A. H., Akobundu E. N. T.: Colostrum and its benefits: a review. Nutrition research 22, (2002). 3. Pocedi ová K.: Laktózová intolerance a syntéza prebiotik s využitím -galaktosidázy. Potraviná ská revue 6, (2011). 4. Vyhláška MZe. 54/2004 Sb. o potravinách ur ených pro zvláštní výživu a o zp sobu jejich použití. Sbírka zákon 2004, ástka 17 (2004). 5. Richmond M. L., Harte B. R., Gray J. I., Stine C. M.: Determination of Sugars in Yogurt and Microbiological Media by High Performance Liquid Chromatography During Processing and Subsequent Storage. Journal of Dairy Science 70, (1987). 6. urda L., Šviráková E.: Electrical Techniques: Lactics and Other Bacteria. Encyclopedia of Food Microbiology 1, (2014). 7. SN ISO 6658: Senzorická analýza Metodologie Všeobecné pokyny. NI, Praha (2009). 8. Plocková M., v knize: Technologie potravin (Kadlec P., ed.), díl II, kap. 4.6, VŠCHT, Praha (2002). 9. Aryana K. J., Albers E., Cueva O.: Colostrum fortified probiotic fat free yogurt. Milchwissenschaft 63, (2008). Kontaktní adresa: Ing. Simona Remišová; Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT, Technická 5, Praha 6; remisovs@vscht.cz 64

65 VYUŽITÍ VÍCE ETNÝCH EMULZÍ V MLÉ NÝCH VÝROBCÍCH Klojdová Iveta, Št tina Ji í Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Application of multiple emulsions in dairy products Summary: Emulsions are dispersed systems of two or more insoluble liquids. Systems with an emulsion as the dispersed phase are called multiple emulsions. Two main multiple emulsions are water in oil in water (w/o/w)-in this system emulsion water in oil is dispersed (in form of droplets) in the continuous water phase and oil in water in oil (o/w/o)-in this system emulsion oil in water is dispersed (in form of droplets) in the continuous oil phase. Multiple emulsions can be used for micro-encapsulation in pharmacy, in cosmetics but they can play significant role in the food industry. Multiple emulsion play an important role in the reduction of the food energy value primarily reduction of the fatt amount which is necessary for the production of the product. It is possible to mask unwanted flavour and improvement of the sensory properties of the product. Multiple emulsion can be used for the encapsulation of active dietary and bioactive compounds. Compounds which are soluble in water (minerals, vitamins, carotenoids) can be included into internal and/or external water phase, compounds which are soluble in oil phase (vitamins, n-3 unsaturated fatty acid, antioxidants) can be included into oil phase. This work is focused on the preparation of multiple emulsions w/o/w two-step emulsification. Efficiency of the preparation and stability of prepared multiple emulsion during storage were evaluated (on the basis of addition glucose into internal water phase and direct determination of glucose in external water phase). Influences of two factors during preparation- rpm of the stirrer during second-emulsification step and time of emulsification were evaluated too. Úvod Emulze jsou disperzní, n kolikafázové systémy, které jsou tvo eny alespo dv ma navzájem samovoln nemísitelnými kapalinami. Vnit ní fáze je rozptýlena ve form kapi ek ve vn jší spojité fázi. Velikost rozptýlených kapi ek je dána obvykle typem emulga ního procesu a pohybuje se v rozmezí od 0,1 μm do 100 μm. Emulze jsou termodynamicky nestabilní a mají tudíž tendenci minimalizovat fázové rozhraní (jako výsledek relativn vysokého povrchového nap tí). Tato skute nost vede k tomu, že dochází ke spojování kapi ek (1). Více etná emulze je vlastn emulze v emulzi. Dva hlavní typy více etných emulzí jsou definovány následovn : emulze voda v oleji ve vod (v/o/v), kde je emulze voda v oleji rozptýlena ve form kapi ek ve spojité vodné fázi a emulze olej ve vod v oleji (o/v/o), kde je pak emulze olej ve vod rozptýlena ve form kapi ek ve spojité fázi olejové. Více etné emulze mají v tší plochu fázového rozhraní a díky tomu jsou i více termodynamicky nestabilní než emulze jednoduché (1). Využití více etných emulzí Více etné emulze mohou být použity pro mikro-enkapsulaci ve farmacii (p ísun protirakovinných p ípravk, hormon, steroid atd.), dále pak v kosmetice (krémy s enkapsulovanými ú innými složkami) a dalších pr myslových odv tvích. Jejich vlastnosti je však možno s výhodou využít i pro aplikace v potraviná ském pr myslu. Nap íklad se uplat ují p i redukci energetické hodnoty potravin p edevším snížením obsahu tuku nezbytn nutného pro výrobní proces dané potraviny, maskování necht ných p íchutí a zlepšení senzorických vlastností výrobku (složka negativn ovliv ující senzorické vlastnosti nep ijde do kontaktu se sliznicí v ústech) (2). Dv ma hlavními d vody, pro se v nuje pozornost aplikaci více etných emulzí v potraviná ské oblasti, je produkce potravin s redukovaným obsahem tuku a enkapsulace citlivých látek, které mohou být následn lépe využity daným organismem. P i výrob potravin s redukovaným obsahem tuku se v sou asnosti využívají následující možnosti: substituenty tuku (nestravitelné tuky), náhražky tuku (mikro ástice bílkovin nebo sacharid ) a více etné emulze. V p ípad redukce obsahu tuku v potravinách se stále hledá co nejlepší zp sob, jak snížit obsah olejové fáze a nahradit ji ekvivalentní více etnou emulzí tak, aby se chu výrobku, kterou vnímá konzument, nezm nila (3). 65

66 V mlékárenské oblasti se uplat ují výrobky, ve kterých je více etnou emulzí nahrazen mlé ný tuk, což vede ke zlepšení nutri ní kvality výrobk snížením obsahu mlé ného tuku (4). Více etná emulze m že být nap íklad vhodná pro výrobu šlehaných mlé ných krém (5). Jak bylo již d íve zmín no, lze pomocí více etných emulzí enkapsulovat nutri n a zdravotn prosp šné látky v rámci výroby funk ních potravin, které jsou v sou asné dob velice populární. Zatímco ve vod rozpustné složky (minerály, n které vitamíny, karotenoidy atd.) mohou být za len ny do vnit ní a/nebo vn jší vodné fáze, v tuku rozpustné složky (n které vitamíny, n-3 nenasycené mastné kyseliny, antioxidanty atd.) mohou být v len ny do fáze olejové. Enkapsulace umožní zvýšení obsahu bioaktivních látek. Více etné emulze lze tudíž použít k mikroenkapsulaci r zných slou enin zahrnujících minerály, vitamíny, karotenoidy a nap íklad i probiotik (2). Lze enkapsulovat i železo, jehož nedostatek má zna ná ást populace (6). P íprava více etných emulzí typu v/o/v a vliv na jejich stabilitu Cílem je p ipravit více etnou emulzi, v níž olejová vrstva na povrchu vnit ních vodních kapek p edstavuje stabilní systém. Každé sebemenší porušení olejové vrstvy zna n snížuje objemový zlomek vnit ní vodné fáze a m že dojít ke snížení viskozity celého systému (7). V porovnání s jednoduchými emulzemi, které se skládají pouze ze dvou navzájem nemísitelných fází, je pot eba p i p íprav více etných emulzí v novat mnohem v tší pozornost p ípadné destabilizaci systému. K nestabilit více etné emulze v/o/v vedou následující 4 procesy: koalescence kapek vnit ní vodné fáze, koalescence kapek oleje, ztráta kapek vnit ní vodné fáze a splynutí obou vodných fází p es olejovou vrstvu. (8). Kapky vnit ní vodné fáze mohou nevratn uniknout do vn jší vodné fáze v pr b hu p ípravy více etné emulze, skladování i následném použití. Je tudíž pot eba v novat pozornost parametr m procesu p ípravy nap. smykovému nap tí, parametr m použitého materiálu nap. emulgátory a strukturálním parametr m nap. velikosti kapek (9). Emulgátory mohou zlepšit stérickou stabilitu vytvo ením tenkého n kolikavrstevného povlaku na povrchu kapek. Kvalitními emulgátory pro p ípravu více etných emulzí jsou sm si biopolymer (hydrokoloidy a bílkoviny). M ly by posloužit jak k zabrán ní uvol ování enkapsulovaných složek, tak i jako látky zlepšující stabilitu více etných emulzí (10). Metody p ípravy více etných emulzí typu v/o/v Více etné emulze lze p ipravit n kolika metodami, nejznám jší a nejstarší z nich je dvoustup ová emulgace, dále je možno využít membránovou emulgaci i nap íklad mikrokanálkovou emulgaci. Dvoustup ová emulgace Nej ast ji se více etné emulze typu v/o/v p ipravují metodou dvoustup ové emulgace, která p edstavuje dva po sob jdoucí kroky emulgace. Nejprve se p ipraví jednoduchá emulze typu v/o, jež se nazývá emulze vnit ní. Tato emulgace se provádí v tšinou za vysokého smykového namáhání, nap íklad za pomoci za ízení jako je vysokotlaký homogenizátor a rychlob žná míchadla typu rotor-stator. Cílem je vytvo ení malých kapek s úzkou distribucí. Druhý stupe emulgace pak spo ívá ve vytvo ení disperzní fáze vnit ní emulze v/o ve vn jší vodné fázi. Tento krok je p i výrob více etné emulze klí ovým. B hem n j m že být totiž ovlivn na jak distribuce velikosti kapek vnit ní vodné fáze, tak i množství vody enkapsulované v olejové fázi. Hlavním kritériem procesu je, aby co nejvíce vody z stalo enkapsulováno v oleji. Její množství ovlivní mimo jiné i funk ní vlastnosti více etné emulze. Proces p ípravy více etných emulzí by m l být tudíž veden tak, aby se co nejvíce zamezilo ztrát kapek vnit ní vodné fáze (9). To znamená, že se druhý krok emulgace musí provád t za nižšího smykového namáhání. ím je smykové namáhání b hem druhého kroku emulgace šetrn jší, tím mén kapek vnit ní fáze se poškodí. B žn je ale pot eba p istoupit i b hem tohoto kroku k vyššímu smykovému namáhání. Jinak nelze zmenšit velikost kapek a ší i distribuce jejich velikosti. Vn jší smykové namáhání zp sobuje zvýšení pohyblivosti vnit ních kapek, tím je zvýšen po et jejich srážek s vn jší vodnou fází, a tudíž i koalescence. Více 66

67 kapek vnit ní emulze se ocitne na novém fázovém rozhraní a riziko jejich splynutí s vn jší fází se tak zvýší. Lze íci, že množství kapek vnit ní emulze, které splyne s vn jší vodnou fází je p ímo závislé na smykovém namáhání. Velikost kapek a jejich zastoupení lze tudíž regulovat pouze aplikací vhodného smykového namáhání. To je hlavní d vod, pro je v tšina více etných emulzí polydisperzní systém (1). Jak bylo již d íve zmín no, b žn se i v druhém kroku emulgace využívá vyšší smykové namáhání. N které citlivé složky, jako jsou nap íklad bílkoviny i škroby, mohou proto ztrácet své funk ní vlastnosti. Proces pak vyžaduje i velkou spot ebu elektrické energie (11). První krok procesu p íprava emulze typu v/o se provádí s p idáním lipofilního emulgátoru. Druhý krok smíchání takto p ipravené emulze typu v/o v prvním kroku s vodní fází se pak provádí s p ídavkem hydrofilního emulgátoru (7). P íprava více etné emulze typu v/o/v pomocí dvoustup ové emulgace je znázorn na na Obr. 1. Tato technika je asto používána, protože je jednoduchá a snadno proveditelná (12). Obr. 1. P íprava více etné emulze typu v/o/v dvoustup ovou emulgací (1). První krok: emulgace za vysokého smykového namáhání s použitím lipofilního emulgátoru, vytvo ení emulze v/o. Druhý krok: emulgace za nižšího smykového namáhání s použitím hydrofilního emulgátoru, vytvo ení více etné emulze v/o/v. Experimentální ást Metoda dvoustup ové emulgace pro více etnou emulzi typu v/o/v byla vypracována b hem tohoto experimentu. Nejprve byla p ipravena jednoduchá (vnit ní) emulze v/o. Jako p edemulgace byla vždy provedena emulgace p i teplot 40 C za pomoci míchadla SILVERSON (L4RT, U.S.) p i 3500 rpm po dobu 5 min. Poté následovala jednostup ová homogenizace s použitím homogenizátoru PandaPLUS 2000 (GEA Niro Soavi S.p.A., Itálie) i homogenizátoru NS2001H (GEA Niro Soavi S.p.A., Itálie) p i tlaku 20 MPa. Poté byla p ipravena za pomoci jednoduché emulze v/o (viz výše) více etná emulze v/o/v. Emulgace byla provedena p i teplot 40 C za pomoci míchadla Silent Crusher M (Heidolph, N mecko) p i 10000, i rpm po dobu 5 i 10 min. Jako vnit ní i vn jší vodná fáze bylo použito obnovené mléko, jako olejová fáze byl použit epkový olej s p ídavkem 5% hm. emulgátoru PGPR (polyglycerolpolyricinoleát). Rovn ž byla vypracována metoda pro p ímé stanovení uniklého množství vnit ní vodné fáze do vn jší vodné fáze na základ p ídavku glukosy do vnit ní vodné fáze. Obsah glukosy ve vn jší vodné fázi byl m en pomocí p ístroje RQ flex 10 plus (Merck, N mecko). Principem stanovení je enzymatická reakce. Ú innost p ípravy více etných emulzí v/o/v byla sledována ihned po p íprav a následn byla pak v pravidelných intervalech v pr b hu skladování p i 4 C, a to po 1, 2 a 4 týdnech hodnocena jejich stabilita. 67

68 Zvoleným faktorem pro porovnání stability byl po et otá ek (rpm) míchadla (Silent Crusher M, Heidolph, N mecko) p i p íprav více etné emulze v/o/v 10% z jednoduché (vnit ní) emulze v/o 40%, jehož vliv byl hodnocen p i dvou zvolených dobách emulgace. Výsledky a diskuse Na Obr. 2. je zaznamenán únik vnit ní vodné fáze do vn jší vodné fáze, který byl m en p ístrojem RQ flex 10 plus (Merck, N mecko) (viz výše). Rovn ž byla sledována velikost ástic více etné emulze v/o/v 10% (Obr. 3.). M ení bylo provedeno za pomoci p ístroje Mastersizer 2000 s disperga ní jednotkou Hydro 2000G (Malvern, Velká Británie), který analyzuje velikost ástic laserovou difrakcí. Vždy byla provedena 3 opakovaná m ení. Jako kritérium vybrané pro hodnocení velikosti ástic byla vybrána velikost ástic vztažená na objem (D [4, 3]). A B Obr. 2. Závislost úniku vnit ní vodné fáze (%) na dob skladování. Emulze byly p ipraveny za r zných otá ek míchadla p i 2. stupni emulgace po dobu: A) 5 min, B) 10 min, vnit ní vodná fáze: obnovené mléko s 1% hm. glukosy, olejová fáze s 5% hm. PGPR, vn jší vodná fáze: obnovené mléko, vnit ní emulze homogenizována p i 20 MPa. A B Obr. 3. Vliv doby skladování na velikost ástic více etné emulze v/o/v 10%. Emulze byly p ipraveny za r zných otá ek míchadla p i 2. stupni emulgace po dobu: A) 5 min, B) 10 min, vnit ní vodná fáze: obnovené mléko s 1% hm. glukosy, olejová fáze s 5% hm. PGPR, vn jší vodná fáze: obnovené mléko, vnit ní emulze homogenizována p i 20 MPa. Z výsledk m ení je patrné, že v obou p ípadech (p i dob emulgace 5 i 10 min) m l vyšší po et otá ek míchadla (rpm) za následek v tší množství uniklé vnit ní vodné fáze do vn jší vodné fáze více etné emulze v/o/v 10%. Avšak vliv doby emulgace na míru úniku vnit ní vodné fáze nebyl prokázán (ANOVA, = 0,05). Z výše uvedených graf znázor ujících velikost ástic je patrné, že vyšší otá ky míchadla (rpm) bez ohledu na dobu emulgace umožnily p ipravit emulzi s ásticemi o menší velikosti, což uvedli b hem své studie i Schuch a kol., 2014 (13). 68

69 Doba skladování nem la vliv na velikost ástic žádné z t chto více etných emulzí (ANOVA, = 0,05). Vliv doby emulgace na velikost ástic více etných emulzí v/o/v 10% byl zaznamenán po 2 a 4 týdnech skladování (ANOVA, = 0,05). Záv r B hem tohoto experimentu byly p ipraveny 2 sady více etných emulzí v/o/v 10% lišící se dobou emulgace b hem kroku p ípravy emulze v/o/v. Sledovaným faktorem byl po et otá ek míchadla (rpm) b hem tohoto kroku. Pro další p ípravy emulzí byl na základ výše provedených m ení navržen po et otá ek míchadla rpm, a to po dobu 5 min. Pod kování: Práce vznikla za finan ní podpory Ministerstva zem d lství (projekt QJ ). Použitá literatura: 1. van der Graaf S., Schroen C.G.P.H., Boom R.M.: Preparation of double emulsions by membrane emulsification a review. Journal of membrane science 251, 7-15 (2005). 2. Cofrades S., Antoniou I., Solas M.T., Herrero A.M., Jiménez-Colmenero F.: Preparation and impal of multiple (water-in-oil-in-water) emulsions in meat systems. Food Chemistry 141, (2013). 3. Dickinson E.: Double Emulsions Stabilized by Food Biopolymers. Food Biophysics 6, 1-11 (2011). 4. Lobato-Calleros C., Recillas-Mota M.T., Espinosa-Solares T., Alvarez-Reminez J., Vernon-Carter E.J.: Microstructural and rheological properties of low-fat stirred yoghurts made with skim milk and multiple emulsions. Journal of texture studies 4O, (2009). 5. Márquez A.L., Wagner J.: Rheology of double (W/O/W) emulsions prepared with soybean milk and fortified with kalcium. Journal of texture studies 41, (2010). 6. Alvarado R.J., Beristain C.I., Medina-Torres L., Román-Guerrero A., Vernon-Carter E.J.: Ferrous bisglycinate content and release in W 1 /O/W 2 multiple emulsions stabilized by protein-polysaccharide complexes. Food Hydrocolloids 23, (2009). 7. Kita Y., Matsumoto S., Yonezawa D.: Viscometric Method for Estimating the Stability of W/O/W-Type Multiple-Phase Emulsions. Journal of Colloid and Interface Science 62, (1977). 8. Schmidts T., Dobler D., Nissing C., Runkel F.: Influence of hydrophilic surfactants on the properties of multiple W/O/W emulsions. Journal of Colloid and Interface Science 338, (2009). 9. Schuch A., Deiters P., Henne J., Köhler K., Schuchmann H.P.: Production of W/O/W (water-in-oil-in-water) multiple emulsions: droplet breakup and release of water. Journal of Colloid and Interface Science 402, (2013). 10. Benichou A., Aserin A., Garti N.: Double emulsions stabilized with hybrids of natural polymers for entrapment and slow release of active matters. Advances in Colloid and Interface Science 108, (2004). 11. Charcosset C., Limayem I., Fessi H.: The membrane emulsification process a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 79, (2004). 12. Nisisako T.: Microstructured Devices for Preparing Controlled Multiple Emulsions. Chemical Engineering & Technology 31, (2008). 13. Schuch A., Tonay A.N., Köhler K., Schuchmann H.P.: Influence of the second emulsification step during production of w/o/w multiple emulsions: comparison of different methods to determine encapsulation efficiency in w/o/w emulsions. The Canadian Journal of Chemical Engineering 92, (2014). Kontaktní adresa: Klojdová Iveta, Ústav mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha, Technická 5, , Praha 6 klojdovi@vscht.cz 69

70 70

71 MIKROBIOLOGICKÉ ASPEKTY ELEKTROMEMBRÁNOVÝCH PROCES E er Ji í 1, Merkel Arthur 1, Tichovský Petr 2 1 MemBrain s.r.o., 2 Moravia Lacto a.s. Microbiological Aspects of Electromembrane Processes Summary: Whey contains both technological microorganisms from a previous production of main dairy products (cottage cheese, cheese) as well as technologically harmful or terms of hygiene undesirable microorganisms that do the raw materials come subsequent contamination or microorganisms is propagated during prolonged storage under unfavorable conditions or during transport and handling commodity. Electrodialysis proceeds in most cases at 15 ± 2 C, which leads to the development of some microorganisms desalinated feedstock. These microorganisms are then propagated in the storage tank and settle as fouling on the membranes of electrodialysis, the distributor and in other parts of the device. Therefore it is very important to strictly observe technological procedures and process raw as fresh as possible and preferably after pasteurization. Cleaning of electrodialysis device also takes place at relatively low temperatures (15-25 C). Therefore it is necessary to shorten the time after cleaning and before the next production to a minimum. Phase samples of whey from selected supply points were aseptically collected in sterile sample containers. By determination of the total number of microorganisms of Enterobacteriaceae, coliform microorganisms and in the case of flushing water also molds and yeasts. The number of microorganisms of the family Enterobacteriaceae and coliform microorganisms at used operating temperatures does not increases, the total number of microorganisms during the process of demineralization increases with time. Úvod Syrovátka obsahuje jednak technologické mikroorganizmy pocházející z p edchozí výroby hlavních mlékárenských produkt (tvarohy, sýry) a jednak technologicky škodlivé nebo z hygienického hlediska nežádoucí mikroorganizmy, které se do suroviny dostanou následnou kontaminací nebo se pomnoží p i dlouhodobém skladování za nevhodných podmínek nebo p i doprav a manipulaci se surovinou. Mikroorganizmy se pak množí v zásobním tanku a usazují se ve form foulingu na elektrodialyza ních membránách, rozd lova ích i v dalších ástech za ízení. Teorie Rychlost množení mikroorganizm v syrovátce b hem elektrodialýzy závisí na teplot (Obr. 1), na po áte ním množství mikroorganizm v surovin (Obr. 2), na délce procesu demineralizace syrovátky (1), na po áte ním mikrobiologickém zne išt ní elektrodialyza ního za ízení (mikroorganizmy, které p ežily chemické išt ní za ízení) a na dob, která uplynula od konce chemického išt ní do zahájení vlastního procesu elektrodialýzy. Elektrodialýza probíhá ve v tšin p ípad p i teplot 15 ± 2 C, kdy dochází k ur itému rozvoji mikroorganizm v odsolované surovin. K menšímu pomnožení mikroorganizm by došlo, kdyby proces elektrodialýzy probíhal p i nižších teplotách (< 10 C), to by ale vedlo k výraznému snížení výkonu elektrodialyza ního za ízení. P i vyšších teplotách (> 25 C), kdy se naopak výkon za ízení zvyšuje, výrazn nar stá rychlost množení mikroorganizm. Bezpe nými by byly teploty nad 50 C, to však v sou asné dob naráží na technické možnosti elektrodialyza ních modul. Rychlost množení mikroorganizm záleží i na velikosti zpracovávané šarže, p ípadn na stupni odsolení. S prodlužováním procesu (zvyšováním velikosti šarže nebo stupn odsolení) tato rychlost roste. 71

72 Obr. 1. Závislost celkového po tu mikroorganizm v ase p i r zných teplotách Obr. 2. Závislost celkového po tu mikroorganizm v ase na po áte ní kontaminaci p i 15 C Experimentální ást Byly provedeny celkem t i testy na pr myslových elektrodialyza ních za ízeních v mlékárn Moravia Lacto a.s. Jihlava, z toho dva na za ízení EWDU P15 2x EDR-II/250 s moduly provozovanými již t i roky a jeden na za ízení EWDU 6x EDR-II/250, ve kterém byly osazeny jen dva zcela nové moduly. Jako surovina byla použita sladká syrovátka z výroby sýr p edem zahušt ná odparem na sušinu 17 %. Vzorky syrovátky v pr b hu procesu elektrodialýzy byly asepticky odebírány do sterilních vzorkovnic z p edem vytipovaných odb rných míst (viz Tabulka I a Tabulka II) a bylo provedeno stanovení celkového po tu mikroorganizm, po tu bakterií eledi Enterobacteriaceae, koliformních mikroorganizm, v p ípad výplachových vod také plísní a kvasinek. 72

73 Tabulka I Odb rná místa (vzorky) p i odsolování syrovátky na EWDU P15 2x EDR-II/250 Odb rné místo (vzorek) íslo Název 1 Syrovátka po p e erpání do T13 (i do T12) 2 Výplachová voda po CIP P15 z nádrže na koncentrát 3 Syrovátka na vstupu do ED t sn po spušt ní ED erpání z T13 4 Syrovátka na výstupu z ED 15 minut po spušt ní ED 5 Syrovátka na vstupu do ED v polovin procesu 6 Syrovátka na výstupu z ED v polovin procesu 7 Syrovátka na vstupu do ED t sn p ed p epnutím na T12 8 Syrovátka na výstupu z ED t sn p ed p epnutím na T12 9 Syrovátka na vstupu do ED t sn po p epnutí na T12 10 Syrovátka na výstupu z ED po reverzaci 11 Syrovátka na vstupu do ED t sn p ed ukon ením ED 12 Syrovátka na výstupu z ED t sn p ed ukon ením ED 13 Syrovátka v T13 po promíchání a vychlazení na 10 C 14 Syrovátka v T12 po promíchání 15 Výplachová voda p ed CIP P15 16 Výplachová voda po CIP P15 Tabulka II Odb rná místa (vzorky) p i odsolování syrovátky na EWDU 6x EDR-II/250 Odb rné místo (vzorek) íslo Název 1 Výplachová voda po CIP EWDU - výstup z modulu 2 Syrovátka v T3.1 3 Syrovátka na vstupu do modulu t sn po spušt ní ED 4 Syrovátka na výstupu z modulu 15 minut po spušt ní ED 5 Syrovátka na vstupu do modulu 6 Syrovátka na výstupu z modulu 7 Syrovátka na vstupu do modulu p ed reverzací 8 Syrovátka v tanku T3.1 p ed reverzací 9 Syrovátka na výstupu z modulu po reverzaci 10 Syrovátka na vstupu do modulu t sn p ed ukon ením ED 11 Syrovátka na výstupu z modulu t sn p ed ukon ením ED 12 Syrovátka v T3.1 po neutralizaci 13 Výplachová voda p ed CIP EWDU - výstup z modulu První test na za ízení EWDU P15 2x EDR-II/250 Do p edem vy išt ných tank T12 a T13 bylo napušt no po 4000 litrech sladké syrovátky (z výroby sýr ) zahušt né odparem s obsahem sušiny 17 %. P ed zahájením testu bylo elektrodialyza ní za ízení standardním zp sobem vy išt no, ale proces odsolování byl zahájen až po n kolika hodinách, p i emž v za ízení byla po celou dobu voda p i b žné teplot. Nejd íve byla zpracovávána syrovátka z tanku T13, p i emž syrovátka nebyla chlazena. Její teplota b hem procesu demineralizace stoupla z po áte ních 10,7 C na 25,0 C. Po dosažení požadovaného odsolení (vodivost diluát na vstupu < 0,8 ms/cm) se za ala zpracovávat syrovátka z tanku T12 a byla provedena reverzace nap tí na elektrodách. Nyní byla teplota syrovátky po celou dobu procesu udržována na 15 C. Po skon ení provozu bylo provedeno standardní išt ní za ízení. 73

74 Druhý test na za ízení EWDU P15 2x EDR-II/250 Do p edem vy išt ných tank T12 a T13 bylo napušt no po 6000 litrech sladké syrovátky (z výroby sýr ) zahušt né odparem s obsahem sušiny 17 %. P ed zahájením testu bylo elektrodialyza ní za ízení standardním zp sobem vy išt no a proces odsolování byl zahájen okamžit po skon ení išt ní a odebrání vzorku výplachové vody. Nejd íve byla zpracovávána syrovátka z tanku T13. Po dosažení požadovaného odsolení (vodivost diluát na vstupu < 0,95 ms/cm) se za ala zpracovávat syrovátka z tanku T12 a byla provedena reverzace nap tí na elektrodách. B hem reverzace došlo ke snížení tlaku ovládacího vzduchu, takže nebylo možné pokra ovat v procesu demineralizace. Do dosažení požadovaného tlaku vzduchu probíhala cirkulace všech médií za ízením (po dobu 55 minut). Teplota syrovátky po celou dobu procesu udržována na 15 C. Po skon ení provozu bylo provedeno standardní išt ní za ízení. Test na za ízení EWDU 6x EDR-II/250 s novými moduly Do p edem vy išt ného tanku T3.1 bylo napušt no 9000 litr sladké syrovátky (z výroby sýr ) zahušt né odparem s obsahem sušiny 17 %. Teplota b hem procesu demineralizace byla udržována na 15,0 C. V polovin procesu byla provedena reverzace nap tí na elektrodách obou svazk. Po dosažení požadovaného odsolení (vodivost diluát na vstupu < 0,65 ms/cm) byl provoz ukon en a provedena neutralizace produktu 50% roztokem NaOH. Na záv r bylo provedeno standardní išt ní za ízení. Výsledky a diskuze P ehled výsledk z test na elektrodialyza ním za ízení EWDU P15 2x EDR-II/250 je uveden v tabulkách Tabulka III a Tabulka IV. Po et mikroorganizm eledi Eneterobacteriaceae a koliformních mikroorganizm p i použitých provozních teplotách nenar stá, ale celkový po et mikroorganizm se v pr b hu procesu demineralizace s asem zvyšuje. P erušení provozu demineralizace v p ípad druhého testu se projevilo nár stem celkového po tu mikroorganizm. Množství mikroorganizm je výrazn ovlivn no prodlevou mezi koncem chemického išt ní a po átkem procesu demineralizace syrovátky, bezprost edn po išt ní je ve výplachové vod minimální po et mikroorganizm. Tabulka III Výsledky prvního testu na EWDU P15 2x EDR-II/250 íslo vzorku as odb ru (min) CPM 5. ed ní Enterobacteriaceae 5. ed ní 74 Koliformní mikroorg. 5. ed ní Kvasinky / plísn 1. ed ní < < / < < < < < < < < < < < < < < < / < < < < / <10

75 Tabulka IV Výsledky druhého testu na EWDU P15 2x EDR-II/250 íslo vzorku as odb ru (min) CPM 3. ed ní 75 Koliformní mikroorg. 3. ed ní Kvasinky / plísn 1. ed ní <1000 < / <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < <1000 < / / 0 P ehled výsledk z testu na elektrodialyza ním za ízení EWDU 6x EDR-II/250 osazeném pouze dv ma novými moduly je uveden v Tabulka V. Po et mikroorganizm eledi Eneterobacteriaceae a koliformních mikroorganizm p i použitých provozních teplotách nenar stá. Celkový po et mikroorganizm z ejm vzhledem k tomu, že se jednalo o zcela nové moduly, se v pr b hu procesu demineralizace také nezvyšoval. Tabulka V Výsledky testu na EWDU 6x EDR-II/250 osazeném pouze dv ma novými moduly íslo vzorku as odb ru (min) CPM 4. ed ní Enterobacteriaceae 3. ed ní Enterobacteriaceae 4. ed ní Koliformní mikroorg. 4. ed ní Kvasinky / plísn 1. ed ní 1 - <100 (2 ) <100 (2 ) <100 (2.) <10 / < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < <100 (2 ) <100 (2 ) <10 / <10 Výsledek mikrobiologického testu s novými moduly je samoz ejm lepší než výsledky test na za ízení se staršími moduly. Velmi závisí na asovém intervalu mezi ukon ením CIP a za átkem další demineralizace syrovátky, protože za ízení je v této dob zavodn né a p i b žné teplot m že dojít k rozvoji

76 mikroorganizm, které p ežily chemické išt ní (po áte ní kontaminace). B hem procesu odsolování syrovátky p i b žné provozní teplot 15 C nedochází k nár stu po tu mikroorganizm eledi Eneterobacteriaceae a koliformních mikroorganizm. Nár st celkového po tu mikroorganizm významn ovliv uje jejich po áte ní po et ve zpracovávané surovin, proto je nutné p ísn dodržovat technologickou káze p i výrob, zpracování, skladování a doprav syrovátky. Nejlepších výsledk by bylo dosaženo v p ípad pasterace syrovátky p ed jejím odsolováním a také pasterace odsoleného produktu. Pod kování: Práce byla ešena za finan ní podpory Ministerstva zem d lství R v rámci projektu Nové technologické postupy s využitím membránových proces poskytující nové potraviná ské produkty se zlepšenými nutri ními a uživatelskými vlastnostmi, program KUS. QJ Použitá literatura: 1.,., a další.. : -, Kontaktní adresa: MemBrain s.r.o., Pod Vinicí 87, Stráž pod Ralskem 76

77 APLIKÁCIA NOVEJ METÓDY PRE KONTROLU MIKROBIÁLNEJ KVALITY POTRAVÍN ZALOŽENEJ NA DETEKCII SPOTREBY KYSLÍKA Lehotová Veronika a, Petruláková Monika a, Karolyi Lenka b, Valík ubomír a a Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Ústav potravinárstva a výživy Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave b Biomedica Slovensko Application of a new method to control microbial quality of foods based on the detection of oxygen consumption Summary: To obtain the results of microbiological cultivation methods, e.g. total viable counts in food matrices for the shortest time is appreciated for many reasons in industrial practice. The GreenLight equipment based on oxygen consumption of the present microbial population during growth enables determining number of microorganisms within less than 24 hours, depending on the microbial load. The aim of this work was to study the responses of microorganisms with different demands on oxygen consumption in this system. The pure cultures of microorganisms (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus rhamnosus GG, Bacillus cereus) were used in the raw milk and sour milk products). The evaluation of the results and calibration of the method were based on regression analysis between times to reach threshold measured by GreenLight system and initial bacterial load estimated by the standard Plate Count method. Coefficients of determination (R 2 ) were found in the range of ,00 for pure cultures of bacteria in GTYE broth. Our experiences with the GreenLight equipment showed that estimation of high microbial numbers in food samples is possible within 4 h (or one shift production). Úvod: Primárna zodpovednos za hygienickú bezchybnos a zdravotnú neškodnos potravín bola legislatívne vždy zakotvená a výrobcom akceptovaná. Kompromisné prístupy, prípadne nedostatky pri uplat ovaní zásad správnej výrobnej/hygienickej praxe majú priamy dosah na výskyt mikroorganizmov v danej požívatine. Práve z tohto h adiska musíme ma na as k dispozícii informácie o tom, i ich výskyt je z h adiska mikrobiologickej kvality a dodržania doby spotreby potravín akceptovate ný alebo nie. Pre hodnotenie a vývoj mikrobiologickej kvality potravín v priebehu doby spotreby sú rozhodujúce po ty životaschopných, teda kultiva ne stanovených mikroorganizmov. Významným kvalitatívnym ukazovate om, ktorý sa sleduje v potravinárskych výrobách je celkový po et mikroorganizmov (CPM) 1. Pod a STN EN ISO sa inkubácia Petriho misiek s inokulovaným agarizovaným médiom GTK uskuto uje pri teplote 30 C po dobu 72 hodín pri aeróbnych podmienkach 2. Získa výsledok CPM o najrýchlejšie a využi ho v rozhodovacom procese je nevyhnutné, zvláš pri kontrole mikrobiologickej kvality surovín, hodnotení ich zá aže pre procesy ich opracovania a spracovania, sledovaní ú innosti procesov dekontaminácie zariadení a plôch prichádzajúcich do styku s potravinami, pri mikrobiologických analýzach medziproduktov ako aj finálnych potravín pred expedíciou ako aj v iných prípadoch 1,3. asová náro nos klasických kultiva ných metód na jednej strane a potreba urýchli as detekcie mikroorganizmov v potravinárskej praxi neustále pôsobili ako hnacie sily mnohých rýchlych, zvä ša nepriamych metód stanovenia po tu mikroorganizmov. V tejto práci máme príležitos predstavi výsledky a popísa skúsenosti so zariadením GreenLight (Mocon Inc., Minneapolis, MN, USA), ktoré je založené na detekcii metabolickej aktivity buniek prítomných v skúšobnej vzorke, ktoré sú schopné rozmnožova sa. Metóda je teda ve mi blízka ku kultiva nému stanoveniu, vo i ktorému sa aj kalibruje. Zariadenie GreenLight kontinuálne deteguje spotrebu kyslíka po as inkubácie inokula skúšobnej vzorky v tekutom kultiva nom médiu (vhodnom pre stanovenie tej ktorej skupiny mikroorganizmov). Výstupom monitorovania rozmnožujúcich sa mikroorganizmov v inkubovanom bujóne so vzorkou je jednak samotný priebeh spotreby kyslíka v závislosti od asu pripomínajúci sigmoidálnu rastovú iaru a predovšetkým konkrétny as, ktorý daná populácia mikroorganizmov 77

78 potrebovala na dosiahnutie tzv. prahovej/hrani nej hodnoty spotreby kyslíka 3. Princíp stanovenia vychádza z predpokladu, že ím viac je v potravine mikroorganizmov, tým rýchlejšie sa spotrebuje kyslík z média a tým kratší je as stanovenia CPM vo vzorke. Z opísaného princípu vyplýva, že táto metóda môže by aplikovate ná pre vä šinu potravín obsahujúcich prevažne aeróbnu a fakultatívne anaeróbnu populáciu mikroorganizmov 4. alšími benefitmi sprevádzajúcimi zavedenie tejto a podobných metód je zníženie prácnosti, zvýšenie produktivity práce, automatizované monitorovanie a uchovávanie záznamov stanovenia prostredníctvom detek ného softvéru, široký rozsah stanovenia po tu mikroorganizmov ako aj postupné rozširovanie metodík pre stanovovanie ostatných indikátorových skupín mikroorganizmov 5. Cie om tejto práce bolo získa skúsenosti pri overovaní metodík stanovenia po tu mikroorganizmov vo viacerých potravinových matriciach, pri kalibrácii zariadenia a tiež spozna odozvy detegované zariadením GreenLight v prípadoch mikroorganizmov s rozdielnym nárokom na kyslík. Materiál a metódy: Použité mikroorganizmy a potravinové matrice Ako zástupcu aeróbnych baktérií sme použili zbierkovú kultúru Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 (ATCC 27853). Fakultatívne anaeróbne mikroorganizmy reprezentovali Escherichia coli BR izolovaná z bryndze (FCHPT STU, Bratislava) a zástupca baktérií mlie neho kysnutia Lactobacillus rhamnosus GG poskytnutého Dr. Salminenom (University of Turku, Turku, Fínsko) a sprostredkovaného Dr. Laukovou (Ústav fyziológie hospodárskych zvierat SAV, SR). Spórotvorné baktérie reprezentoval Bacillus cereus CCM 2010 (ATCC 14579), kvasinky Candida tropicalis (CCY ) a Geotrichum candidum, izolát G (FCHPT STU, Bratislava). Na analýzy sa použili nasledovné potravinové komodity: UHT mlieko (1,5 %, Rajo a.s., Bratislava, Slovenská republika), ktoré bolo zámerne inokulované surovým mliekom, alej kyslomlie ne výrobky a.s. OLMA ( R): pochú ková kysnutá smotana zámerne inokulovaná Geotrichum candidum a ovocný jogurt inokulovaný kvasinkou Candida tropicalis. Zariadenie GreenLight Metóda stanovenia po tu mikroorganizmov je založená na fluorescen nej detekcii spotreby kyslíka populáciou mikroorganizmov vyskytujúcich sa v danej vzorke. Jedná sa o mechanizmus nazývaný ako zhášanie fluorescencie, kedy dochádza ku skráteniu doby života excitovaného stavu molekuly fluoroforu (optický senzor kyslíka na dne vialky) po kontakte so zhášadlom (kyslík prítomný v médiu, vo vialke). Následne na základe Stern-Volmerovho vz ahu sa meria táto doba života excitovaného stavu (resp. doba dosvitu), ktorá ur uje množstvo kyslíka v médiu 1. Metodika stanovenia Pri stanovení po tu mikroorganizmov sa využíva desiatkové riedenie skúšobnej vzorky. Pre overenie a zistenie rozsahu stanovenia (KTJ/ml) sme využili isté kultúry horeuvedených mikroorganizmov s po iato nými obsahmi od KTJ.ml -1. Ako médium pre stanovenie po tu baktérií sme použili GTK bujón a v prípade kvasiniek selektívny bujón s glukózou, kvasni ným extraktom, enzýmovým hydrolyzátom kazeínu a chloramfenikolom (0,01 g/1000 ml). Pripravené riedenia vzoriek sa pipetovali do špeciálnych vialiek s fluorescen ným inidlom GreenLight APCheck a inkubovali sa pri teplote 30 C. Inkubácia trvala do dosiahnutia prahovej hodnoty spotreby kyslíka. Tento as potrebný pre dosiahnutie prahovej hodnoty je nepriamo úmerný po iato nému po tu mikroorganizmov. Získané asy dosiahnutia prahovej hodnoty spotreby kyslíka (angl. time to reach treshold) sa vyhodnotili vo vz ahu s po tami mikroorganizmov stanovených kultiva ne 2. Výsledky sa podrobili lineárnej regresii (Excel, Microsoft, USA). 78

79 Výsledky a diskusia: Jednotlivé odozvy populácií mikroorganizmov zaznamenané zariadením GreenLight boli vyhodnotené ako závislosti asu prekro enia prahovej hodnoty spotreby kyslíka od po tov mikroorganizmov stanovených pod a normy STN EN ISO Vyššie po ty mikroorganizmov prirodzene dosahovali kratšie asy potrebné na prekro enie prahovej hodnoty. Pri hodnotení závislosti horeuvedených závislostí v sledovaných prípadoch mikroorganizmov sme sa zamerali na hodnoty smerníc a koeficientov determinácie R 2. Hodnoty smerníc lineárnych závislostí medzi asom potrebným na dosiahnutie prahovej hodnoty a kultiva ne stanovenými po tami mikroorganizmov nás zaujímali predovšetkým z poh adu rozlíšite nosti baktérií s rozdielnymi nárokmi na prítomnos kyslíka. Predpokladali sme, že odozvy takýchto mikroorganizmov sa budú líši práve rozdielnou strmos ou týchto závislostí, o sa napokon aj na obr. 1 prakticky potvrdilo. Koeficient determinácie R 2 je dôležitý pre zhodnotenie stup a korelácie jednotlivých premenných. Súhrnne pre všetky mikroorganizmy sa pohyboval v rozmedzí od 0,95 0,99, o znamenalo, že % variability asov prekro enia prahovej hodnoty sa dá vysvetli lineárnym vz ahom s po tom mikroorganizmov, resp. že v danej závislosti bol dosiahnutý vysoký stupe tesnosti medzi závislou a nezávislou premennou (log N). Obr. 1. Závislos asu potrebného pre dosiahnutie prahovej hodnoty od po tu mikroorganizmov stanovených kultiva ne pod a normy STN EN ISO 4833:1 Hodnoty smerníc uvedených na obr. 1 nám takmer vo všetkých prípadoch potvrdili trend, že ím bol mikroorganizmus, aspo na základe vlastností bežne uvedených v knižných publikáciách 6, aeróbnejší, tým bola smernica zápornejšia (jej absolútna hodnota vyššia) a sklon priamky strmší. Výnimkou sa stal Lactobacillus rhamnosus GG, ktorého smernica bola zo všetkých analyzovaných baktérií najzápornejšia b = -3,547. Napriek tomu, že tento mikroorganizmus je fakultatívne anaeróbny, odlišoval sa od ostatných baktérií schopnos ou fermentácie glukózy na kyselinu mlie nu po as rastu. V porovnaní s iným fakultatívne anaeróbnym mikroorganizmom, napríklad Bacillus cereus boli taktiež asy odoziev pri rôznych po toch Lactobacillus rhamnosus GG takmer o 48,7 % asu dlhšie. Domnievame sa, že práve vplyv prítomnosti kyseliny mohol ma za následok zníženie intenzity fluorescencie, a tým dlhšie asy merania. Do úvahy tiež prichádza d žka lag fázy množiacej sa populácie a s tým súvisiace naštartovanie metabolizmu, zvláš pri nízkych 79

80 po iato ných po toch nutri ne náro nejšieho laktobacila. V kone nom dôsledku však koeficienty determinácie R 2 vypovedajú o dosiahnutí významných korelácií medzi premennými. Kvasinky sa z h adiska využitia vzdušného kyslíka pre svoj rast vyzna ujú zna nou variabilitou, pri om vláknité huby prítomnos kyslíka vä šinou vyžadujú. Vo všeobecnosti sa radia ale k pomalšie rastúcim mikroorganizmom. Na obr. 2. sú uvedené závislosti asu dosiahnutia odozvy signálu na spotrebu kyslíka od kultiva ne stanovených po tov Geotrichum candidum a Candida tropicalis. Pri analýze týchto dvoch kvasiniek sme ako substrát pre rast využili zakysanú smotanu a ovocný jogurt, ktoré sú aj potenciálnymi potravinovými matricami pre kontamináciu danými kvasinkami. Obr. 2. Závislosti asu dosiahnutia prahovej hodnoty kvasiniek v kyslomlie nych výrobkoch od ich po tov stanovených kultiva ne pod a normy STN EN ISO 4833:1 V porovnaní s koeficientmi determinácie získanými pri korelácií baktérií, v tomto prípade bol koeficient determinácie nižší R 2 G.candidum = 0,926 a R 2 C.tropicalis = 0,817 a asy dosiahnutia prahovej hodnoty boli taktiež dlhšie. Pri tomto pokuse bolo potrebné klás dôraz na precíznu homogenizáciu danej inokulovanej potravinovej matrice. Nesprávna homogenizácia mohla by jedným z faktorov, ktorý iasto ne ovplyvnil variabilitu medzi premennými. Tieto mikroorganizmy patriace ku asporogénnym kvasinkám môžu tvori výrazné mycélium (Geotrichum candidum) a pseudomycélium (Candida tropicalis) 6. Aj tvorba takýchto štruktúr mala pravdepodobne vplyv na zníženie koeficientu determinácie a skreslenie výsledkov. Sú as ou overovania využitia tejto metodiky bola aj detekcia nesterility mlie nych UHT výrobkov. Ke že sa pri jej kontrole najskôr uskuto uje inkubácia odobratých vzoriek a potom sa stanovujú resuscitované a pomnožené baktérie a systém GreenLight už pri detekcii mikroorganizmov inkuba ný stupe zahrnuje, mohlo by sa jeho aplikáciou dosiahnu skrátenie inkuba nej periódy pred samotnou detekciou mikrobiálnych kontaminantov v UHT výrobkoch. Pre potenciálnu aplikáciu v tejto oblasti mikrobiologickej kontroly kvality sme použili UHT mlieko, ktoré sme zámerne na rôzne po iato né po ty inokulovali mikroflórou surového mlieka. V tomto prípade sme v závislosti rovnakého typu ako vyššie zistili R 2 = 0,949. Pozitívnou skuto nos ou bolo, že pri aplikácii metódy v zahrani ných mliekar ach/laboratóriách (n = 2) ich výsledky nadväzovali na naše a so zvyšovaním po tu údajov sa závislosti pre surové a trvanlivé mlieko skvalit ovali, príslušný koeficient determinácie sa zvyšoval. V práci sme alej pokra ovali napríklad aj pri analýze surového kuracieho mäsa (rôznych astí), kedy sme dosiahli koeficienty determinácie v rozmedzí 0,76 0,84. Na menej významnej korelácii v tomto prípade sa mohli podie a : podstatne zložitejšia matrica, nehomogénna distribúcia mikroorganizmov v skúšobnej vzorke ako aj užší interval kultiva ne stanovených po tov mikroorganizmov (skúšobné vzorky sme zámerne nenao kovali). Z týchto experimentov vlastne vyplynulo, že vä šou variabilitou bolo s najvä šou pravdepodobnos ou za ažené kultiva né stanovenie prítomných mikroorganizmov a nie variabilita v meraní spotreby kyslíka zariadením GreenLight. 80

81 Záver: Záverom môžeme konštatova, že táto metóda v každom prípade z asového h adiska poskytuje rýchlejšie výsledky ako klasické kultiva né stanovenia. Pri vyšších po toch mikroorganizmov je možné zariadením GreenLight získa výsledok aj do 2 až 6 hod. V potravinárskej praxi to znamená, že ušetrením tohto asu môžeme zabráni rôznym neprijate ným následkom rozhodnutí manažérov v dôsledku nedostatku informácií o mikrobiologickej kontaminácií surovín, medziproduktov alebo finálnych potravín. Z našich pokusov môžeme potvrdi, že po kvalitne vykonanej kalibrácii je systém GreenLight aplikovate ný v širokom spektre potravinárskych matríc. Proces kalibrácie v niektorých prípadoch môže vyžadova špecifický prístup skúsených mikrobiologických pracovníkov. Po absolvovaní tohto kroku je zariadenie vhodné pre rýchle rutinné stanovenia po tu mikroorganizmov, kvasiniek a vláknitých húb v KTJ/ml al. g. Po akovanie: Autori akujú firmám MOCON Inc. (Minneapolis, MN, USA) a Biomedica za poskytnutie zariadenia GL Model 930 a spotrebného materiálu - vialiek s fluorescen ným inidlom GreenLight APCheck. Použitá literatúra: 1. GREXA O., VALÍK., KOCKOVÁ M., KÁROLYI L. Hygiena alimentarium XXXV, 2014, s. 2. STN EN ISO : 2014 Mikrobiológia potravinárskeho re azca. Horizontálna metóda na stanovenie po tu mikroorganizmov. as 1: Metóda po ítania kolónií kultivovaných pri 30 C zalievaním inokula. 3. PETRULÁKOVÁ M., VALÍK., GREXA O. In: STARUCH L. Laboralim, 2015, Bratislava, s. 4. Dostupné na: ( ) 5. Dostupné na: ( ) 6. Görner F., Valík. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, 2004, 69 s, ISBN Kontaktná adresa: Prof. Ing. ubomír Valík, PhD., Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika, lubomir.valik@stuba.sk 81

82 82

83 VHODNOS KUKURI NÝCH SUBSTRÁTOV PRE KYSLOMLIE NE FERMENTÁCIE Matej eková Zuzana, Liptáková Denisa, Pelikánová Jana, Valík ubomír Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave Suitability of corn substrates for lactic acid fermentation Summary: Fermentation of cereals by lactic acid bacteria may represent the most economical and simple way of getting a nutritionally rich products and it can bring a new trend in the development of new functional foods. This work was therefore focused on the study of the growth of selected lactic acid bacteria in milk- and water-based maize mashes with sucrose or flavouring compounds (chocolate, caramel, vanilla). To assess the suitability of prepared maize mashes for fermentation was analyzed the growth of probiotic strain Lb. rhamnosus GG and Fresco DVS 1010 culture during fermentation of maize products at 37 ± 1 C for 8 hours in CO 2 incubator (5%) and then the ability of selected probiotic strain to survive during storage at 6 ± 1 C for 14 or 21 days, depending on the type of substrate. Observed lactic acid bacteria showed sufficient growth and survival in mashes with the gowth rates ranging from log KTJ.ml -1.h -1 to log KTJ.ml -1.h -1 and during storage period were able to maintain their concentrations above the limit 10 6 CFU.ml -1, necessary to achieve the desired probiotic effect. In addition to monitoring the growth, it was also conducted sensory evaluation of flavoured maize mashes. Caramel milk maize mash after 8h of fermentation was the product with the highest points and the most appropriate sensory acceptance according to the final evaluation of overall acceptability. Úvod Skupina baktérií mlie neho kysnutia (BMK) zah a grampozitívne, fakultatívne anaeróbne (mikroaerofilné), acidotolerantné, nespórotvorné koky, alebo pali ky s podobnými fyziologickými a metabolickými vlastnos ami 1,2. V potravinárskom priemysle zohrávajú dôležitú úlohu, nako ko prispievajú k rozvoju organoleptických vlastností (chuti, textúry, vône), ako aj k nutri nej hodnote finálnych produktov 3. Do tejto skupiny zara ujeme rody: Leuconostoc, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus a Bifidobacterium 4. Sú nevyhnutné pre výrobu fermentovaných produktov ako sú syry, jogurty, kyslé mlieko a maslo. Niektoré druhy sú taktiež zapojené do výroby vína, kváskového chleba, kapusty, rovnako aj zeleniny v so nom náleve 5. História výroby fermentovaných potravín siaha až do ias starovekého Egypta, kedy bol proces výroby jednoduchý, bez uvedomovania si prítomnosti a úlohy mikroorganizmov v om. Až koncom 19. storo ia došlo k rozvoju zákysových kultúr, ktorými sa zabezpe ila stabilita samotného technologického procesu a rozvoj výroby fermentovaných potravín 6. Prirodzená fermentácia cereálií vedie k poklesu hladiny sacharidov, rovnako aj niektorých nestrávite ných poly- a oligosacharidov. Taktiež sa zlepšuje kvalita bielkovín, dostupnos vitamínov skupiny B a navyše môžu by syntetizované niektoré aminokyseliny. Fermentácia taktiež poskytuje optimálne ph podmienky pre enzymatickú degradáciu fytátov vyskytujúcich sa v obilninách vo forme komplexov s polyvalentnými katiónmi 7,8. Fermentované probiotické mlie ne výrobky by mali obsahova až do asu kon iacej trvanlivosti životaschopné, aktívne mikroorganizmy v minimálnych po toch 10 6 KTJ/g (ml). Dodržaním týchto podmienok majú probiotiká vedecky preukázaný pozitívny vplyv na zdravie konzumenta 9. Protektívne vlastnosti na zdravie hostite a sa prejavujú predovšetkým prostredníctovm modulácie imunitnej odpovede. Vyvážený ú inok probiotických mikroorganizmov spo íva vo zvyšovaní bakteriálnych po tov, predovšetkým laktobacilov a bifidobaktérií, a v znižovaní potenciálne škodlivých mikroorganizmov 8,10. Zdraviu prospešnos probiotických mikroorganizmov je kme ovo špecifická, dokonca ani kmene rovnakého druhu nemusia by ú inné za rovnakých podmienok 11. Pri výbere probiotických mikroorganizmov je dôležité splnenie nieko kých kritérií: nesmú by patogénne ani toxické, musia by správne taxonomicky identifikované a geneticky stabilné 12. alej musia by rezistentné vo i technologickým procesom, kyslému prostrediu v žalúdku a vo i žl ovým kyselinám v zažívacom trakte. Významný selek ný faktor je adherencia na epiteliálny 83

84 povrch v reve 13. Nako ko je ponuka probiotických potravín na našom trhu obmedzená na mlie ne produkty, napredujúci vývoj vhodne fermentovaných výrobkov pripravených na báze týchto substrátov, môže vies k obohateniu stravovania celiatikov, potravinových alergikov, alebo inak metabolicky hendikepovaných udí, ale taktiež môže vies k vyváženiu stravovania zdravých udí. Materiál a metodika Použité kultúry Monokultúra Lactobacillus rhamnosus GG je zbierkový kme od fínskych mikrobiológov Ouwehanda a Salminena. Poskytla ho Dr. Lauková z Ústavu fyziológie hospodárskych zvierat SAV v Košiciach (SR). Zmesná kultúra Fresco DVS 1010 je komer ná kultúra od spolo nosti Christian a Hansen (Hørsholm, Dánsko), ktorá pozostáva z bakteriálnych druhov Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris a Streptococcus salivarius spp. thermophilus a bola poskytnutá spolo nos ou Rajo, a.s.. Inokulácia a kultivácia istá kulúra laktobacila bola pred experimentmi uchovávaná v MRS bujóne (Biokar, Diagnostics, Beauvais, Francúzsko) pri 5 ± 1 C a zmesná kultúra Fresco v mraziacom boxe. Základná suspenzia kultúry Lb. rhamnosus GG bola pripavená kultiváciou v MRS bujóne pri 37 ± 1 C a 5 % CO 2 po as 24 h a kultúra Fresco v M17 bujóne (Biokar, Diagnostics, Beauvais, Francúzsko) pri 30 ± 1 C po as 24 h aeróbne. Získané štartovacie 24 h kultúry sme scentrifugovali pri 6000 g 5 minút. Následne sme kultúry premyli objemom 10 ml sterilnej destilovanej vody a opätovne centrifugovali pri rovnakých podmienkach. Po centrifugácii sa supernatant zlial a pelet buniek sa rozsuspendoval v pôvodnom objeme sterilnej destilovanej vody 14. Príprava kukuri nej kaše Cereálne kukuri né kaše boli pripravované z 10 % kukuri nej múky (Sol anka, Sol any), UHT mlieka s obsahom tuku 1,5 g.l -1 (Rajo, a.s., Bratislava), alebo vody a sacharózy (2%). V prípade ochutených kaší bolo percentuálne zastúpenie múky 8 %, pri om pomer cereálnej zložky a vody, alebo mlieka bol 80 % a príchute 20 %. Tieto prídavky sa ukázali ako najvhodnejšie z h adiska konzistencie kaší tak, aby sa finálny produkt dal konzumova lyži kou ako dezert. Po navážení jednotlivých zložiek do sterilných kadi iek boli kaše tepelne ošetrené pri 100 C po as 20 minút, pri om každých 3 až 5 minút ich bolo potrebné premieša. Po uvarení kaší nasledovala sterilizácia v autokláve pri teplote 121 C a tlaku 120 kpa po as 20 minút. Fermentácia a uchovávanie Po sterilizácii a ochladení boli kukuri né kaše nao kované 5 % štartovacej kultúry na približnú po iato nú denzitu 10 6 KTJ.ml -1. Nasledovala fermentácia realizovaná po dobu 8 hodín pri teplote 37 ± 1 C v amosfére s obsahom 5 % CO 2. Po skon ení fermenta ného procesu sme cereálne kaše udržiavali pri teplote 6 ± 1 C, pri om sa sledovalo prežívanie BMK ako aj pokles hodnôt ph po dobu 2 resp. 3 týžd ov. Sú as ou práce bola aj senzorická analýza pripravených ochutených kukuri ných kaší pomocou 5-bodovej stupnice (0 4 body), pri om erstvé fermentované produkty (37 ± 1 C / 8h) a skladované produkty (6 ± 1 C / 10 a 21 dní) boli hodnotite om predložené sú asne. Výsledky a diskusia Rastové rýchlosti probiotického kme a Lb. rhamnosus GG sa po as samostatnej fermentácie (37 ± 1 C; 5 % CO 2 ) v kukuri ných ochutených mlie nych resp. vodných kašiach pohybovali od 0,207 do 0,404 log KTJ.ml -1.h -1, pri om došlo k nárastu po iato ných po tov o 1,2 až 1,8 log poriadku. Získané rastové parametre sledovaného probiotického kme a Lb. rhamnosus GG po as fermentácie a následného chladiarenského uchovávania kukuri ných ochutených kaší sú pre preh adnos zosumarizované v tabu ke I a II. 84

85 Vyššie rastové rýchlosti laktobacila boli zaznamenané v kašiach na báze mlieka. Najvyššiu rastovú rýchlos dosiahol Lb. rhamnosus GG v mlie nej okoládovej kaši, kedy sa po iato ná koncentrácia zvýšila rýchlos ou 0,404 log KTJ.ml -1.h -1. Táto zaznamenaná rastová rýchlos bola o 24 % vyššia ako v okoládovej kaši na báze vody. V prípade vanilkovej vodnej kaše bol zaznamenaná najnižšia dynamika rastu laktobacila (0,207 log KTJ.ml -1.h -1 ), o predstavuje o 39 % pomalší rast ako v prípade vanilkovej kaše na báze mlieka. Vo vanilkových kukuri ných kašiach bol zárove zistený najvä ší rozdiel rastových rýchlostí Lb. rhamnosus GG pri porovnaní vodnej a mlie nej kaše. Kocková a Valík 15 sledovali rast kme a Lb. rhamnosus GG v produktoch pripravených z cereálnych, pseudocereálnych a strukovinových z n uvarených v slanej vode. Zistili, že sledovaný probiotický kme je schopný rás a rozmnožova sa vo všetkých typoch substrátov a na konci 10 h fermentácie pri teplote 37 C dosiahol koncentrácie 6,68 až 7,58 log KTJ.g -1 a v priebehu skladovania pri teplote 5 C si po as 21 dní udržal svoje po ty nad hodnotou 6 log KTJ.g -1. Podobný trend dynamiky rastu Lb. rhamnosus GG po as fermentácie pri 37 C zaznamenali v lisovanom pohánkovom produkte na báze, vody, resp. mlieka bez a s prídavkom ochucujúcej zložky i Liptáková a kol. 16, pri om životaschopnos laktobacilov bola zachovaná aj po 10 d och uchovávania produktu pri 12 C. V priebehu chladiarenského uchovávania finálnych ochutených produktov po as 3 týžd ov sa dosiahnuté po ty po fermentácii výraznejšie nemenili a prežívanie sledovaného kme a laktobacila na vysokých koncentráciách dosiahnutých po fermentácii pretrvávalo až do ukon enia 21-d ového skladovania. V prípade mlie nej karamelovej a mlie nej vanilkovej kaše došlo naopak k miernemu nárastu po tov rýchlos ou 0,0005 a 0,0008 log KTJ.ml -1.h -1. Po as fermentácie ochutených substrátov na báze vody sa rýchlos poklesu ph pohybovala v rozmedzí od -0,165 do -0,243 h -1, v mlie nych ochutených produktoch od -0,061 do -0,116 h -1. Všeobecne bola pozorovaná vyššia rýchlos poklesu ph v produkoch na báze vody, pri om najvyšší pokles po as fermentácie bol zaznamenaný vo vanilkovej vodnej kaši (1,9 jednotky). Po as skladovania pri 6 ± 1 C dochádzalo ešte k alšiemu miernemu poklesu hodnôt na kone ných 4,71 až 3,69, s najnižšou hodntou taktiež v prípade vodnej vanilkovej kaše (3,69). Posúdenie celkovej chutnosti kukuri ných ochutených substrátov je najdôležitejším ukazovate om z h adiska hodnotenia senzorickej kvality posudzovaných výrobkov. Zah a celkovú senzorickú kvalitu, najmä z h adiska chute a vône, ale aj ostatných ukazovate ov dôležitých pre daný druh skúmanej potraviny. Najvyšším po tom bodov (4) bola ohodnotená karamelová kukuri ná kaša s mliekom po 8 h fermentácii, o predstavuje ve mi príjemnú celkovú chutnos. Skladovaním chutnos kaší klesala, o pravdepodobne súvisí s okyslením produktu, a teda zárove so znížením intenzity sladkej chute. Pri porovnaní vody a mlieka, boli lepšie vyhodnotené kaše na báze mlieka, ím majú takéto výrobky potenciál by prijaté konzumentmi ako zdroj probiotických baktérií. Tabu ka I Rastové parametre Lb. rhamnosus GG po as fermentácie ochutených kukuri ných substrátov (Gr f rastová rýchlos po as fermentácie, trvanie lag-fázy, N 0 po iato né po ty, N max po ty dosiahnuté po fermentácii a kone né po ty (N end )) Substrát Gr f [log KTJ.ml -1.h -1 ] [h] N 0 [log KTJ.ml -1 ] N max [log KTJ.ml -1 ] N end [log KTJ.ml -1 ] Voda - vanilka 0,207 1,3 6,95 8,31 8,26 okoláda 0,307 1,5 6,87 8,52 8,50 karamel 0,217 1,4 7,02 8,43 8,15 Mlieko- vanilka 0,339 3,1 6,91 8,11 8,63 okoláda 0,404 2,4 6,87 8,68 8,63 karamel 0,332 3,1 6,88 8,04 8,51 85

86 Tabu ka II Parametre zmien ph po as fermentácie a uchovávania ochutených substrátov kme om Lb. rhamnosus GG (ph 0 po iato ná hodnota ph, ph 8 hodnota ph po 8 h fermentácii, ph end kone ná hodnota ph, k phf rýchlos poklesu ph po as fermentácie, k phs rýchlos poklesu ph po as skladovania) Substrát ph 0 ph 8 ph end k phf [h -1 ] k phs [h -1 ] Voda - vanilka 6,52 4,58 3,69-0,243-0,0007 okoláda 6,20 4,55 3,87-0,206-0,0008 karamel 6,07 4,75 3,81-0,165-0,0009 Mlieko- vanilka 6,43 5,83 4,60-0,075-0,0023 okoláda 6,32 5,39 4,25-0,116-0,0015 karamel 6,27 5,78 4,71-0,061-0,0018 V prípade spolo nej fermentácie kultúry Fresco s probiotickým kme om Lb. rhamnosus GG (obr. 1) vstúpili sledované BMK ihne po za atí fermenta ného procesu do exponenciálnej fázy rastu. Rastové rýchlosti sledovaných BMK sa po as spolo nej fermentácie pohybovali od 0,307 log KTJ.ml -1.h -1 do 0,583 log KTJ.ml -1.h -1. Po iato ná koncentrácia Lb. rhamnosus GG sa v mlie nej kaši zvýšila rýchlos ou 0,528 log KTJ.ml -1.h -1, vo vodnej kaši rástol laktobacil 1,7 krát pomalšie (Gr = 0,307 log KTJ.ml -1.h -1 ). Kultúra Fresco naopak zaznamenala o 10 % rýchlejší rast v kaši na báze vody (Gr = 0,583 log KTJ.ml -1.h -1 ). K poklesu ph v prípade mlie nej kukuri nej kaše došlo o 1,6 jednotky na kone ných 4,61, v prípade kaše na báze vody ph pokleslo o 2,3 jednotky, pri om rýchlos poklesu bola stanovená na - 0,471 h -1. Narozdiel od samostatnej fermentácie, kedy si probiotický kme Lb. rhamnosus GG zachovával nadobudnuté po ty po as celej doby skladovania, resp. došlo k ich miernemu nárastu, v prípade spolo nej fermentácie s kulúrou Fresco došlo k poklesu sledovanej probiotickej kultúry o 1 log poriadok, avšak nie pod hranicu 10 6 KTJ.ml -1 potrebnú z legislatívneho h adiska [log KTJ.ml -1 ; ph] Fresco 37/6 C LGG 37/6 C ph [log KTJ.ml -1 ; ph] Fresco 37/6 C LGG 37/6 C ph as [h] Obr. 1. Dynamika rastu kultúry Fresco DVS 1010 a probiotického kme a Lb. rhamnosus GG v mlie nej (v avo) a vodnej kukuri nej kaši (vpravo) po as fermentácie pri 37 ± 1 C a po as uskladnenia pri 6 ± 1 C as [h] 86

87 Záver Na základe experimentov možno konštatova, že probiotický kme Lb. rhamnosus GG aj sledovaná kultúra Fresco DVS 1010 vykazovali dobrý rast vo všetkých kukuri ných kašiach po as fermentácie pri 37 ± 1 C a následne boli schopné prežíva po as skladovania pri 6 ± 1 C, 14 resp. 21 dní, pri om si udržiavali svoje po ty nad hranicou 10 6 KTJ.ml -1. Z h adiska získaných rastových parametrov po as samostatnej fermentácie kme om Lb. rhamnosus GG možno konštatova, že prídavok mlieka mal v prípade ochutených kaší pozitívny vplyv na rastové parametre, stabilitu po as uchovávania a na zmeny ph hodnôt, ktoré boli vyvážené lepšou pufrovacou schopnos ou mlie neho substrátu. Aj ke typickým rastovým médiom pre baktérie mlie neho kysnutia sú prevažne mlie ne výrobky, na základe získaných výsledkov možno konštatova vhodnos pripravených kukuri ných kaší pre fermentáciu vybranými BMK. Ochutené kukuri né kaše poskytujú konzumentom lacný, výživný a senzoricky prijate ný produkt, ktorý môže vies k vyváženiu stravovania zdravých udí, ale taktiež je vhodný pre celiatikov a pre udí trpiacich laktózovou intoleranciou (fermentované kaše na báze vody). Po akovanie: Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/0495/13. Použitá literatúra: 1. KHALID, K. An overview of lactic acid bacteria. In international Journal of Biosciences, 2011, vol. 1, no. 3, p KOCKOVÁ, M., VALÍK,. Potentional of cereals and pseudocereals for lactic acid fermentations. In Potravinárstvo, 2011, vol. 5, no. 2, p PELIKÁNOVÁ, J., LIPTÁKOVÁ, D., VALÍK,. The growth dynamics of Lactobacillus paracasei in milk. In Potravinárstvo, 2011, vol. 5, p GÖRNER, F., VALÍK,. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s. ISBN CHARLIER, P., CRETENET, M., EVEN, S., LE LOIR, Y. Interactions between Staphylococcus aureus and lactic acid bacteria: An old story with new perspectives. In International Journal of Food Microbiology, 2009, vol. 131, p HELLAND, M.H., WICKLUND, T., NARVHUS, J.A. Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in milk- and water-based cereal puddings. In International Dairy Journal, 2004, vol. 14, p BLANDINO, A., AL-ASEERI, M. E., PANDIELLA, S.S., CANTERO, D., WEBB, C. Cereal-based fermented foods and beverages. In Food Research International, 2003, vol. 36, p HAARD, N.F., ODUNFA, S.A., LEE, C.H., QUINTERO-RAMIREZ, R., LORENCE QUINONES, A., WACH-RADARTE, C. Fermented cereals. A global perspective. In FAO Agricultural Services Bulletin., 1999, vol. 138, p TABASCO, R., PAARUP, T., JANER, C., PELÁEZ, C., REQUENA, T. Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. In International Dairy Journal, 2007, vol. 17, no. 9, p MARZOTTO, M., MAFFEIS, C., PATERNOSTER, T., FERRARRIO, R., RIZZOTTI, L., PELLEGRINO, M., DELLAGLIO, F., TORRIANI, S. Lactobacillus paracasei A survives gastrointestinal passage and affects the fecal microbiota of health infants. In Research in Microbiology, 2006, vol. 157, p SHAH, N.P., Functional foods from probiotics and prebiotics. In Food Technology, 2001, vol.55,p PELIKÁNOVÁ, J., LIPTÁKOVÁ, D., VALÍK,., STAN EKOVÁ, K. Evaluation of the growth of selected lactobacilli in pseudocereal substrate. In Potravinárstvo, 2011, vol. 5. no. 4, p SIKORSKI, Z. E. Chemical and functional properties of food components, Third edition, CRC Press, 87

88 2006, p. 544, ISBN ANGELOV, A., GOTCHEVA, V., KUNCHEVA, R., HRISTOZOVA, T. Development of a new oatbased probiotic drink. In International Journal of Food Microbiology, 2006, vol. 112, p KOCKOVÁ, M., VALÍK,. Development of new cereal-, pseudocereal-, and cereal-leguminous-based probiotic foods. In Czech Journal of Food Science, 2014, vol. 32, no.4, p LIPTÁKOVÁ, D., PETRULÁKOVÁ, M., PELIKÁNOVÁ, J., VALÍK,., KRIŠTÚFKOVÁ, K. Rast a prežívanie probiotických laktobacilov v lisovanom pohánkovom produkte. In Chemické listy, 2016, vol. 2, p , In press. Kontaktná adresa: Ing. Zuzana Matej eková, Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, , Bratislava, Slovenská republika, zuzana.matejcekova@stuba.sk 88

89 KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ PROBIOTICKÝCH LAKTOBACIL VE FERMENTOVANÝCH MLÉ NÝCH VÝROBCÍCH Mühlhansová Andrea, Horá ková Šárka, Plocková Milada Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Quantitative determination of probiotic lactobacilli in fermented milk products Summary: In this work, the selectivity of various cultivation media used for the determination of probiotic lactic acid bacteria (Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus) was tested. The determination of bacterial count obtained by plate methods and the quantitative polymerase chain reactions in pure cultures as well as in the commercial fermented products were compared. Media according to SN ISO , MRS agar ph 5.6; MRS agar ph 5.6 cultured for 14 days at 15 C, MRS agar with vancomycin, MRS agar with bile, LC agar and M-RTLV agar were used in this work. The examined plate methods for the determination of Lactobacillus casei in fermented dairy products were not sufficiently selective. On the other hand, MRS agar with clindamycin and ciprofloxacin was found to be selective for the determination of Lactobacillus acidophilus in fermented dairy products. The number of cells determined by the quantitative polymerase chain reaction was about 1 to 2 log cycle higher compared to plate methods. Úvod Vzhledem k pozitivním zdravotním ú ink m potravin obsahujícím probiotika má konzumace probiotických fermentovaných mlé ných výrobk vzr stající tendenci, což vede k pot eb jejich selektivního stanovení ve sm si s ostatními druhy bakterií mlé ného kvašení z d vodu zajišt ní kontroly jejich deklarovaného množství. Cílem práce bylo vyhodnotit selektivitu doporu ených kultiva ních médií pro nej ast ji se v R vyskytující probiotické druhy L. acidophilus a L. casei a porovnat tyto plotnové metody s kvantitativní PCR (qpcr) s použitím nov navržených primer kódujících peptidoglykanhydrolasy. Stanovení probiotických mikroorganism pomocí plotnové metody závisí na typu výrobku, stanovovaném mikroorganismu a na p ítomnosti a druhovém složení ostatní p ítomné mikroflóry (1). V sou asnosti neexistuje normovaná metoda pro stanovení po tu L. casei. K jeho selektivnímu stanovení se obvykle používá MRS agar s vankomycinem (MRS-V) agar, který je doporu ován komer ními výrobci (nap íklad DSM, Holandsko). V odborné literatu e byla popsána celá ada p d pro jeho stanovení s r znou mírou selektivity. Pro stanovení presumptivního po tu L. acidophilus na selektivní živné p d se používá postup dle SN ISO Molekulární metody jsou stále více používány pro detekci, kvantifikaci a studium mikrobiálních populací v potravinách. Hlavní výhodou qpcr oproti plotnovým metodám je rychlost, spolehlivost, opakovatelnost a vysoká citlivost. Metoda qpcr zahrnuje i kritické kroky, kterými jsou nap. izolace DNA a návrh specifických primer (2). Experimentální ást Použité kmeny V práci byly použity kmeny Lactobacillus acidophilus LA 5 Christian Hansen (Dánsko) a CCDM 151 Laktoflora Milcom ( R). Pro Lactobacillus casei kmeny Lafti L26 DSM (Nizozemsko) a CCDM 198 Laktoflora Milcom ( R). Kultivace kmen rodu Lactobacillus Zkoumané kmeny rodu Lactobacillus byly kultivovány v bujónu MRS o ph 5,6. Médium bylo zao kováno 1 % (obj.) inokula a laktobacily byly kultivovány p i teplot 37 ºC po dobu 16 h anaerobn. 89

90 Plotnové metody Stanovované mikroorganismy byly vždy desítkov na ed ny ve fyziologickém roztoku a poté dle vybraných ed ní zao kovány a kultivovány na p dách dle tabulky I. Všechna stanovení krom p dy MRS s clindamycinem a ciprofloxacinem (MRS/CL/CP) byla zao kovány 1 ml inokula a p elita p íslušnou živnou p dou. U p dy MRS/CL/CP se jednalo o metodu rozt ru s objemem inokula 0,1 ml. Tabulka I Použité plotnové metody P da MRS s clindamycinem a ciprofloxacinem ph 6,2 Doba kultivace Teplota kultivace selektivita a L. acidophilus MRS 5, a subsp. L. delbrueckii bulgaricus M17 6, a S. thermophilus MRS 5,6 MRS s vankomycinem reference SN ISO SN ISO 7889 SN ISO 7889 Ozna ení p dy MRS/CL/CP MRS 5,4 M L. casei MRS 5,6-14 D 15 L. casei MRS 14D 6, a L. casei Dle návodu výrobce Lafti L26 MRS-V MRS se žlu í 6, L. casei (6) MRS-B LC agar 5, L. casei (1) LC M-RTLV 6, a L. casei (8) M-RTLV a použití upravené atmosféry obsahující 5 obj. % CO 2, Návrh a testování primer V genových bankách byly vyhledány: a) Sekvenované kmeny daných druh L. acidophilus a L. casei b) Ortologické geny k Lhv_190 a Lhv_191 u L. acidophilus a L. casei. Návrh primer k detekci charakteristických druh probiotických laktobacil se skládal z: (i) vyhledávání dostupných bioinformatických dat v NCBI genové bance ( (ii) nalezení podobných sekvencí v genové bance pomocí BLASTu ( (iii) porovnání sekvencí pomocí CLUSTALW ( (iv) nalezení specifického místa v sekvenci a (v) návrhu primer v tomto specifickém míst pomocí Primer ( P ed syntézou primer byla pro kontrolu specificity provedena in silico PCR ( Pro testování specificity primer pomocí qpcr s použitím interkala ního barviva SYBR Green byly použity jakožto pozitivní a negativní kontroly r zné druhy rodu Lactobacillus a S. thermophilus. Izolace DNA u testovaných kmen byla provedena z istých kultur. Na záv r byla provedena analýza amplifika ních graf, HRM analýza a gelová elektroforéza PCR produkt. 90

91 Izolace DNA Izolace DNA z istých kultur probíhala pomocí komer n dostupného kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Izolace DNA z mlé ných výrobk probíhala modifikovan s po áte ní p ípravou a ed ním vzorku (3). Byl odst ed n 1 ml erstv narostlé kultury p i 4550 g, 10 min, 4 C, byl odlit supernatant a bu ky byly promyty v 1 ml sterilní vody. K bu kám bylo p idáno nejd íve 180 l lytického pufru (inkubace 45 min p i 37 ºC), poté 25 l proteinasy K (42 U mg -1 ) a 200 l pufru AL (inkubace 30 min p i 56 ºC). K vzniklému lyzátu bylo p idáno 200 l ethanolu (98 %, - 20 ºC) a zkumavka byla promíchána obrácením zkumavky až do dosažení homogenity. Inkubace probíhala 5 min p i 25 ºC. Veškerý obsah zkumavky byl p enesen do kolonky (Dneasy Mini spin), odst ed ní probíhalo p i t chto podmínkách 5750 g, 2 min, 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a bylo p idáno 500 l pufru AW1, zkumavka byla odst ed na p i 5750 g, 2 min, 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a bylo p idáno 500 l pufru AW2, odst ed ní prob hlo p i g, 3 min, 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a zopakováno odst ed ní. Na st ed membrány v kolonce bylo napipetováno 50 l elu ního pufru AE, inkubace 2 min p i 25 ºC a poté probíhalo odst ed ní dle následujích podmínek 5750 g, 1 min, 4 C. Pro zvýšení výt žku byl zopakován poslední elu ní krok. Bylo naváženo 10 g vzorku mlé ných výrobk a z ed no s 90 g citrátového pufru (20 g l -1 ), ed ní 1:10, vzorek byl homogenizován, 1 min (stomacher). Bylo odebráno 1 ml takto p ipravené suspenze a odst ed no p i g, 10 min, 21 C. Byl odsát supernatant. K bu kám bylo p idáno 400 l lytického pufru (p ed použitím bylo p idáno 40 mg ml -1 lysozymu a 10 l ml -1 mutanolysinu), inkubace prob hla p i 37 C, 1 h. Poté bylo p idáno 25 l proteinasy K a 200 l pufru AL, inkubace p i 70 C, 30 min. K lyzátu bylo p idáno 200 l ethanolu (98 %, -20 C). Veškerý obsah zkumavky byl p enesen do kolonky (Dneasy Mini spin), odst ed ní probíhalo p i 5750 g, 2 min 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a bylo p idáno 500 l AW1 pufru, odst ed ní probíhalo p i 5750 g, 2 min 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a bylo p idáno 500 l AW2 pufru, odst ed ní probíhalo p i g, 3 min 4 C. Byla vym n na sb rná zkumavka a zopakováno odst ed ní. Na st ed membrány v kolonce bylo napipetováno 50 l elu ního pufru AE, inkubace prob hla 2 min p i 25 ºC a poté probíhalo odst ed ní dle následujích podmínek 5750 g, 1 min, 4 C. Pro zvýšení výt žku byl zopakován elu ní krok. Pufry AW1, AW2, AL, AE jsou sou ástí komer n dostupného kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Kvantitativní polymerázová et zová reakce Nejprve byl p ipraven mix dle tabulky II. Následn bylo do každé jamky napipetováno 9 l mixu. A poté byl do každé jamky napipetován 1 l stanovované DNA (duplikátn byla napipetována kalibra ní ada i neznámé vzorky). Vlastní reakce probíhala dle tabulky III. P ehled používaných primer v práci je v tabulce IV. Tabulka II PCR mix PCR mix výrobce objm [ l] iq SYBR Green Supermix Biorad 5 Primer Fwd (10 mol l -1 ) GeneriBiotech 0,5 Primer Re (10 mol l -1 ) GeneriBiotech 0,5 Demineralizovaná sterilní voda - 3 Celkový objem 9 91

92 Tabulka III Pr b h qpcr reakce Po et cykl Teplota [ C] as [s] /62 a K ivka tání ,05 s / 0,5 C a 65 C bylo použito pro všechny primery, krom primer LDB 0224, pro které byla použita teplota 62 C Tabulka IV P ehled použitých primer Primery pro: Název primeru gen sekvence L. casei L. acidophilus L. casei _F GGTGTATGACAACGACAGTGAAT PGH L. casei _R GTAGCATAGCCATCCGTCTTC LA1 Fwd LA1 Re LA Fwd LA Re PGH PGH TTTGACGAATGCTTGATGGA GGCTTTAACTGCTTGCTTGG CCGTGTAGGCGAGAATGAAT ATTGGCGAATACCGATTCTG délka primeru (bp) Výsledky a diskuse Stanovení po tu bun k istých kultur pomocí plotnových metod Byly stanoveny po ty bun k istých kultur L. acidophilus LA 5, L. acidophilus CCDM 151, L. casei Lafti L26, L. casei CCDM 198. Byla testována selektivita p d uvedených v tabulce I. Výsledky t í paralelních stanovení jsou v tabulkách V-VIII. Z nich je patrné, že mikroorganismy vykazovaly dobrý r st na všech testovaných p dách krom MRS agaru se žlu í. Nebyla zjišt na žádná inhibice jednotlivých druh na p dách; p i porovnání výsledk získaných ze stanovení na p dách definovaných legislativn a ostatních p dách nebyly pr kazné žádné rozdíly mezi zjišt nými po ty bun k. Tabulka V Stanovení po tu bun k isté kultury L. casei Lafti L26 [log KTJ ml -1 ] P da/ stanovení MRS/ CL/CP MRS 5,4 M 17 MRS 14D MRS-V MRS-B LC M-RTLV I 8,91 8,61 8,64 8,60 8,67 a 8,72 9,79 II 9,30 8,97 9,00 8,89 8,92 8,89 8,99 9,18 III a 8,51 8,15 a 8,36 a 8,45 10,20 Složení jednotlivých p d a kultiva ní podmínky jsou uvedeny v tab. I, str. 23; a - nestanoveno 92

93 Tabulka VI Stanovení po tu bun k isté kultury L. casei CCDM LC 198 [log KTJ ml -1 ] P da/ MRS/ MRS MRS 5,4 M 17 MRS-V MRS-B LC stanovení 93 M- RTLV CL/CP 14D I 9,20 9,18 9,11 9,15 9,11 8,73 9,11 9,26 II 8,88 8,69 8,52 8,20 8,66 8,40 8,52 8,70 III a 8,43 8,18 8,72 8,46 a 8,36 9,95 Složení jednotlivých p d a kultiva ní podmínky jsou uvedeny v tab. III, str. 23; a - nestanoveno Pro selektivní stanovení L. casei byly z literatury vybrány zvýrazn né p dy v tabulce V a VI. Mezi jednotlivými p dami navrhnutými jako selektivní pro L. casei nebyly nalezeny žádné významn jší rozdíly v po tu bun k. Pouze na M-RTLV agaru byl stanovován vyšší po et bun k L. casei o cca 1 až 2 ády. Tento rozdíl by mohl být dán tím, že výsledky získané pomocí M-RTLV agaru byly falešn pozitivní, nebo kolonie na M-RTLV agaru byly obvykle velmi malé. Selektivní stanovení L. casei na MRS agaru se 14ti denní kultivací za snížené teploty se ukázalo jako nevhodné, a to jak kv li dlouhé dob kultivace (4), tak i proto, že za podmínek této metody narostly na agaru i ostatní stanovované isté kmeny. Další použitou p dou byl MRS agar s vankomycinem, který je doporu ován ke stanovení L. casei komer ními výrobci (nap. DSM). V této práci na MRS s vankomycinem nicmén narostly i kolonie vybraných kmen jogurtové kultury a také L. acidophilus, navíc všechny kolonie m ly pr m r asi 0,3 mm. LC agar byl objeven Shahem a Ravulou (1998) jako selektivní médium pro L. casei a je vhodný pro odlišení od ostatních mikroorganism, které se vyskytují ve fermentovaných mlé ných výrobcích (5, 6). V této práci bylo zjišt no, že kultivace misek s LC agarem v prost edí s upravenou atmosférou obsahující 5 obj. % CO 2 není vhodná, nebo na agaru nenarostou žádné kolonie. Z tohoto d vodu byla v této práci u LC agaru použita anaerobní kultivace. M-RTLV agar, který objevili Sakai a kol. (2010), by m l být vhodný pro selektivní stanovení L. casei a L. paracasei od L. rhamnosus. Na tomto médiu by L. casei a L. paracasei m ly tvo it ervené kolonie, zatímco L. rhamnosus by m l tvo it r žové kolonie anebo bílé kolonie s ervenou te kou. V tomto stanovení, které bylo provedeno, se kolonie od sebe nelišily ani barevn ani velikostn. Na M-RTLV agaru narostly kolonie jak L. casei a L. rhamnosus, tak i kolonie jogurtové kultury a L. acidophilus. Tabulka VII Stanovení po tu bun k isté kultury L. acidophilus LA 5 [log KTJ ml -1 ] P da/ MRS/ stanovení CL/CP MRS 5,4 M 17 MRS 14D MRS-V MRS-B LC M-RTLV I 9,08 8,51 8,40 8,04 8,82 a 8,62 9,53 II 9,23 9,26 7,95 8,95 8,88 8,83 9,38 9,30 III a 8,61 8,45 8,84 8,48 a 8,41 10,18 Složení jednotlivých p d a kultiva ní podmínky jsou uvedeny v tab. III, str. 23; a - nestanoveno Tabulka VIII Stanovení po tu bun k isté kultury L. acidophilus CCDM 151 [log KTJ ml -1 ] P da/ MRS/ stanovení CL/CP MRS 5,4 M 17 MRS 14D MRS-V MRS-B LC M-RTLV I 8,79 8,52 8,41 a 8,76 a 8,71 9,49 II 8,97 9,38 9,30 9,32 8,93 9,15 9,34 10,20 III 9,08 8,98 8,90 9,11 8,92 a 8,93 10,04 Složení jednotlivých p d a kultiva ní podmínky jsou uvedeny v tab. III, str. 23; a - nestanoveno

94 Dle SN ISO je pro stanovení L. acidophilus ur en MRS agar s clindamycinem a ciprofloxacinem. Z výsledk, které byly nam eny je patrné, že na této p d rostly i ostatní testované kmeny L. casei Lafti L26 i CCDM 198. Po et kolonií stanovený na MRS/CL/CP se od po tu kolonií L. acidophilus stanoveného na MRS agaru o ph 5,4 lišil o 0,03-0,57 ádu. Stanovení po tu bun k istých kultur pomocí qpcr V další fázi práce bylo provedeno srovnání stanovení po tu bun k pomocí plotnové metody a metody qpcr. Jednotlivé mikroorganismy byly kultivovány v MRS bujónu a následn byl jejich po et stanoven na MRS agaru (ph 5,6, 37 C, 72 h, 5 % obj. CO 2 ). U všech stanovovaných mikroorganism byla provedena t i až šest m ení. Výsledky jsou uvedené v tabulkách IX a X. Tabulka IX Stanovení po tu bun k isté kultury L. casei Lafti L26 (a) a L. casei CCDM 198 [log KTJ ml -1 ] (b) Metoda/ stanovení MRS 5,6 qpcr Metoda/ stanovení MRS 5,6 qpcr I 8,73 10,78 I 9,08 10,62 II 8,97 10,11 II 8,84 10,04 III 9,08 9,68 III 8,82 9,81 IV 8,51 9,79 a IV 8,43 9,63 Pro stanovení isté kultury L. casei byla provedena ty i paralelní stanovení. Po et bun k stanovený pomocí qpcr byl u obou stanovovaných kmen vždy vyšší nežli po et bun k stanovený pomocí plotnových metod (o 0,6-2,0 ádu). Pomocí qpcr se stanoví veškerá DNA vyizolovaná z bun k, tedy i z mrtvých bun k, zatímco kultiva ními metodami se stanoví pouze živé bu ky (9). b Tabulka X Stanovení po tu bun k isté kultury L. acidophilus La 5 (a) a L. acidophilus CCDM 151 [log KTJ ml -1 ] (b) Metoda/ Metoda/ MRS 5,6 qpcr MRS 5,6 qpcr stanovení stanovení I 9,04 9,35 I 9,40 9,61 II 8,86 9,06 II 9,23 10,08 III 8,34 9,90 III 8,94 10,17 IV 9,18 9,40 IV 8,99 10,07 V 9,23 9,21 V 9,20 9,16 VI 9,30 9,47 a VI 9,40 9,61 b Stanovení po tu probiotických laktobacil ve fermentovaných mlé ných výrobcích Bylo vybráno sedm výrobk z tržní sít tak, aby obsahovaly r zné kombinace mikroorganism, p i emž daný výrobek musel vždy obsahovat bu L. acidophilus nebo L. casei. Byla provedena vždy dv stanovení, ze dvou r zných šarží a to tak, aby doba do konce expirace byla podobná (v polovin expira ní lh ty) u všech výrobk. Výsledky m ení jsou uvedeny v tabulce XI. 94

95 Tabulka XI Porovnání stanovení po tu bun k L. casei a L. acidophilus ve výrobcích z komer ní sít plotnovými metodami a qpcr [log KTJ g -1 ] ve dvou stanoveních z odlišných šarží (I a II) Metoda MRS/ CL/CP qpcr MRS- V LC qpcr Výrobky Acidofilní mléko 1 Acidofilní mléko 2 Probiotický nápoj 1 Probiotický nápoj 2 Stanovení po tu bun k L. acidophilus Kysané podmáslí Probiotický nápoj 3 Probiotický nápoj 4 I 6,70 6,78 ND 6,60 5,48 7,91 ND II 7,11 7,48 ND 7,00 5,85 7,91 ND I 5,15 7,51 ND 8,23 6,18 6,85 ND II 6,95 8,00 ND 8,08 6,15 6,72 ND Stanovení po tu bun k L. casei I 6,85 6,74 8,49 6,83 6,54 7,41 6,86 II 7,11 7,04 9,20 8,43 6,57 7,41 6,93 I 6,95 7,11 8,38 6,59 7,04 7,36 6,86 II 7,18 7,69 9,11 7,46 7,08 7,45 6,83 I 7,12 7,20 7,96 7,9 7,10 7,60 7,28 II 7,11 7,80 7,72 7,79 7,20 7,65 7,20 Po et bun k L. casei stanovený v této práci na agaru MRS s vankomycinem i LC agaru odpovídal deklarovanému po tu bun k. U stanovení po tu bun k L. acidophilus jsou výsledky získané pomocí kultiva níchch metod vyšší, než výsledky získané qpcr, krom 2 výrob. Nižší výsledky získané qpcr mohou být zp sobené inhibitory, které se asto vyskytují v biologických vzorcích (10). Bylo zjišt no, že v p ípad mlé ných výrobk mlé né komponenty mohou blokovat DNA a chránit ji proti polymerase, konkrétn se jedná o ionty Ca 2+. Dalším inhibitorem je tuk. Záv r Pro stanovení po tu bun k L. casei ve výrobcích byly vybrány p dy MRS s vankomycinem a LC agar, které za podmínek metody uvedených v této práci je možné po mikroskopické kontrole ozna it jako selektivní. Také MRS s clindamycinem a ciprofloxacinem dle SN ISO pro stanovení presumptivního po tu L. acidophilus ve výrobcích v této práci za podmínek metody je po mikroskopické kontrole možné ozna it jako selektivní. Kvantitativní stanovení L. casei a L. acidophilus pomocí qpcr trvá 3 h, oproti plotnovým metodám, které vyžadují 3 dny kultivace. A tak by tato metoda byla vhodná pro kvantitativní stanovení vybraných bakterií mlé ného kvašení. Pod kování: Financováno z ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT. 20/2015). Použitá literatura: 1. Shah N. P.: Probiotic Bacteria: Selective Enumeration and Survival in Dairy Foods. Journal of Dairy Science 83, (2000). 2. Postollec F., Falentin H., Pavan S., Combrisson J., Sohier D.: Recent advances in quantitative PCR (qpcr) applications in food microbiology. Food Microbiol. 28, (2011). 95

96 3. Parayre S., Falentin H., Madec M N., Sivieri K., Le Dizes A., Sohier D., Lortal S.: Easy DNA extraction method and optimisation of PCR-Temporal Temperature Gel Electrophoresis to identify the predominant high and low GC-content bacteria from dairy products. J. Microbiol. Methods 69, (2007). 4. Shah N. P., Ravula R.R.: Selective enumeration of L. casei from yogurt and fermented milk drinks. Journal od Chemical Technology and Biotechnology 12, (1998). 5. Shah N. P.: Probiotic Bacteria: Selective Enumeration and Survival in Dairy Foods. Journal of Dairy Science 83, (2000). 6. Vinderola C. G., Reinheimer J. A.: Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria fermented dairy products. International Dairy Journal 10, (2000). 7. Lima K. G. de C., Kruger M. F., Behrens J., Destro M. T., Landgraf M., Melo Franco B. G.: Evaluation of culture media for enumeration of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium animalis in the presence of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus. Food and Technology 42, (2009). 8. Sakai T., Oishi K., Asahara T., Takada T., Yuki N., Matsumoto K., Nomoto K., Kushiro A.: M- RTLV agar, a novel selective medium to distinguish Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei from Lactobacillus rhamnosus. International Journal of Food Microbiology 139, (2010). 9. García-Cayuela T., Tabasco R., Peláez C., Requena T.: Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bi dobacteria in fermented milk by using propidium monoazide and real-time PCR. International Dairy Journal 19, (2009). 10. Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A.: Quantification of mrna using real-time RT-PCR. Natural protocols 1, (2006). Kontaktní adresa: Ing. Andrea Mühlhansová, Ústav mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha, Technická 5, , Praha 6, Andrea.Muhlhansova@vscht.cz 96

97 VYUŽITÍ BAKTERIÍ S ANTIKLOSTRIDIÁLNÍM Ú INKEM V POLOPROVOZNÍCH VÝROBÁCH SÝR EIDAMSKÉHO TYPU Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, N me ková Irena Výzkumný ústav mlékárenský s. r. o. The exploitation of bacteria with the anticlostridial effect in the pilot plant manufacturing of Edam cheese Summary: Our previous results on the selection of microorganisms suitable as protective cultures obtained by agar plate methods, model experiments in the cheese-slurry as well as the detection of genes for the production of bacteriocins led in this work focused on the pilot plant application. Using our pilot equipment, we manufactured Edam cheese containing tested microorganisms from Laktoflora collection - two strains of nisin-producing lactococci (Lcc. lactis ssp. lactis CCDM 71 and CCDM 731), enterocin-producing Enterococcus faecium CCDM 945 or their combination. These strains were added to the mesophilic starter at the beginning of the manufacturing as well as the mesophilic starter alone was used as a control. As an indicator strain, Clostridium tyrobutyricum 5T isolated from a blown-cheese was used. The effect of the anticlostridial strains was compared with a commercial nisin preparation. Our experiment led to the comparable effect of both nisin preparation and nisin-producing cultures which completely suppressed the production of butyric acid by the added clostridial strain. Although it was found out in previous experiments, the effect of Ent. faecium wasn t confirmed under the pilot plant experiment. Úvod: Výrobky z mléka jsou složitou sm sí složek a biologických struktur, které jsou v pr b hu výroby podrobovány fyzikálním a chemickým zásah m. P itom se od nich o ekává atraktivita, vyhovující senzorické vlastnosti, stálost, bezpe nost, nutri ní benefity a v souhrnu všeho schopnost dobrého uplatn ní na trhu (1). Ú innost bakteriocin v této souvislosti závisí na jejich interakcích se složkami výrobk z mléka (2) a m že se proto lišit od jejich ú innosti stanovené jinými metodami, nap. difúzní jamkovou metodou, a zárove je ovliv ována vlastnostmi daného výrobku, v našem p ípad sýra, v pr b hu celého zrání. Bakteriociny produkující mlé né bakterie se mohou po otestování stát sou ástí bioprotektivních kultur zvyšujících kvalitu a bezpe nost mlé ných výrobk. (3). Z t chto d vod byly ov ovány ú inky kmen produkujících bakteriociny nisin a enterocin na klostridia v poloprovozních výrobách sýr navazujících na výsledky p edcházejících prací, kdy byly testovány v laboratorním m ítku jinými metodami. Materiál a metody: kmen Enterococcus faecium CCDM 945 (CCDM Laktoflora, CZ) kmen Lactococcus lactis ssp.lactis CCDM 731 (CCDM Laktoflora, CZ) kmen Lactococcus lactis ssp.lactis CCDM 71 (CCDM Laktoflora, CZ) kmen Clostridium tyrobutyricum 5T (izolát VÚM, CZ) mezofilní smetanová kultura DCC 232 (Chr. Hansen s, DK) pasterované mléko (MADETA a.s., CZ) nisinový preparát Nisaplin (nisin z Lactococcus lactis ssp.lactis, deklarovaná ú innost > 1 mil. IU/g, Danisco, DK) stanovení heterofermentativních laktobacil : živný agar FHN (MILCOM a. s., CZ) s p ídavkem vancomycinu (0,5 ml/100 ml) a kyseliny nalidixové (0,5 ml/100 ml), kultivace anaerobn p i 37 C po dobu 6 dn. stanovení mezofilních mlé ných kok podle normy IDF Standart 149A pomocí živné p dy M17 (Lab M Limited, LAB 092, UK), kultivace aerobn 30 C po dobu 3 dn. stanovení bakterií rodu Enterococcus: živný agar KEA (Oxoid, CM0591, UK), kultivace aerobn p i 37 C po dobu 2 dn. stanovení kyseliny a plyn-produkujících klostridií: diagnostický agar RCM (Oxoid, CM0151, 97

98 UK), s p ídavkem 10 ml roztoku neutrální erveni na 1000 ml (0,5% v 60% etanolu) a s p ídavkem mupirocinu v dávce 10 ml/100 ml. Kultivace anaerobn p i 37 C po dobu 5 dn. stanovení halotolerantních mikroorganism : Mannitol salt agaru (MSA) (Lab M Limited, LAB 007, UK), kultivace p i 30 C po dobu 3 dn. stanovení titra ní kyselosti ( SH) a aktivní kyselosti podle SN a SN ph metrem inolab ph 720 (WTW, Weilheim, D) stanovení obsahu sušiny podle SN ISO stanovení aktivity vody na AwSprint (Novasina, CH) metodou podle SN ISO 21807, p i konstantní teplot 25 C. stanovení nižších mastných kyselin izotachoforetickým analyzátorem EA 02 (VILLA Labeco, SK) SOP. 23 MILCOM a. s. stanovení obsahu chlorid titra ní argentometrickou metodou podle Mohra Pro samotné testování byl vybrán enterocin produkující kmen Enterococccus faecium CCDM 945 a dva nisin-produk ní kmeny Lactococcus lactis ssp.lactis CCDM 731 a CCDM 71. Technologický postup byl zvolen tak, aby byl jednoduchý a opakovatelný a p itom zachovával principy klasické výroby. Po celou dobu výroby a zrání byly sýry sledovány a v pravidelných intervalech stanovovány všechny zm ny ve složení a v zastoupení jednotlivých skupin mikroorganism (laktokoky, enterokoky, halotolerantní, fakultativn heterofermentativní laktobacily a klostridia). U sýr byly provád ny následující fyzikáln -chemické rozbory: ph, SH, sušina, aw, obsah soli a nižších mastných kyselin. Pokusné výroby byly provedeny s indikátorovým kmenem 5T identifikovaným jako Clostridium tyrobutyricum. V jedné sérii byla vždy první kontrolní výroba pouze se smetanovou kulturou, druhá výroba s p ídavkem testovaného kmene i jejich kombinací, t etí výroba s p ídavkem indikátorového kmene spole n s bakteriocin-produk ním kmenem i jejich sm sí a tvrtá výroba pouze s p ídavkem indikátorového kmene. V poslední sérii byl testován vybraný enterocin-produk ní kmen s p ídavkem nisinového preparátu, kterým byly nahrazeny testované nisin-produk ní kmeny laktokok. Postup výroby: k pasterovanému mléku na sýry v množství 5 litr bylo p idáno 0,3 ml/l chloridu vápenatého a bylo zao kováno tekutou mezofilní smetanovou kulturou a vybranými kmeny p ípadn i s p ídavkem nisinového preparátu podle schématu v Tab. 1. P i teplot C bylo mléko zasý eno tekutým chymozinovým sy idlem o síle 1: Doba od p ídavku MK do odtažení syrovátky byla 120 minut. Po odtažení 1/3 syrovátky byl p idán stejný objem prací vody a dosoušení probíhalo p i teplot C po dobu 40 minut. Pak byla sm s zrna se syrovátkou vypušt na do lisovacích forem a 1 hodinu byly sýry lisovány za postupn se zvyšujícího tlaku. Celková doba výroby sýr do konce lisování byla minut. Prokysané sýry byly soleny 3,5 hodiny v 20% solné lázni p i teplot 14 C, osušeny a zabaleny do smrštitelné fólie. Sýry zrály p i teplot 15 C. Vzorky byly odebírány p ibližn 1., 30., 60. a 90. den po výrob a byly u nich provedeny fyzikáln chemické rozbory a stanoveno zastoupení jednotlivých skupin mikroorganism. Výsledky a diskuze: Schéma všech p ídavk a použitých kultur je uvedeno v tabulce 1. Tabulky sledovaných a kontrolovaných hodnot všech uvedených pokusných výrob nejsou pro zna nou rozsáhlost zahrnuty a jsou k dispozici u autor. Fyzikáln chemické parametry sýr s p idanými testovanými i indikátorovými kmeny i bez nich se v jednotlivých fázích zrání prakticky nelišily a nem ly by tedy ovliv ovat tvorbu a p sobení bakteriocin. Zrání probíhalo standardn u všech výrob. Výsledky obsahu kyseliny mlé né a máselné a po ty klostridií jsou uvedeny pro každou sérii na obr U výrob. 3 v sériích 7, 8, 9 a 11, kde bakteriociny produkované nao kovanými kmeny potla ovaly r st klostridií v každé z t chto sérií, z stával obsah kyseliny mlé né po celou dobu zrání na hodnotách nad 1000 mg/100 g. U výrob ozna ených íslem 4 v každé sérii, kde byla pouze smetanová kultura a indikátorový kmen klostridií, klesal obsah kyseliny mlé né na hodnoty 98

99 mg/100 g a sou asn se zvyšoval v pr b hu zrání obsah kyseliny máselné až na hodnoty 456 až 639 mg/100 g po 90 dnech zrání což odpovídá stanoveným po t m klostridií, kde byl konstatován nár st obsahu klostridií vždy u 4. výroby v každé sérii. Výjimku tvo í série. 10 (obr.. 4), kde byla nao kována klostridia sou asn s enterokokovou kulturou. Zde nar stal obsah kyseliny máselné sou asn s poklesem obsahu kyseliny mlé né ve výrob. 3 stejn jako u výroby. 4. Enterokoky viditeln r st klostridií v sýrech nepotla ovaly, a koliv p i testování v jiných podmínkách (4) vykazovaly v i indikátorovému kmenu klostridií inhibi ní ú inek. Ješt více z ejmý je ú inek jednotlivých testovaných kmen a jejich kombinací na obr. 6, kde je zdu ení sýr kontaminovaných cílen pouze klostridii patrné už po 30 dnech zrání. U série. 10 jsou zdu elé i sýry s p ídavkem enterokokové kultury. Lze tedy p edpokládat, že v sérii. 8, kde byly použity všechny t i testované kmeny produkující bakteriociny ú inné proti klostridiím, je potla ení r stu klostridií zp sobeno pouze nisin produk ními kmeny laktokok, které tento ú inek vykazovaly samostatn v sériích. 7 a 9. Rovn ž v sérii. 11 je možné p edpokládat, že na antiklostridiálním ú inku sm si Nisaplinu a enterokokové kultury se podílel pouze Nisaplin. Sýry, které byly vyrobeny bez p ídavku klostridií, tzn. v každé sérii 1. výroba jen se smetanovou kulturou a 2. výroba se smetanovou a testovanou antiklostridiální kulturou byly v pr b hu zrání senzoricky hodnoceny. Všechny byly shledány jako vyhovující v chuti i konzistenci a sýry pouze se smetanovou kulturou a se smetanovou kulturou a p ídavkem testovaných kmen se lišily jen minimáln. Záv r: Antiklostridiální ú inek dvou laktokokových sbírkových kmen ve sm si se smetanovou kulturou byl potvrzen proti kmenu klostridií izolovanému ze zdu elého sýra. P ídavek t chto kmen do mléka ve sm si se smetanovou kulturou nem l negativní vliv na zrání a výslednou kvalitu sýr a výsledek byl srovnatelný s použitím komer ního p ípravku Nisaplin. Po otestování proti dalším kmen m klostridií identifikovaným jako p vodci pozdního du ení by bylo možno tyto dva kmeny využít jako složky protektivních kultur. Pod kování: Tato práce vznikla za finan ní podpory MZe R, NAZV, projekt QJ v rámci programu KUS a institucionální podpora dle rozhodnutí. RO1415. Použitá literatura: 1. Hoover, D. G., Steenson, L. R.: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Academic Press (1993), ISBN Chen, H., Hoover, D. G. (2003), Bacteriocins and their Food Applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2: doi: /j tb00016.x 3. De Vuyst, L., Leroy, F., Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification and food applications. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007, 13, doi: / Periodická zpráva projektu MZe QJ za rok Kontaktní adresa: Ing. Irena N me ková, Ph.D., Výzkumný ústav mlékárenská s.r.o., Ke Dvoru 12a, Praha 6, nemeckova@milcom-as.cz 99

100 Tabulka I Seznam pokusných výrob, kombinace a množství použitých kultur íslo série íslo výroby použité kultury/preparát ozna ení inokulum 7-1 smet. kultura DCC ,98 log CFU ml smet. kultura DCC ,76 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 71 6,73 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,76 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 71 6,73 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 3,02 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,98 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 3,02 log CFU ml smet. kultura DCC ,72 log CFU ml smet. kultura DCC ,63 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,95 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 71 6,33 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 731 6,44 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,63 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,95 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 71 6,33 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 731 6,44 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 3,02 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,72 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 3,02 log CFU ml smet. kultura DCC ,56 log CFU ml smet. kultura DCC ,34 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 731 6,62 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,34 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 731 6,62 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 2,09 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,56 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 2,09 log CFU ml smet. kultura DCC ,88 log CFU ml smet. kultura DCC ,88 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,60 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,88 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,60 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 1,93 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,88 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 1,93 log CFU ml smet. kultura DCC ,58 log CFU ml smet. kultura DCC ,58 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,84 log CFU ml -1 nisinový preparát Nisaplin 0,02 g l -1 smet. kultura DCC ,58 log CFU ml -1 testovaný kmen CCDM 945 1,84 log CFU ml -1 nisinový preparát Nisaplin 0,02 g l -1 indik. kmen 5T 1,93 log CFU ml -1 smet. kultura DCC ,58 log CFU ml -1 indik. kmen 5T 1,93 log CFU ml

101 Obr. 1. série výrob. 7 Obr. 2. série výrob

102 Obr. 3. série výrob. 9 Obr. 4. série výrob

103 Obr. 5. série výrob

104 104

105 Plakátová sd lení

106

107 SLOŽENÍ MLÉKA A PROFIL MASTNÝCH KYSELIN MLÉ NÉHO TUKU NOSOROŽCE DVOUROHÉHO ERNÉHO (DICEROS BICORNIS MICHAELI) Kou imská Lenka 1, Rada Vojt ch 2, Vokálová Hana 1, Nový Pavel 1 1 Katedra kvality zem d lských produkt, 2 Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, FAPPZ, eská zem d lská univerzita v Praze Composition of Milk and Fatty Acid Profile of Fat from the Eastern Black Rhinoceros (Diceros bicornis michaeli) Summary: Basic components (fat, protein, casein, lactose, total solids and non-fat solids) in two milk samples and one sample of colostrum of the eastern black rhinoceros (Diceros bicornis michaeli) from the zoo in Dv r Králové were analyzed using infrared spectroscopy instrument MilkoScan FT 120. Fatty acid profile of milk fat was determined by GC/FID. Sample of colostrum had higher total solids, content of fat, total protein, casein, and less lactose than normal mature milk from two other females. Comparing the fatty acid profile with cow's milk the samples of normal milk from rhino contained more capric and lauric acids, and less palmitic and stearic acids. There was a significantly higher content of capric and lauric acids and lower proportion of palmitic, oleic and linoleic acids than in human milk. The sum of saturated fatty acids in rhinoceros samples was similar as in cow's milk. There were less monounsaturated fatty acids than in cow's and human milks. Polyunsaturaded fatty acid content was significantly higher than that of cow's milk, but roughly half that of human milk. Úvod Nosorožec je druhý nejv tší suchozemský savec. Pat í mezi býložravce a monogastry. Literárních údaj o složení nosorož ího mléka je velmi málo, áste n proto, že po celém sv t je v zajetí chováno pouze n kolik exemplá, jejichž rozmnožování není jednoduché. V sou asné dob existují pouze ty i rody a p t druh nosorožc. Jsou to nosorožec tuponosý (Ceratotherium simum) též nosorožec bílý, druh vyskytující se v Africe, nosorožec dvourohý (Diceros bicornis) též nosorožec erný, rozší en v Africe, nosorožec indický (Rhinoceros unicornis) též nosorožec pancé ový, vyskytuje se na území Indie, nosorožec jávský (Rhinoceros sondaicus) nejvzácn jší druh nosorožce, na Sumat e žije posledních jedinc a nosorožec sumaterský (Dicerorhinus sumatrensis) nejmenší nosorožec, v sou asné dob kriticky ohrožený druh. Samice nosorožce produkuje mléko p ibližn ješt 2 roky po porodu mlád te. Matky za ínají mlá ata odstavovat v období m síc života. Mléko nosorožc se v n kterých složkách výrazn liší mezi jednotlivými druhy a jeho složení se m ní i b hem laktace. Osthoff et al. 1 uvádí následující složení mléka nosorožce bílého (Ceratotherium simum) v g/kg: voda 922,5, tuk 7,4, tukuprostá sušina 70,1, proteiny 16,2, kasein 2,9, syrovátkové bílkoviny 13,3 a laktosa 75,5. Nath et al. 2 porovnává složení mléka n kolika druh nosorožc r zného stádia laktace (Tabulka I). Je vid t, že mléka nosorožc m la menší obsah sušiny, tuku a protein a více laktosy než mléko kravské. Jelikož nosorožec pat í mezi monogastry, jsou jeho obsahové složky bližší albuminovým mlék m nap. kon i lov ka. Profil mastných kyselin v mlé ném tuku nosorožce sledovalo pouze n kolik autor. Osthoff et al. 1 uvádí, že mléko nosorožc je charakterizováno vysokým množstvím nasycených mastných kyselin (603,7 g/kg mlé ného tuku), dále pak monoenových (104,8 g/kg) a polyenových mastných kyselin (61,9 g/kg). Dle autor existují velké rozdíly v obsahu kyseliny kaprinové v mléce indického nosorožce v r zných fázích laktace. Nam ené hodnoty se pohybují mezi 180 a 360 g/kg. Auto i uvád jí, že mlé ný tuk nosorožce bílého má obdobné zastoupení mastných kyselin jako tuk nosorožce indického, až na kyselinu laurovou. Mléko nosorožce bílého obsahuje 165,2 g/kg této kyseliny, což je dvojnásobné množství než u nosorožce indického se 42 až 80 g/kg. Zatímco v mléku nosorožce indického byla nalezena malá množství C10:1, C12:1, C16:3 a C26, žádná z t chto kyselin nebyla detekována v mléce nosorožce bílého 1. Profil mastných kyselin tuku mléka nosorožce bílého uvádí Tabulka II. 107

108 Tabulka I Složení mléka n kolika druh nosorožc r zného stádia laktace 2. Druh nosorožce Dny postpartum Celková sušina (%) Tuk (%) Proteiny (%) Sacharidy (%) Popel (%) Zdroj dle Nath et al. 2 Ceratotherium simum cottoni 1 14,23 1,73 7,34 NR NR Mathews (1973) Rhinoceros unicornis 41 NR 4,00 1,32 8,30 NR Lang (1961) Ceratotherium simum simum 150 8,84 0,60 1,54 6,50 0,2 Wallach (1969) Diceros bicornis ,8 0,2 1,4 6,6 0,3 Oftendal (1984) Ceratotherium simum simum 540 8,26 stopy 1,18 6,85 0,23 Wallach (1969) Diceros Aschaffenburg 570 8,10 stopy 1,54 6,06 0,34 bicornis et al. (1961) NR = neuvedeno; proteiny uvedeny jako hrubé bílkoviny (N x 6,38). Tabulka II Profil mastných kyselin tuku mléka nosorožce bílého 3. Mastná kyselina Relativní zastoupení v % C8:0 3,1 C10:0 26,6 C12:0 17,2 C14:0 10 C15:0 0,4 C16:0 17,1 C16:1c9 1,2 C17:0 0,5 C18:0 9,2 C18:1c9 8,9 C18:2c9,12 (n-6) 3,9 C18:3c9,12,15 (n-3) 2,6 C24:1c15 0,8 Materiál a metody Mléko a mlezivo nosorožce dvourohého východního erného (Diceros bicornis michaeli, Zukowsky 1964) bylo zamraženo a dodáno ze ZOO Dv r Králové. Pocházelo od t í samic Jessie (mlezivo), Elba a Maisha (zralé mléko 6 týdn po porodu). Základní složky mléka byly stanoveny infra ervené spektroskopie na p ístroji MilkoScan FT 120 (Foss, Dánsko). Odst ed ný mlé ný tuk byl esterifikován pomocí metanolické báze 0,5 (Supelco). Profil mastných kyselin byl analyzován pomocí GC/FID (Agilent 7890). Injektován byl 1 μl vzorku, split 1:10. Nosným plynem bylo helium o pr toku 1,2 ml/min. Kolona Rt-2560 m la rozm ry 100 m x 250 μm x 0,2μm. Teplota nást iku a detektoru byla 250 C. Teplotní program byl 70 C (výdrž 2 min.), 5 C/min na 225 C (výdrž 9 min.), 5 C na 240 C (výdrž 15 minut). Chromatogramy byly vyhodnoceny metodou vnit ní normalizace, identifikace analyt byla dle FAME mix 37 (Supelco), výsledky jsou uvád ny v relativních procentech. 108

109 Výsledky a diskuse Výsledky stanovení základních složek mléka uvádí Tabulka III. Vzorek mleziva (Jessie) m l vyšší celkovou sušinu, obsahoval více tuku, celkových bílkovin, kaseinu a mén laktosy než vzorky zralého mléka od ostatních dvou samic (Maisha a Elba). Výsledky odpovídají hodnotám, které pro zralé mléko nosorožce dvourohého uvádí Nath et al. (1993). Hodnoty obsahu kaseinu jsou ale p íliš vysoké na albuminové mléko, což bude z ejm zp sobeno kalibrací p ístroje MilkoScan na mléko kravské. Tabulka III Složení mléka (Elba a Maisha) a mleziva (Jessie) nosorožce dvourohého erného. Veli ina Jednotky Jessie Maisha Elba Hustota g/cm 3 1,03 1,04 1,04 Tuk % 3,99 0,99 0,41 Kasein % 3,99 1,82 1,42 Bílkoviny % 5,28 1,85 1,55 TS % 14,63 10,16 9,42 SNF % 10,97 8,94 8,71 Laktosa % 4,6 6,95 7,32 Bod mrznutí C -0,67-0,59-0,59 TS = celková sušina; SNF = tukuprostá sušina V tuku mléka nosorožce (Obr. 1) byly nejvíce zastoupeny nasycené mastné kyseliny kaprinová (C10:), laurová (C12:0), palmitová (C16:0) a myristová (C14:0). Z nenasycených dominovaly olejová (C18:1) a linolová kyselina (C18:2). Mlezivo se od zralého mléka odlišovalo vyšším obsahem linolové kyseliny, mén byly zastoupeny C12:0 a C14:0. Data získaná o zastoupení majoritních mastných kyselin se shodují s daty o nosorožci bílém (Ceratotherium simum) 3, i když se jedná o jiný druh. Oba dva druhy se ale vyskytují v Africe a dá se u nich p edpokládat podobná skladba stravy Elba Jessie Maisha Obr. 1. Porovnání zastoupení majoritních mastných kyselin v tuku mléka (Elba a Maisha) a mleziva (Jessie) nosorožce dvourohého erného. 109

110 P i porovnání profilu mastných kyselin s mlékem kravským 3,4,5,6 (Obr. 2) obsahovalo mléko nosorožce výrazn více kaprinové a laurové kyseliny, a mén palmitové a stearové kyseliny (18:0). Oproti mléku mate skému 3,7,8 byl zaznamenán také významn vyšší obsah kaprinové a laurové kyseliny, mén bylo naopak palmitové, olejové a linolové kyseliny. Celkov m ly vzorky mléka nosorožce (Obr. 3) obdobný podíl nasycených mastných kyselin jako mléko kravské a mén monoenových mastných kyselin než mléko mate ské i kravské. Obsah polyenových mastných kyselin byl výrazn vyšší než u mléka kravského, ale výrazn nižší v porovnání s mlékem mate ským. Rozdíly v obsahu mastných kyselin lze pozorovat nejen mezi mléky kaseinovými a albuminovými (mlé ný tuk nosorožce a krávy), ale i mezi mléky albuminovými (mléko mate ské a nosorožce), což reflektuje mimo jiné odlišné zp soby stravování a výživové požadavky mlá at Kravské Mate ské Nosorož í Obr. 2. Porovnání zastoupení majoritních mastných kyselin v tuku mléka nosorožce s tukem mléka kravského a mate ského Kravské Mate ské Nosorož í 10 0 SFA MUFA PUFA Obr. 3. Porovnání obsahu nasycených (SFA), monoenových (MUFA) a polyenových (PUFA) mastných kyselin v tuku mléka nosorožce s mlékem kravským a mate ským. 110

111 Záv r Složení mléka i profil mastných kyselin mlé ného tuku nosorožce dvourohého se významn odlišují jak od mléka kravského (kaseinového), tak i od mléka mate ského pat ícího shodn mezi mléka albuminová. Získané informace mohou být cenné pro odchov nosorožc v zajetí a v p ípadech záchrany mlá at, které p ijdou ve volné p írod o svoji matku. Pod kování: Auto i d kují Ing. Monice Ptá kové ze ZOO Dv r Králové a. s. za získání vzork mléka. Práce byla finan n podpo ena S grantem MŠMT R. Použitá literatura: 1. OSTHOFF, G., HUGO, A., JOUBERT, C., SWARTS, J. DSC of milk fats from various animals with high levels of medium-chain, unsaturated and polyunsaturated fatty acids. South African Journal of Chemistry, 2011, vol. 64, pp OSTHOFF, G., HUGO, A., DE WIT, M. Milk composition of a free ranging white rhinoceros (Ceratotherium simum) during late lactation. Mammalian Biology, 2008, vol. 73, no. 3, pp NATH, N. C., HUSSAIN, A., RAHMAN, F. Milk characteristic of a captive Indian rhinoceros (Rhinoceros unicornis). Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 1993, vo. 24, no. 4, pp RODRÍGUEZ-ALCALÁ, L. M., HARTE, F., FONTECHA, J. Fatty acid profile and CLA isomers content of cow, ewe and goat milks processed by high pressure homogenization. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, vol. 10, no. 1, pp KARGAR, S., GHORBANI, G. R., ALIKHANI, M., KHORVASH, M., RASHIDI, L., SCHINGOETHE, D Lactational performance and milk fatty acid profile of Holstein cows in response to dietary fat supplements and forage: Concentrate ratio. Livestock Science, 2012, vol. 150, no. 1-3, pp SERAFEIMIDOU, A., ZLATANOS, S., KRITIKOS, G., TOURIANIS, A. Change of fatty acid profile, including conjugated linoleic acid (CLA) content, during refrigerated storage of yogurt made of cow and sheep milk. Journal of Food Composition and Analysis, 2013, vol. 31, no. 1, pp JENSEN, R. The lipids in human milk. Progress in Lipid Research, 1996, vol. 35, no. 1, pp MOLTÓ-PUIGMARTÍ, C., CASTELLOTE, A., CARBONELL-ESTRANY, X., LOPÉZ-SABATER, M. Differences in fat content and fatty acid proportions among colostrum, transitional, and mature milk from women delivering very preterm, preterm and term infants. Clinical Nutrition, 2011, vol. 30, no. 1, pp Kontaktní adresa: Doc. Ing. Lenka Kou imská, Ph.D., Katedra kvality zem d lských produkt, FAPPZ, ZU v Praze, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, kourimska@af.czu.cz 111

112 112

113 VYBRANÉ UKAZATELE SYROVÉHO KOZÍHO MLÉKA ZE DVOU FAREMNÍCH CHOV A JEJICH ZM NY V PR B HU LAKTACE Kalhotka Libor 1, Šustová Kv toslava 2, Kuchtík Jan 3, Dostálová Lenka 1, Detvanová Lenka 1, Dvo ák Lukáš 2, Sýkora Vladimír 2, Pytel Roman 2 1 Ústav agrochemie, p doznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, 2 Ústav technologie potravin, 3 Ústav chovu a šlecht ní zví at, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brn Selected indicators of raw goat milk in two farms with different style of breeding and their changes during lactation Summary: The aim of this work was observe the behavior of milk during one period of lactation. There were studied selected indicators in raw goat milk from two farms with different style of breeding. During the lactation period were collected bulk samples in three times (begin, middle, and the end of lactation). In the samples were analyzed microbiological parameters such as total bacteria count (TBC), number of fam. Enterobacteriaceae, enterococci, psychrotrophic microorganisms (PSM), cytological parameter somatic cell count, respectively. The investigated microbial parameters (in CFU/mL) from farm A are following: TBC 9.3 x 10 4, Enterobacteriaceae 1.5 x 10 4, enterococci 99, PSM 2.9 x 10 4, and from farm B are these TBC 5.6 x 10 6, Enterobacteriaceae 3.1 x 10 2, enterococci 7.3 x 10 3, PSM 5.8 x 10 4, respectively. The technological parameter somatic cell count was 1,280,670 in the farm A and 987,330 cells/ml in the farm B. From non-microbial analysis were analyzed active acidity in ph, titratable acidity by Soxhlet-Henkel, content of fat (g/100g), lactose (g/100g), protein (g/100g), total solid (g/100g), conductivity (ms/cm), rennet coagulation time (sec) and curd quality (scale 1-5), respectively. The chemical-technological parameters in farm A were following: 6.71, 5.67, 2.97, 4.56, 2.60, 10.83, 4.56, 96.67, and 2, respectively. On the farm B there were these parameters 6.53, 6.61, 3.35, 4.59, 2.82, 11.62, 4.19, 65.33, and 2, respectively. The wide variability was in the samples by farm-self and between farms; the highest variability was observed in total bacteria count, somatic cell count, and in the titratable acidity. Úvod Malí p ežvýkavci - kozy se vyskytují po celém sv t, jsou považováni za dob e adaptovatelná zví ata pro pastvu a okus v neúrodných a marginálních oblastech, zejména v t žkých environmentálních a klimatických podmínkách. Oficiální údaje FAO nazna ují, že kozí farmá ství bude mít velkou roli v ekonomickém sektoru venkova r zných spole ností a v environmentálních oblastech na všech kontinentech. 1 Kozí mléko, stejn jako kravské, pat í mezi kaseinová mléka a v základním složení se mu podobá, v pr m ru obsahuje okolo 12,6 % sušiny, 3,4 % bílkovin, 3,8 % tuku, 4,3 % laktosy a 0,8 % minerálních látek. 2 Má bílou barvu, organismus kozy má omezenou schopnost vst ebávat beta-karoten a vylu ovat jej do mléka. 3 M rná hmotnost kolísá v rozmezí 1,025 1,036 g/l 3, pr m rné ph je 6,78 a titra ní kyselost mezi 6,20 7,20 SH. 4 Vyzna uje se typickou chutí a pachem, tyto jeho pro mnoho lidí nep íjemné vlastnosti lze minimalizovat správnou zoohygienou, technikou chovu, krmením a hygienou p i dojení. 3, 5 Mléko je díky svému složení a vlastnostem velmi dobrým substrátem pro mikroorganismy. Mikroflóra mléka m že být velmi pestrá a rovn ž množství p ítomných mikroorganism bývá velmi prom nlivé. Kritéria hygienické kvality syrového mléka jsou uvedena v Na ízení Evropského parlamentu a Rady (ES). 853/2004 ve zn ní pozd jších zm n (Na ízení 1662/2006). Obsah mikroorganism p i 30 C (na ml) má být v kozím mléce (klouzavý geometrický pr m r za dvoum sí ní období, alespo dva vzorky za m síc). Pokud je však mléko ur eno pro výrobu mlé ných výrobk ze syrového mléka postupem, který nezahrnuje tepelnou úpravu, musí mléko obsahovat mikroorganism na ml. Syrové mléko ur ené k prodeji musí rovn ž spl ovat limit daný naší národní legislativou, Vyhláškou. 11/2015 Sb. v níž je uveden limit pro Staphylococcus aureus 500 KTJ/ml. Toto jsou jediná mikrobiologická kritéria platící v eské republice pro syrové kozí mléko. Kritérium pro po et somatických bun k (PSB) není evropskou legislativou pro kozí mléko stanoveno. Pr m rné PSB v mléce zdravých koz se pohybují v rozmezí 113

114 od do /ml 6, podobné hodnoty uvád jí i Leitner et al. 7 Silanikove et al. 8 uvád jí, že PSB v mléce zdravých koz by m l init /ml. U malých p ežvýkavc (koz) existuje velká variabilita ve zp sobu chovu a není žádný metodický pokyn, jakým zp sobem kozí mléko vykupovat, na rozdíl od dojnic, u nichž je zp sob chovu a výkup mléka standardizovaný. Výkup kravského mléka je stabilní a dojnice, resp. složky mléka jsou sledovány celoro n jak mlékárnami, tak kontrolními orgány. Kozí mléko se v R zpracovává v drtivé v tšin p ímo na farmách p edevším na sýry, od erstvých až po déle zrající, nebo se vyrábí kozí tvaroh i žervé. Kozí mléko konzumní a máslo se zpravidla nevyrábí, ale v obchodní síti lze najít na eském trhu n kolik producent, kte í mléko importují do eské republiky zpravidla z Rumunska. Optimalizování parametr pro možný výkup kozího mléka a zvýšení jeho hygienických standard je dle Klimešové 9 sice možné, ale je t eba brát z etel na to, že v tuto chvíli se v eské republice kozy dojí pouze sezónn (v laktaci) a pouze ve stáji bez dalšího komer ního výkupu. Takovéto mléko je velmi variabilní a jeho parametry jsou ovliv ovány pr b hem laktace a dalšími vlivy mnohem více než mléko kravské, které je získáváno celoro n bez vlivu sezóny. Tato práce sleduje zm nu ukazatel u dvou kozích farem a monitoruje aktuální situaci v oblasti jednotlivých technologických a mikrobiologických ukazatel. Materiál a metodika Bazénové vzorky syrového kozího mléka ze dvou faremních chov (A a B) s r znou velikostí a technologickou úrovní (viz Tab. I) byly steriln odebrány a v chladu dopraveny k analýzám. Vzorky byly odebírány v pr b hu laktace (po átek, st ed a konec). Tabulka I Stru ná charakteristika farem Farma Plemeno Typ chovu Dojená zví ata Dojení Chlazení A bílá krátkosrstá konven ní 115 2x denn nerezové chladicí B koza bílá krátkosrstá koza konven ní do potrubí 2x denn do konví za ízení speciální sklen né nádoby v chladni ce V mléce byly standardními postupy stanovovány následující skupiny mikroorganism : celkový po et mikroorganism (CPM) na GTK-AB (MILCOM a.s. Tábor, R) p i 30 C za 72 h, bakterie. Enterobacteriaceae na V ŽG (MILCOM a.s. Tábor, R) p i 37 C za 24 h, enterokoky na Slanetz-Bartley agaru (Merck, N mecko) p i 37 C za 48 h a psychrotrofní mikroorganismy na GTK (MILCOM a.s. Tábor, R) p i 6,5 C za 10 dní. Po uplynutí doby kultivace byly ode teny na Petriho miskách narostlé charakteristické kolonie a výsledek byl po p epo tení vykázán jako KTJ/ml. Z dalších parametr byl sledován po et somatických bun k (PSB), ph, SH, množství tuku, laktosy, bílkovin, sušina, vodivost, as sý ení a jakost sý eniny. PSB byl sledován pomocí fluoro-opto-elektronické metody s využitím p ístroje Bentley Somacount 150 (Bentley Instruments, USA) dle SN EN ISO :2007 v laborato i eskomoravské spole nosti chovatel a.s. v Brn Chrlicích. Pro následující analýzy bylo zchlazené mléko vytemperováno na 40 C a zchlazeno na 20 C. Sušina byla stanovena dle SN ISO 6731, kde je navážka vzorku mléka p i 20 C vysrážena kyselinou octovou a dále se postupuje p i sušení dle SN. Stanovení obsahu dusíku a následný p epo et na istou bílkovinu bylo provedeno dle SN ISO Stanovení tuku bylo provedeno dle SN ISO 2446 Mléko stanovení obsahu tuku. Stanovení mlé ného cukru laktosy polarimetricky se provád lo dle SN Vodivost se stanovovala na p ístroji Conductometer GLF100 (Geisinger Electronic, N mecko) a byla m ena v ms/cm. Aktivní kyselost v ph byla m ena nakalibrovaným ph metrem, kdy sonda byla kalibrována v pufru 7 ph a poté v prost edí 4 ph. Následn byly sondou m eny vzorky kozího mléka p i 20 C. M ení titra ní kyselosti v SH

115 bylo provedeno dle metody z SN za použití 0,25N roztoku hydroxidu sodného na 100 ml mléka p i teplot 20 C. as sý ení je doba od p ídavku 2 ml sy idla do prvního vyvlo kování. Následn byl vzorek vložen na 60 min do termostatu p i teplot 35 C, a poté byla hodnocena kvalita sý eniny dle Gajd ška. 10 Výsledky a diskuse Výsledky analýz bazénových vzork kozího mléka jsou uvedeny v tabulkách II až IV. Hlavním ukazatelem kontroly hygieny syrového mléka a kritériem pro jeho výkup je stanovení celkového po tu mikroorganism CPM. Z výsledk mikrobiologických analýz (Tab. II) je patrné, že po ty CPM u mléka z farmy A spl ovaly p edepsaný limit na rozdíl od mléka z farmy B, které tento limit n kolikanásobn p ekro ily. To m že být zp sobeno rozdílnou technologií získávání a dalšího ošet ení mléka p edevším zp sobem chlazení. Zweifel et al. 11 uvádí ve Švýcarsku u bazénových vzork pr m r ádov 10 6 KTJ/ml, rozmezí pak 10 2 až 10 8 KTJ/ml, Foschino et al. 12 (2002) pro Itálii (Bergamo) rozmezí 10 3 až 10 5 KTJ/ml a Delgado-Pertiñez et al. 13 pro Špan lsko rozmezí 10 4 až 10 5 KTJ/ml. Pro posouzení syrového kozího mléka z pohledu dalších skupin mikroorganism, které mají technologický význam, lze využít doporu ených hodnot vycházejících z SN , které se ovšem týkají kravského mléka a nejsou právn závazné. Po et psychrotrofních mikroorganism by m l být do v 1 ml, po et termorezistentních mikroorganism do 2000 v 1 ml, po et koliformních bakterií nejvýše 1000 v 1 ml a sporotvorné anaerobní bakterie by m ly být v 0,1 ml negativní. Z tohoto pohledu jsou další velmi d ležitou skupinou psychrotrofní mikroorganismy. Ty mohou tvo it i více jak 90 % z mikrobiální populace zchlazeného mléka. 14 Jejich pr m rné po ty u farmy A nep esahují doporu ení pro syrové kravské mléko, u farmy B je tento limit p ekro en. Tabulka II Po ty mikroorganism v KTJ/ml a somatických bun k v bazénových vzorcích kozího mléka z farem A a B Farma Období CPM Enterobac. Enterokoky Psychrotrofní m. PSB (tis./ml) A po átek 2,1 x ,8 x ,1 x st ed 1,5 x ,5 x ,6 x konec 5,0 x ,1 x ,6 x pr m r 9,3 x ,5 x ,9 x ,67 B po átek 8,2 x ,1 x ,2 x st ed 8,5 x ,1 x ,1 x ,8 x konec 2,1 x ,8 x ,6 x pr m r 5,6 x ,1 x ,3 x ,8 x ,33 Vysv tlivky: CPM celkový po et mikroorganism, PSB po et somatických bun k Bakterie eledi Enterobacteriaceae se vyskytují v p d, ve vod, na rostlinných a živo išných materiálech. ada druh jsou patogeny rostlin a živo ich v etn lov ka. Z hlediska mikrobiologie mléka a mlé ných výrobk je významná skupina ozna ovaná jako koliformní bakterie, jejich zdrojem je st evní trakt teplokrevných zví at. Hrají významnou roli jako indikátory úrovn hygieny získávání mléka a jeho p ípadné fekální kontaminace, mohou indikovat i p ítomnost st evních patogen. Možnými zdroji kontaminace syrového mléka koliformními bakteriemi jsou hn j, p da a fekáln kontaminovaná voda. 15 Mohou se však množit i v biofilmu, útvaru typickém v mlé ném potrubí a na ostatních površích technologických potraviná ských za ízení. 16 Jejich pr m rné po ty p esahovaly za sledované období u obou farem 10 4 KTJ/ml. 115

116 Enterokoky pat í k nejvíce termotolerantním mikrob m ze skupiny nesporulujících bakterií. P vodním stanovišt m enterokok je intestinální trakt lidí a zví at. Sekundárn se nacházejí v mléce a mlé ných výrobcích. 17, 18 Jejich po ty v mléce z farmy A byly velmi nízké. U mléka z farmy B byl pr m rný po et za sledované období 7,3 x 10 3 KTJ/ml. Vysoké po ty t chto bakterií a jejich termotolerantnost mohou p edstavovat problém p i dalším zpracování mléka na r zné výrobky. 19 V EU zatím nejsou, na rozdíl od mléka kravského, stanoveny parametry pro po et somatických bun k v syrovém kozím mléce. Leitner et al. 7 uvád jí, že normální kozí mléko obsahuje až /ml. Z tohoto pohledu je tedy možno považovat PSB v mléce (Tab. II) z obou farem za odpovídající. Po ty mikroorganism v kozím mléce bývají tedy velmi prom nlivé a jsou ovlivn ny adou faktor. Hlavním faktorem je vliv farmy jako výsledek sou tu ady dalších faktor p edevším typu krmení, organizací chovu, hygienických podmínek p i dojení, zp sobu dojení atd. Samotné mléko je pak v pr b hu dojení vystaveno sekundární kontaminaci z okolního prost edí, dojicího za ízení, rukou doji e, vemene aj. 11, 12, 13 Stádium laktace však nemá na po et mikroorganism v kozím mléce na rozdíl od nap. po tu somatických bun k významný vliv. 12 Tabulka III Obsah tuku, bílkovin, laktosy, sušiny a vodivost ve vzorcích syrového kozího mléka z farem A a B Farma Období Tuk (g/100g) Bílkoviny (g/100g) 116 Laktosa (g/100g) Sušina (%) Vodivost (ms/cm) A po átek 3,13 2,40 4,66 10,9764 5,88 st ed 2,55 2,53 4,33 10,2481 4,00 konec 3,23 2,86 4,70 11,2739 3,81 pr m r 2,97 2,60 4,56 10,8328 4,56 B po átek 3,61 2,61 4,85 11,5750 5,16 st ed 2,65 2,64 4,46 10,5455 4,39 konec 3,78 3,22 4,47 12,7456 3,02 pr m r 3,35 2,82 4,59 11,6220 4,19 Tabulka IV Zjišt né ph, SH, as zasý ení a jakost sý eniny syrového kozího mléka z farem A a B as zasý ení Farma Období ph SH (s) Jakost sý eniny A po átek 6,71 6, st ed 6,74 4, konec 6,69 6, pr m r 6,71 5,67 96,67 2 B po átek 6,46 7, st ed 6,57 5, konec 6,55 7, pr m r 6,53 6,61 65,33 2 Obsah bílkovin v kozím mléce je variabilní a závisí na následujících ukazatelích: plemeno, 20, 21 genetika, sezónnost, stádium laktace, krmení a další. Pr m rn se bílkoviny (Tab. III) pohybovaly na farm A 2,60 % a na farm B 2,82 %. B hem celé laktace u obou farem až na jeden p ípad nedošlo ke vzr stu bílkoviny nad pr m rnou hodnotu 3,1 %, kterou uvádí Boyazoglu 22, Park et Haenlein 23 uvád jí jako pr m rnou hodnotu až 3,5 %. B hem laktace se m ní i obsah tuku,

117 který byl vyšší na farm B, a to ve všech odb rových termínech. Tu nost na farm B se pohybovala v pr m ru 3,55 % a na farm A 2,97 %. Boyazoglu 22 uvádí, že u st edomo ských plemen bývá tu nost v pr m ru 3,0 %, naopak vyšší hodnoty uvád jí Park et Haelein 23 a to až 3,8 %. Nejstabiln jší složkou s nejmenší variabilitou byla laktosa, jejíž obsah byl velmi podobný u obou farem. První dva odb rové termíny, byl obsah laktosy vyšší u farmy B, v posledním termínu pak u farmy A. V pr m ru obsah laktosy u farem A a B dosahoval 4,56 4,59 %. U laktosy byly nam eny celkov vyšší hodnoty než 4,1 %, které uvádí Park et Haenlein. 23 Všechny vzorky mléka, krom jediného (farma B - konec laktace 12,75 %) vykazovaly nižší obsah sušiny než literaturou udávaných 12,2 %. as sý ení bývá zpravidla u kozího mléka rychlejší než u mléka kravského, a to díky velikosti kaseinových micel. Jakost sý eniny dle Gajd ška 10 byla stanovena na hodnotu 2. Toto íslo znamená velmi dobrou jakost sý eniny, v porovnání s kravským mlékem, kozí mléko velmi z ídka dosahuje kvality 1. Kvalita sý eniny je ovlivn na obsahem alfa-s 1 -kaseinu, který v kozím mléce chybí a díky tomu se netvo í ideální trojrozm rná sraženina. Záv r Z výsledk je z ejmé, že vybrané ukazatele syrového kozího mléka vykazují významnou variabilitu jak na jednotlivých farmách v pr b hu laktace, tak v mnohem v tší mí e mezi farmami. Tyto rozdíly jsou zp sobeny mnoha faktory, z nichž nejvýznamn jší jsou plemeno, zdravotní stav, fáze laktace, produk ní systém, farma, zp sob dojení, po et dojených zví at, hygiena vemene, úrove hygieny a istoty dojicího za ízení, doba skladování mléka, teplota mléka p i skladování. Proto se vytvo ení obecn platných ustanovení obsahujících vybrané parametry vhodné jako podklad pro zpen žování kozího mléka v podmínkách eské republiky jeví jako proces dlouhodobý a složitý. Nicmén je možno využít p i tvorb t chto ustanovení p íklad ze zahrani í. Významnou roli zde ale bude vždy hrát konkrétní dodavatelsko-odb ratelská smlouva. Pod kování Práce vznikla s podporou projektu NAZV KUS QJ Použitá literatura 1. KALANTZOPOULOS, G. (2003): Kvalita ov ieho a kozieho mlieka z poh adu IDF. Mliekarstvo 34 (4), s HERIAN, K. (2008): Ov ie a kozie mliekarstvo na Slovensku. Farmá ská výroba sýr a kysaných mlé ných výrobk V. Sborník referát ze seminá e s mezinárodní ú astí. MZLU v Brn, s , ISBN MATYÁŠ, Z. (1990): Složení mléka samic jiných druh zví at než krav. In: Grieger, C., Holec, J. (eds.): Hygiena mlieka a mlie nych výrobkov. Príroda, Bratislava, s P IDALOVÁ, H. (2012a): Kozí mléko. In: Navrátilová, P., Králová (Dra ková) M., Janštová, B., p idalová, H., Cupáková Š., Vorlová, L.: Hygiena produkce mléka. VFU, FVHE, Brno. s , ISBN BOROŠ, V. (1999): Nebovinné mlieka vo výžive udí. Mliekarstvo 30 (2), s PAAPE, M. J., POUTREL, B., CONTRERAS, A., MARCO, J. C., KAPUCO, A. V. (2001): Milk Somatic Cells and Lactation in Small Ruminants. J. Dairy Sci. 84 (E. Suppl.): E237-E LEITNER, G., MERIN, U., SILANIKOVE, N., EZRA, E., CHAFFER, M., GOLLOP, N., WINKLER, M., GLICKMAN, A., SARAN, A. (2004): Effect of subclinical intramammary infection on somatic cell counts, NAGase activity and gross composition of goats milk. J. Dairy Res. 71, p doi: /S SILANIKOVE, N., LEITNER, G., MERIN, U., PROSSER, C. G. (2010): Recent advances in exploiting goat's milk: quality, safety and production aspects. Small Rumin. Res., 89(2-3): KLIMEŠOVÁ, M., HANUŠ, O., BOGDANOVI OVÁ, K., N ME KOVÁ, I., NEJESCHLEBOVÁ, L., KOPECKÝ, J., KALHOTKA, L. (2015): Hodnocení složkových, hygienických, fyzikálních a technologických ukazatel syrového ov ího a kozího mléka a jejich srovnání s kravským mlékem. Mléka ské listy Zpravodaj 152, s

118 10. GAJD ŠEK, S. (1997): Mléka ství II, MZLU v Brn, 84 s., ISBN ZWEIFEL, C., MUEHLHERR, J. E., RING, M., STEPHAN, R. (2005): Influence of different factors in milk production on standard plate count of raw small ruminant s bulk-tank milk in Switzerland. Small Ruminant Resaerch 58, p doi: /j.smallrumres FOSCHINO, R., INVERNIZZI, A., BARUCCO, R., STRADIOTTO, K. (2002): Microbial composition, including the incidence of pathogens, of goat milk from the Bergamo region of Italy during a lactation year. J. of Dairy Research, vol. 69, no. 2, p DELGADO-PERTIÑEZ, M., ALCALDE, M. J., GUZMÁN-GUERRERO, J. L., CASTEL, J. M., MENA, Y., CARAVACA, F. (2003): Effect of hygiene-sanitary management on goat milk quality in semi-extensive systems in Spain. Small Ruminant Resaerch 47, p SAMARŽIJA, D., ZAMBERLIN, Š., PAGA I, T. (2012): Psychrothropic bacteriaand milk and dairy products quality. Mljekarstvo 62 (2), p CUPÁKOVÁ, Š. (2012): Mikroorganismy v mléce. In: Navrátilová, P., Králová (Dra ková) M., Janštová, B., P idalová, H., Cupáková Š., Vorlová, L.: Hygiena produkce mléka. VFU, FVHE, Brno. s , ISBN HANUŠ, O., VYLET LOVÁ, M., JE ÁBKOVÁ, J. (2012): Kontrola jakosti mléka. In: Samková, E. (eds.): Mléko: produkce a kvalita. Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích. s FRANZ, CH., M. A. P., STILES, M. E., SCHLEIFER, K. H., HOLZAPFEL, W. H. (2003): Enterococci in foods a conundrum for food safety. Int. J. of Food Microbiology 88, p GÖRNER, F., VALÍK,.(2004): Aplikovaná mikrobiológia požívatín. MALÉ CENTRUM, Bratislava, 528 s., ISBN: FRANZ, CH., M. A. P., HOLZAPFEL, W. H., STILES, M. E. (1999): Enterococci at the crossroads of food safety? Int. J. of Food Microbiology 47, p PARK, Y. W. (2007): Rheological characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, 68, PARK, Y. W., JUÁREZ, M., RAMOS, M., HAENLEIN, G. F. W. (2007): Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Research, 68, BOYAZOGLU, J., MORAND-FEHR, P. (2001): Mediterranean dairy sheep and goat products and their quality. Small Ruminant Research 40(1), 1-11 [cit ]. DOI: /S (00) ISSN PARK, Y. W., HAENLEIN, G. F. (2006): Handbook of milk of non-bovine mammals. 1st ed. Ames, Iowa: Blackwell Pub., x, 449 p. ISBN Kontaktní adresa Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Ústav agrochemie, p doznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brn, Zem d lská 1, Brno, xkalhotk@node.mendelu.cz 118

119 ZM NY VE VÝT ŽNOSTI ERSTVÉHO SÝRA V ZÁVISLOSTI NA KVALIT MLÉKA Kala Robert, Ko án Jakub, Samková Eva, Bártová Zuzana Katedra kvality zem d lských produkt, Zem d lská fakulta, Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích The changes in yield of fresh cheese depending on the quality of milk Summary: The evaluation was performed of fresh cheese produced in laboratory conditions. The object was primarily to observe yield and active acidity (ph) of cheese depending on the quality and temperature of the milk during to renneting. Raw cows milk was collected in morning milking and was treated with gentle pasteurisation (72 C for 20 s). The period of collecting was from November 2012 to March Total number of samples was 45 and volume of each sample was 500 ml. All samples was examined in four experiments. To renneting was conducted at different temperatures: 30 C, 32 C and 34 C. Among the monitoring indicators were included weight of cheese (g), yield (%) and ph values. Detection and measurement of the curd was conducted six times the 1st, 4th, 7th, 19th, 22nd and 25th hour from the beginning of the formation of the curd. On the average weight of the cheese was differed each hour. The somatic cells count (SCC) could affected the weight of the cheeses, subsequently the yield. In milk with the highest SCC (355,000 cells/ml) was determined the lowest weight (167 g), meanwhile the milk with the lowest SCC (272,000 cells/ml) was determined the highest weight (216 g). The fermentation temperature could affected primarily ph value of the cheese, because when from the 19th hour were determined statistically higher ph values for higher fermentation temperatures. In conclusion the last measurement (the 25th hour) the ph values were 4.71 (30 C), 4.76 (32 C), additionally 4.87 (34 C). Úvod Výroba erstvých sýr je v porovnání s ostatními druhy sýr z ekonomického hlediska výhodn jší. Je to zp sobeno p edevším tím, že zde není pot eba dlouhého skladování ve zracích sklepech. Je však nutné podotknout, že v p ípad nedodržení správného výrobního procesu m že docházet k nižší výt žnosti a ovlivn ní výsledné jakosti sýra. erstvé sýry jsou definované jako nezrající sýry, které jsou po prokysání tepeln neošet ené [1]. Výrobu sýr ovliv uje nejen kvalita, ale také zdravotní nezávadnost mléka a technologie použitá p i jeho zpracování [2]. K získání co nejvyšší výt žnosti a kvality výsledného produktu je proto nutné použít mléko se správným složením a výbornou mikrobiologickou kvalitou. Správné složení má vliv p edevším na sy itelnost. Tu ovliv ují faktory, mezi n ž jsou azeny obsah kaseinu a zastoupení jeho frakcí, velikost a stav kaseinových micel a obsah a formy vápníku a fosforu [3]. Dalšími initeli ovliv ujícími sy itelnost mohou být teplota a ph mléka. D raz je kladen také na mikrobiologickou (celkový po et mikroorganizm ) a hygienickou (rezidua inhibi ních látek, po et somatických bun k PSB) kvalitu mléka. Je nap íklad prokázáno, že v p ípad vysokého PSB v mléce dochází k v tší ztrát bílkovin a tím ke snížení výt žnosti [4; 5]. Cílem pokusu bylo sledovat vybrané ukazatele erstvého sýra v závislosti na r zných podmínkách fermentace mlékárenské suroviny. Materiál a metodika Bazénové vzorky syrového kravského mléka byly odebrány na farm Haklovy Dvory p i ranním dojení. Z celkového po tu t í odb r v zimním období (tabulka I) byly uskute n ny ty i pokusy s celkovým po tem vzork 45 (7, 11, 12, resp. 15). Mléko bylo pasterováno v mini-pasterizéru FJ 16 (Ketris R) na teplotu 72 C po dobu 20 s. Po áste ném vychlazení byly vzorky mléka o objemu 500 ml p ipraveny do kádinek a vloženy do vodních lázní nastavených na fermenta ní teploty 30, 32 a 34 C (po et vzork pro každou teplotu byl 15). Zákysovou kulturou byl 5 % p ídavek podmáslí s obsahem tuku 1 %. Po deseti minutách byl p idán chlorid vápenatý a sy idlo Laktochym od spole nosti Milcom, a.s. (0,06 %, resp. 0,08 %). Koagulace probíhala 40 minut, po níž následovalo zpracování sý eniny pokrájení mini harfou na kosti ky o velikosti 2 x 2 cm. Pokrájená sý enina byla ponechána 20 minut ve vodní lázni a poté byla vkládána nab ra kou do formi ek. 119

120 Tabulka I Chemické složení a po et somatických bun k (PSB) u syrového kravského mléka Odb r 1 (pokus 1) Odb r 2 (pokus 2 a 3) Odb r 3 (pokus 4) Sušina (%) 12,73 13,39 13,07 Tuk (%) 3,48 4,58 4,15 Bílkoviny (%) 3,33 3,15 3,22 Kasein (%) 2,68 2,47 2,55 Laktóza (%) 5,28 4,92 4,95 PSB (tis./1 ml) Mezi sledované ukazatele byla zahrnuta hmotnost sýra (g), výt žnost (%) a ph sýra. Sledování ukazatel probíhalo po 1., 4., 7., 19., 22. a 25. hodin od po átku formování. Pro výpo ty výsledk bylo využito program Microsoft Excel a Statistica Cz 9.0 (Statsoft R). K analýze vliv (pokus, teplota) byla použita jednofaktorová analýza rozptylu. Pro porovnání (post-hoc testy) ve skupinách byl použit Fisher v LSD test na obvyklých hladinách významnosti. Výsledky a diskuse erstvé sýry jsou díky technologii výroby azeny k sýr m, které mohou být po prob hnutí procesu prokysávání ihned konzumovány. Díky tomuto faktu a pom rn jednoduché a levné výrob jsou vyhledávaným produktem. S postupem výroby, v etn kvality mléka, také souvisí d ležitý ekonomický ukazatel, kterým je výt žnost [6]. P i pokusech bylo vyrobeno celkem 45 vzork erstvých sýr, u nichž byla b hem prokysávání zjiš ována hmotnost pro stanovení výt žnosti a také aktivní kyselost. Vybrané statistické charakteristiky hmotností sýra zjišt ných v pr b hu prokysávání ( hodinu) jsou uvedeny v tabulce II. V tabulce je rovn ž uvedena výt žnost, která byla zjiš ována z hmotnosti sýra k p vodnímu objemu mléka v etn zákysové kultury. Tabulka II Vývoj hmotností (g) a výt žností (%) sýr b hem prokysání v jednotlivých pokusech ( pr m ry s odlišnými horními indexy v ádcích se statisticky významn liší na hladin p<0,05) Hodina a, b, c, d 1. pokus (n=7) 2. pokus (n=11) 3. pokus (n=12) 4. pokus (n=15) Celkem (n=45) hmot. výt ž. hmot. výt ž. hmot. výt ž. hmot. výt ž. hmot. výt ž. x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x x ±s x b ±13 32 b ±2 197 a ±18 37 a ±2 191 a ±17 36 a ±3 216 c ±10 41 c ±2 197±22 37± b ±12 26 b ±2 157 a ±18 30 a ±3 151 a ±9 29 a ±2 177 c ±10 34 c ±2 159±19 30± b ±14 21 b ±3 134 a ±7 26 a ±1 127 a ±9 24 a ±2 167 c ±11 32 c ±2 140±22 27± a ±5 19 a ±1 123 c ±7 23 c ±1 117 b ±4 22 b ±1 136 d ±9 26 d ±2 123±14 23± a ±6 21 a ±1 111 a ±4 21 a ±1 128 b ±9 24 b ±2 117±11 22± a ±5 20 a ±1 107 a ±4 20 a ±1 122 b ±9 23 b ±2 113±10 21±2 Z tabulky je patrný výrazný pokles hmotností vyráb ných sýr v pr b hu prvních sedmi hodin po vložení do formi ek, kdy došlo k poklesu hmotnosti o 29 % (z celkové pr m rné hmotnosti 197 g na 140 g). Mezi 7. a 25. hodinou pak došlo k poklesu hmotnosti o 19 % (ze 140 g na 113 g). 120

121 Jak již bylo uvedeno, složení mléka je jedním z faktor, který m že ovlivnit výt žnost sýra [7]. U sledovaných vzork se hodnoty v obsazích tuku, bílkovin, laktózy a PSB lišily (tabulka I). P edpoklad, že nap. nejvyšší obsah bílkovin/kaseinu bude znamenat vyšší výt žnost, však potvrzen nebyl. U vzorku 1 byl v porovnání s ostatními vzorky obsah bílkovin/kaseinu nejvyšší (3,33 %, resp. 2,68 %). P esto u tohoto vzorku byly zjišt ny nejnižší hmotnosti po 1. hodin formování. Faktorem, který mohl v tomto p ípad ovlivnit hmotnosti sýr a následn i výt žnosti, byl PSB. S klesajícím PSB se totiž zvyšovala pr m rná hmotnost sýra. S výjimkou pokusu 2 a 3, kde byl použit stejný bazénový vzorek mléka, byly rozdíly v hmotnostech mezi pokusy statisticky významné (p<0,05), [7; 8]. Teplota fermentace, jako druhý sledovaný faktor tohoto pokusu, ovlivnila zejména aktivní kyselost sýr. Aktivní kyselost nar stá se zvyšujícím se obsahem kyseliny mlé né, která vzniká rozkladem laktózy [9]. Zm na teploty fermentace ovlivnila znateln tento proces od 19. hod., kdy byly zjiš ovány statisticky vyšší hodnoty ph p i vyšších fermenta ních teplotách (tabulka III). P i posledním m ení (25. hod.) byly hodnoty ph 4,71 (p i 30 C), 4,76 (32 C) a 4,87 (34 C). Tabulka III Vývoj pr m rné aktivní kyselosti (ph) od 19. do 25. hodiny v závislosti na teplot ( a, b, c pr m ry s odlišnými horními indexy ve sloupcích se statisticky významn liší na hladin p<0,05) Teplota Hodiny ph s x ph s x ph s x 30 C 5,15 a 0,05 4,70 a 0,20 4,71 a 0,03 32 C 5,07 a 0,06 4,78 b 0,25 4,76 b 0,03 34 C 5,27 b 0,01 4,91 c 0,15 4,87 c 0,02 Záv r Z výsledk vyplývá, že p i zjiš ování hmotností, resp. výt žností byly v pr b hu prokysávání zjišt ny statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými pokusy. Tyto rozdíly byly pravd podobn zp sobeny PSB v mléce použitém k výrob sýr. Vzorky sýra vyrobené z mléka s nejvyšším PSB (355,000 bun k/ml) vykazovaly nejnižší výt žnost. Pod kování: P ísp vek byl sou ástí ešení projektu GAJU 002/2016/Z a NAZV KUS QJ Použitá literatura: 1. Vyhláška Ministerstva zem d lství R. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. 2. Abd El-Gawad, M.A.M., Ahmed, N.S. Cheese yield as affected by some parameters. Review. Acta Scientiarum Polonorum, Technologia Alimentaria, 2011, 10 (2): Šustová, K., Sýkora, V. Mlékárenské technologie. Brno, Mendelova univerzita, 2013, 223 s. ISBN Klei, L., Yun, J., Sapru, A., Lynch, J., Barbano, D., Sears, P., Galton, D. Effects of milk somatic cell count on Cottage cheese yield and quality. Journal of Dairy Science, 1998, 81 (5): Silva, N.M.A., Bastos, L.P.F., Oliveira, D.L.S., Oliveira, M.C.P.P., Fonseca, L.M. Influence of somatic cell count and total bacterial counts of raw milk in cheese yield using small-scale methodology. ARQUIVO Brasileiro de Medicina Veterinãria E Zootecnia [online], 2012, 64 (5):

122 6. Fenelon, M.A., Guinee, T.P. The effect of milk fat on cheddar cheese yield and its prediction, using, modifications of the Van Slyke cheese yield formula. Journal of Dairy Science, 1999, 82 (11): Sapru, A., Barbano, D.M., Yun, J.J., Klei, L.R., Oltenacu, P.A., Bandler, D.K. Cheddar cheese: Influence of milking frequency and stage of lactation on composition and yield. Journal of Dairy Science, 1997, 80 (3): Skeie, S. Characteristics in milk influencing the cheese yield and cheese quality. Journal of Animal and Feed Sciences, 2007, 16 (1): Samková, E. Mléko: produkce a kvalita. Milk: production and quality: v decká monografie. eské Bud jovice, Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích, 2012, 240 s. ISBN Kontaktní adresa: Ing. Robert Kala, Katedra kvality zem d lských produkt, Zem d lská fakulta, Jiho eská univerzita v eských Bud jovicích, Studentská 809, eské Bud jovice, eská republika, kalarobert@seznam.cz 122

123 VLIV PASTERACE A P ÍDAVKU CHLORIDU VÁPENATÉHO NA SY ITELNOST MLÉKA A JAKOST VZNIKAJÍCÍ SÝ ENINY Pytel Roman, Valí ková Jana, Sýkora Vladimír, P ibyla Lubomír, Šustová Kv toslava Mendelova univerzita v Brn, Ústav technologie potravin Influence of pasterization and of addition calcium chloride on rennet coagulation properties and curd quality Summary: The important milk property is fermentation activity of dairy fermented products, in the cheese-making there is another one, in detail it is rennet coagulation properties. These properties are determinated by empirical visual method such as addition of rennet into the raw milk and observation of the first casein flocks on the glass-wall. This paper focuses on subjective visual method in comparison with the nephelo-turbidimetry. The rennet coagulation properties were studied in the raw and pasteurized milk and with CaCl 2 addition. The significant difference was between these two methods from 3 to seconds. In theory, the pasteurized milk has the worst rennet coagulation properties, nevertheless, these properties are improved with the increasing concentration of adding calcium chloride. The quality of curd was evaluated after rennet coagulation. The curd quality is changed by the heat treatment and the additional CaCl 2, respectively. The final curd quality was influenced by heat treatment, rennet and calcium chloride addition. The finest curd quality was observed at commercial rennet CHY-MAX where calcium chloride was at low concentration. On the other hand, the commercial rennet Laktochym showed better curd quality with the higher concentration. Úvod Sy itelnost je jednou z nejd ležit jších technologických vlastností mléka, která zásadním zp sobem ovliv uje celý proces výroby sýr. P ídavkem sy idla do vzorku mléka za ne mléko podléhat fyzikáln biochemickým zm nám, které zahrnují modifikaci kaseinových micel, výsledkem jsou zm ny ve viskozit a elasticit mléka (1). as koagulace je doba (v sekundách), která je m ena od p ídavku sy idla do mléka do za átku koagulace (2). Dle studie (3) p edstavuje dobrá sy itelnost co nejkratší as nutný k vysrážení mléka od p ídavku sy idla. V provozních podmínkách se má mléko ideáln vysrážet nejd íve za minut, ale tuhnoucí charakter sý eniny je možný pozorovat d íve. Sy itelnost mléka ovliv uje mnoho faktor, které mohou ovliv ovat primární nebo sekundární fázi srážení, p ípadn ob. Složení mléka má p ímý vliv na koagulaci mléka a celkovou výt žnost sýr. Obzvláš významný je obsah vápníku, konkrétn jeho ionizovaná forma, která má p ímý vliv na vznik gelovité konzistence sý eniny (4). Materiál a metodika Mléko pocházelo z brn nského automatu, bylo vytemperováno na teplotu 40 C a zchlazeno na teplotu 20 C. Poté bylo ihned analyzováno. P ed m ením koagulace byly u mléka provedeny základní laboratorní analýzy, které mohou mít vliv na sy itelnost mléka. Byla stanovena dle SN (5) titra ní kyselost, ph, obsah vápníku, N-test a obsah bílkovin dle SN EN ISO :2002 (6). Mléko bylo po temperaci rozd leno na mléko syrové a na mléko, které bude vystaveno tepelnému ošet ení. Bylo p edpokládáno, že vlivem tepelného ošet ení bude as pot ebný ke koagulaci u pasterovaného mléka delší než u mléka syrového. Mléko bylo pasterováno na 72 C, 20 sekund tato kombinace teploty a asu je nej ast ji používána pro výrobu sýr. Následn bylo mléko rozd leno na celkem 20 vzork (4 vzorky mléka syrového, 4 vzorky mléka pasterovaného, 4 vzorky mléka pasterovaného s p ídavkem 20 μl, 30 μl nebo 40 μl 36% CaCl 2. P ídavek proteolytického enzymu do mléka vyvolá srážení bílkovin. Pro tuto práci byly použity chymosinové sy idla CHY-MAX a Laktochym. CHY-MAX byl ed n destilovanou vodou v pom ru 1:5, sy idlo Laktochym ed no nebylo. Dané ed ní bylo zvoleno tak, aby doba zasý ení se pohybovala v rozmezí sekund. 123

124 M ení koagulace mléka, probíhalo pomocí vizuální metody a metody využívající nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka pro kontrolu sy itelnosti mléka. Vzorek mléka (100 ml) byl vytemperován na 35 C, p i této teplot bylo k mléku p idán 1 ml sy idla a byl m en as pot ebný k zahlédnutí prvních vlo ek (vizuální metoda). Výsledkem nefelo-turbidimetrického m ení srážení mléka je k ivka s inflexním bodem p edstavujícím as koagulace mléka. Každý vzorek byl pro zvýšení objektivnosti podroben m ení dvakrát, z t chto ísel byl vypo ítán pr m r, který se porovnával s asem koagulace, který byl nam en nefelo-turbidimetricky. Statisticky byl vyhodnocen vztah mezi ob ma metodami za použití t-testu. Práce sledovala také sy itelnost u tepeln ošet eného mléka po p ídavku rozdílných koncentrací CaCl 2. Obr. 1. Nefelo-turbidimetrický sníma koagulace mléka (7) Zasý ené mléko bylo umíst no do termostatu vytemperovaného na 35 C. Po uplynutí jedné hodiny byly vzorky vyhodnoceny dle Gajd ška (8), kde sý enina první jakosti je velmi dobrá, pevná, po vyklopení si zachovává tvar. Syrovátka uvoln ná z této sý eniny je irá, žlutozelená. Nejhorší kvalitu má sý enina páté jakosti, kde nedochází k vyvlo kování kaseinu. Výsledky a diskuze Mléko, které bylo použito k porovnání sy itelnosti m lo titra ní kyselost v rozmezí 6,7 7,02 SH, pr m rné ph mléka bylo 6,69 6,71. Obsah vápníku se pohyboval v rozmezí 1,0 1,3 g/l. N-test byl vyhodnocen jako t ída 2 vzorek mléka po promíchání s reagens zm nil konzistenci, která byla do 30 sekund od smíchání kapalin viskózního charakteru s ulpívajícím filmem na skle. Po et bun ných element nep esahoval hranici, která by inila toto mléko nevhodné k sýra ské produkci. Bílkoviny byly stanoveny Kjeldahlovou metodou a to od 30,4 31,1 g/l. Porovnání sy idel Na obr. 2 vidíme, že inflexní bod (bod kdy dojde k vyvlo kování kaseinu) syrového mléka je lépe viditelný u sy idla Laktochymu než u CHY-MAXu ( CHY-MAX sráží mléko v malých, h e viditelných vlo kách). 124

125 Obr. 2. Porovnání sy itelnosti nefelo-turbidimetricky pomocí CHY-MAXu (inflexní bod stanovený nefelo-turbidimetrem 119 s) a pomocí Laktochymu (104 s) stejného syrového mléka Srovnání sy itelnosti mléka syrového, pasterovaného a pasterovaného s p ídavkem 40 μl CaCl 2 je viditelné na obr. 3, kde bylo mléko sráženo CHY-MAXem. Jak lze o ekávat nejkratší as ( as kdy dojde k vyvlo kování) má mléko pasterované s p ídavkem chloridu vápenatého. Nejdelší as zasý ení je u mléka pasterovaného bez p ídavku CaCl 2, kde dochází ke zm nám rozpustnosti vápenatých iont. Velmi podobný trend vykazovaly tyto mléka i p i zasý ení Laktochymem. Obr. 3. Porovnání sy itelnosti syrového mléka (inflexní bod stanovený nefelo-turbidimetrem 107 s), pasterovaného (119 s) a pasterovaného mléka s p ídavkem 40 μl CaCl 2 (93 s) P i porovnání sy idla CHY-MAX a stejného mléka dojde p i porovnání vizuální a nefelo-turbidimetrické metody ke statisticky významnému rozdílu mezi metodami, a to v rozmezí od 10,6 do 24,75 sekund na hladin pravd podobnosti 99 %. Statisticky významný rozdíl na stejné hladin pravd podobnosti p i použití Laktochymu se pohyboval v rozmezí od 3 do 14 sekund. 125

126 Na obr. 4 m žeme pozorovat, že ím v tší p ídavek chloridu vápenatého, tím kratší as k zasý ení mléka pot ebujeme. Tento trend je stejný pro ob použitá chymosinová sy idla. Obr. 4. Porovnání sy itelnosti pasterovaného mléka zasý eného Laktochymem s p ídavkem 20 μl CaCl 2 (inflexní bod stanovený nefelo-turbidimetrem 86 s), 30 μl CaCl 2 (80 s) a 40 μl CaCl 2 (76 s) Jakost sý eniny P i porovnání vzniklé sý eniny se potvrdil p edpoklad, že pokud se mléko zpasterizuje, bude to mít vliv na výslednou jakost sý eniny. Tyto sý eniny byly m kké, h e uvol ovaly syrovátku. Tato syrovátka byla mírn zakalena. Stejn tak na jakost sý eniny má vliv i použité sy idlo. P i vyšší koncentraci p idaného CaCl 2 je lepší použít sy idlo Laktochym, kdy vzniklá sý enina je pevná, drží tvar, syrovátka je zelenožlutá, irá. P i koncentraci 30 a 40 μl CaCl 2 byla výsledná sý enina jakosti 1, naproti tomu u p ídavku 20 μl CaCl 2 byla výsledná jakost 2 sý enina byla mén pevná a h e uvol ovala syrovátku. P i použití sy idla CHY-MAX vznikaly lepší sý eniny bez p ídavku CaCl 2 nebo p i koncentraci do 20 μl CaCl 2. Obr. 5. Porovnání jakosti sý eniny u CHY-MAXu a Laktochymu (hodnoceno dle 8) 126

127 Na základ zjišt ných výsledk je možné tvrdit, že ob srovnávané metody nepodávají stejné hodnoty výsledk a as koagulace m en vizuáln a s pomocí nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka se statisticky významn liší. Zjišt ný rozdíl v ase sy itelnosti mléka mezi jednotlivými metodami byl do 25 sekund. Naše výsledky jsou srovnatelné s prací autor Chládek a ejna, kte í se zabývali porovnáváním vizuální a p ístrojové metody s využitím nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka (9). Na základ nam ených výsledk bylo zjišt no, že rozdíl mezi výsledky p i porovnávání t chto dvou metod byl 40 sekund. Je tomu tak z d vodu, že pr m rný as koagulace mléka zjišt n vizuální metodou (po et vzork n=30), je 243 sekund, zatímco u stejného po tu vzork za stejných podmínek metody je as koagulace zjišt n nefelo-turbidimetrem 203 sekund. Záv rem studie je, že u vizuální metody dochází k opožd n jšímu ode ítání vlo ek, než je tomu u metody p ístrojové. Obdobnou analýzou se zabývala studie publikovaná v roce 2011 (10), ve které byl as koagulace mléka hodnocen u 16 bazénových vzork vizuální metodou a s využitím nefelo-turbidimetru. Cílem bylo zjistit vztah mezi t mito metodami. V této studii byly nam eny rozdílné výsledky asu koagulace mezi metodami, a to 139 sekund u vizuální metody a 58 sekund u metody p ístrojové. Studie zd vod uje, že tento rozdíl mohl vzniknout subjektivním vlivem a dále interakcí mléka, enzymu a metody, kdy v daných podmínkách p ístrojová metoda d íve zachytila koagulaci bílkovin. Mezi t mito dv ma metodami byla zjišt na signifikantní závislost, a z tohoto d vodu auto i doporu ují nefelo-turbidimetr pro pot eby sýrárny. Auto i dopl ují, že výpov hodnoty asu koagulace k následné možné technologické kvalit sýr, zejména ve smyslu jejich pravd podobné pozd jší konzistence a textury, se jeví jako mén významná (10). Záv r D ležitým krokem p i výrob sýr je správné dávková sy idla. Nadbytek zp sobuje tuhou, kožovitou sý eninu s ostrým lomem, kdežto nedostatek zp sobuje m kkou sý eninu. V obou p ípadech tak dohází ke ztrátám kaseinu, který odchází spole n se syrovátkou. P i stanovení sy itelnosti použitím nefelo-turbidimetru byl prokázán statisticky významné rozdíl oproti posuzování sy itelnosti okem, a to od 3 24,75 sekund p i hladin pravd podobnosti 99 %. Pastera ní záh ev má velmi velký vliv jak na sy itelnost, tak i na výslednou jakost sý eniny. Jako nejvhodn jší se projevil p ídavek CaCl 2 v množství 40 μl CaCl 2, kde byl as sy itelnosti nejnižší a to u CHY-MAXu v rozmezí sekund, u Laktochymu v rozmezí sekund. P i testování dvou sy idel byl zjišt n rozdílný vliv na kvalitu sý eniny i p i použití p ídavku CaCl 2. P ídavek vyšších koncentrací CaCl 2 (30 nebo 40 μl CaCl 2 /100 ml mléka) se více projevil na zlepšení jakosti sý eniny u mléka zasý eného Laktochymem. P i použití CHY-MAXu vznikaly sý eniny lepší kvality bez p ídavku CaCl 2. Vzniklé sý eniny byly pevné, soudržné, držely tvar a uvol ovaly irou, zelenožlutou syrovátku. Použitá literatura 1. EJNA V., 2008: Zkušenosti z mlékárny se sy itelností mléka ve vazb na dodavatele mléka [online]. P ibyslav. [cit ]. Dostupné z: Rapotin-Cejna.pdf 2. BU EK P., 2013: Koagulace mléka p i výrob sýr. In: Chov skotu,. 1, ro. 10, Praha, MSCH a.s. 3. EJNA V., P IBYLA L., 2006: Porovnání vizuální a nefelo-turbidimetrické metody pro m ení sy itelnosti mléka. In: Den mléka 2006, s. Praha: eská zem d lská univerzita v Praze, 172 s., ISBN: ROGINSKI H., FUQUAY J. W., FOX P., 2003: Encyclopedia of dairy sciences : Volume 1. New York: Academic Press, 557 s., ISBN SN (570530). 1972: Metody zkoušení mléka a tekutých mlé ných výrobk, Praha: Vydavatelství Ú adu pro normalizaci a m ení, 108 s. 6. SN EN ISO :2002: Mléko Stanovení obsahu dusíku ást 1, Metoda dle Kjeldahla, Praha: eský normaliza ní institut, 16 s. 127

128 7. P IBYLA L., 2015: CHARAKTERIZACE sy itelnosti MLÉKA pomocí Nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka [online] [cit ]. Dostupné z: 8. GAJD ŠEK S., 1998: Mléka ství II. Brno: Mendlova zem d lská a lesnická univerzita, 197 s., ISBN CHLÁDEK G., EJNA V., 2005: M ení sy itelnosti mléka pomocí nefelo-turbidimetrického sníma e. In: Mléko a sýry, s. ISBN: SOJKOVÁ K., HANUŠ O., GEN UROVÁ V., VYLET LOVÁ M., MANGA I., KOPECKÝ J., JEDELSKÁ R., 2011: Nefelometricky a tradi n stanovená sy itelnost.. In: Sborník z : Farmá ská výroba sýr a kysaných mlé ných výrobk VIII., s., Brno: Mendlova zem d lská a lesnická univerzita. ISBN: Pod kování: P ísp vek byl zpracován za podpory projektu NAZV KUS QJ Kontaktní adresa: Ing. Roman Pytel, Mendelova univerzita v Brn, Agronomická fakulta, Ústav technologie potravin, Zem d lská 1, Brno , r.pytel@seznam.cz Ing. Lubomír P ibyla, ul. Bílanská 83, Krom íž , LPribyla@seznam.cz prof. Ing. Kv toslava Šustová, Mendelova univerzita v Brn, Agronomická fakulta, Ústav technologie potravin, Zem d lská 1, Brno , kvetoslava.sustova@mendelu.cz 128

129 STANOVENÍ ŽIVOTASCHOPNÝCH PROBIOTICKÝCH LAKTOBACIL POMOCÍ QPCR S VYUŽITÍM PROPIDIUM MONOAZIDU Mühlhansová Andrea, Houšková Kate ina, Horá ková Šárka, Plocková Milada Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Determination of viable probiotic lactobacilli using qpcr with Propidium Monoazide Summary: The quantitative polymerase chain reaction technique with the use of intercalating dyes (propidium monoazide and ethidium monoazide) was tested for determination of viable lactobacilli. Conditions of the methods such as selecting dyes, dye concentration, the addition of sodium cholate and time of photoinduction were evaluated. The given method PMA-qPCR was compared with plate methods and qpcr methods without the use of propidium monoazide. Propidium monoazide with the final cocentration of 50 mmol l -1 with addition of 0,5 % wt. sodium cholate and 15 min of the photoinduction period with LED lamp was the most suitable for the determination of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei. Results obtained by this method were more comparable to those obtained by cultivation media than qpcr alone. Results obtained using this method was more specific than using qpcr. Úvod V dnešní dob roste zájem ve ejnosti o informace týkající se potravin, a už jsou to údaje o krajin p vodu potraviny, jejím zpracovateli i vlivu konzumace ur itých potravin na lidské zdraví. Zárove ím dál více spot ebitel od potraviny o ekává i její pozitivní vliv na zdraví. Výrobci se snaží na tuto poptávku reagovat a nap íklad p idávají do svých potravin probiotika. Probiotika jsou živé mikroorganismy, které p i podání v adekvátním množství p ináší hostiteli zdravotní výhody (FAO/WHO, 2002). Dle mnohých autor je t eba, aby výrobek obsahoval alespo 10 6 až 10 9 KTJ g -1 životaschopných probiotických mikroorganism (1). Z tohoto d vodu je d ležité mít ov ené metody selektivního stanovení probiotických bakterií (1,2). N kte í auto i upozor ují na problém selektivního stanovení probiotických mikroorganism ve sm si s ostatními bakteriemi mlé ného kvašení pomocí plotnových metod a nabízejí jako možné ešení stanovení pomocí kvantitativní polymerázové et zové reakce, které by navíc umož ovalo ur it, zda se jedná o deklarovaný kmen (3,4). Klasické stanovení po tu kolonií pomocí ploten se selektivní p dou je metodou, kterou se zachycují pouze živé bu ky, což je její velkou výhodou, na druhou stranu se jedná o asov náro nou metodu, která m že vykazovat odchylku až 30 % (5). Z tohoto d vodu by bylo vhodné použití qpcr, která je rychlejší a p esn jší (3,5). Výhodou qpcr je její vysoká citlivost, p esnost, dobrá opakovatelnost, minimální riziko kontaminace a nejsou t eba další kroky (po qpcr). Mezi její nevýhody pat í, že data získaná pomocí qpcr zna n závisí na p esnosti odb ru a p íprav vzorku, kvalit standardu a správném výb ru primer. Další její nevýhodou je, že se stanovují nejen živé bu ky, ale též mrtvé (5). V sou asnosti jsou již vyvinuty techniky pro stanovení pouze živých bun k pomocí propidium monoazidu (PMA) (5,6) i ethidium monoazidu (EMA) (6). Cílem ráce bylo optimalizovat metodu pro stanovení pouze životaschopných laktobacil za použití propidium monoazidu v kombinaci s qpcr (PMA-qPCR). Byly hodnoceny podmínky metody jako je výb r barviva, koncentrace barviva, p ídavek cholátu sodného a doba fotoindukce. Daná metoda PMA-qPCR byla porovnána s plotnovými metodami a qpcr bez použití propidium monoazidu. 129

130 Experimentální ást Použité kmeny Byly použity kmeny: Lactobacillus acidophilus CCDM 151 Laktoflora Lactobacillus casei Lafti L26 DSM (Nizozemsko). Milcom ( R) a Kultivace kmen rodu Lactobacillus Zkoumané kmeny rodu Lactobacillus byly kultivovány v bujónu MRS, ph 5,6 (po sterilaci), bylo zao kováno 1 obj. % inokula. Laktobacily byly kultivovány v upravené atmosfé e s obsahem 5 % obj. CO 2 p i 37 C. Plotnové metody V práci byly vyzkoušeny a porovnávány plotnové metody pro kvantifikaci L. casei a to konkrétn MRS agar s vankomycinem (MRS-V) p i podmínkách anaerobní inkubace za teploty 37 C po dobu 72 h, ph bylo upraveno na hodnotu 5,2-4,6 a p idán vankomycin; výsledná koncentrace 1 mg l -1, dále LC agar, jehož složení bylo následující: na jeden litr 10 g bakteriologického peptonu, 1 g kvasni ného extraktu, 4 g Lab Lemco, 2 g KH 2 PO 4, 3 g trihydrátu acetátu sodného, 1 g citrátu triamonného, 0,2 g heptahydrátu síranu ho e natého, 0,05 g tetrahydrátu síranu ho e natého, 1 g hydrolyzátu kyselého kaseinu, 1 g Tweenu 80, ph upraveno na 5,1 ± 0,1, p idáno 6 ml bromkresolové zelen a 12 g bakteriologického agaru. T sn p ed o kováním byla k médiu p idána D-ribosa; kone ná koncentrace 1 % hm, misky byly inkubovány anaerobn p i 27 C po dobu 72 až 96 h (LC) (1). Pro stanovení presumptivního po tu L. acidophilus na selektivní živné p d byl použit postup dle SN ISO Dle této normy byla p ipravena MRS p da s clindamycinem hydrochloridem a ciprofloxacinem hydrochloridem (MRS/CL/CP); ph 6,2 ± 0,2. Výsledná koncentrace clindamycinu hydrochloridu byla 0,1 mg l -1, ciprofloxacinu hydrochloridu 10 mg l -1. Misky byly inkubovány anaerobn p i 37 C po dobu 72 ± 3 hodiny ( SN ISO 20128). Dále byl použit agar MRS ph 5,6 (MRS 5,6) používaný obecn pro stanovení laktobacil. Izolace DNA s obarvením propidium monoazidem nebo ethidium monoazidem Byl odst ed n 1 ml erstv narostlé kultury ( g, 10 min, 4 C) a odsán supernatant. Bu ky byly promyty v 1 ml 1,5 % (hm.) roztoku NaCl a odst ed ny g, 10 min, 4 C). Po odsátí supernatantu bylo p idáno 500 l sterilní vody. K suspenzi bylo p idáno 1,25 l roztoku PMA (roztok 20% obj.) sterilního dimethylsulfoxidu s PMA (finální koncentrace 50 mmol l -1 PMA) a prob hla inkubace 5 min ve tm. Následovala fotoindukce azidové skupiny použitím LED lampy (Phastblue, GenIUL, Špan lsko) (15 min). Suspenze byla odst ed na ( g, 10 min, 4 C), supernatant byl odsán, bu ky byly promyty nejprve v 1 ml 1,5 % (hm.) roztoku NaCl, odst ed ny ( g, 10 min, 4 C), a poté v 1 ml sterilní vody a op t odst ed ny ( g, 10 minut, 4 C). Dále bylo p idáno 400 l lytického pufru a prob hla inkubace 1 h p i 37 C. Poté bylo p idáno 25 l proteinasy K (20 mg ml -1 ) a 200 l pufru AL a následovala inkubace 30 min p i 70 C. Suspenze byla p evedena do 2 ml mikrozkumavek s 0,3 g zirkoniových kuli ek (diametr 0,5 mm). Mikrozkumavky byly prot epány 3krát po dobu 30 s. Suspenze byla p evedena zp t do Eppendorfových zkumavek a odst ed na ( g, 10 min, 25 C). Po p evedení do kolonky (DNeasy Mini spin z kitu DNeasy Blood and Tiessue kit, Qiagen, N mecko) bylo p idáno 200 l ethanolu (98 %, -20 C) a inkubováno 5 min p i 25 C. Poté byl vzorek odst ed n (5 750 g, 2 min, 4 C). Po odst ed ní byl vylit obsah sb rné zkumavky, p idáno 500 l pufru AW1 a následovalo odst ed ní (6 750 g, 2 min, 4 C). Op t byl vylit obsah sb rné zkumavky, bylo p idáno 500 l pufru AW2 a odst ed no ( g, 3 min, 4 C). Nakonec byl ješt jednou vylit obsah sb rné zkumavky a následovalo další odst ed ní ( g, 3 min, 4 C). P ed elucí DNA byla vym n na sb rná zkumavka. Na st ed membrány v kolonce bylo napipetováno 50 l elu ního pufru AE, prob hla inkubace 2 min p i 25 C a poslední odst ed ní (5 750 g, 1 min, 4 C). V p ípad obarvení ethidium monoazidem byl PMA pouze nahrazen EMA. Pufry AW1, AW2, AL jsou sou ásti komer n dostupného kitu DNeasy Blood and Tiessue kit, Qiagen, N mecko. 130

131 Izolace DNA s použitím cholátu sodného p ed obarvením PMA a EMA upravenou metodou dle Yanga a kol. (2011) Byl odst ed n 1 ml erstv narostlé kultury ( g, 10 min, 4 C) a odsán supernatant. K pelet byl p idán cholát sodný (kone ná koncentrace 0,5 hm. %) a poté prob hla inkubace 30 min p i 37 C. Dále se v práci pokra ovalo dle p edchozího odstavce. Kvantitativní polymerázová et zová reakce Nejprve byl p ipraven mix dle tabulky I. Následn bylo do každé jamky napipetováno 9 l mixu. A poté byl do každé jamky napipetován 1 l izolované a obarvené DNA zp sobem uvedeným výše (triplikátn byla napipetována kalibra ní ada i neznámé vzorky). Vlastní reakce probíhala dle tabulky II. Primery použité pro kvantifikaci L. acidophilus a L. casei kódují geny peptidoglykanhydrolas a byly navrženy na Ústavu mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT v Praze. Tabulka I PCR mix PCR mix výrobce objem ( l) iq SYBR Green Supermix Biorad 5 Primer Fwd (10 mol l -1 ) GeneriBiotech 0,5 Primer Re (10 mol l -1 ) GeneriBiotech 0,5 Demineralizovaná sterilní voda - 3 Celkový objem 9 Tabulka II Pr b h qpcr reakce Po et cykl Teplota ( C) as (s) / K ivka tání ,05 s / 0,5 C Výrobky z komer ní sít, porovnání metod Bylo porovnáváno 7 r zných fermentovaných nápoj pomocí plotnových metod, qpcr a PMA-qPCR. Izolace DNA prob hla podle návodu výše s jednou modifikací a to, že byl odst ed n 1 ml desetkrát z ed ného fermentovaného mlé ného nápoje. ed ní prob hlo fyziologickým roztokem. Složení a pr b h reakce byl dle Tabulek I-II stejný jako pro isté kultury. Výsledky a diskuse Porovnání kvantitativního stanovení po tu bun k L. acidophilus a L. casei pomocí propidium monoazidu a ethidium monoazidu Bylo provedeno porovnání stanovení po tu kolonií tvo ících jednotek kmene L. casei a L. acidophilus, jak je uvedeno v tabulkách III-V, pomocí kultiva ních metod, qpcr, PMA-qPCR a pomocí qpcr s obarvením EMA (EMA-qPCR). Po et bun k stanovený pomocí qpcr byl o 1,0-1,3 ádu vyšší než plotnovými metodami. Lepší korelace s kultiva ními metodami byla dosažena u qpcr s interkala ními barvivy. Nocker a kol. uvádí, že v jejich práci došlo k poklesu po tu bun k stanovených pomocí EMA-qPCR o 1-2 ádu oproti stanovení PMA-qPCR. Tento jev je dán tím, že EMA m že proniknout také bun nou st nou živých bun k a zkreslovat tak výsledky, zatímco PMA bun nou st nou živých bun k neproniká (6). Množství živých bun k, do kterých EMA pronikne je dáno druhem bun k (6), použitou koncentrací barviva (7) i hustotou bakteriální suspenze (7, 8). Existují názory, že EMA není vhodný k odlišení živých a mrtvých bun k (7, 8, 9). PMA byl navržen jako vhodná alternativa EMA, nebo je specifi t jší. D vodem by mohlo být to, že PMA má vyšší náboj 131

132 molekuly (PMA 2+, EMA 1+ ) (6). Nevýhodou PMA je generace falešn pozitivních výsledk z d vodu potla ení neúplného signálu. Na druhou stranu, EMA-qPCR zp sobuje vyšší snížení C T hodnoty než PMA-qPCR p i srovnání s qpcr (10). Ke stejnému výsledku se došlo i v této práci u L. casei Lafti L26 a L. acidophilus CCDM 151. Tabulka III Porovnání stanovení po tu bun k isté kultury L. casei Lafti L26 pomocí plotnových metod, qpcr a qpcr s obarvením PMA a EMA (log KTJ ml -1 ) MRS 5,6 MRS-V LC qpcr PMA-qPCR EMA-qPCR 8,49 8,45 8,46 9,78 9,77 9,62 Tabulka IV Porovnání stanovení po tu bun k isté kultury L. acidophilus CCDM 151 pomocí plotnových metod, qpcr a qpcr s obarvením PMA a EMA (log KTJ ml -1 ) MRS 5,6 MRS/CL/CP qpcr PMA-qPCR EMA-qPCR 8,08 8,04 8,31 7,91 5,02 Vliv zm ny podmínek na kvantitativní stanovení po tu živých bun k L. acidophilus a L. casei pomocí PMA-qPCR a EMA-qPCR Byla popsána nutnost stanovení efektivní koncentrace barviva a doby ozá ení pro stanovovaný mikroorganismus (11). Byla provedena stanovení pro optimalizaci metody pro použití PMA-qPCR (EMA-qPCR) pro L. casei a L. acidophilus se zam ením na koncentraci použitého barviva a dobu fotoindukce barviva. isté kmeny L. casei Lafti L26 a L. acidophilus CCDM 151 byly kultivovány v bujónu a dále byla provedena izolace DNA se zm nou koncentrace barviva (kone ná koncentrace barviva 25 mmol l -1, 50 mmol l -1, 100 mmol l -1 a 200 mmol l -1 ) v prvním p ípad (obr. 1 a 2), ve druhém p ípad (obr. 3 a 4 byla použita koncentrace barviva 50 mmol l -1, ale byla pozm n na doba fotoindukce (7,5 min, 15 min a 30 min). Po et bun k stanovený plotnovou metodou byl u L. casei Lafti L 26 i L. acidophilus CCDM 151 o 2 ády nižší než qpcr, oproti PMA-qPCR o cca 1,5 ádu. V p ípad EMA-qPCR se od sebe L. casei a L. acidophilus lišili více. U L. casei došlo k poklesu od PMA-qPCR o 0,3 ádu. U stanovení po tu bun k L. acidophilus s rostoucí koncentrací EMA klesal stanovený po et bun k. EMA se nejspíše navázala na DNA i ze živých bun k L. acidophilus. Z obrázk 3 a 4 je patrné, že doba fotoindukce nem la v t chto p ípadech p íliš velký vliv na stanovení po tu bun k L. casei a L. acidophilus (pouze v p ípad doby fotoindukce 7,5 minuty u EMA-qPCR byl zaznamenán pokles po tu stanovených bun k o 2,5 ádu). Fotoindukci po dobu 15 minut pro obarvení PMA používají ve své práci nap íklad Guarcía- Caguella a kol. (2009). Obr. 1 Stanovení po tu bun k L. casei Lafti L26 p i r zné koncentraci interkala ních barviv 132

133 Obr. 2 Stanovení po tu bun k L. acidophilus CCDM 151 p i r zné koncentraci interkala ních barviv Obr. 3 Stanovení po tu bun k L. casei Lafti L26 p i r zné dob fotoindukce interkala ních barviv Obr. 4 Stanovení po tu bun k L. acidophilus CCDM 151 p i r zné dob fotoindukce interkala ních barviv Použití cholátu sodného p ed obarvením bun k PMA a EMA u qpcr upravenou metodou dle Yanga a kol. (2011) Dle Yanga a kol. (2011) je vhodné p ed obarvením bun k PMA použít deoxycholát sodný. Ú inek cholátu sodného byl testován v této práci u L. casei Lafti L26, který byl kultivován v bujónu. Byla vyizolována DNA s cholátem sodným (CHS). Bylo také provedeno stanovení po tu bun k plotnovou metodou na MRS agaru ph 5,6; Porovnání výsledk je patrné v tabulce V. Po et bun k obarvených PMA (EMA) bez cholátu sodného byl vyšší než po et bun k obarvených PMA (EMA) s cholátem sodným. Po tu bun k stanovených plotnovými metodami bylo nejblíže stanovení PMA-qPCR s cholátem sodným. Ke stejnému zjišt ní došli Yang a kol. (2011) 133

134 v práci zam ené na kvantitativní stanovení E. coli. V naší práci pro L. casei Lafti L26 jsou výsledky získané EMA-qPCR s použitím cholátu sodného bližší plotnové metod nežli pouze EMA-qPCR. Tabulka V Porovnání stanovení po tu bun k pomocí qpcr, qpcr-pma, qpcr-pma-chs, qpcr-ema, qpcr-ema-chs a plotnovými metodami L. casei Lafti L26 (log KTJ ml -1 ) MRS 5,6 qpcr PMA-qPCR PMA-qPCR s CHS EMA-qPCR EMA-qPCR s CHS 9,00 11,55 9,74 8,94 9,31 9,10 Výrobky z komer ní sít, porovnání metod Po et mikroorganism obsažených ve výrobcích zakoupených v komer ní síti byl stanoven pomocí plotnových metod, qpcr a PMA-qPCR. Bylo zjišt no, že po et bun k L. casei a L. acidophilus stanovený PMA-qPCR se více shoduje s po tem bun k stanoveným plotnovými metodami než pomocí qpcr, jak je vid t v Tabulce VI resp. VII. Všechna testovaná acidofilní mléka obsahovala více jak 10 6 KTJ g -1 L. acidophilus, ímž splnila podmínku pro acidofilní mléka danou Vyhláškou MZe. 77/2003 Sb. Všechny testované výrobky obsahovaly L. casei v rozmezí KTJ g -1. Tabulka VI Porovnání stanovení po tu bun k L. acidophilus ve výrobcích z komer ní sít plotnovými metodami, qpcr a PMA-qPCR (log KTJ g -1 ) P da/qpcr Výrobek 1 Výrobek 2 Výrobek 4 Výrobek 5 Výrobek 6 MRS/CP/Cl 6,85 6,83 5,18 5,62 6,76 qpcr 7,83 8,43 6,30 6,94 7,78 PMA-qPCR 7,77 8,00 5,18 6,92 7,40 Tabulka VII Porovnání stanovení po tu bun k L. casei ve výrobcích z komer ní sít plotnovými metodami, qpcr a PMA-qPCR (log KTJ g -1 ) P da/qpcr Výrobek 3 Výrobek 4 Výrobek 7 MRS-V 8,72 5,71 6,81 LC 8,67 5,53 6,69 qpcr 7,15 5,98 7,32 PMA-qPCR 6,80 5,96 6,78 Záv r Byla provedena optimalizace qpcr s použitím PMA a EMA. Pro stanovení po tu bun k L. casei a L. acidophilus byla vybrána PMA-qPCR s kone nou koncentrací PMA 50 mmol l -1 a optimální doba fotoindukce byla stanovena na 15 minut p i použití LED lampy Phastblue, GenIUL (Špan lsko). P i použití ošet ení bun k cholátem sodným (kone ná koncentrace 0,5 hm. %) p ed samotnou reakcí PMA-qPCR bylo dosaženo nejvyšší shody s hodnotami po tu bun k stanovenými kultiva ními metodami. Výsledky získané pomocí této metody byly specifi t jší než pomocí qpcr. Metoda PMA-qPCR se osv d ila i pro kvantifikaci L. casei a L. acidophilus ve sm si s dalšími BMK ve fermentovaných mlé ných nápojích zakoupených v distribu ní síti. 134

135 Pod kování: Financováno z ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT. 20/2015). Použitá literatura: 1. Shah N. P.: Probiotic Bacteria: Selective Enumeration and Survival in Dairy Foods. Journal of Dairy Science 83, (2000). 2. Lima K. G. de C., Kruger M. F., Behrens J., Destro M. T., Landgraf M., Melo Franco B. G.: Evaluation of culture media for enumeration of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium animalis in the presence of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus. Food and Technology 42, (2009). 3. Furet J.P., Quénée P., Tailliez P: Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR. International Journal of Food Microbiology 97, (2004). 4. Huang Ch. H., Lee F. L.: Development of novel species-specific primers for species identification of the Lactobacillus casei group based on RAPD fingerprints. Journal of the Science of Food Agriculture 89, (2009). 5. García-Cayuela T., Tabasco R., Peláez C., Requena T.: Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bi dobacteria in fermented milk by using propidium monoazide and realtime PCR. International Dairy Journal 19, (2009). 6. Nocker A., Cheung Ch-Y., Camper A. K.: Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods 67, (2006). 7. Flekna G., Štefani P., Wagner M., Smulders F. J. M., Možina S. S., Hein I.: Insufficient differentiation of live and dead Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes cells by ethidium monoazide (EMA) compromises EMA/real-time PCR. Research in Microbiology 158, (2007). 8. Kobayashi H., Oethinger M., Tuohy M. J., Hall G. S., Bauer T. W.: Unsuitable distinction between viable and dead Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by ethidium bromide monoazide. Letters in Applied Microbiology 48, (2009). 9. Nam S., Kwon S., Kim M.-J., Chae J.-Ch., Maeng P. J., Park J.-G.,Lee G.-Ch.: Selective detection of viable Helicobacter pylori using ethidium monoazide or propidium monoazide in combination with realtime polymerase chain reaction. Microbiology and Immunology 55, (2011). 10. Fittipaldi M., Nocker A., Codony F.: Progress in understanding preferential detection of live cells using viability dyes in combination with DNA ampli cation. Journal of Microbiological Methods 91, (2012). 11. Yáñez M. A., Nocker A., Soria-Soria E., Múrtula R., Martínez L., Catalán V.: Quantification of viable Legionella pneumophila cells using propidium monoazide. Journal of Microbiological Methods 85, (2011). 12. Yang X., Badoni M., Gill C. O.: Use of propidium monoazide and quantitative PCR for differentiation of viable Escherichia coli from E. coli killed by mild or pasteurizing heat treatments. Food Microbiology 28, (2011). Kontaktní adresa: Ing. Andrea Mühlhansová, Ústav mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha, Technická 5, , Praha 6 Andrea.Muhlhansova@vscht.cz 135

136 IDENTIFIKACE BAKTERIÍ RODU ACINETOBACTER, IZOLOVANÝCH Z MLÉKÁRENSKÝCH SUROVIN, VÝROBK A VÝROBNÍHO ZA ÍZENÍ, POMOCÍ METODY PCR S ORIGINÁLN NAVRŽENÝMI RODOV SPECIFICKÝMI PRIMERY Šviráková Eva 1, Mühlhansová Andrea 2, Purkrtová Sabina 3, Jelínková Markéta 4, Felsberg Jürgen 4 1 Ústav konzervace potravin, 2 Ústav mléka, tuk a kosmetiky, 3 Ústav biochemie a mikrobiologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 4 Mikrobiologický ústav Akademie v d eské R, v. v. i., St edisko sekvenování DNA Identification of Acinetobacter spp. isolated from dairy raw materials, dairy products and production facilities using the PCR method with the originally designed genus-specific primers Summary Bacteria of the Acinetobacter genus belong to the Gram-negative, non-spore-forming, non-motile, nonfermentative, oxidase-negative, nitrate-negative, strictly aerobic, bacteria. There are important soil and water bacteria with wide occurrence in nature, raw food materials, foods and human sources. Acinetobacteria represent health risk bacteria causing in immunocompromised individuals life-threatening infections, mostly nosocomial infections. These bacteria represent a significant technological risk in the dairy industry where causing serious problems in connection to many sensory and texture defects. They can be detected relatively quickly with high reliability at the genus and species levels using different methods. The aim of this work was the identification of Acinetobacter spp. (baumannii, calcoaceticus, guillouiae, johnsonii, lwoffii and pittii), which were isolated from raw milk, dairy products and production facilities, using the PCR method with newly designed 100% genus-specific primers AcinetoFor1 and AcinetoRev1. Pre-identification of isolates was done by use of the MALDI-TOF MS method and reliable identification was done using of the 16S rrna sequencing analysis. Obtained results may have been useful for assurance safety and quality of food raw materials and final food products using reliable and rapid identification method. Úvod Bu ky rodu Acinetobacter tvo í gramnegativní, nepohyblivé, nefermentující, enkapsulované kokobacilové ty inky se striktn aerobním metabolismem. Nej ast ji se vyskytují v p írodních zdrojích typu voda nebo p da, ale nalézány jsou také v potraviná ských surovinách a výrobcích, v etn lidských zdroj. V mlékárenském pr myslu mají statut technologicky rizikových bakterií zp sobujících vážné texturní a senzorické vady výrobk. U imunokompromitovaných jedinc p edstavují zdravotní riziko nej ast ji spojované s nozokomiálními infekcemi. Mohou být identifikovány relativn rychle a s vysokou spolehlivostí na úrove rodu i druhu s využitím moderních molekulárn biologických i instrumentálních metod. Cílem této práce byla identifikace deseti kmen acinetobakterií, izolovaných ze syrového mléka, z mlékárenských výrobk a výrobního za ízení a pom cek, pomocí metody polymerázové et zové reakce (PCR) s využitím origináln navržených rodov specifických primer, po jejich pre-identifikaci za pomoci fenotypové metody MALDI-TOF MS a spolehlivé identifikaci pomocí genotypové metody sekvenování úseku 16S rdna. Materiál a metody Izolace bakterií z mlékárenských surovin, výrobk a výrobního za ízení Testované bakterie byly izolovány ze syrového mléka, z r zných mlékárenských výrobk (nap. z mléka UHT, ze sýr a solných nálev ), dále z výrobního za ízení (nap. pro zpracování sý eniny) a pom cek (nap. z tkanin - plachetek pro odkapání syrovátky ze sý eniny). Pro primární záchyt a kultivaci izolát byla použita plotnová metoda s využitím r stu bakterií na r zných agarových r stových médiích (izolace byly provedeny na pracovišti VÚM s.r.o.). Pro následnou rodovou a druhovou identifikaci byl pro r st bakterií použit Columbia agar s 5 % (obj.) beraní krve (Bio-Rad, USA). 136

137 Kultivace a biochemická identifikace bakteriálních izolát Bakteriální izoláty byly inokulovány frakcionovaným rozt rem na povrch Columbia agaru s 5 % (obj.) beraní krve, kultivovány p i teplot 37 C (sbírkový izolát) nebo p i teplotách 30 C a 25 C (izoláty z pr myslu), po dobu 24 h, za aerobních podmínek. Izoláty byly následn podrobeny makroskopickému vyhodnocení morfologie kolonií narostlých na površích Petriho misek, Gramovu barvení, mikroskopickému pozorování morfologie bun k s využitím optického mikroskopu DFC 320 (Leica, SRN), a také identifikaci pomocí biochemického testu API 20 NE (biomérieux, FR). Izoláty dob e rostly také v tekutém syntetickém r stovém Trypton-sójovém bujónu (tj. v bujónu z kaseinového a sójového peptonu ur eného pro mikrobiologii) (Merck KGaA, SRN), p i teplot 37 C nebo 30 C nebo 25 C dle charakteru izolát (viz výše), po dobu 18 h, za aerobních podmínek. Izolace chromozomální DNA z acinetobakterií Izolace DNA z testovaných acinetobakterií probíhala pomocí komer ní soupravy DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, SRN). Narostlé kmeny byly odst ed ny (4550 g, 10 min, 4 C) a jejich bu ky byly promyty ve sterilní vod (1 ml). K bu kám byl nejd íve p idán lytický pufr (180 l) (inkubace p i teplot 37 C po dobu 45 min), poté proteinasa K (25 l) (42 U mg -1 ) a pufr AL (200 l) (inkubace p i 56 C po dobu 30 min). Ke vzniklému lyzátu byl p idán 98% ethanol (200 l) (-20 C) a zkumavky byly promíchány obrácením. Inkubace byla uskute n na p i teplot 25 C po dobu 5 min. Obsahy zkumavek byly p eneseny do kolonek izola ní soupravy (Dneasy Mini spin), kde byla DNA pro išt na a promyta pomocí dvou pufr. Posledním krokem byla eluce DNA. Na st ed membrány v kolonkách byl pipetován elu ní pufr AE (50 l); inkubace byla uskute n na p i teplot 25 C po dobu 2 min. Pro zvýšení výt žku byl zopakován elu ní krok (Qiagen, SRN). Pre-identifikace acinetobakterií pomocí metody MALDI-TOF MS Pre-identifikace acinetobakterových izolát byla uskute n na pomocí fenotypové instrumentální metody MALDI-TOF MS. Vlastní analýze p edcházela p íprava vzork metodou s krokem extrakce. K identifikaci byl použit p ístroj Bruker Autoflex Speeds s využitím komer ní databáze MALDI Biotyper 3.0, spolu s metodami doporu enými výrobcem 1. Následovala vizualizace proteinových profil acinetobakterií pomocí programu mmass 5 5. Spolehlivost metody MALDI-TOF MS byla vyjád ena v kategoriích spolehlivosti závislých na hodnot skóre. To znamená na hodnot dekadického logaritmu míry shody získaného proteinového profilu a referen ního proteinového profilu, nabývajícího hodnot v rozmezí 0 (žádná shoda) až 3 (maximální shoda). Spolehlivost závisela po tu proteinových profil jednotlivých kmenov specifických druh, uvedených v použité databázi, a zahrnovala i optimalizaci procesu p ípravy vzorku, v etn kultiva ních podmínek 2. Identifikace acinetobakterií pomocí metody sekvenování úseku 16S rdna Vlastní identifikaci acinetobakterových izolát pomoci genotypové metody sekvenování úseku 16S rdna p edcházela p íprava produktu PCR pro sekvenování, a také p e išt ní produktu PCR p ed sekvenováním. K identifikaci acinetobakterií byla použita tradi ní Sangerova sekvena ní metoda 4, nazývaná také jako "dideoxy" metoda 3. Metoda byla modifikována dle interních pracovních návod St ediska sekvenování DNA, Mikrobiologického ústavu AV R, v. v. i. V jedné sekvena ní reakci byla ur ena sekvence vlákna o délce až 1500 nukleotid, nej ast ji s pr m rem nukleotid. Sekvenování probíhalo na vysoce výkonném sekvenátoru ABI PRISM 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems, Hitachi; nyní Life Technologies) b hem celkem 35 cykl s použitím univerzálních primer pro genový úsek 16S rdna u acinetobakterií. 137

138 Identifikace acinetobakterií pomocí metody PCR s origináln navrženými rodov specifickými primery Testované izoláty byly podrobeny PCR s origináln navrženými, rodov -specifickými, primery pro rod Acinetobacter (viz Tabulka I). Nov navržená individuální PCR probíhala za dále popsaných podmínek. Po áte ní denaturace: 95 C po dobu 5 min. Poté následovalo 39 cykl s amplifika ním profilem: 95 C po dobu 45 s (denaturace), 67 C po dobu 45 s (nasedání primer ) a 72 C po dobu 90 s (prodlužování et zce); kone né prodlužování et zce: 72 C po dobu 5 min. Reakce PCR byla ukon ena p i teplot 4 C. Výsledky V Tabulce I jsou uvedeny nové, origináln navržené, rodov -specifické, primery pro rod Acinetobacter. V Tabulce II jsou uvedeny výsledky srovnání identifikace acinetobakterových izolát pomocí metody MALDI-TOF MS a sekvenování úseku 16S rdna. Tabulka I Origináln navržené, rodov -specifické, primery pro rod Acinetobacter* Název primeru Sekvence oligonukleotidu (5 3 ) Obsah G + C (%) Teplota tání primeru T m ( C) AcinetFor1 GGT-GAG-TAA-TRC-TTA-GGA-ATC-TG 39,1 52,1 AcinetFor2 GGT-AAA-GGC-CTA-CCA-AGG-CGA-CG 60,8 71,9 AcinetRev1 GTA-TTC-ACC-GCG-GCA-TTC-TGA-TC 52,1 70,3 AcinetRev2 GAT-CCG-CGA-TTA-CTA-GCG-ATT-CC 52,1 68,4 * Návrh primer : Jürgen Felsberg, CSc. & Ing. Markéta Jelínková, Ph.D. (Mikrobiologický ústav AV R, v. v. i., St edisko sekvenování DNA). 138

139 Tabulka II Identifikace neznámých kmen acinetobakterií: srovnání výsledk p i použití metody sekvenování 16S rdna a MALDI-TOF MS íslo izolátu (Projektové ozna ení) íslo izolátu (Individuální ozna ení) Identifikace izolátu pomoci sekvenování 16S rdna Druh Druh Identifikace izolát pomoci MALDI-TOF MS Spolehlivost (skóre) CCM 4353 CCM 4353 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii +++ ANO N35 (12) Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter pittii +++** NE PM27* (14) komplex: Acinetobacter baumannii RS021 Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter pittii Acinetobacter pittii +++** MO2 (71) Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii +++ ANO O6 (325) Acinetobacter johnsonii Acinetobacter johnsonii +++ ANO O9 (328) Acinetobacter johnsonii Acinetobacter johnsonii +++ ANO O16 (335) Acinetobacter johnsonii Acinetobacter johnsonii +++ ANO O73 (478) Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii +++ ANO 1TBX1 (844) Acinetobacter lwoffii Acinetobacter lwoffii ++ ANO GTKM35 (907) Acinetobacter johnsonii Acinetobacter johnsonii +++ ANO 66-GTKM6,5-0 (1298) Acinetobacter guillouiae Acinetobacter guillouiae +++ ANO Shoda ANO ++ spolehlivá rodová a pravd podobná druhová identifikace spolehlivá rodová a druhová identifikace +++ * ** izolát z projektu KONBIO. p íslušník komplexu: A. baumannii A. calcoaceticus A. pittii; d ležitost použití kroku extrakce u vzork p ed analýzou pomocí MALDI-TOF MS vzhledem ke spolehlivé identifikaci na úrove druhu.

140 Záv ry Za pomoci metod sekvenování úseku 16S rdna a MALDI-TOF MS bylo zjišt no, že testované izoláty acinetobakterií pat ily k šesti r zným druh m Acinetobacter spp. (Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter guillouiae, Acinetobacter johnsonii, Acinetobacter lwoffii a Acinetobacter pittii). Ob použité metody se ukázaly být pro identifikaci acinetobakterií až na úrove druhu vhodné. Novinkou v identifikaci acinetobakterií je metoda PCR se 100% spolehlivými, nov navrženými, originálními, rodov specifickými primery AcinetoFor1 a AcinetoRev1. Výsledky této práce mohou být užite né p i screeningovém zajiš ování hygienické úrovn nejenom mlékárenských výrob s ohledem na eliminaci výskytu bakterií rodu Acinetobacter s využitím jejich spolehlivé identifikace za pomoci moderních fenotypových a genotypových metod. Pod kování Tato práce byla podpo ena Ministerstvem zem d lství, Národní agenturou pro zem d lský výzkum, projektem QJ Systémy jišt ní kvality a bezpe nosti mlékárenských výrobk vhodnými metodami aplikovatelnými v praxi ( , MZE/QJ), v programu QJ - Komplexní udržitelné systémy v zem d lství KUS ( ). Použitá literatura 1. ANONYMOUS. MALDI Biotyper CA System, Technické materiály spole nosti Bruker Divisions. Staženo z ( ). 2. CROXATTO, A.; PROD HOM, G.; GREUB, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic mikrobiology. FEMS Microbiology Reviews, 2012, 36, RÉDEI, G. P. Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics, and Informatics, 3 rd ed. Springer (Springer Netherlands), Germany, SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, 74, STROHALM, M.; KAVAN, D.; NOVÁK, P.; VOLNÝ, M.; HAVLÍ EK, V. mmass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Analytical Chemistry, 2010, 82, Kontaktní adresa Ing. Eva Šviráková, Ph.D., Ústav konzervace potravin, Fakulta potraviná ské a biochemické technologie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 3/5, Praha 6 Dejvice, eská republika, eva.svirakova@vscht.cz 140

141 ANTIFUNGÁLNÍ AKTIVITA LAKTOBACIL Horá ková Šárka, Nováková Tereza, Sluková Marcela *, Mühlhansová Andrea, Olšanská Eliška, Plocková Milada Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha * Ústav sacharid a cereálií, VŠCHT Praha Antifungal activity of lactobacilli Summary: In this work, agar diffusion method on malt agar and milk agar plate s method were used for screening of antifungal activity of Lactobacillus acidophilus CCDM 151, L. plantarum MP3, L. zymae CCDM 361, L. panis CCDM 471 and L. sanfranciscensis CCDM 827 against strains Fusarium culmorum DMF1 and Penicillium expansum DMF 0004, which are common contaminants of food and environment. Lactobacilli were characterized by growth in MRS broth (cell s count, ph) and by the production of lactic and acetic acids (HPLC). L. plantarum MP3 showed the biggest inhibitory effect on the growth of both fungi species during 10 days of observation. Strain F. culmorum DMF1 was more sensitive to antifungal activity of growing lactobacilli cells. The antifungal activity of heat-treated cell-free supernatants was detectable only after 3 days of cultivation with F. culmorum DMF1. Synergetic effect of lactic and acetic acid was also proved. The size of colonies of F. culmorum DMF1 on agar supplemented with acetic acid (0.1g/100 g of agar) was 7.9 cm, while on agar whose ph was initially adjusted by the addition of 10% wt. lactic acid to 4.6 and then acetic acid was added (0.1g/100 g) the average colony diameter was only 0.55 cm. Use of lactobacilli cultures with antifungal activity when preparing for example the leaven for the baking industry can lead to suppression of mould growth on bread. Vláknité houby a kvasinky jsou asto se vyskytující mikroorganismy zp sobující kažení potravin. Plísn mohou r st na celé ad potraviná ských produkt jako je máslo, jogurty, pekárenské výrobky, ovoce a zelenina, obiloviny apod. Mají schopnost produkovat lipolytické, proteolytické a sacharolytické enzymy, které mohou zp sobovat zhoršení senzorických vlastností výrobk. Z hlediska zdravotního je d ležitá jejich tvorba sekundárních metabolit mykotoxin, které jsou pro obratlovce toxické již v malé koncentraci. Jednou z možností, jak prodloužit trvanlivost potravin a zárove zabránit r stu nežádoucích plísní, je použití p írodní konzervace potravin pomocí innosti bakterií mlé ného kvašení, které produkují celou adu antimikrobiálních metabolit. Mezi metabolity s nejvyšší antifungální aktivitou lze za adit hlavn organické kyseliny (kyselina mlé ná, octová, fenylmlé ná, p-hydroxyfenylmlé ná, kyselina propionová) 1, peroxid vodíku 2, reuterin 3, vyšší mastné kyseliny a hydroxylované mastné kyseliny 4 i cyklické peptidy 5. Je prokázáno, že z bakterií mlé ného kvašení vykazují antifungální aktivitu p edevším kmeny rodu Lactobacillus, mén kmeny rodu Lactococcus. 6 Rod Lactobacillus je azen mezi grampozitivní, nesporulující, katalasa-negativní, ty inkovité bakterie, jejichž hlavním kone ným produktem fermentace sacharid je kyselina mlé ná. Ke svému r stu pot ebují na živiny bohatá média obsahující nap. sacharidy, vitaminy, soli, mastné kyseliny nebo estery mastných kyselin i deriváty nukleových kyselin. Jedná se o rozmanitou skupinu bakterií, což dokazuje široká škála pom r C+G a malá homologie DNA-DNA mezi mnoha druhy. 7 Antifungální aktivita byla prokázána u zástupc všech fermenta ních skupin laktobacil, tj. u homofermentativních, ale zvlášt u fakultativn heterofermentativních a obligátn heterofermentativních druh. 8,9 Ú inek r zných druh rodu Lactobacillus byl zjišt n u plísní rodu Penicillium, Aspergillus, Fusarium. 10,11 Z tohoto d vodu se také stále hledají nové kmeny laktobacil, které by mohly být použity jako protektivní kultury v mlékárenském, masném i peka ském pr myslu. 12,13,14 Cílem této práce bylo otestovat ú inek vybraných druh laktobacil na r st plísní Penicillium expansum a Fusarium culmorum, které jsou astými kontaminanty prost edí i potravin. 141

142 Použité metody Použité mikroorganismy: Lactobacillus acidophilus CCDM 151; L. zymae CCDM 361; L. panis CCDM 471; L. sanfranciscensis CCDM 827 všechny Laktoflora, Milcom, a.s.; Lactobacillus plantarum MP3 Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Fusarium culmorum DMF1; Penicillium expansum DMF Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Kmeny laktobacil byly kultivovány v MRS bujónu (ph 6) p i 37 C po dobu h s 2 % obj. inokulem. Po kultivaci byl zjiš ován po et bun k (KTJ/ml) plotnovou metodou za použití MRS agaru (Oxoid, Velká Británie; ph 6, 37 C, 72 h, atmosféra 5 % obj. CO 2 ), ph (ph metr Cyberscan PC 5500, Eutech, Velká Británie) a obsah kyseliny mlé né a octové metodou HPLC. Použité plísn byly uchovávány na agaru s maltosovým výtažkem po kultivaci 5 10 dn p i 22 C. Agarová difusní metoda pro stanovení antifungální aktivity 15 Ke stanovení bylo použito 100 l p íslušného ed ní suspenze laktobacil ve fyziologickém roztoku, které bylo zalito 10 ml modifikovaného MRS agaru (bez octanu sodného). Po zatuhnutí byl agar p evrstven 5 ml agaru s maltosovým výtažkem (konc. agaru 0,75 % hm.) a následn zao kován 5 l suspenze spor plísní (cca 10 5 KTJ/ml). V pr b hu 10 dn byly m eny pr m ry kolonií narostlých plísní. Metoda mlé ných agarových ploten pro stanovení antifungální aktivity bezbun ných supernatant 16 Sterilní odst ed né mléko (5 ml) s 1 ml supernatantu bylo smícháno s 10 ml BCP agaru (15 g agar, 100 mg bromkresolové erven v 1 l), po zatuhnutí p evrstveno 5 ml agaru s maltosovým výtažkem (0,75 % hm. agaru), a zao kováno suspenzí spor (cca 10 5 KTJ/ml). Pr m ry kolonií plísní byly m eny v pr b hu 10 dn. Supernatanty byly získány po kultivaci laktobacil p i 37 C, 18 h a následném odst ed ní kultury p i 9000 ot./min po dobu 10 min p i 20 C. Takto p ipravené supernatanty byly tepeln ošet eny ve vodní lázni p i 100 C po dobu 5 min. Sledování antifungální aktivity média s r zným pom rem kyseliny mlé né a octové 17 Byl použit agar s maltosovým výtažkem s r znými p ídavky koncentrované kyseliny octové 0; 0,05 a 0,10 g/100 g agaru a agar s maltosovým výtažkem se stejnými p ídavky kyseliny octové, jehož ph bylo na za átku upraveno 10 % obj. kyselinou mlé nou na ph 4,65. Po zatuhnutí agaru bylo do st edu misky vpichem nao kováno 5 l suspenze spor plísní. Kultivace probíhala p i pokojové teplot, kdy byly v intervalu 2, 7 a 10 dn m eny pr m ry kolonií plísní. Uvedené výsledky u všech metod jsou aritmetické pr m ry z 2 3 paralelních stanovení. Výsledky a diskuse Základní charakteristika použitých kmen laktobacil je uvedena v Tab. 1. Je patrné, že menší r st a tím i tvorbu organických kyselin v MRS bujónu vykazovaly kmeny L. panis CCDM 471 a L. sanfranciscensis CCDM 827, což m že být zp sobeno specifickými nároky t chto druh na živiny, které byly izolovány z kvas. U kmen 361 a MP3 byla prokázána tvorba kyseliny fenylmlé né. Pro sledování antifungální aktivity byla nejprve použita agarová difusní metoda. V první fázi práce bylo u testovaných kmen laktobacil použito do misek 100 l suspenze bun k o koncentraci 10 9 KTJ/ml. Tato koncentrace zp sobovala naprostou inhibici r stu obou plísní, r st nenastal ani po 10 dnech kultivace. Proto byla pro následující m ení použita ed ní nakultivovaných laktobacil, byla dávkována koncentrace bun k 10 3 KTJ/ml. V tabulkách II a III jsou uvedeny pr m rné velikosti kolonií plísní b hem 10denní kultivace p i pokojové teplot. 142

143 Tabulka I Charakteristika použitých kmen laktobacil r st v MRS bujónu a tvorba organických kyselin Kmen po et bun k (KTJ/ml) ph 143 glukosa (g/l) k. mlé ná (g/l) k. octová (g/l) k. fenylmlé ná L. acidophilus CCDM 151 2,2 x ,82 6,7 15,1 2,9 ND* L. plantarum MP3 2,5 x ,78 4,1 17,7 3,5 stopy L. zymae CCDM 361 1,9 x ,75 1,9 18,2 3,6 stopy L. panis CCDM 471 4,5 x ,04 16,2 2,6 3 ND* L. sanfranciscensis CCDM 827 ND* nedetekováno 4,7 x ,94 14,3 3,7 3,1 ND* MRS 19,5 0,8 2,8 ND* Tabulka II Pr m r kolonií (cm) plísn F. culmorum DMF1 p i kultivaci s testovanými laktobacily agarovou difusní metodou Kmen Den 151 MP Kontrola 4 2,3 1,4 1,4 2,6 3,0 3,3 6 2,9 1,4 1,5 4,9 4,9 5,5 10 4,7 1,8 2,0 7,7 7,6 CM* CM* = plíse porostla celou misku (pr m r misky inil 9,0 cm) Tabulka III Pr m r kolonií (cm) plísn P. expansum DMF 0004 p i kultivaci s testovanými laktobacily agarovou difusní metodou Kmen Den 151 MP Kontrola 4 0,8 0,7 0,8 0,8 0,8 0,7 6 0,9 0,8 0,9 0,8 0,9 0,8 10 1,0 0,8 1,0 1,1 1,1 1,3 CM* = plíse porostla celou misku (pr m r misky inil 9,0 cm) Z tab. II a III je patrné, že nejvyšší inhibi ní aktivitu vykazoval kmen L. plantarum MP3 a L. zymae CCDM 361. V porovnání s kontrolním stanovením pouze nepatrn inhibovaly r st plísní kmeny L. panis CCDM 471 a L. sanfranciscensis CCDM 827, což m že být zp sobeno jejich nízkou r stovou aktivitou a nízkou tvorbou kyselin za podmínek této metody. K ú ink m laktobacil byl daleko citliv jší kmen F. culmorum DMF1. P i kontrolním r stu porostl tento kmen po 10 dnech kultivace celou misku (9,0 cm), p i inhibi ním p sobení laktobacil byl nap. u kmene L. plantarum MP3 po této dob pr m r kolonie pouze 1,8 cm. Kmen P. expansum DMF0004 vykazoval pomalý r st na agaru s maltosovým výtažkem (kontrola po 10 dnech 1,3 cm). Bylo by vhodné pro tuto metodu otestovat i jiné druhy kultiva ních médií pro plísn, jako je agar s bramborovým extraktem i Czapek-Dox agar, aby se zajistil v tší nár st této plísn, a tím i lepší porovnání antifungální aktivity laktobacil. Mezi kmeny laktobacil nebyly zjišt ny výrazné rozdíly v inhibici P. expansum. Po 10 dnech kultivace vykazoval vyšší aktivitu op t kmen MP3. Podobné záv ry byly publikovány i jinými autory. Dal Bello a kol. 8 zjistili, že L. plantarum FST má silné inhibi ní ú inky v i plísni Fusarium culmorum TMW, zatímco L. sanfranciscensis LTH 2581 nevykazoval žádnou inhibici r stu plísn. Antifungální aktivitu kmene L. rhamnosus VT1

144 ov ili také Stiles a kol. 15 v i plísním rodu Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. a Rhizopus sp. Došli k záv ru, že octan sodný jakožto jedna ze složek MRS agaru má antifungální ú inek a v kombinaci s kmenem L. rhamnosus VT1 projevuje synergický efekt (v naší studii byl použit MRS agar bez octanu sodného). Nejvíce citlivý rod z testovaných plísní byl také Fusarium sp. 15 Pro použití v potraviná ství je d ležité zjiš ovat rovn ž aktivitu samotných metabolit laktobacil, nebo v n kterých technologiích mohou být živé bu ky inaktivovány tepelným záh evem. Proto byla antifungální aktivita testována i u tepeln ošet ených bezbun ných supernatant metodou mlé ných agarových ploten. Výsledky jsou uvedeny v tab. IV. Tabulka IV Pr m r kolonií (cm) plísn F. culmorum DMF1 p i stanovení antifungální aktivity bezbun ných tepeln ošet ených supernatant testovaných laktobacil Kmen 151 MP Kontrola Den 3 3,1 3,2 3,2 3,8 4,4 4,3 6 6,7 6,6 6,1 7,0 7,2 7,3 10 CM* CM* CM* CM* CM* CM* CM* = plíse porostla celou misku (pr m r misky inil 9,0 cm) Po 3 dnech kultivace nebyly mezi inhibi ními ú inky supernatant kmen 151, MP3 a 361 významné rozdíly, slabší inhibi ní aktivitu vykazovaly op t kmeny 471 a 827. Antifungální aktivita byla potvrzena ješt po 6 dnech kultivace u kmen 151, MP3 a 361, ale po 10 dnech kultivace byl inhibi ní ú inek všech supernatant zcela potla en a mycelium plísn porostlo celou misku. V porovnání s aktivitou rostoucích bun k m ly supernatanty slabší antifungální aktivitu. Antifungální aktivita supernatant byla prokázána i jinými autory. 6,18 Bylo prokázáno, že za antifungální aktivitu laktobacil jsou zodpov dné p edevším organické kyseliny. 1 Vzhledem k tomu, že se produkce kyseliny mlé né a octové m že u r zných kmen laktobacil zna n lišit, byl v dalším experimentu ov en antifungální efekt obou kyselin samostatn i antifungální efekt jejich sm si. Jako kultiva ní médium byl použit agar s maltosovým výtažkem bez úpravy ph (ph 6,6) nebo s p ídavkem 10 % obj. kyseliny mlé né (ph upraveno na 4,6) a to bu s nebo bez p ídavku kyseliny octové (0,05 a 0,10 g/100 g agaru). Výsledky r stu plísn F. culmorum DMF1 jsou uvedeny v tab. V a na obr. 1. Tabulka V Pr m r kolonií (cm) plísn F. culmorum DMF1 p i stanovení antifungálního ú inku kyseliny mlé né a octové Agar s p ídavkem k. mlé né (ph upraveno na 4,6) Agar bez p ídavku k. mlé né (ph 6,6) A B C D E F k. octová (g/100 g agaru) 0 0,05 0,1 0 0,05 0,1 kone né ph 4,63 4,45 4,17 6,65 5,81 4,62 Den 2 0,8 0,5 0,5 1,1 0,8 0,5 7 7,4 4,3 0,5 CM* 7,4 4,2 10 CM* 7,9 0,5 CM* CM* 7,9 CM* = plíse porostla celou misku (pr m r misky inil 9,0 cm) 144

145 Z nam ených výsledk vyplývá, že ob kyseliny vykazovaly v prvních dnech r stu inhibi ní ú inky. Po 10 dnech kultivace však byla ú innost již zna n snížena, kyselina octová p idaná do agaru v koncentraci 0,05 g/100g zp sobila pouze malý rozdíl v r stu plísn vzhledem ke kontrole. P ídavek samotné kyseliny mlé né (ph agaru upraveno na 4,6) byl již po 7 dnech málo ú inný (kolonie se rozrostla na celou misku (9 cm) oproti kontrole (pr m r kolonie 7,4 cm). Naopak p i sou asném použití obou kyselin byl i po 10 dnech r st plísn potla en, p i okyselení agaru kyselinou mlé nou na ph 4,6 a následném p ídavku kyseliny octové (0,1 g/100 g) agaru dosáhl pr m r kolonie plísn pouze 0,5 cm. Synergický efekt obou kyselin potvrdil vhodnost použití heterofermentativních kmen laktobacil, které tyto kyseliny produkují, jako protektivních kultur. Obr. 1. R st plísn F. culmorum DMF1 na agaru s maltosovým výtažkem o r zném ph upraveném kyselinou mlé nou a r zné koncentraci p idané kyseliny octové po 7 dnech kultivace; legenda A F viz tab. V. Záv rem je možno konstatovat, že testované druhy laktobacil vykazovaly r zný stupe inhibi ní aktivity v i plísním F. culmorum DMF1 a P. expansum DMF0004. Nejvyšší antifungální aktivita byla zjišt na u kmene L. plantarum MP3. Bezbun né tepeln ošet ené supernatanty vykazovaly nižší antifungální aktivitu v porovnání s živými rostoucími bu kami. K p sobení laktobacil byl ve všech p ípadek citliv jší druh F. culmorum. Byl prokázán synergický efekt kyseliny mlé né a octové na potla ení r stu plísn F. culmorum DMF1. Použití laktobacilových kultur s antifungální aktivitou, nap. p i p íprav kvas pro pekárenský pr mysl, m že vést k potla ení plesniv ní pekárenských výrobk. Použitá literatura: 1. Gerez L. C., Torino M. I., Rollán G., Font de Valdez G.: Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties. Food Control 20, (2009). 2. Venturini M. E., Blanco D., Oria R.: In vitro antifungal activity of several compounds against Penicillium expansum. J. Food Prot. 65, (2002). 3. Dalié D. K. D., Deschamps A. M., Richard-Forget F.: Lactic acid bacteria Potential for control of mould growth and mycotoxins. Food Control 21, (2010). 4. Belguesmia Y., Rabesona H., Mounier J., Pawtowsky A., Le Blay G., Barbier G., Haertlé T., Chobert J. M.: Characterization of antifungal organic acids produced by Lactobacillus harbinensis K.V9.3.1Np immobilized in gellan-xanthan beads during batch fermentation. Food Control 36, (2014). 5. Ryan L. A. M., Zannini E., Dal Bello F., Pawlowska A., Koehler P., Arendt E. K.: Lactobacillus amylovorus DSM as a novel food-grade antifungal agent for bakery products. Int. J. Food Microbiol. 146, (2011). 6. Plocková M., Chumchalová J., Stiles J.: Hodnocení antifungální aktivity bakterií mlé ného kvašení metodou mlé ných agarových ploten. Mlék. Listy 62, (2000). 145

146 7. Curry B., Crow V.: General Characteristics. V knize: Encyclopedia of dairy science (Roginski H., ed.), sv. III, str Academic Press, Londýn Dal Bello F., Clarke C. I., Ryan L. A. M., Ulmer H., Schober T. J., Ström K., Sjögren J., Van Sinderen D., Schnürer J., Arendt E. K.: Improvement of the quality and shelf life of wheat bread by fermentation with the antifungal strain Lactobacillus plantarum FST 1,7. J. Cereal Sci. 45, (2007). 9. Corsetti A., Settanni L.: Lactobacilli in sourdough fermentation. Food Res. Int. 40, (2007). 10. Sangmanee P., Hongpattarakere T.: Inhibitory of multiple antifungal components produced by Lactobacillus plantarum K 35 on growth, aflatoxin production and ultrastructure alterations of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Food Control 40, (2014). 11. Schillinger U., Villarreal J. V.: Inhibition of Penicillium nordicum in MRS medium by lactic acid bacteria isolated from foods. Food Control 21, (2010). 12. Comi G., Tirloni E., Andyanto D., Manzano M., Iacumin L.: Use of bio-protective cultures to improve the shelf-life and the sensorial characteristics of commercial hamburgers. Food Sci. Technol. 62, (2015). 13. Delavenne E., Ismail R., Pawtowski A., Mounier J., Barbier G., Le Blay G.: Assessment of lactobacilli strains as yogurt bioprotective cultures. Food Control 30, (2013). 14. Coda R., Cassone A., Rizzello C. G., Nionelli L., Cardinali G., Gobbetti M.: Antifungal activity of Wickerhamomyces anomalus and Lactobacillus plantarum during sourdough fermentation: identification of novel compounds and long term effect during storage of wheat bread. Appl. Environ. Microbiol. 77, (2011). 15. Stiles J., Penkar S., Plocková M., Chumchalová J., Bullerman L. B.: Antifungal activity of sodium acetate and Lactobacillus rhamnosus. J. Food Prot. 65, (2002). 16. Suzuki I., Nomura M., Morichi T.: Isolation of lactic acid bacteria which suppress mould growth and show antifungal action. Milchwiss. 46, (1991). 17. Aunsbjerg S. D., Honoré A. H., Marcussen J., Ebrahimi P., Vogensen F. K., Benfeldt C., Skov T., Knøchel S.: Contribution of volatiles to the antifungal effect of Lactobacillus paracasei in defined medium and yogurt. Int. J. Food Microbiol. 194, (2015). 18. Ström K., Sjörgren J., Broberg A., Schnürer J.: Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides and phenyllactic acid. Appl. Environ. Microbiol. 68, (2002). Kontaktní adresa: Ing. Šárka Horá ková, CSc., Ústav mléka, tuk a kosmetiky, Technická 5, VŠCHT Praha, Praha 6; e:mail: sarka.horackova@vscht.cz 146

147 INHIBI NÝ Ú INOK BAKTÉRIÍ MLIE NEHO KYSNUTIA NA RAST STAPHYLOCOCCUS AUREUS A ESCHERICHIA COLI PRI VÝROBE SYROV ZO SUROVÉHO MLIEKA Man ušková Tatiana, Medve ová Alžbeta, Matej eková Zuzana, Valík ubomír Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave, Slovenská republika Lactic acid bacteria inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Escherichia coli during manufacturing of raw milk cheese Summary: Traditional Slovak dairy products, ewes lump cheese and bryndza cheese are characterized by production from raw ewes milk. Pathogens, e.g. Staphylococcus aureus and Escherichia coli, can be present in raw milk, therefore lactic acid bacteria are used for their inhibition during cheese production. For quantitative description of pathogens growth in presence of different lactic acid bacteria amounts, cultivation experiments in UHT milk were performed. Initial density of S. aureus 2064 and E. coli BR were N 0 3 log CFU.ml -1 and Fresco starter culture initial density ranged from 3 to 6 log CFU.ml -1. The results were analyzed using Baranyi s D-model and tools of predictive microbiology. It was shown, that the growth of studied microorganisms was positively determined by cultivation temperature and increasing of initial concentration of lactic acid bacteria resulted in slower growth of both pathogens. The best temperature for fermentation process is C, when grow-up of undesirable microorganisms is the lowest and starter culture activity is high enough to achieve critical ph 4.5 in 24 hours. These temperatures are also recommended for raw ewes milk cheese production by Specification for Slovak bryndza cheese in Council Regulation (EC) No. 510/2006. Úvod Ov í hrudkový syr a bryndza sa na Slovensku tradi ne vyrábajú zo surového ov ieho a kravského mlieka, v ktorom môžu by prirodzene prítomné patogénne a potenciálne patogénne mikroorganizmy. Medzi ne patria okrem iných tiež bakteriálne druhy Staphylococcus aureus a Escherichia coli, ktoré sa môžu v potravine množi a po konzumácii spôsobi u udí nepríjemné infekcie, prípadne intoxikácie 1,2. Staphylococcus aureus je grampozitívna kokovitá baktéria a taxonomicky sa zara uje do e ade Staphylococcaceae. Je katalázopozitívny a redukuje nitrát. Bežne sa nachádza na udskej pokožke, slizniciach a dýchacej sústave. Hoci nie je striktne patogénny, asto spôsobuje infekcie pokožky (napr. abscesy), infekcie dýchacieho traktu (napr. zápal prínosových dutín) a otravy z potravín 3,4. Patogénne kmene asto podporujú rozvoj infekcie produkciou rôznych toxínov a expresiou povrchovo aktívnych proteínov, ktoré viažu a inaktivujú protilátky. Rozvoj stafylokokových kme ov rezistentných vo i antibiotikám (predovšetkým meticilín-rezistentný Staphylococcus aureus, MRSA) je celosvetovým problémom v klinickej medicíne 5,6. Escherichia coli je gramnegatívna fakultatívne anaeróbna pali ka z e ade Enterobacteriaceae, ktorá sa bežne nachádza v intestinálnom trakte teplokrvných živo íchov 7. Vä šina kme ov je neškodných, sú sú as ou mikroflóry riev a pôsobia preventívne pri kolonizácii slizníc patogénnymi baktériami a/alebo produkujú esenciálne látky, napr. vitamín K2. Niektoré sérotypy však môžu spôsobi ochorenia po konzumácii potravín od ahších tráviacich problémov až po vážne otravy 8,9. V sú asnosti mnohí konzumenti uprednost ujú tradi né mlie ne výrobky vyrábané bez využitia pasterizácie a/alebo chemickej konzervácie. Do popredia sa tak dostáva nevyhnutná inhibícia nežiaducich mikroorganizmov prostredníctvom baktérií mlie neho kysnutia. Našim cie om bolo kvantitatívne popísa rast S. aureus a E. coli v prítomnosti baktérií mlie neho kysnutia a definova podmienky, v ktorých sa nežiaduce mikroorganizmy dokážu/nedokážu rozmnožova. Materiály a metódy V práci boli použité kultúry Staphylococcus aureus 2064 (izolovaný z ov ieho hrudkového syr), Escherichia coli BR (izolovaná z bryndze) a štartovacia kultúra Fresco DVS 1010 (Christian 147

148 Hansen, Dánsko). Patogény boli inokulované do predtemperovaného UHT mlieka (Rajo, Slovensko) na po iato nú koncentráciu cca 3 log KTJ.ml -1. Pre stanovenie inhibi ného ú inku baktérií mlie neho kysnutia bola kultúra Fresco inokulovaná do mlieka na po iato nú koncentráciu približne 3, 4, 5 alebo 6 log KTJ.ml -1. Aeróbna statická kultivácia prebiehala v troch paralelných sériách pri teplotách 12, 15, 18, 21, 25, 30 a 37 ±0,5 C. Aktuálne po ty mikroorganizmov boli v pravidelných asových intervaloch stanovené prostredníctvom zrie ovacej kultiva nej metódy na príslušných agaroch (Baird-Parker agar pre S. aureus, Chromocult Coliform agar pre E. coli a M17 agar pre Fresco, všetky Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko). V rovnakých asoch boli odoberané vzorky pre stanovenie aktívnej kyslosti prostredia pomocou ph metra (WTW Inolab 720, Weilheim, Nemecko). Získané údaje, rastové iary a rastové parametre (d žka lag fázy, rastová rýchlos a alšie) boli vyhodnotené pomocou programového rozšírenia DMFit, ktorý využíva primárny prediktívny model pod a Baranyiho a kol. 10. Výsledky a diskusia Na základe výsledkov možno poveda, že rýchlos rastu mikroorganizmov je pozitívne determinovaná inkuba nou teplotou. V rozsahu teplôt 12 až 37 C a v závislosti od prítomnosti/neprítomnosti inhibi nej mikroflóry boli pre S. aureus stanovené rastové rýchlosti Gr v rozsahu 0,025 0,780 KTJ.ml -1.h -1 a pre E. coli v rozsahu 0,042 0,720 KTJ.ml -1.h -1 (tab. I). Rastové rýchlosti Gr kultúry Fresco po as ko-kultivácie s patogénnymi mikroorganizmami dosahovali hodnoty 0,058 0,868 KTJ.ml -1.h -1. Tabu ka I Rastové rýchlosti S. aureus (Gr STA ) a E. coli (Gr EC ) po as ko-kultivácie s baktériami mlie neho kysnutia v závislosti od po iato nej koncentrácie kultúry Fresco (N 0Fr ) a teploty (T) Rastová rýchlos Gr STA (log KTJ.ml -1.h -1 ) Gr EC (log KTJ.ml -1.h -1 ) T ( C) N 0Fr (log KTJ.ml -1 ) ,035 0,042 0,027 0,027 0, ,057 0,057 0,061 0,045 0, ,118 0,108 0,103 0,123 0, ,210 0,155 0,151 0,113 0, ,309 0,290 0,286 0,179 0, ,527 0,531 0,464 0,398 0, ,780 0,756 0,776 0,662 0, ,049 0,046 0,042 0,046 0, ,120 0,102 0,074 0,071 0, ,149 0,126 0,117 0,102 0, ,218 0,181 0,168 0,181 0, ,335 0,262 0,277 0,274 0, ,571 0,363 0,314 0,288 0, ,720 0,465 0,441 0,494 0,516 V dôsledku zvyšovania po iato nej koncentrácie baktérií mlie neho kysnutia došlo ku skráteniu d žky lag fázy ph ( ph pri po iato nej koncentrácii kultúry Fresco 3 log KTJ.ml -1 bola v priemere približne dvojnásobne dlhšia ako ph v pokusoch, v ktorých bola kultúra Fresco pridaná na úrove 6 log KTJ.ml -1 ). Tiež bol pozorovaný rýchlejší pokles ph na kritickú hodnotu 4,5, o viedlo k postupnému spomaleniu rastu oboch patogénov (obr. 1). 148

149 log N(log KTJ.ml 1 ), ph log N (log KTJ.ml 1 ) obr. 1b as (h) obr. 1a as (h) Obr. 1. Rast S. aureus ( ) a E. coli ( ) pri teplote 18 C v monokultúre (obr. 1a) a po as kokultivácie s kultúrou Fresco ( ) pri jej po iato nej koncentrácii N 0Fr = 3 log KTJ.ml -1 (obr. 1b), resp. N 0Fr = 6 log KTJ.ml -1 (obr. 1c) a príslušné hodnoty ph ( ) log N (log KTJ.ml 1 ), ph obr. 1c as (h) Napriek tomu, že rastová rýchlos S. aureus a E. coli neklesala vždy úmerne zvyšujúcej sa koncentrácii baktérií mlie neho kysnutia, denzita kultúry Fresco výrazne ovplyvnila maximálne po ty patogénov v stacionárnej fáze. Po as monokultivácie oba sledované mikroorganizmy dokázali zvýši svoje po ty priemerne o 5 logaritmických poriadkov. Na druhej strane, maximálna dosiahnutá koncentrácia S. aureus a E. coli bola po as kokultivácie s baktériami mlie neho kysnutia výrazne nižšia. Prídavok kultúry Fresco na úrovni približne 3 log KTJ.ml -1 sa v porovnaní s výsledkami monokultivácie odzrkadlil v poklese kone ných po tov patogénov o 0,5 2,8 log KTJ.ml -1. alšie zvyšovanie koncentrácie zákysovej kultúry viedlo k ešte výraznejšej inhibícii ich rastu. Pri po iato nej koncentrácii kultúry Fresco približne 6 log KTJ.ml -1 dochádzalo v prípade oboch mikroorganizmov k poklesu koncentrácie v stacionárnej fáze ešte o alších 1,1 2,3 log KTJ.ml -1 v závislosti od teploty inkubácie (tab. II). Okrem vplyvu množstva zákysových baktérií na rast S. aureus a E. coli sme sledovali tiež kombináciu vplyvu po iato nej koncentrácie kultúry Fresco a inkuba nej teploty na správanie patogénov. Najnižší nárast patogénov bol zaznamenaný pri teplotách do 21 C, o zodpovedá štandardnej fyziologickej odpovedi mikroorganizmov na suboptimálne teploty. Pri nižších teplotách však bola obmedzená tiež rastová a metabolická aktivita zákysovej kultúry, o sa prejavilo dlhším asom potrebným pre dosiahnutie kritického ph 4,5 (tab. III). Z týchto dôvodov tak boli ako najvhodnejšie zákysové teploty vyhodnotené teploty C, pri ktorých bol nárast nežiaducich mikroorganizmov relatívne najnižší a kritické ph 4,5 bolo pri najvyššom prídavku baktérií mlie neho kysnutia dosiahnuté po približne 24 hodinách. Tieto teploty sa zárove pod a Špecifikácie Slovenskej bryndze k Nariadeniu (ES). 510/2006 odporú ajú pri výrobe ov ích hrudkových syrov. 149

150 Tabu ka II Nárast koncentrácie (N max N 0 ) mikroorganizmov S. aureus ( N STA ) a E. coli ( N EC ) po as kokultivácie s baktériami mlie neho kysnutia v závislosti od po iato nej koncentrácie kultúry Fresco (N 0Fr ) a teploty (T) Nárast koncentrácie mikroorganizmu N STA (log KTJ.ml -1 ) N EC (log KTJ.ml -1 ) T ( C) N 0Fr (log KTJ.ml -1 ) ,73 1,93 1,41 0,95 0, ,92 2,13 1,69 1,18 0, ,77 2,82 2,12 1,36 1, ,60 2,44 1,78 1,04 0, ,68 3,69 2,63 2,00 1, ,74 4,35 3,26 2,33 2, ,73 4,47 3,83 3,44 2, ,31 3,70 3,33 2,23 1, ,16 2,88 2,89 2,19 1, ,30 3,78 3,05 2,30 1, ,68 4,02 3,24 2,35 2, ,11 4,22 3,57 2,30 2, ,03 3,70 3,24 2,61 2, ,34 4,42 3,80 3,66 3,03 Tabu ka III as potrebný na dosiahnutie kritického ph 4,5 (t ph4,5 ) v závislosti od po iato nej koncentrácie kultúry Fresco (N 0Fr ) a teploty (T) as t ph4,5 (h) T ( C) N 0Fr (log KTJ.ml -1 ) ,0 97,4 81,6 73, ,4 56,8 49,1 38, ,0 34,8 29,4 28, ,5 27,7 22,1 22, ,8 19,6 16,1 15, ,3 12,9 11,7 9, ,1 11,1 9,4 8,0 Podobný vplyv zmesi kyslomlie nych baktérií pozostávajúcej z kombinácie laktobacilov, laktokokov a pediokov na rast a prežívanie S. aureus a E. coli zaznamenali aj Tesfaye a kol. 11 v syre Ayib. Po as kysnutia tohto tradi ného erstvého etiópskeho syra pozorovali nárast koncentrácie patogénov len o 1 až 2 log KTJ.g -1 a po as fázy zrenia sa ich po ty už postupne znižovali. Medve ová a Valík 12 sledovali vplyv prídavku kyslomlie nych baktérií na rast S. aureus v mlieku. Výskum preukázal významný inhibi ný potenciál baktérií mlie neho kysnutia vo i tejto patogénnej baktérii, ktorý súvisí najmä s produkciou organických kyselín a príslušnou acidifikáciou média. 150

151 Záver Dostato né množstvo aktívnych kyslomlie nych baktérií a správna vo ba teploty kysnutia výrazne prispievajú k zabezpe eniu mikrobiologickej kvality syrov zo surového mlieka. Podmienky musia by zvolené tak, aby bol nárast nežiaducich mikroorganizmov relatívne najnižší a aktivita štartovacej kultúry bola dostato ná na dosiahnutie kritického ph 4,5 po as prvých 24 hodín. Tieto predpoklady sp a výroba syrov pri teplotách C s prídavkom kultúry Fresco na po iato nú koncentráciu približne 6 log KTJ.ml -1. Po akovanie Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/0495/13 a Nadáciou Tatra banky pod a Zmluvy. 2015vs047. Použitá literatúra: 1. VALÍK,. Hodnotenie rizika surového mlieka z h adiska výskytu patogénnych baktérií. Published online 12/11/2013. Quoted 01/15/ PANGALLO, D. ŠAKOVÁ, N. KORE OVÁ, J. et al. Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese. In International Journal of Food Microbiology, , p CHENG, A. G. MISSIAKAS, D. SCHNEEWIND, O. The Giant Protein Ebh Is a Determinant of Staphylococcus aureus Cell Size and Complement Resistance. In Journal of Bacteriology, :5, p DOYLE, M. P. BUCHANAN, R. L. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. ASM Press, p., ISBN BALABAN, N. RASOOLY, A. Staphylococcal enterotoxins. In International Journal of Food Microbiology, , p OTERO, L. H. ROJAS-ALTUVE, A. LLARRULL, L. I. et al. How allosteric control of Staphylococcus aureus penicillin binding protein 2a enables methicillin resistance and physiological function. In Proceedings of the National Academy of Sciences, :42, p MENG, J. SCHROEDER, C. M. Escherichia coli. In Poole, T. L. Simjee, S. Foodborne Diseases. Springer Science & Business Media, p. 1 26, ISBN GÖRNER, F. VALÍK,. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, p., ISBN GIBSON, G. R. ROBERFROID, M. B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. In Journal of Nutrition, , p BARANYI, J. ROBERTS, T. A. A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. In Journal of Food Microbiology, , p TESFAYE, A. MEHARI, T. ASHENAF, M. The Inhibition of Some Foodborne Pathogens by Mixed Lab Cultures During Preparation and Storage of Ayib, a Traditional Ethiopian Cottage Cheese. In World Journal of Dairy and Food Science, :1, p MEDVE OVÁ, A. VALÍK,. Staphylococcus aureus: Characterisation and Quantitative Growth Description in Milk and Artisanal Raw Milk Cheese Production. In Eissa, A. A. Structure and Function of Food Engineering. InTech, p , ISBN Kontaktná adresa: Tatiana Man ušková Oddelenie výživy a hodnotenia potravín Fakulta chemickej a potravinárskej technológie Slovenská technická univerzita v Bratislave Radlinského 9, Bratislava 1, Slovensko tatiana.mancuskova@stuba.sk 151

152 152

153 KOMBINOVANÝ EFEKT TEPLOTY A AKTIVITY VODY NA RADIÁLNY RAST DRUHU GEOTRICHUM CANDIDUM Ko uchová Martina, Matej eková Zuzana, Liptáková Denisa, Dubská Katarína, Valík ubomír Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave Combined effect of temperature and water activity on the radial growth of Geotrichum candidum Summary: Geotrichum candidum is yeast naturally found in milk and it is used as adjunct culture in the ripening process of soft and semihard cheeses. If G. candidum is present in excessive quantities on the surface of raw soft ripened cheeses (camembert type) it is considered to be responsible for many defects such as unstable or slippery rind, unequal covering of cheese surface. This micromycete is responsible for the degradation of fresh cheeses and dairy products like cottage cheese, cream and butter. In order to keep quality of these products at sufficient level, there is a need to predict the growth ability of G. candidum. The work deals with quantitative radial growth description of three representatives of G. candidum cultivated on the surface of SMA agar in dependence on temperature (15, 18, 21 C) and water activity (0, 1, 3, 5 and 7 % w/v of NaCl). In all studied cultivation temperatures G. candidum exhibited the highest tolerance to the medium with 1 % salt concentration (a w = ±0.003). The conclusion from this study indicated, that the salt addition over 5 % (a w = ±0.004) rapidly slowed down the growth of this milk yeast. Finally, G. candidum was not capable to grow at 10 % NaCl (a w = 0,924 ±0.004) content in agar medium. Úvod Mikromycéty (vláknité huby a kvasinky) sú vä šinou známe ako kontaminanty surovín a potravinových produktov. Vplyvom svojej metabolickej aktivity a/alebo produkciou toxických látok môžu zníži nutri nú kvalitu požívatín, spôsobi ich kazenie a zárove aj ohrozi zdravie spotrebite a. Na druhej strane sú však kultúrne kmene kvasiniek a vláknitých húb nenahradite né pri výrobe viacerých fermentovaných potravín, v Európe naj astejšie syrov. Významným komponentom mykobioty mäkkých syrov zrejúcich pod mazom, syrov kamembertského typu a mnohých tradi ných slovenských produktov vyrábaných zo surového mlieka je aj kvasinka Geotrichum candidum 1. Rast tejto mikromycéty môžeme pozorova v rozsahu od 5 do 38 C, s optimom pri 25 C. Dokáže rás v širokom rozsahu ph hodnôt: od 3 až po 11, ale s optimom okolo 5,5 až 6,0. Druh G. candidum nevykazuje toleranciu vo i zníženým hodnotám aktivity vody (a v ), a teda je citlivý na obsah soli v médiu. Táto senzitívnos je však kme ovo závislá a líši sa najmä v intervale od 1 do 2,5 % NaCl (w/v) v médiu 1,2,3. G. candidum je dôležitý mikroorganizmus v po nohospodárskom a potravinárskom priemysle. Vyskytuje sa v rôznych prostrediach, ako sú napr. pôda, tráva, siláž, rastliny, ovocie alebo k mne zmesi. Táto kvasinka je zárove komenzálny organizmus v tráviacom trakte loveka a zvierat 4. Výskyt tejto kvasinky v potravinách nemá jednozna ný význam. Jej prítomnos je v ur itých druhoch mlie nych produktov, akými sú napríklad maslo, smotana, erstvé syry, považovaná za nežiaducu 5. Ako sú as kontaminujúcej mikroflóry sa zástupcovia rodu Geotrichum asto vyskytujú aj na povrchoch technologických zariadení. Zárove sú pri výrobe syrov dominantnou sú as ou biofilmov, a týmto spôsobom môžu výsledný výrobok znehodnoti a zníži jeho mikrobiologickú kvalitu 3,4,6. Kvasinka G. candidum sa využíva v potravinárskom priemysle i v pozitívnom slova zmysle, na zlepšenie akosti niektorých mlie nych výrobkov. Kultúrne kmene G. candidum majú významné postavenie v mliekarskom priemysle najmä pri výrobe syrov v procese ich zrenia, kde sa používajú ako prídavná kultúra do kravských polotvrdých (napr. St. Nectaire, Reblochon) a mäkkých syrov zrejúcich s ples ou na povrchu (napr. encián, plesnivec) a pod mazom (napr. Münster, Livarot). Taktiež sa využívajú aj pri výrobe ov ích a kozích syrov (bryndza, ov í a kozí hrudkový syr). Uvo ovanie amoniaku a utilizácia kyseliny mlie nej touto kvasinkou spôsobuje zvýšenie ph 153

154 hodnoty syrov, o následne umož uje menej acidotolerantným mikroorganizmom, ako sú mikrokoky a koryneformné baktérie, rás 4,7,8. Svojou biochemickou aktivitou taktiež prispieva k rozvoju textúry, chuti, arómy a bezpe nosti syrov tým, že v priebehu procesu zrenia vytvára rôzne aromatické (S-metyl tioacetát, S-metyl tiobutyrát, S-metyl tiopropionát, dimetylsulfid, dimetyltrisulfid) a bioaktívne (kyselinu fenylmlie nu, indoloctovú, hydroxyfenylmlie nu) metabolity 2,4,9,10. Z potravinársko-technologického a hygienického h adiska na rast mikroorganizmov významne vplývajú vnútorné a vonkajšie faktory prostredia 11. Predložená práca sa zaoberá kvantitatívnym opisom radiálneho rastu kvasinky G. candidum na povrchu stuženého živného média s obsahom odstredeného mlieka v závislosti od kultiva nej teploty a vodnej aktivity. Materiál a metódy Mikrobiálne kultúry Rastový potenciál zbierkového kme a G. candidum CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holandsko) a dvoch izolátov druhu G. candidum sme vyšetrovali na povrchu agaru s prídavkom odstredeného sušeného mlieka (SMA, Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko). Pozorovaný izolát G. candidum A bol izolovaný z ov ieho hrudkového syra vyrobeného zo surového ov ieho mlieka a izolát B bol získaný ako kontaminujúca mikroflóra z cottage cheese. Inokulácia a kultivácia Základnú suspenziu jednotlivých kultúr sme si pripravili zo 72 h kultúry vyrastenej na SMA kolmom agare vytrepaním do fyziologického roztoku (5ml). Hodnota ph SMA agaru, ktorá bola upravená roztokom kyseliny mlie nej na 5,5, bola zvolená z technologického h adiska v súvislosti s výrobou ov ieho hrudkového syra. Následne sme na povrch stuženého živného média v 3 paralelných sériách inokulovali 2 μl zriedenej suspenzie G. candidum. Experimenty sme vykonali nielen pri prirodzenej hodnote aktivity vody kultiva ného média ale aj na agare, kde sme obsah využite nej vody upravili 1, 3, 5 a 7 % (w/v) prídavkom chloridu sodného. Misky sme inkubovali pri teplote 15, 18 a 21 ±1 C, oto ené hore dnom, za aeróbnych podmienok. Priemer kolónií sme merali vo vopred stanovených intervaloch pomocou posuvného meradla (150x0.02 mm, Sinochem Jiangsu, ína) v dvoch na seba kolmých smeroch. Výsledný priemer vyrastenej kolónie sme ur ili ako aritmetický priemer. Matematická analýza Radiálny rast sledovaných zástupcov druhu G. candidum bol vyhodnotený v závislosti od asu inkubácie pomocou primárneho Baranyiho D-modelu. Rastové rýchlosti, trvanie lag-fázy a alšie rastové parametre získané z príslušných rastových iar sa podrobili analýze v sekundárnej fáze matematického modelovania mikrobiálneho rastu, pri om boli použité Gibsonovej a Ratkowskeho prediktívne modely. Výsledky a diskusia Po bodovej inokulácii rástli pozorované izoláty a zbierkový kme G. candidum na povrchu agarizovaného živného média v podobe rozrastajúcich sa kolónií. Pre názornos je na nasledovnom obrázku 1 znázornený priebeh dynamiky rastu izolátu A pri teplote 15 C. Získané rastové krivky mali sigmoidálny charakter s lag-fázou, následnou exponenciálnou fázou, po ktorej nasledovala stacionárna fáza rastu. Koncentrácia pridanej soli do média výrazne ovplyvnila dynamiku rastu G. candidum. Vo všeobecnosti môžeme skonštatova, že rast tejto mikromycéty najviac stimuloval 1 % prídavok NaCl (a v = 0,991) do stuženého živného média. Tento trend bol pozorovaný pri oboch sledovaných izolátoch a zbierkovom kmeni pri všetkých testovaných inkuba ných teplotách. Vzh adom na skuto nos, že 1 % prídavok soli do prostredia neobmedzil významne rast tejto mikromycéty, navýšili sme koncentráciu na 3 %. Týmto poklesom aktivity vody na a v = 0,982 boli sledovaní 154

155 zástupcovia schopní rás pomalšie a rozdiel medzi rastovými rýchlos ami bol v priemere 47 %. Následkom alšieho poklesu aktivity vody na a v = 0,972 (5 % NaCl) rastová rýchlos pri všetkých monitorovaných kultiva ných teplotách klesla najmenej o polovicu. Zvýšenie prídavku chloridu sodného z 3 na 5 % zaprí inilo najvýraznejšie spomalenie rastu izolátu B v exponenciálnej fáze pri 18 C; pozorovali sme takmer 4-násobný pokles jeho rastovej rýchlosti (Gr B 3%NaCl = 0,139 mm.h -1 ; Gr B 5%NaCl = 0,037 mm.h -1 ). Pod a o akávaní 7 % koncentrácia NaCl (a v = 0,954) v médiu spôsobila alšie spomalenie rastu a pred ženie lag-fázy. Tempel a Nielsen 12 zaznamenali úplnú inhibíciu rastu dvoch kme ov G. candidum po 4 % prídavku soli, ktorý znížil aktivitu vody kultiva ného média na a v = 0,97. Nami pozorovaní zástupcovia druhu G. candidum sa však na rozdiel od spomínaných kme ov, dokázali prispôsobi nepriaznivým podmienkam a rás až pri 7 % prídavku soli. Avšak, pri alšom navýšení obsahu NaCl na 10 % boli rastové podmienky pre sledované izoláty a zbierkový kme nato ko nepriaznivé, že bunky G. candidum už neboli schopné rastu. Obr. 1. Rastová iara radiálneho rastu izolátu A na povrchu SMA agaru s prídavkami 0, 1, 3, 5 a 7 % NaCl pri teplote 15 C Podobne ako rastová rýchlos kolónií bola pri 1 % obsahu soli do média najvyššia, aj kone né priemery kolónií pozorovaných zástupcov pri tejto koncentrácii NaCl dosahovali najvä šie hodnoty. Kone ný priemer kolónie izolátu A kultivovanom pri 15 C na médiu s 1 % obsahom tejto osmoticky aktívnej látky (d ka 1%NaCl = 78,85 mm) bol o 22 % vä ší ako pri 0 % koncentrácii v SMA agare (d ka 0%NaCl = 64,23 mm). Naopak, pri aktivite vody a v = 0,954 (7 % NaCl) sme pozorovali najnižšie kone né priemery. Kvasinka využila viac energie na prispôsobenie sa zníženému obsahu využite nej vody než v prípade agaru s 1 % prídavkom a bez prídavku soli a táto metabolická adaptácia na stres sa prejavila aj v zmene morfológie kolónií (obr. 2). Okraj kolónií už nebol rovnomerný a oblý, ale zvlnený s výbežkami kolónií do agaru. Obr. 2. Makroskopický vzh ad kolónií izolátu A na povrchu agaru s obsahom odstredeného sušeného mlieka s koncentráciou 0 % NaCl (v avo) a 5 % NaCl (vpravo) pri teplote 18 C 155

156 Rovnako, ako v prípade aktivity vody, aj pri meniacej sa inkuba nej teplote sme pozorovali významný vplyv na rastový potenciál tejto kvasinky. Prevažne pri teplote 18 C boli namerané najvyššie hodnoty rýchlostí rastu, avšak rozdiel medzi radiálnymi rýchlos ami jednotlivých zástupcov G. candidum po as ich rastu pri 15, 18 a 21 C na médiu s 1 % prídavkom soli nebol výrazný. Následkom zvýšenia inkuba nej teploty z 15 C na 18 C dochádzalo k postupnému rýchlejšiemu prispôsobovaniu sa mikroorganizmu negatívnym podmienkam prostredia. Izolát A bol schopný na médiu bez prídavku NaCl pri 18 C po 2-násobne kratšej lag-fáze ( A 0%NaCl = 22,8 h) rás o 33 % rýchlejšie (Gr A 0%NaCl = 0,180 mm.h -1 ) ako pri 15 C. Zvýšením prídavku chloridu sodného na 1 % sme pozorovali 1,2-násobné pred ženie lag-fázy ( = 28,2 h), ale rastová rýchlos spomínaného izolátu sa o 22 % zvýšila (Gr A 1%NaCl = 0,220 mm.h -1 ). Táto dlhšia lag-fáza pravdepodobne poskytla izolátu dostatok asu na prispôsobenie svojho metabolizmu daným podmienkam a tak po naštartovaní aktivity dokázal rýchlejšie rás. V rámci empirického prístupu k modelovaniu vplyvu aktivity vody na rastovú rýchlos G. candidum pri jednotlivých inkuba ných teplotách bol použitý Gibsonovej model. Z priebehu jednotlivých iar je zrejmé, že rast bol pozitívne determinovaný 1 % prídavkom soli do média a na agare s hodnotou aktivity vody nižšou ako a v = 0,991 dochádzalo k poklesu špecifickej rýchlosti rastu. Na popísanie spolo ného vplyvu oboch sledovaných environmentálych faktorov na radiálny rast G. candidum, teploty a aktivity vody, bol použitý Ratkowskeho lineárny model. Obr. 3. Gibsonovej model (v avo) a Ratkowskeho odmocninový model (vpravo) popisujúci experimentálne údaje po as kultivácie izolátu A na povrchu SMA agaru s jednotlivými prídavkami NaCl v intervale teplôt 15 C až 21 C Tabu ka I Rastová rýchlos kolónie a d žka lag-fázy G. candidum v závislosti od koncentrácie NaCl po as ich kultivácie na povrchu SMA agaru pri teplote 15 C Rastová rýchlos Gr col [mm.h -1 ] Izolát A Izolát B CBS D žka D žka Rastová rýchlos Rastová rýchlos lag-fázy Gr [h] col [mm.h -1 lag-fázy ] Gr [h] col [mm.h -1 ] 156 D žka lag-fázy [h] 0 % NaCl 0,135 45,4 0,166 23,5 0,175 32,7 1 % NaCl 0,163 60,2 0,225 20,1 0,243 49,1 3 % NaCl 0,096 63,7 0,148 60,1 0,125 78,5 5 % NaCl 0, ,1 0, ,7 0, ,9 7 % NaCl 0, ,4 0, ,2 0, ,2

157 Tabu ka II Rastová rýchlos kolónie a d žka lag-fázy G. candidum v závislosti od koncentrácie NaCl po as ich kultivácie na povrchu SMA agaru pri teplote 18 C Rastová rýchlos Gr col [mm.h -1 ] Izolát A Izolát B CBS D žka D žka Rastová rýchlos Rastová rýchlos lag-fázy Gr [h] col [mm.h -1 lag-fázy ] Gr [h] col [mm.h -1 ] D žka lag-fázy [h] 0 % NaCl 0,180 22,8 0,237 15,7 0,226 12,7 1 % NaCl 0,220 28,8 0,253 20,6 0,270 30,0 3 % NaCl 0,095 31,2 0,139 24,2 0,140 76,3 5 % NaCl 0,040 99,5 0,037 89,1 0, ,1 7 % NaCl 0, ,2 0, ,4 0, ,9 Tabu ka III Rastová rýchlos kolónie a d žka lag-fázy G. candidum v závislosti od koncentrácie NaCl po as ich kultivácie na povrchu SMA agaru pri teplote 21 C Rastová rýchlos Gr col [mm.h -1 ] Izolát A Izolát B CBS D žka D žka Rastová rýchlos Rastová rýchlos lag-fázy Gr [h] col [mm.h -1 lag-fázy ] Gr [h] col [mm.h -1 ] D žka lag-fázy [h] 0 % NaCl 0,163 12,2 0,204 8,3 0,196 6,9 1 % NaCl 0,180 23,9 0,223 8,7 0,255 12,0 3 % NaCl 0,096 42,7 0,106 46,4 0,118 50,7 5 % NaCl 0,043 71,7 0,040 81,0 0,040 48,6 7 % NaCl 0,021 94,0 0,014 85,4 0,018 89,9 Záver Mikromycéta G. candidum je na obsah soli v médiu citlivá, ale táto vlastnos je kme ovo závislá. Na základe pozorovaní možno konštatova, že rast všetkých sledovaných zástupcov druhu G. candidum bol pozitívne determinovaný 1 %-ným prídavkom soli do živného média. Z uvedených výsledkov vyplýva, že sledovaný druh nie je osmotolerantným mikroorganizmom. Dokáže tolerova 1 % prídavok soli do prostredia, avšak alšie zvyšovanie koncentrácie na 3 a viac % viedlo k spomaleniu radiálneho rastu kolónie, k predlžovaniu lag-fázy a zmene morfológie kolónií. Výraznejšie zníženie rastovej rýchlosti bolo pozorované pri 5 a 7 % obsahu soli v substráte, omu odpovedá hodnota aktivity vody a v 5% NaCl = ±0.003 a a v 7% NaCl = ± Pri inkuba nej teplote 18 C bola pozorovaná najvä šia tolerancia vo i znižujúcim sa hodnotám aktivity vody. Získané výsledky poskytujú cenné informácie, na základe ktorých možno predpoveda rast tejto kvasinky na povrchu syrov, kde vytvára biely povlak a vplyvom jej enzýmovej aktivity môžu vznika nežiaduce senzorické defekty, o v kone nom dôsledku skracuje dobu spotreby. Možno skonštatova, že rast druhu G. candidum po as zrenia syrov môže by kontrolovaný znížením aktivity vody pod hodnotu 0,991 ±0,003. Po akovanie: Tento projekt bol podporený Nadáciou Tatra banky pod a zmluvy. 2015vs

158 Použitá literatúra: 1. Hudecová, A., Valík,., Liptáková, D. Quantification of Geotrichum candidum growth in co-culture with lactic acid bacteria. In Czech Journal of Food Science. 2009, vol. 27, p Boutrou R., Guéguen M. Interests in Geotrichum candidum for cheese technology. In International Journal of Food Microbiolog,y, 2005, vol. 102, s Ko uchová M., Šípková A., Valík. Celostátní p ehlídky sýr 2014, Praha, leden 2014: Výsledky p ehlídek a sborník p ísp vk konference Mléko a sýry. Praha: Vysoká škola chemickotechnologická v Praze, 61 (2014). 4. Ko uchová, M., Liptáková, D., Šípková, A., Valík,. Využitie druhu Geotrichum candidum v mliekarenskom priemysle. Chemické listy, in press. 5. Lauren ík, M., Sulo, P., Sláviková, E., Piecková, E., Seman, M., Ebringer, L. The diversity of eukaryotic microbiota in the traditional Slovak sheep cheese bryndza. In International Journal of Food Microbiology. 2008, vol. 127, p Pitt, J.I., Hocking, A.D. Fungi and food spoilage. 3. vyd. New York: Springer Science+Business Media, 2009, 519 s., ISBN Hudecová, A., Valík,., Liptáková, D. Surface growth of Geotrichum candidum: Effect of the enviromental factors on its Dynamics. In Potravinárstvo, 2011, vol. 5, p Pottier I., Gente S., Vernoux J. P., Guéguen M. Safety assessment of dairy microorganisms: Geotrichum candidum. In International Journal of Food Microbiology, 2008, vol. 126, p Sacristán N., González L., Castro J. M., Fresno J. M., Tornadijo M. E. Technological characterization of Geotrichum candidum strains isolated from a traditional Spanish goats milk cheese. In Food Microbiology, 2012, vol. 30, p Pinotti, T., Carvalho, P.M.B., Garcia, K.M.G., Silva, T.R., Hagler, A.N., Leite, S.G.F. Media components and amino acid supplements influencing the production of fruity aroma by Geotrichum candidum. In Brazilian Journal of Microbiology. 2006, vol. 37, p Görner, F., Valík,. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé centrum, s. ISBN Tempel, T., Nielsen, M.S. Effects of atmospheric conditions, NaCl and ph on growth and interactions between moulds and yeasts related to blue cheese production. In International Journal of Food Microbiology. 2000, vol. 57, p Kontaktná adresa: Ing. Martina Ko uchová, Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, Bratislava, Slovenská republika, martina.konuchova@stuba.sk 158

159 HODNOCENÍ MIKROBIÁLNÍCH BIOFILM POMOCÍ DART/TOF-MS Hrubá Magdaléna, Prchalová Jana, Rajchl Aleš Ústav konzervace potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Evaluation of microbial biofilms by DART/TOF-MS Summary: An integral part of all operations in the food industry is a certain degree of contamination of working surfaces and parts production facilities. For each operation it is necessary that the level of contamination does not exceed a certain degree causing contamination of produced food. Cleaning and disinfection are an integral part of safe and quality food production, following current legislative requirements. One of the main aims of cleaning and disinfection is to eliminate contamination, which support causes the potential growth of bacteria, yeasts and moulds, in order to reduce the risk of contamination, poisoning or spoilage of food. Manufacturing food products which are microbiologically unsafe or of poor quality, what is due to a reduction in shelf life, causes serious economic consequences for the manufacturers (loss of reputation, lawsuits, foodborne illnesses, consequential compensation to clients, including large losses of sales). For that reason, in the food industry there are constantly developed new procedures for quick verification of sanitation efficacy and identify cation of residual contamination. Modern ionization technique DART (The Direct Analysis in Real Time) belongs to the group of ambient ionization techniques. By using this technique it is possible to analyse the gases, liquids and solid samples without sample pre-treatment. This method it suitable for rapid screening. The DART/TOF-MS technique is able to characterize basic pollution in production lines (e.g. carbohydrates, lipids, organic acids, and others). During sanitation lines it is easy to select a suitable one and to optimize the sanitation process (duration the concentration and suitable temperature of the sanitizer). By using the DART/TOF-MS technique it is possible to estimate bacteria, yeasts and moulds. The DART/TOF-MS technique appears to be potentially suitable for identification of bacterial biofilms, for the basic characterisation of microorganisms and for controling the forming efficiency of sanitation of food plants. Nedílnou sou ástí všech operacích v potraviná ství je jistá míra zne išt ní pracovních ploch a ástí výrobních za ízení. Pro každou operaci je však nezbytné to, aby úrove zne išt ní nep esáhla takovou míru, že by hrozilo nebezpe í kontaminace vyráb ných potravin. Proces išt ní a desinfekce je sou ástí úsp šné potraviná ské výroby, v etn spln ní legislativních požadavk. Jedním z hlavních cíl išt ní a desinfekce je odstranit zne išt ní, které umož uje potenciální r st bakterií, kvasinek a plísní, a snížit tak riziko kontaminace potravin, otravy z potravin nebo zkažení potravin. Vyrobení potraviná ského výrobku mikrobiologicky nebezpe ného, zkontaminovaného nebo o špatné kvalit, která je d vodem ke snížení doby trvanlivosti, má pro výrobce vážné ekonomické následky (ztráta pov sti, soudní p e, onemocn ní z potravin, následné náhrady zákazník m, v etn velkých ztrát prodej ). Z tohoto d vodu jsou v potraviná ství neustále vyvíjeny nové postupy, jak rychle ov it ú innost išt ní a sanitace, p ípadn, jak co nejrychleji identifikovat neodstran né zne išt ní. Moderní ioniza ní technika DART (Direct Analysis in Real Time) pat í do skupiny ambientních ioniza ních technik. S touto technikou lze analyzovat plyny, kapaliny i pevné látky bez složit jších úprav vzork. Je proto ideální k rychlému screeningu. Technika DART/TOF-MS umožnila charakterizovat základní zne išt ní výrobních linek (sacharidy, lipidy, organické kyseliny a podobn ), což p i išt ní výrobních linek umožní snadno vybrat vhodný sanita ní prost edek, v etn optimalizace sanita ního procesu (dobu p sobení, koncentraci a stanovení vhodné teploty sanita ního prost edku). Materiály a metody Pomocí techniky DART/TOF-MS byly rozlišeny jednotlivá zne išt ní výrobních linek. Byly zm eny simulovaná typická zne išt ní v mlékárenském, masném pr myslu a v pr myslu zpracovávající ovoce a zeleninu. Všechna zne išt ní byla m ena p ímo (bez p edchozí úpravy vzorku) v pozitivním i negativním módu p i ioniza ních teplotách od 50 C do 450 C s intervalem 50 C, m ení do 250 C v pozitivním i negativním módu neukázala významné rozdíly mezi jednotlivými zne išt ními. Ioniza ní teploty od 300 C do 400 C byly nejvhodn jší pro identifikaci m ených zne išt ní. Metoda byla optimalizována a optimální podmínky metody jsou v pozitivním 159

160 módu p i teplot 350 C (Obr. 1). V jednotlivých MS spektrech se poda ilo identifikovat charakteristické látky (sacharidy, lipidy, organické kyseliny a podobn ) pro daný typ zne išt ní. Bylo testováno zvyšující se množství bakterií v ádu 10 1 až 10 6 KTJ ml -1 (koncentraci vyšší než 10 6 KTJ ml -1 v bun né suspenzi se nepoda ilo kultivovat, z d vodu nízké vitality bakteriálního kmenu Pseudomonas fragi CCM 1974), ov ení koncentrace bun né suspenze prob hlo pomocí plotnové metody na agaru TSA (Tryptone Soya Agar) za kultiva ních podmínek: 48 hodin p i 30 C (koncentrace mikroorganismu v suspenzi byla ov ena plotnovou metodou podle SN EN ISO 7218). Jako indikátorový mikroorganismus byl zvolen bakteriální druh Pseudomonas fragi (konkrétn sbírkový kmen Pseudomonas fragi CCM 1974). Bakteriální druh Pseudomonas fragi byl kultivován v TSB (Tryptone Soya Broth) p i 30 C po dobu 16 hodin. Bun ná suspenze Pseudomonas fragi o koncentraci 10 6 KTJ ml -1 byla odst ed na p i 4 C a následn n kolikrát promyta demineralizovanou vodou a op tovn odst ed na. Poté byla vytvo ena koncentra ní ada v rozmezí 10 1 až 10 6 KTJ ml -1 v demineralizované vod, navíc byla p ipravena stejná koncentra ní ada v TSB. Takto p ipravené vzorky byly zm eny p ímo v pozitivním i negativním módu p i ioniza ních teplotách od 50 C do 450 C s intervalem 50 C. Nam ené výsledky nejsou jednozna né, z d vodu nízké opakovatelnosti m ení. Technika DART/TOF-MS se ukázala jako nep íliš vhodná pro rozlišení jednotlivých druh bakterií, p i emž v ešení dané problematiky se bude nadále pokra ovat. Nejvhodn jší fingerprint s nejv tšími rozdíly byl nam en v pozitivním módu p i ioniza ní teplot 450 C, z tohoto MS spektra se poda ilo identifikovat specifické látky (Tabulka I). Dále byl zkoumán rozdíl mezi bu kou bakterie, kvasinky a plísn. Byla m ena MS spektra kvasinky Saccharomyces cerevisiae CCM 8191, plísn Aspergillus braziliensis CCM 8222 a bakterie Pseudomonas fragi CCM Vzorek kvasinky Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 a plísn Aspergillus braziliensis CCM 8222 byl aplikován p ímo z Petriho misky na sklen nou ty inku a p ímo m en na p ístroji DART/TOF-MS. Všechny vzorky byly zm eny v pozitivním i negativním módu p i ioniza ních teplotách od 50 C do 450 C s intervalem 50 C, nejv tší rozdíly mezi kvasinkou Saccharomyces cerevisiae CCM 8191, plísní Aspergillus braziliensis CCM 8222 a bakterií Pseudomonas fragi CCM 1974 byly zaznamenány p i m ení v negativním módu p i teplot 300 C. Tato data byla následn zpracována v programu Statistica 12. Pomocí analýzy hlavních komponent byla rozlišena bakterie, kvasinka a plíse (Obr. 3). Výsledky Obr. 1: MS spektrum simulovaného zne išt ní v mlékárenském pr myslu v pozitivním módu, ioniza ní teplota 350 C 160

161 Obr. 2: MS spektrum Pseudomonas fragi CCM 1974 v pozitivním módu, ioniza ní teplota 450 C Tabulka I: Tabulka nalezených látek v MS spektru Pseudomonas fragi CCM 1974 Látka Sumární vzorec Pozorovaný ion HDP, HLaM, BMM, BLaP, OcDM, OcLaLa, DDLa, HDL OcLaM, HMM, HLaP, BMP, OcDP, DDM, HDS, BLaS, BPoPo HMP, BPP, BMS, OcLaP, OcMM, DLaM, HLaS, HBP Experimentální hmota (m/z) Teoretická hmota (m/z) Chyba (ppm) C 35 H 66 O 6 [M+NH 4 ] + 600, , ,2 C 37 H 70 O 6 [M+NH 4 ] + 628, , ,0 C 39 H 74 O 6 [M+NH 4 ] + 656, , ,2 LaLaM, DMM, OcMP, HPP, BPS, DLaP, HMS, BHS DLaO, HPO, BOS, OcMO, DMPo, OcPPo MMM, LaMP, DPP, OcPS, HSS, DMS OcSS, DPS, LaMS, LaPP, MMP C 41 H 78 O 6 [M+NH 4 ] + 684, ,6137-8,9 C 43 H 80 O 6 [M+NH 4 ] + 710, ,6293-6,6 C 45 H 86 O 6 [M+NH 4 ] + 740, ,6763-3,4 C 47 H 90 O 6 [M+NH 4 ] + 768, ,7076 3,6 DOS, LaPO, MPoP, MMO C 49 H 92 O 6 [M+NH 4 ] + 794, ,7232 0,4 MPO, LaSO C 51 H 96 O 6 [M+NH 4 ] + 822, ,7545-1,2 POO C 53 H 100 O 6 [M+NH 4 ] + 850, ,7858 0,9 PP C 35 H 66 O 4 [M+H] + 551, , ,8 PO C 37 H 68 O 4 [M+H] + 577, ,519-13,9 B = kyselina máselná, D = kyselina kaprinová, H = kyselina kapronová, L = kyselina linolová, La = kyselina laurová, Ln = kyselina linolenová, M = kyselina myristová, O = kyselina olejová, Oc = kyselina kaprylová, P = kyselina palmitová, Po = kyselina palmitoolejová, S = kyselina stearová 161

162 Obr. 3: Analýza hlavních komponent Aspergillus braziliensis CCM 8222, Pseudomonas fragi CCM 1974 a Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 v negativním módu, ioniza ní teplota 300 C Záv r Pomocí techniky DART/TOF-MS byly rozlišeny jednotlivá zne išt ní výrobních linek. Technika DART/TOF-MS umož uje charakterizovat základní zne išt ní výrobních linek (sacharidy, lipidy, organické kyseliny a podobn ). Z MS spekter je z ejmý rozdíl mezi eukaryotickou a prokaryotickou bu kou. Pomocí analýzy hlavních komponent byla rozlišena bakterie, kvasinka a plíse. Technika DART/TOF-MS se jeví jako potenciáln vhodná pro identifikaci biofilm a základní charakteristiku mikroorganism. Pod kování: Financováno z ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT.20/2015): A2_FPBT_2015_10 Použitá literatura: 1. Cody, R. B.; Laramée, J. A.; Durst, H. D.: Direct Analysis in Real Time (DART tm ) Mass Spectrometry. JEOL News; 2005, 40 (1), Denkhaus, E.; Meisen, S.; Telgheder, U.; Wingender, J.: Review: Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta; 2007, 158, Hajslova, J.; Cajka, T.; Vaclavik, L.: Challenging applications offered by direct analysis in real time (DART) in food-quality and safety analysis. Trends in Analytical Chemistry; 2011, 30 (20), Kontaktní adresa: magdalena.hruba@vscht.cz 162

163 VYUŽITÍ STATISTISTICKÝCH METOD P I SENZORICKÉM HODNOCENÍ MLÉKA A MLÉ NYCH VÝROBK Ilko Vojtech, Koštejnová Denisa, Panovská Zd nka, Doležal Marek Ústav analýzy potravin a výživy, VŠCHT Praha Use of statistical methods for sensory evaluation of milk and dairy products Summary: In this study we used different methods of sensory analysis on samples of milk and dairy products. Part of the work is dedicated to assess the performance of the sensory panel using the standards General guidance for monitoring the performance of a quantitative sensory panel. The samples of processed cheese was investigated performance by sensory panel and graphic evaluation was performed using PanelCheck. In another part were evaluated milk samples were evaluated using the method of principal components (PCA), factor analysis and cluster analysis using. Using correlation matrices were determined based on the occurrence of sensory defects in the manufacturing conditions in the samples of blue cheeses. Pomocí senzorické analýzy se hodnotí vzorky bezprost edn lidskými smysly. Organoleptické vlastnosti potravin hodnotí panel školených hodnotitel, aby byla zajišt na co nejv tší p esnost sbíraných dat. Školený panel hodnotitel zjiš uje znaky, které ovliv ují vlastnosti produktu. Pro získání reprezentativních výsledk ze senzorické analýzy je d ležité statistické zpracování dat. Díky po íta ové technice došlo k nár stu program pro zpracování dat ze senzorické analýzy, což m lo za následek vznik nových statistických metod ur ených pro vyhodnocení dat získaných pomocí senzorického hodnocení. V této práci byly použity r zné metody senzorické analýzy na vzorcích mléka a mlé ných výrobk. ást práce se v nuje posouzení výkonu senzorického panelu pomocí normy General guidance for monitoring the performance of a quantitative sensory panel. Na vzorcích tavených sýr byl zkoumán výkon senzorického panelu a grafické vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu PanelCheck. V další ásti byly hodnoceny vzorky mléka, které byly vyhodnocovány pomocí metody hlavních komponent (PCA), faktorové analýzy nebo pomocí shlukové analýzy. Pomocí korela ní matrice byly zjišt ny závislosti výskytu senzorických vad na výrobních podmínkách ve vzorcích sýr s modrou plísní. Posouzení výkonu senzorického panelu Panel ty hodnotitel porovnával tavené sýry t i po sob následující týdny, aby mohlo být provedeno posouzení výkonu senzorického panelu podle normy ISO Cílem hodnocení bylo uvést do praxe vyhodnocení výkonu panelu, jelikož by se v senzorických laborato ích m lo více používat. V obrázku 1 je vid t jak dva hodnotitelé r zn hodnotí vzorky tavených sýr. Výsledky pro vzorek 2 u hodnotitele B a D ukazují, že hodnotitel B m l skute n veliké rozdíly mezi replikami. Pokud by cht l v hodnocení pokra ovat, bylo by dobré, aby byl opakovan proškolen. Naopak hodnotitel D m l na neškoleného hodnotitele velice srovnatelné hodnocení mezi replikami, ale i p esto nebyly jeho výsledky srovnatelné se školeným hodnotitelem. Obrázek 2 znázor uje výsledky vzorku 4 od všech hodnotitel (v etn jejich opakovaných hodnocení). V p ípad ideální opakovatelnosti a reprodukovatelnosti by svislá linka m la být co nejkratší. Na vybrané deskriptory u všech vzork je možné se podívat z pohledu profilového grafu (Obr. 3). Celkovou p íjemnost posuzovali hodnotitelé s nejv tší reprodukovatelností u vzork 3,4 a 5, naopak s nejnižší podobností hodnocení u vzork 1 a 2. F hodnota je hodnota testovaného kritéria (Obr. 4), která porovnává modely. Obecn je možné tvrdit, že ím vyšší F hodnota u hodnotitele pro ur itý deskriptor, tím v tší má hodnotitel schopnost rozlišit vzorky dle daného deskriptoru. Analýza provedena pomocí programu PanelCheck. 163

164 Obr 1: Porovnání výkonu hodnotitel pomocí pavu inových graf Obr 2. Profil vzorku 4 164

165 Obr. 3 Profilový graf: Celková p íjemnost chuti Obr. 4 F graf pro deskriptory Hodnocení tavených sýru profilovou zkouškou Nejprve byli hodnotitelé požádáni, aby vytvo ili maximální po et deskriptor k popisu všech po itk vyvolaných p edloženými vzorky. Podle pravidel pro snížení po tu deskriptor, která jsou uvedená v norm SN ISO 11035, byl vytvo en formulá ítající 17 deskriptor. V rámci studie byly hodnoceny 3 vzorky, p i emž dva byly tavené sýry a 3. vzorek byl tavený výrobek s p ídavkem 15 % rostlinného tuku. Výsledky byly zpracovány pomocí programu Statistica. Obr. 5 Histogram celkové p íjemnosti chuti kategorizace dle vzorku a obliby 165

166 Pokud byla do histogramu vnesena kategorizace dle obliby tavených sýr, hodnocení bylo p ekvapiv celkem shodné (Obr. 5). Hodnotitelé, kte í nemají rádi tavené sýry, hodnotili vzorek I shodn v porovnání s hodnotiteli, kte í naopak sýry mají rádi. Rozdíl byl ovšem u vzorku II, který hodnotili velice kladn (i p esto, že nemají tavené sýry rádi), a to z ejm z d vodu vysokého obsahu tvarohu, tudíž jim vzorek II nep ipomínal typické tavené sýry. Naopak vzorek III byl hodnocen spíše negativn. P i pohledu na výsledky biplotu (Obr. 6) vzorek II hodnotitelé zaznamenávali jako tvarohový a kyselý, což odpovídalo jeho složení. Složením také odpovídal vzorek III, který byl klasifikován dle margarínové chuti. Hodnotitelé z r zných kraj byli dle svého hodnocení seskupeni do t í skupin (Obr. 7). Obr. 6 Biplot deskriptory vzorky Obr. 7 Dendrogram shlukování dle p vodu 166

167 P i porovnání hodnocení muž a žen nebyly nalezeny žádné podstatné rozdíly pro hodnocení vzork. Malé rozdíly byly zaznamenány i p i porovnání ku ák a neku ák. Ku áci zaznamenávali menší intenzitu sladké, kyselé, ho ké, pal ivé, máselné a margarínové chuti, naopak tvarohovou chu hodnotili mírn intenzivn ji než neku áci (Tab. I). Tab. I Popis shluk ku áci/neku áci Shluk Sladkost Kyselost Ho kost Pal ivost Máselná chu Margarínová chu Tvarohová chu Ku áci Neku áci Hodnocení mléka profilovou zkouškou Byly analyzovány 3 druhy mléka polotu né, bezlaktosové a kozí. Analýza hlavních komponent p edstavovala 52,61 % celkové variability mezi všemi vzorky. První hlavní složka tvo ila 32,65 % a byla vysoce negativn ovlivn na intenzitou a p íjemností sladké chuti a také celkovou p íjemností chuti. Proti tomu druhá hlavní složka zastupovala 19,96 % celkové variability. T i hodnocené vzorky byly dle hodnotitel rozdílné celkovou p íjemností chuti, p íjemností sladké chutí a dokonce i intenzitou pachutí (Obr. 8). Pokud byla hodnotitelem zaznamenána silná intenzita pachutí, hodnotil ve v tšin p ípad nižší p íjemností celkové chuti. U bezlaktosového mléka sice hodnotitelé zaznamenávali také siln jší intenzitu pachutí, ale vzorek byl hodnocen jako velmi p íjemn sladký, a proto byl celkov p ijateln jší. Obr. 8 Analýza hlavních komponent p i dopl kové prom nné dle vzorku 167

168 Záv r Tato práce shrnuje poznatky o používaných statistických metodách a statistických programech v senzorické analýze. Experimentální ást byla v nována vyhodnocení senzorického profilu zvolenými statistickými metodami (histogramy, faktorovou, shlukovou, diskrimina ní analýzou a analýzou hlavních komponent) a na posouzení výkonu senzorického profilu. Do budoucích let bude vhodné ast jší použití výše testovaných statistických metod, jelikož slouží pro pochopení vzájemných vztah mezi výrobky a senzorickými vlastnostmi. 168

169 SENZORICKÉ VLASTNOSTI EXPERIMENTÁLNE VYROBENÝCH SYROV S PROBIOTICKÝMI KULTÚRAMI Dudriková Eva 1, Lovayová Viera 2, Vrabec, M. 1 1 Ústav hygieny a technológie mlieka UVLF v Košiciach, SR 2 Ústav verejného zdravotníctva a hygieny UPJŠ v Košiciach, SR Sensory properties of experimentally manufactured cheeses with probiotic culture Summary: Sensory properties of experimentally semi-hard low-cooking cheese (Polyfood model Si-050; Inventa Agri, Italy) with probiotic culture: Lactobacillus acidophilus (group A), Lactobacillus casei (group B) and Lactobacillus plantarum 96 (group C) were analysed. Group D represented cheese manufactured by the same technological process without used probiotic bacteria. Cheese ripened during 6 months at the temperature of 10 C. After the rind formation, cheese was varnished (Opti cid P50, Optiferm Germany) and two weeks later, the cheese was waxed (Optiwax, Germany). Six months after manufacturing process, cheeses were assessed by a panel of 30 students of the University of Veterinary Medicine and Pharmacy in Košice for 18 sensory attributes; namely external aspect, rind thickness, paste colour, texture, odour, taste, and aroma. Cheeses were the uniform in shape and weight, with clean rind. Detection of ruptures and punctures were detected in the level of sensitivity in cheese of group C and D. Colour of probiotic cheese was creamy yellow to slight creamy. In cheese of group B, gold yellow colour was detected. Typical cheese milky sour taste was observed in all experimental manufactured cheese. In cheese of group B a typical cheese aroma was detected and this aroma was evaluated as the best pleasing. The highest creamy-milky taste was the best pleased in the cheese of group A and C. Evaluators assessed according to the all sensory attributes as the best cheese, the cheese with Lactobacillus casei (group B), then with Lactobacillus plantarum 96 (group C) and control cheese group (D). Úvod: Mlieko a mlie ne výrobky sú sú as ou potravy loveka už nieko ko tisíc rokov. Medzi najstaršie výrobky z mlieka patria syry. Dôležitos syrárstva spo íva v tom, že v syroch je možné prirodzenou cestou konzervova všetky najdôležitejšie sú asti mlieka. Syry sú rôznorodou skupinou mlie nych výrobkov, biologicky a biochemicky dynamické a premenlivé [4, 11, 12]. Syry predstavujú tradi né produkty, ktoré lovek poznal už pred 8000 rokmi. Jedná sa o erstvé alebo zrelé výrobky získané koaguláciou mlieka o rôznej tu nosti a po následnom oddelení srvátky. V syroch sú teda zakoncentrované základné zložky sušiny mlieka, predovšetkým kazeín a mlie ny tuk [2]. Z h adiska svojho zloženia patria syry k najhodnotnejším potravinám. Sú významným zdrojom bielkovín, minerálnych látok a vitamínov. Strávite nos bielkovín obsiahnutých v syroch je vysoká, až 95%. Denná potreba bielkovín u dospelého loveka je pokrytá zhruba zo 100 g syra. Z minerálnych látok je najviac cenený obsah vápnika a fosforu, ktorých optimálny pomer zais uje ideálne využitie vápnika. Vo všetkých druhoch syrov sú prítomné vitamíny skupiny B, u tu nejších syrov vitamíny A a D. Lipidy prispievajú ku konzistencii a vlá nosti syrov a sú dobre strávite né. Niektoré vo né aminokyseliny obsiahnuté v mlie nom tuku prispievajú k tvorbe charakteristického buketu. Laktóza je v syroch obsiahnutá len v malom množstve, takže syry môžu konzumova aj udia s intoleranciou laktózy. Základným parametrom pre prijatie syrov spotrebite om je senzorická analýza. Je to metóda, ktorou sa skúmajú organoleptické vlastnosti potravín pomocou zmyslových orgánov. Hlavné parametre, ktoré sa u syrov hodnotené, sú vonkajší a vnútorný vzh ad, textúra, chu, vô a a aróma [16]. Výsledky hodnotenia vykonaného pomocou udských zmyslov majú rovnaký význam ako výsledky z ktorejko vek inej analýzy vykonávanej u potravinárskych výrobkov. Senzorické hodnotenie však dokáže odhali tiež nedostatky syrov, ktoré môžu vznika po as všetkých procesov ich výroby a zrenia. Vlastnosti syrov možno hodnoti tiež fyzikálne alebo chemicky, ale tieto metódy stanovujú len podnety nie vnemy, ktoré sa stanovujú iba pomocou senzorickej analýzy. 169

170 Objektivizácia hodnotenia senzorickej analýzy spo íva v správnej vo be senzorickej metódy, matematicko-štatistickom spracovaní dosiahnutých výsledkov a výberom preškolených posudzovate ov [7]. Materiál a metódy: Polotvrdé syry s nízko dohrievanou syreninou s obsahom vybraných probiotických baktérií boli vyrobené z kravského mlieka (ŠPP Zemplínska Teplica) na zariadení Polyfood, model Si-050 (Inventa Agri, Taliansko) s použitím probiotických kultúr: Lactobacillus acidophilus (skupina A), Lactobacillus casei (skupina B) a Lactobacillus plantarum 96 (skupina C). Skupinu D predstavovali syry vyrobené rovnakým spôsobom bez použitia probiotických baktérií. Syry zreli šes mesiacov pri teplote 10 C. Po vytvorení kôry, syry boli lakované (Opti cid P50, Optiferm Nemecko) a po dvoch týžd och voskované (Optiwax, Nemecko). Vzorky syrov boli hodnotené v šiestom mesiaci ich zrenia. Analýza bola prevedená 30 lennou komisiou (pou ení hodnotitelia, študenti UVLF v Košiciach) v senzorickom laboratóriu Inštitútu vzdelávania veterinárnych lekárov v Košiciach. Hodinu pred hodnotením boli vzorky syrov ponechané pri izbovej teplote, aby došlo k žiaducemu rozvoju chuti a arómy. Analýza bola prevedená metódou senzorického profilu. Celková chutnos posudzovaných syrov bola rozdelená do 18 rôznych chu ových deskriptorov a 11 rozli ných haptických vnemov. Úlohou hodnotite ov bolo kvalifikova jednotlivé deskriptory a vnemy prostredníctvom šes bodovej stupnice, ktorej intenzitná škála obsahovala nasledovné slovné hodnotenie pri jednotlivých íselných stup och: 1 = nevnímate ná, 2 = ve mi slabo vnímate ná, 3 = slabo vnímate ná, 4 = vnímate ná, 5 = silno vnímate ná, 6 = ve mi silno vnímate ná). Hodnotenia sa zapisovali do príslušných protokolov. Výsledky z vyplnených záznamových protokolov zo senzorickej analýzy boli spracované do grafov programu Microsoft Office Excel. U každého deskriptora bol vykonaný t-test zhody stredných hodnôt. Dôležitou hodnotou bola tzv. dvojstranná pravdepodobnos (p-hodnota), ktorá hovorí, i bola rozdielnos medzi vzorkami preukázaná. Výsledky: Syry boli tvarovo vyrovnané s istým povrchom. Prítomnos trhlín a prasklín bola zaznamenaná na úrovni vnímate nosti u syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus plantarum 96 (skupina C) a kontrolnej vzorky syrov (skupina D). Aj prítomnos dutín a ôk bola najviac vnímate ná u syrov skupiny C a D (Obr. 1). Pri štatistickom vyhodnotení celkového vzh adu syrov bol štatistický rozdiel na hladine p < 0,3457 v intervale spo ahlivosti 95% preukázane štatisticky nevýznamný pri porovnaní všetkých skupín experimentálne vyrobených syrov. kraj A B C D stred kraj stred kraj stred kraj stred 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 homogenita sfarbenia škvrny prítiomnos dutín a ôk prítomnos trhlín a prsklín Obr. 1. Celková príjemnos vzh adu experimentálne vyrobených syrov 170

171 Farba prevažnej asti vzoriek probiotických syrov bola charakterizovaná ako smotanovo žltá až svetlo krémová (78,65%). U syrov skupiny B (Lactobacillus casei) prevládalo zlatožlté sfarbenie (38,75%) (Obr. 2). Pri hodnotení výkrojov krajovej a stredovej výse e jednotlivých vzoriek syrov sa neobjavovali žiadne výrazné odlišnosti od typickej farby. Farba syrov v priebehu zrecieho obdobia postupne prechádzala od bieleho do žltého až zlatožltého odtie a. 4,5 4 3,5 Body 3 2,5 2 A B C D 1,5 1 biela smotanovožltá svtelo krémovožltá Obr. 2. Farba experimentálne vyrobených syrov žltá zlatožltá iná Pri štatistickom vyhodnocovaní stredových a okrajových vzoriek experimentálne vyrobených syrov bol rozdiel medzi jednotlivými vzorkami na hladine p<0,8765 u stredových vzoriek a p<0,9886 u okrajových vzoriek syrov, o nazna uje štatistickú nevýznamnos medzi jednotlivými skupinami probiotických syrov v hodnotení farebných zmien syrov. U všetkých nami vyrobených probiotických syroch výrazne prevládala typická syrovo - mlie ne kyslá vô a (Obr. 3). Najintenzívnejšiu typickú syrovú vô u vykazovali syry skupiny B (Lactobacillus casei). Táto bola z h adiska celkovej príjemnosti vône vybraná ako najpríjemnejšia. Pri posudzovaní intenzity cudzích vôni dochádzalo s postupným zretím syrov k ve mi slabo vnímate ným nárastom iných vôni. U všetkých probiotických syrov sa v okrajovej asti vyskytovala štip avá vô a, ktorá ale zanikala smerom do stredu jednotlivých syrov. Na základe štatistického vyhodnotenia jednotlivých sledovaných probiotických syrov nebola preukázaná štatistická významnos na hladine 95%. 4,5 4 Body 3,5 3 2,5 2 typická syrová mlie ne kyslá štiplavá iná 1,5 1 A B C D Obr. 3. Celková príjemnos vône u experimentálne vyrobených syrov 171

172 Pri hodnotení tvrdosti v ústach najvä šiu silu museli hodnotitelia vyvinú pri skupinách probiotických syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus casei (skupina B) a Lactobacillus plantarum 96 (skupina C). Vyššiu elasticitu mali vzorky syrov skupiny B (Lactobacillus casei). Najmenej elastická bola vzorka syrov skupiny A (Lactobacillus acidophilus). Pri hodnotení žuvate nosti sa hodnotilo sformovanie sústa v ústach. Ako ahko žuvate né boli ozna ené skupiny syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus plantarum 96 (skupina C) a kontrolná skupina syrov (skupina D). Vysokú drobivos vykazovala skupina syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus (skupina A). Medzi odobratými vzorkami syrov zo stredu a okraja nebol preukázaný štatistický rozdiel pri porovnaní jednotlivých parametrov textúry syrov. Celková príjemnos chuti sa v priebehu zrenia probiotických syrov pohybovala v širokej škále definovaných chutí (Obr. 4). 4,5 4 3,5 Body 3 2,5 2 A B C D 1,5 1 Obr. 4. Celková príjemnos chuti experimentálne vyrobených syrov Pri hodnotení celkovej chuti mala najvyššiu intenzitu smotanovo-mlie na chu, pri om najintenzívnejšia sa prejavovala u skupín syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus plantarum 96. Zo všetkých posudzovaných chutí bola slaná chu vnímaná najintenzívnejšie u syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum 96 a kontrolnej vzorky. Na hranici vnímate nosti v skupine syrov obsahujúcich Lactobacillus casei (skupina B) sa viac prejavovala kyslá chu. Naj astejšie sa vyskytujúca cudzia chu bola štip avá chu, ktorá sa vyskytovala len u syrov skupiny D. Vo všetkých skupinách syrov na hranici ve mi slabo vnímate nej chuti sa najviac ešte popisovala tvarohová chu. Hodnotitelia posúdili za najlepšiu skupinu probiotických syrov obsahujúcu probiotickú kultúru Lactobacillus acidophilus (skupina A) po všetkých stránkach hodnotených deskriptorov. Na druhom mieste to bola skupina s probiotickou kultúrou Lactobacillus casei (skupina B) a potom nasledovali skupiny s probiotickou kultúrou Lactobacillus plantarum 96 (skupina C) a kontrolné syry skupiny D. Diskusia: mlie na smotanová kyslá slaná sladká Senzorické vlastnosti syrov sú vlastne udské reakcie na vnímanie podnetov, ktoré produkujú syry. Vo všeobecnosti je možné charakterizova ich pomocou pojmov definovaných v rámci kategórií vzh ad, farba, vô a, chu a textúra [1, 8, 9, 14]. Zatia o na za iatku zrecieho obdobia sa nevyskytovali takmer žiadne trhliny a praskliny postupom asu sa ich po et zvyšoval. V skupinách syrov obsahujúcich kultúry Lactobacillus plantarum 96 a Lactobacillus acidophilus bola sledovaná prítomnos trhlín a prasklín, o je ale u klasického zretia syrov povolené. 172

173 Tieto zmeny sú v protiklade so štúdiou Matulovej a Panghyovej [13], ktorá uvádza, že celková príjemnos vzh adu u sledovaných polotvrdých syrov sa v priebehu zrenia takmer nezmenila. Pod a Griegera, Holeca a kol. [5] praskliny vznikajú pri silnejšom lisovaní, pri vysokej kyslosti so ného roztoku, pri uložení syrov vo ve mi suchom prostredí, pri preprave syrov vo viacerých vrstvách. V syroch s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus a kontrolnej skupiny syrov sa vyskytovali srvátkové hniezda, ktoré ale boli v minimálnom po te. Možnou prí inou vzniku srvátkových hniezd môže by uzatvorenie srvátky vo vnútri syra [6]. Pri hodnotení farby u syrov s probiotickou kultúrou vo vä šine prípadov sa vyskytovala krémovo-žltá farba odpovedajúca farbe syrov s nízkodohrievanou syreninou. Rovnomernos zafarbenia syrov mala v priebehu celého zrecieho obdobia jednotlivých syrov vzrastajúci charakter. To isté vo svojej práci uvádzajú aj Matulová a Panghyová [13]. Zo zistených hodnôt možno konštatova, že po as experimentálneho obdobia sa celková príjemnos vône u všetkých sledovaných syrov mierne zhoršovala i napriek po iato nej prevládajúcej syrovo-mlie ne kyslej vône. Pri hodnotení textúry u sledovaných probiotických skupín syrov dochádzalo k poklesu tvrdosti tak medzi prstami ako aj v ústach u syrov kontrolnej skupiny a skupiny syrov obsahujúcich Lactobacillus acidophilus. Ako najtvrdšie boli vyhodnotené skupiny syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus casei a Lactobacillus plantarum 96. Niektoré kmene laktobacilov produkujú nadmerné množstvo CO 2, o spôsobuje vznik ôk alebo trhlín v závislosti na konzistencii syra [15]. Pri posudzovaní elasticity v ústach neboli medzi vzorkami jednotlivých skupín probiotických syrov výrazné rozdiely. Šustová [17] došla k záveru, že elasticita syrov sa zvyšovala v závislosti na znižovaní tvrdosti v priebehu zretia syrov. Najvyššiu intenzitu mala smotanovo-mlie na chu, a to u syrov s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus plantarum 96. Intenzita slanej chuti u všetkých skupín probiotických syrov ako aj kontrolnej skupiny syrov najprv mierne klesala a v priebehu zretia syrov narastala. Pri solení medzi syrom a so ným roztokom prebieha difúzia v kôre syra medzi zrnom a osmóza dovnútra syrového zrna. Zo so ného roztoku prechádza do syra chlorid sodný, pri om zo syra vyteká srvátka obsahujúca kyselinu mlie nu, soli a sérové bielkoviny [23]. Naj astejšie sa vyskytujúca cudzia chu bola štip avá chu, ktorá sa vyskytovala len u skupiny kontrolných vzoriek syrov. Zimák [18] uvádza naj astejšie sa vyskytujúcu cudziu chu práve štip avú, a to aj pri rozdielnej tu nosti syrov. Záver: Pre rozhodovanie o výrobku je úplne zásadným východiskom o najpresnejšie porozumenie potrebám a o akávaniam zákazníkov. Syry pre svoje výživové hodnoty tvoria dôležitú sú as udského jedálni ka. Pri posudzovaní intenzity cudzej vône dochádzalo s postupným predlžovaním doby zretia k nárastom cudzích vôni. Ve mi slabo bola vnímaná kvasinková vô a u skupiny syrov s Lactobacillus plantarum 96 a kontrolnej skupiny syrov. Pri senzorickom hodnotení probiotických syrov s nízkodohrievanou syreninou možno zo získaných údajov usudzova, že celková prijate nos vzh adu jednotlivých skupín probiotických syrov obsahujúcich vybrané probiotické kultúry bola v po iato nej fáze zrenia prijate ná. Po akovanie: Práca bola podporená grantom KEGA. 005-UVLF-4/2015. Použitá literatúra: 1. CLARK, S., COSTELLO, M., DRAKE, M.A., BODYFELT, F The sensory evaluation of dairy products. 2nd ed. Springer Science & Business Media LLC, 576p. ISBN URDA, L Tvarohy a sýry, s In: KADLEC, P., MELZOCH, K., VOLD ICH, M., 2012: P ehled tradi ních potraviná ských výrob: technologie potravin, KEY Publishing, Ostrava, 569 s. 173

174 3. FORMAN, L Mlékárenská technologie II.VŠCHT, Praha, 288 s., ISBN FOX, P.F. et al Cheese: chemistry, physics and microbiology. 3. vyd. Amsterdam: Elsevier, 617 p. ISBN GRIEGER, C., HOLEC, J Hygiena mlieka a mlie nych výrobkov. 1. vyd. Príroda. ISBN s HAVLÍ EK, Z Praktikum syrárske výroby. 1.vyd. Praha: SNTL, 272 s. 7. INGR, I., POKORNÝ, J., VALENTOVÁ, H Senzorická analýza potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn, Brno, 180 s. ISBN JAROŠOVÁ, A Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno: Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn, 86 s. ISBN LAVANCHY, P., BERODIER, F., ZANNONI, M., NOEL, Y., ADAMO, C., SQUELLA, J., HERRERO, L A Guide to the Sensory Evaluation of Texture of Hard and Semi-Hard Cheeses. INRA, Paris. 10. LAWLES, H.T., HEYMANN, H Sensory evaluation of food. Principles and practices. Springer Science & Business Media LLC, 2013, 827p. ISBN LEGAROVÁ, V., KOU IMSKÁ, L., MICHLOVÁ, T Senorická analýza tvrdých a polotvrdých sýr. In: Farmá ská výroba sýr a kysaných mlé ných výrobk VII. Sb. Referát ze seminá e s mezinárodní ú astí. Brno, , LUKÁŠOVÁ, J. a kol., Hygiena a technologie mlé ných výrobk, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 180 s. 13. MATULOVÁ, M., PANGHYOVÁ, E Prežívanie buniek vybraných kme ov baktérií mlie neho kysnutia v modelových podmienkach tráviacej sústavy. In: Bulletin potravinárskeho výskumu, ro. 44,. 3-4, s ISSN MUIR, D.D., TAMIME, A.Y., SHENANA, M.E., DAWOOD, A.H Processed Cheese Analogues Incorporating Fat-Substitutes 1. Composition, microbiological quality and flavour changes during storage at 5 C. Lebensm. Wiss. Technol. 32, p STADHOUDERS, J., HUP, G., EXTERKATE, F.A., VISSER, S Bitter formation in cheese. 1. Mechanism of the formation of the bitter flavour defect in cheese. Neth. Milk Dairy Journal, 37, p ŠUSTOVÁ, K Senzorická analýza sýr. In KUCHTÍK, J. Farmá ská výroba sýr a kysaných mlé ných výrobk. Brno: MZLU v Brn, 2004, s ISBN ŠUSTOVÁ, K Syrá ství. Brno, MZLU, 72 s. 18. ZIMÁK, E Technologie pro 4. ro ník SPŠ studijního oboru zpracování mléka. Praha: SNTL, 362 s. ISBN Kontaktná adresa: Doc. MVDr. Eva Dudriková, PhD., Ústav hygieny a technológie mlieka, UVLF v Košiciach, Komenského 73, Košice, Slovenská republika, eva.dudrikova@uvlf.sk 174

175 SENZORICKÉ HODNOTENIE OV ÍCH A KRAVSKÝCH KYSLOMLIE NYCH VÝROBKOV PO AS SKLADOVANIA Semjon Boris, Dudriková Eva, Výrostková Jana, Ma ová Jana, Ma a Pavel Katedra hygieny a technológie potravín, Ústav hygieny a technológie mlieka, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach Sensory evaluation of sheep and cow s fermented milk products during storage Summary: Fermented milk products are made from different type of milk or from fermented milk products with chosen microorganisms used, which cause characteristic changes in this process. Characteristic attribute of fermented milk products is presence of live microorganisms used for process of fermentation. Acidophilus milk is the most popular fermented milk product characterised with Lactobacillus acidophilus culture. In last few years has sensory evaluation main role in industrially foodstuff production. It is used as instrument of producing new products and also as quality examination of current products. In this study we evaluate sensory ability of evaluators with sensory examination tests required for gaining certification of sensory foodstuff evaluators. Subsequently they evaluate sensory properties of sheep fermented product called žin ica and two type of acidophilus milk with different fat content. Sensory evaluation was carried out also after seven days of storage at 6 C in original package. Sensory protocols included body score and sensory profile evaluation. The obtained results were statistically evaluated by paired t-test. In sample of full-fat fermented milk we found statistically significant difference in thick, fatty, lumpy, tractional, sweet and sour, sour creamed, and starch taste after seven days of storage. In reduced-fat fermented cow s milk we found statistically difference in lump, tractional and starch taste after storage. In sample of sour sheep fermented milk we found statistically difference in thick, empty, sour and animally taste. Úvod: Kyslomlie ne výrobky (fermentované výrobky) sú výrobky vyrábané z mlieka kravského, ov ieho alebo kozieho, alebo z mlie nych výrobkov procesom kysnutia s vhodnými mikroorganizmami, ktoré vyvolávajú charakteristické biochemické zmeny sprevádzané znížením ph, vyzrážaním bielkovín z mlieka a tvorbou aromatických látok. Charakteristickým znakom kyslomlie nych výrobkov vrátane jogurtov je prítomnos živých mikroorganizmov použitých na fermentáciu (1). V posledných rokoch dochádza k rastúcemu trendu za le ovania zdraviu prospešných bakteriálnych druhov Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium longum do fermentovaných mlie nych produktov. Acidofilné mlieko je kyslý produkt, ktorý fermentoval za podmienok pre rast a rozvoj termofilných baktérií mlie neho kysnutia. Tento typ fermentácie mlieka je produkovaný rozvojom Lactobacillus acidophilus v mlieku (2). V posledných rokoch sa asto diskutuje o zdravotných benefitoch fermentovaných mlie nych produktoch. Aby bolo možné hovori o zdravotných benefitoch týchto výrobkov, bola navrhnutý minimálny po et probiotických baktérii v probiotickom mlieku of 10 6 po 10 7 kolónii tvoriacich jednotiek (3). Materiál a metódy: Vzorky kyslomlie nych výrobkov, ktoré sme použili v tejto práci boli zakúpené z obchodnej siete v Košiciach. Výberu produktov predchádzal prieskum dostupnosti jednotlivých vzoriek. Boli vybrané dva druhy kyslomlie nych acidofilných mliek s rozdielnym obsahom tuku, Acidofilné mlieko 3,6 % (vzorka A), Acidofilné mlieko 1,0 % (vzorka B) a ov í kyslomlie ny produkt žin ica (vzorka C). Samotné senzorické hodnotenie vykonávali študenti Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach, ktorí mali základné vedomosti z technológie výroby posudzovaného výrobku a poznali charakteristiku chýb, ktoré by sa mohli v predkladaných vzorkách kyslomlie nych výrobkov vyskytova. Senzorickú analýzu sme vykonávali v priestoroch laboratória ústavu a školenie a testovanie hodnotite ov pre získavanie certifikátu senzorického posudzovate a potravín v priestoroch Špecializovaného senzorického laboratória v Inštitúte vzdelávania veterinárnych lekárov v Košiciach. Pri hodnotení sme dodržali zásady a podmienky pre senzorickú analýzu pod a STN ISO 8589, a taktiež podmienky skladovania uvádzané na obale výrobcom (teplota 175

176 skladovania, doba minimálnej trvanlivosti). Hodnotenie prebiehalo v dvoch fázach v rozsahu 7 dní od prvého hodnotenia. Druhé hodnotenie nasledovalo po siedmich d och. V každej fáze hodnotenia bola analýza vykonávaná z novootvorených správne skladovaných výrobkov. Pri senzorickom hodnotení sme postupovali nasledovne. Najprv sme posudzovali farebný tón, vzh ad a konzistenciu v protokole pre bodové hodnotenie. Následne bola hodnotená chu v bodovej stupnici a hodnotené deskriptory v protokole senzorického profilu. Vzorky boli predkladané v transparentných sklenených pohároch v dávkach, t.z. sú asne sa hodnotila jedna vzorka, následne bola predložená vzorka alšia. Obaly boli hodnotené až nakoniec senzorického posudzovania. Protokol pre senzorické profily predkladaných vzoriek syrov pozostával zo zoznamu ôsmich nami vybraných hodnotených deskriptorov pre kyslomlie ne výrobky. Každý deskriptor bol hodnotený pod a slovne a íselne vyjadrenej intenzitnej škály 1-6 s tým, že hodnota intenzity deskriptora sa zazna ovala do tabu ky protokolu pre príslušnú vzorku. Výsledky: Posudzovatelia v protokoloch ur ili preferenciu medzi jednotlivými vzorkami plnotu ného, polotu ného acidofilného mlieka a ov ej kyslej žin ice. Najpreferovanejšia spomedzi vzoriek bola vzorka plnotu ného acidofilného mlieka, nasledovalo polotu né acidofilné mlieko a nakoniec ov ia kyslá žin ica. Graf 1 poukazuje na priemerné bodové hodnotenie vzorky plnotu ného acidofilného mlieka pred skladovaním a po siedmich d och skladovania. Na základe získaných výsledkov sme zistili pri tejto vzorke zvýšenie bodového hodnotenia v chuti, farbe a konzistencii po skladovaní. Vo vzh ade došlo k zníženému po tu získaných bodov. Hodnotenie obalov po skladovaní sa odlišovalo proti tomu pred skladovaním, len v desatinách bodu. Vysvet ujeme si to subjektívnym hodnotením posudzovate ov. V parametri konzistencii sme zistili štatisticky významný rozdiel po skladovaní (P<0.01). Graf 1. Priemerné bodové hodnotenie vzorky A pred a po skladovaní Vzorka B, polotu né acidofilné mlieko po skladovaní získalo vyššie bodové hodnotenie vo vzh ade, farbe a obale (graf 2). Hodnotenie chuti a konzistencie u tejto vzorky sa znížilo po skladovaní. V sledovaných charakteristikách pri tejto vzorke sme nezistili štatisticky významný rozdiel po siedmych d och skladovania. Rozdiel v hodnotení obalu pri tejto vzorke ako pri predchádzajúcej vzorky je len v desatinách bodov. 176

177 Graf 2. Priemerné bodové hodnotenie vzorky B pred a po skladovaní Graf 3 popisuje zmeny v bodovom hodnotení vzorky C - kyslej ov ej žin ice pred a po skladovaný. Ako vyplýva z grafu po skladovaní získala vzorka vyšší po et bodov v charakteristike chuti, vzh adu, farbe konzistencii a aj obalu. Na základe získaných výsledkov sme zistili štatisticky významný rozdiel v chuti ov ej žin ice po skladovaní (P<0,0001), vo vzh ade (P<0,01) a vo farbe (P<0.01). Hodnotenie obalu u ktorého je však tento rozdiel opä malý ako u predchádzajúcich vzoriek. Pri hodnotení obalov sme nezistili štatisticky významný rozdiel, a preto usudzujeme že pri tomto hodnotení môžeme potvrdi objektívnos vizuálneho senzorického hodnotenia. Graf 3. Priemerné bodové hodnotenie vzorky C pred a po skladovaní Pri vytváraní protokolu pre senzorické profilovanie sme použili zoznam nami vybraných deksriptorov, ktoré popisuje tabu ka I. Z výsledkov štatistickej analýzy sme zistili, štatisticky významný rozdiel pri vzorke A v deskriptoroch hustej (P<0,0001), tu nej (P<0,001), hrudkovitej (P<0,05), ahavej (P<0,01), sladkokyslej (P<0,01), smotanovo kyslej (P<0,05), škrobovitej chuti (P<0,01). 177

178 Pri vzorke polotu ného acidofilného mlieka sme zistili štatisticky významný rozdiel v dekriptoroch hrudkovitej (P<0,05), ahavej (P<0,05) a škrobovitej chuti (P<0,01). Z výsledkov preto usudzujeme, že polotu né acidofilné mlieko si po skladovaní siedmich d och, o je pravdepodobná maximálna doba skladovania tohto výrobku v domácich podmienkach spotrebite a, zachováva pomerne stabilné chu ové vlastnosti. Vo vzorke C sme zistili štatisticky významné rozdiely v deskriptoroch hustej (P<0,05), prázdnej (P<0,05), tu nej (P<0,05), kyslej (P<0,01) a animálnej chuti (P<0,0001). Ako vyplýva z výsledkov senzorického profilovania, hodnotitelia správne posúdili rozdiel v animálnej chuti vzorky C kyslá ov ia žin ica, ktorá mala výrazne ov iu chu. Komparáciou senzorických profilov kravských acidofilných mliek (vzorka A a vzorka B) sme zistili, významné rozdiely v podobných deskriptoroch. Pri plnotu nom mlieku oproti polotu nému je rozdiel v hustej a tu nej chuti, ktoré sú pri tomto kyslomlie nom výrobku s vyšším obsahom tuku výraznejšie. Tabu ka I Štatistické vyhodnotenie zmien v senzorickom profile vzoriek pred a po skladovaní Senzorický profil Chu Vzorka A Vzorka B Vzorka C pred skladovaním vs. po pred skladovaním vs. po pred skladovaním vs. po 7 d och skladovania 7 d och skladovania 7 d och skladovania P hodnota P hodnota P hodnota jemná 0,2767 ns. 0,0832 ns. 0,5416 ns. hustá < *** 0,5990 ns. 0,0125 * prázdna 0,5336 ns. 0,2530 ns. 0,0125 * tu ná 0,0005 *** 0,1353 ns. 0,0354 * pies itá 0,2562 ns. 0,7998 ns. 0,3684 ns. hrudkovitá 0,0374 * 0,0397 * 0,7968 ns. ahavá 0,0026 ** 0,0261 * 0,6670 ns. vlo kovitá 0,3232 ns. 0,3608 ns. 0,9206 ns. kyslá 0,1710 ns. 0,3154 ns. 0,0272 * sladkokyslá 0,0041 ** < ns. 0,2483 ns. smotanovokyslá 0,0360 * 0,1420 ns. 0,3171 n animálna 0,4817 ns. 0,2629 ns. < *** škrobovitá 0,0040 ** 0,0078 ** 0,9189 ns. nahorklá 0,8946 ns. 0,1290 ns. 0,1007 ns. lahodná 0,6021 ns. 0,5990 ns. 0,6180 ns. cudzia prichu 0,3232 ns. 0,1598 ns. 0,0584 ns. ns. štatisticky nevýznamné; * - štatisticky významný rozdiel (P<0,05); ** - štatisticky významný rozdiel (P<0,01); *** - štatisticky významný rozdiel (P<0,001); Záver: Cie om tejto práce bolo senzorické hodnotenie spotrebite mi ob úbených kyslomlie nych výrobkov bežne dostupných v obchodnej sieti. Zamerali sme sa pritom na hodnotenie výrobkov skladovaných po as siedmych dní, o je pravdepodobná približná doba po as ktorej spotrebite skladuje výrobky tohto druhu v domácich podmienkach. Zo senzorických hodnotení sme zistili, že hodnotitelia preferovali plnotu né acidofilné mlieko oproti polotu nému. A taktiež uprednostnili druhovo kravský výrobok oproti ov iemu, hlavne pre jeho výraznú animálnu chu. 178

179 Po akovanie: Práca bola podporená grantom KEGA. 005 UVLF-4/2015 Použitá literatúra: 1. Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky a Ministerstva zdravotníctva Slovenskej republiky zo 14. augusta / , ktorým sa vydáva hlava Potravinového kódexu Slovenskej republiky upravujúca mlieko a výrobky z mlieka. Dostupné na internete: 2. Junaid, M., Javed, I., Abdullah, M., Gulzar, M., Younas, U., Nasir, J., Ahmad, N. Development and quality assessment of flavored probiotic acidophilus milk. In The Journal of Animal & Plant Sciences. 2013, 23, 5, s ISSN Moayednia, N., R Ehsani, M., Emamdjomeh, Z., F Mazaheri, A. Effect of refrigerated storage time on the viability of probiotic bacteria in fermented probiotic milk drinks. In International Journal of Dairy Technology. 2009, 62, 2, s ISBN Kontaktná adresa: MVDr. Boris Semjon, Katedra hygieny a technológie potravín, Ústav hygieny a technológie mlieka, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach, Komenského 73, Košice, Slovenská republika, boris.semjon@student.uvlf.sk 179

180 180

181 SLEDOVÁNÍ ÚBYTKU LAKTÓZY B HEM FERMENTACE MLÉKA S POUŽITÍM HPLC-RI Bubelová Zuzana, Chodáková Kate ina, Pachlová Vendula, Bu ka František Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše bati ve Zlín Monitoring of lactose decline during milk fermentation using HPLC-RI Summary: The aim of this work was to monitor the milk fermentation based on active acidity decline, titratable acidity increase and lactose decrease observation. Milk samples were inoculated with six cultures (two yoghurt, two one-strain thermophilic and two more-strain mesophilic) and the fermentation proceeded at two different temperatures (43 and 37 C and 30 and 25 C, respectively) until isoelectric point was reached. The course of fermentation was monitored at 30 or 60 minute intervals. Sample preparation for the lactose determination included extraction in warm water and clarification with Carrez solutions. Lactose content was determined using high-performance liquid chromatography with refractometric detection. It follows from the results, that fermentation up to isoelectric point achieving lasted hours. Longer period was always, according to expectations, reached at lower cultivation temperature. Active acidity during the fermentation declined by 2.2 on the average and titratable acidity rose by 27 SH. Average lactose drop was about 35 % from original amount. Úvod: Bakterie mlé ného kvašení (BMK) jsou nepohyblivé, nesporulující, grampozitivní koky a ty inky, které mají schopnost za fakultativn anaerobních podmínek fermentovat laktózu na kyselinu mlé nou a p ípadn další produkty. Mezi BMK pat í zástupci rod Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc a Lactobacillus 1,2,3. Homofermentativní BMK zp sobují fermentaci laktózy tém výhradn na kyselinu mlé nou (min. 90 %), naproti tomu heterofermentativní BMK fermentují laktózu za vzniku kyseliny mlé né (min. 50 %) a dále kyseliny octové, acetaldehydu, diacetylu, etanolu, i CO 2. Mezi hlavní zástupce homofermentativních BMK pat í Lactococcus lactis ssp. lactis, Pediococcus sp., Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus. Nejd ležit jšími zástupci heterofermentativních BMK jsou Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis a Lactobacillus buchneri 4,5,6. Ke kysaným mlé ným výrobk m (tj. výrobk m získaným kysáním mléka, smetany, podmáslí i jejich sm sí, tepeln neošet ených po kysacím procesu) se adí jogurt a jogurtové mléko, acidofilní mléko, kefír a kefírové mléko, smetanový zákys, kysaná smetana, kysané podmáslí a kysaný výrobek s bifido kulturou 7. Fermentované mlé né výrobky mají již odedávna v lidské výživ stálé místo a jsou sou ástí každodenního jídelní ku velké skupiny osob. Nachází uplatn ní také v lé ebné výživ a p i r zných dietách. Díky tomu, že vlivem bakterií mlé ného kvašení dochází ke št pení laktózy na kyselinu mlé nou a jiné metabolity, se mohou kysané mlé né výrobky stát sou ástí jídelní ku i u osob, které mají diagnostikovanou sníženou toleranci laktózy nebo úplnou intoleranci. P ednosti mlé ných zakysaných výrobk spo ívají též v senzorických a výživových vlastnostech, vysoké stravitelnosti a delší trvanlivosti 8,9. Pr b h kysacího procesu lze sledovat na základ zm n aktivní a titra ní kyselosti a samoz ejm také laktózy. Obsah laktózy a dalších cukr lze stanovit metodami polarimetrickými, refraktometrickými, kolorimetrickými i titra ními. Nejspolehliv jší výsledky v detekci sacharid ovšem dává vysokoú inná kapalinová chromatografie s refraktometrickou detekcí (HPLC- RI) 10,11,12. Cílem práce bylo sledovat fermentaci mléka p sobením r zných bakteriálních kultur na základ snižování hodnot ph, zvyšování titra ní kyselosti a poklesu obsahu laktózy. Inkubace byla provedena p i dvou teplotách po r zn dlouhou dobu (do dosažení izoelektrického bodu). 181

182 Metodika: Základním použitým materiálem bylo Selské mléko od Olma a.s. plnotu né mléko bez standardizace obsahu tuku. Mléko bylo p ed inokulací ošet eno vysokou pasterací (95 C, 2 min). Fermentace probíhala v inkuba ních lahvích v inkubátoru INCU-line (VWR International). Pro fermentaci bylo použito šest mléka ských kultur, z toho 2 jogurtové (Laktoflora a YB1), 2 termofilní jednokmenové (TH-3 a LH-B02) a 2 mezofilní vícekmenové (YY-88 a CHN- 22). Ob jogurtové kultury obsahují druhy Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Termofilní kultura TH-3 p edstavuje kmen Streptococcus thermophilus, kultura LH-B02 pak kmen Lactobacillus helveticus. Mezofilní aromatická kultura YY-88 je sm s kmen Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus helveticus. Mezofilní aromatická kultura CHN-22 obsahuje sm s kmen Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris a Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetylactis. Všechny kultury byly získány od firmy Chr. Hansen s výjimkou Laktoflory (Milcom) a YB1 (MicroMilk). Zvolené kultiva ní teploty byly 43 a 37 C s výjimkou kultury CHN-22, u které probíhala fermentace p i 30 a 25 C. Pr b h fermentace byl sledován v 30minutových (vyšší kultiva ní teplota u jogurtových a termofilních kultur) resp. 60minutových (nižší kultiva ní teplota u jogurtových a termofilních kultur a ob teploty u mezofilních kultur) intervalech. V každém intervalu byly odebrány 3 inkuba ní lahve (n = 3) a byla stanovena aktivní kyselost (vpichový ph metr se sklen nou elektrodou; Eutech) a titra ní kyselost (titrátor HI 84529; HANNA Instruments). Fermentace byla ukon ena po dosažení izoelektrického bodu (ph 4,6). Pro stanovení laktózy byla nejd íve provedena extrakce teplou vodou (25 g vzorku, 10 ml ultra isté H 2 O, 50 C, 5 min; magnetické míchadlo s oh evem MSH-20D; Vitrum) následovaná i ením pomocí Carrezových inidel (2x 5 ml; 100 ml odm rná ba ka) 11,12. Po filtraci p es papírový filtr KA 4 (Papírna Pernštejn Keseg & Rathouzský) a st íka kový mikrofiltr (0,2 m; Cronus) byla laktóza stanovena na kapalinovém chromatografu Shimadzu LC-20AD Prominence vybaveném kvartérní pumpou, p tikanálovým degaserem DGU-20A 5R, autosamplerem SIL-20AC HT a diferenciálním refraktometrickým detektorem RID-20A (vše Shimadzu). Pro stanovení byla použita kolona Agilent Zorbax NH 2 (4,6 x 250 mm x 5 m) a p edkolonový cartridge filtr (0,2 m; Optimize technologies). Jako mobilní fáze byl použit 70% acetonitril ve vod. Vzorky byly eluovány izokraticky p i pr toku 1,4 ml.min -1. Délka analýzy byla 15 minut 13,14. Každý z 3 p ipravených vzork byl analyzován 2x (n = 6). Kalibra ní k ivka byla sestrojena v rozmezí 0,1 10 g.l -1 ; z její regresní rovnice byl vypo ítán obsah laktózy v g.100 g -1 vzorku. Výsledky a diskuze: Nar stající kyselost syrovátky s asem nad hodnotu nativní kyselosti je zp sobena rozkladem laktózy na mlé nou kyselinu inností mikroorganizm. Mezi aktivní a titra ní kyselostí mléka neexistuje absolutní závislost, nebo hodnoty závisejí na pufra ní schopnosti p ítomných solí a bílkovin. Díky jejich tlumivým vlastnostem se p ídavek kyseliny nebo zásady projeví až poté, co se jimi zneutralizují. Platí tedy, že p i zvyšující se titra ní kyselosti nedochází zpo átku v d sledku pufra ního systému k velkým zm nám v hodnot ph mléka. Jakmile dojde k vy erpání kapacity pufra ního systému, ph se za ne m nit v závislosti na titra ní kyselosti. Tato skute nost je využívána p edevším p i r stu ady mikroorganizm v mléce 15. B hem experimentu byly použity dva rozdílné typy mléka ských kultur s jinou optimální teplotou pro innost mikroorganizm. Dv jogurtové a 2 jednokmenové termofilní, pro které je vhodná inkuba ní teplota C a dv mezofilní s teplotním optimem C 2. P sobením BMK dochází ke št pení disacharidu laktózy a jedním ze vznikajících metabolit tohoto procesu je kyselina mlé ná, která má vliv na celkové okyselování prost edí a s tím spojené snížení hodnoty ph. Soub žn se snižováním aktivní kyselosti dochází k postupnému nár stu titra ní kyselosti vlivem p ítomných kyselin. Proces fermentace má díky p sobení BMK vliv i na celkový obsah laktózy ve fermentovaných mlé ných výrobcích. S p ibývající délkou fermentace se úm rn snižuje obsah laktózy ve výrobku 3,4. 182

183 Výsledky stanovení aktivní a titra ní kyselosti jsou pro jednotlivé kultury zaznamenány v Tabulce I, výsledky stanovení obsahu laktózy jsou pro jednotlivé kultury uvedeny v Tabulce II. Pro ilustraci je na Obrázku 1 3 zobrazen vývoj aktivní kyselosti (Obr. 1), titra ní kyselosti (Obr. 2) a obsahu laktózy (Obr. 3) b hem fermentace mléka pomocí jogurtové kultury Laktoflora. Tabulka I Výsledky stanovení aktivní a titra ní kyselosti pro jednotlivé mlé né kultury Kultura Teplota Délka fermentace ph na konci TK [ SH] na fermentace [ C] [hod] fermentace konci fermentace Laktoflora ,4 31, ,5 24,9 YB ,6 28,5 43 5,5 4,4 28,8 TH ,4 31, ,6 23,7 LH-B ,4 33,9 43 4,5 4,5 33,6 YY ,6 30, ,5 34,4 CHN ,8 34, ,7 34,0 Po áte ní hodnoty aktivní i titra ní kyselosti byly vždy stanoveny v inokulovaném mléku v ase 0. Zatímco ph se v mléce p ed fermentací pohybovalo v rozmezí 6,5 6,6, po áte ní hodnoty titra ní kyselosti se pr m rn pohybovaly okolo 5,5 SH, což jsou b žné hodnoty pro mléko ošet ené vysokou pasterací 16. Tabulka II Výsledky stanovení obsahu laktózy pro jednotlivé mlé né kultury Kultura Laktoflora YB1 TH-3 LH-B02 YY-88 CHN-22 Teplota fermentace [ C] 183 Obsah laktózy na konci fermentace [g.100 g -1 ] Úbytek obsahu laktózy [%] 37 4, , , , , , , , , , , ,64 32 Mléka, která byla zao kována jogurtovými kulturami (Laktoflora, YB1), m la v obou p ípadech rychlejší pr b h fermentace p i teplot 43 C. Zaznamenání izoelektrického bodu u jogurtové kultury Laktoflora trvalo p i teplot 43 C o p l hodiny mén, než p i použití kultury YB1. Naopak p i zvolené nižší teplot 37 C ú inkem jogurtové kultury YB1 byla doba dosažení izoelektrického bodu kratší o dv hodiny v porovnání s Laktoflorou. Nejv tší úbytek laktózy byl

184 zaznamenán u vzorku mléka, který byl zao kován kulturou YB1 a fermentován p i teplot 37 C (42 %). Naopak nejmenší úbytek byl zaznamenán u vzorku mléka zao kovaného stejnou kulturou, ale fermentovaného p i vyšší teplot 43 C (28 %). Zvolená nižší teplota 37 C u obou kultur m la za následek v tší úbytek laktózy. 7,0 6,5 43 C 37 C 6,0 ph 5,5 5,0 4,5 4, as (h) Obr. 1. Vývoj aktivní kyselosti b hem fermentace mléka pomocí jogurtové kultury Laktoflora C 37 C 24 SH as (h) Obr. 2. Vývoj titra ní kyselosti b hem fermentace mléka pomocí jogurtové kultury Laktoflora 6 5, Laktóza (g.100 g -1 ) 5 4,5 4 3, as (h) Obr. 3. Vývoj obsahu laktózy b hem fermentace mléka pomocí jogurtové kultury Laktoflora 184

185 U obou jednokmenových termofilních kultur (LH-B02 a TH-3) byl zaznamenán nár st titra ní kyselosti p i zvolených teplotách tém stejný. Doba fermentace k dosažení izoelektrického bodu probíhala stejn dlouho. Jediný malý rozdíl byl v kultu e LH-B02, kde p i zvolené teplot 43 C byla fermentace pomalejší o ½ hodiny než u druhé termofilní kultury p i stejné teplot. Úbytek laktózy byl u obou kultur v rozmezí %. Nejrozsáhlejší proces št pení laktózy prob hl u vzorku mléka zao kovaného kulturou LH-B02 p i teplot 43 C a naopak nejmén rozsáhlý proces byl u vzorku mléka zao kovaného stejnou kulturou, ale fermentovaného p i teplot 37 C. Mezofilní kultury v porovnání s ostatními kulturami vždy vykazovaly pomalejší pr b h fermentace mléka p i zvolených teplotách. Mezofilní kultury prokázaly nejlepší ú inek na fermentaci p i teplot 30 C (CHN-22) a p i teplot 37 C (YY-88), tedy vždy p i vyšších kultiva ních teplotách. Z toho je vid t, že nejvhodn jší teplota pro optimální r st je 30 C 35 C 17. P íliš nízká teplota není vhodná. Mléko zao kované mezofilní aromatickou kulturou CHN-22 m lo p i teplot 25 C celkov nejpomalejší pr b h fermentace, kde ani po uplynutí 13 hodin nebylo dosaženo izoelektrického bodu. I p esto, že mléko zao kované kulturou CHN-22 p i teplot 25 C m lo nejpomalejší pr b h fermentace, u tohoto mléka došlo k výraznému snížení obsahu laktózy, a to o 40 %. Naopak nejmenší úbytek laktózy (24 %) byl zaznamenán u mléka fermentovaného p i teplot 37 C a zao kovaného kulturou YY-88. Pokles aktivní kyselosti a nár st titra ní kyselosti byl u v tšiny kultur zeza átku pozvolný, což odpovídá lag-fázi mikroorganizm, s výrazn jším zlomem po ur ité dob fermentace. innost BMK nezahrnuje pouze zm ny aktivní a titra ní kyselosti a obsahu laktózy, ale také zm ny organoleptických vlastností zejména textury, chuti a v n 3,8. S p ibývající délkou fermentace získávaly výrobky pevn jší konzistenci, byl patrný vznik gelu vlivem kyselého srážení. Vznikalo také výrazn jší aroma, charakteristické pro kysané mlé né výrobky. Aroma bylo nejvýrazn jší u obou mezofilních kultur a také u obou jogurtových kultur a kultury TH-3, která je složkou jogurtových kultur. Všechny tyto kultury pat í mezi aromatvorné. Naopak Lactobacillus helveticus (kultura LH-B02) výrazné aroma netvo il. Výsledky experimentu ukázaly, že zvolené jogurtové a termofilní kultury fermentovaly o n co více laktózy na kyselinu mlé nou, p ípadn jiné metabolity (v obou p ípadech pr m rn 36 %), než použité mezofilní kultury, které metabolizovaly v pr m ru 34 % laktózy. Tato skute nost je dána p edevším zvolenými fermenta ními teplotami v porovnání s teplotními optimy jednotlivých kultur. I p esto, že ve zkoumaných vzorcích došlo ke snížení obsahu laktózy, stále by výrobky po ukon ení fermentace (po dosažení izoelektrického bodu) nebyly vhodné pro jedince s intolerancí laktózy. V tomto p ípad by musela fermentace probíhat déle nebo by bylo nutné doplnit proces fermentace i jinou metodou mající vliv na št pení laktózy ve výrobku, tj. nap. využití enzymu laktázy ( -galaktosidázy). Záv r: V rámci této práce byl sledován ú inek 6 bakteriálních kultur (2 jogurtových, 2 jednokmenových termofilních a 2 mezofilních) b žn používaných v mlékárenském pr myslu na pr b h fermentace mléka. P i 2 inkuba ních teplotách byl sledován pokles aktivní kyselosti, nár st titra ní kyselosti a zárove úbytek obsahu laktózy. Délka fermentace (ukon ená dosažením izoelektrického bodu) byla vždy kratší p i vyšší kultiva ní teplot (4,5 8 hod), pro nižší teplotu inkubace dosáhla 7 13 hod. Aktivní kyselost se snížila pr m rn o 2,2 (1,8 2,4), titra ní kyselost se zvýšila pr m rn o 27 SH (23,8 30,0 SH). Úbytek laktózy se pohyboval v rozmezí %, pr m rn došlo ke snížení koncentrace laktózy o 35 % z p vodního obsahu. K nejú inn jším kulturám je možné za adit ob jednokmenové termofilní kultury, které p i optimální inkuba ní teplot vykazovaly nejrychlejší fermentaci (pouze 4,5 hodiny). Ob kultury také zap í inily výrazné snížení obsahu laktózy (nad 30 %). Nejvyšší pokles laktózy byl ovšem zaznamenán u jogurtové kultury YB1 (42 %). 185

186 Použitá literatura: 1. ROBINSON, Richard K. Dairy Microbiology Handbook: The Microbiology of Milk and Milk Products. 3 rd Edition. New York: John Wiley & Sons, ISBN MONTVILLE, Thomas J. a Karl L. MATTHEWS. Food Microbiology. An Introduction. 2 nd Edition. Washington: ASM Press, ISBN ADAMS, Martin R. a Maurice O. MOSS. Food Microbiology. 3 rd Edition. Cambridge: RSC Publishing, ISBN JAY, James M. Modern Food Microbiology. 6 th Edition. Gaithersburg: Aspen Publication, ISBN X. 5. JANŠTOVÁ, B., L. VORLOVÁ, P. NAVRÁTILOVÁ, M. KRÁLOVÁ, L. NECIDOVÁ a E. MA ICOVÁ. Technologie mléka a mlé ných výrobk. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, ISBN LEGAROVÁ, Veronika. Posouzení kvality sladké syrovátky vzhledem k možnosti využití pro potraviná ské ú ely, Praha, Diserta ní práce. eská zem d lská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a p írodních zdroj, Katedra kvality zem d lských produkt. 7. ESKO. Vyhláška ze dne 1. ervence 2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje, v platném zn ní. In: Sbírka právních p edpis 77/2003 Sb LUND, Barabara M., Tony C. BAIRD-PARKER a Grahame W. GOULD. The Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publication, ISBN DENG, Y.Y., B. MISSELWITZ, N. DAI a M. FOX. Lactose intolerance in adults: biological mechanism and dietary management. Nutrients, 2015, ro. 7,. 9, s ISSN FOX. P.F. a P.L.H. McSWEENEY. Dairy Chemistry and Biochemistry. London: Blackie Academic & Professional, ISBN RAESSLER, Michael. Sample preparation and current applications of liquid chromatography for the determination of non-structural carbohydrates in plants. Trends in Analytical Chemistry, 2011, ro. 30,. 11, s ISSN SANZ, M. a I. MARTÍNEZ-CASTRO. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates. Journal of Chromatography A, 2007, ro. 1153,. 1-2 s ISSN NELOFAR, A., A.H. LAGHARI a A. YASMIN. Validated HPLC-RI method for the determination of lactulose and its process related impurities in syrup. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010, ro. 72,. 2, s ISSN ZAKHAROVA, A.M., I.L. GRINSHTEIN, a L.A. KARTSOVA. Determination of carbohydrates and sweeteners in foods and biologically active additives by high-performance liquid chromatography. Journal of Analytical Chemistry, 2011, ro. 68,. 12, s ISSN BU KA, F., V. PACHLOVÁ, L. BU KOVÁ a M. ERNÍKOVÁ. Mlékárenská technologie I. Zlín: Univerzita Tomáše Bati, ISBN B EZINA, Pavel a Jaroslav JELÍNEK. Chemie a technologie mléka. Praha: VŠCHT, ISBN ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila. Mikrobiologie pro potraviná e a biotechnology. 3. opr. a dopln. vydání. Praha: Academia, ISBN Kontaktní adresa: Ing. Zuzana Bubelová, Ph.D. Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín Nám. T. G. Masaryka 5555, Zlín bubelova@ft.utb.cz tel.:

187 DEKARBOXYLÁZOVÁ AKTIVITA MIKROORGANIZM IZOLOVANÝCH Z VÝROBY TVAROHU Pachlová Vendula 1, Bu ková Leona 2, Flasarová Radka 1, Havlí ková Šárka 3, N me ková Irena 3, Purkrtová Sabina 4, Bu ka František 1 1 Ústav technologie potravin, 2 Ústav inženýrství ochrany životního prost edí, UTB ve Zlín 3 Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o., Praha; 4 Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT v Praze The decarboxylation activity of isolates from acid cheese production Summary: The aim of study was observed biogenic amine production of isolates from manufacture and storage of acid cheese. Histamine, phenylethylamine, tryptamine, cadaverine and spermidine were not detected in cheese samples. Tyramine, putrescine and spermidine contents increased during manufacture process and especially storage of cheese. However total biogenic content did not reach health-threatening values. A total of 123 isolates were obtained from samples. Isolates were tested for ability to biogenic amine production in growth medium. Extensive biogenic amine production was demonstrated in 52 % of the isolates (biogenic amine concentration above 200 mg/l growth medium). As major producer of biogenic amine, which were isolated during manufacture process, were labelled Bacillus licheniformis, Serratia fonticola, Pseudomonas jesseni, Acinetobacter johnsonii and Enterococcus faecium. Tyramine production was demonstrated in all isolates while 59 microorganisms (totally 48 % isolates) produced concentration above 100 mg/l. Significant activity of tyramine production was observed in case of lactic acid bacteria (especially Enterococcus faecium) which were isolated from acid cheese during storage period. Úvod B žná množství biogenních amin v potravinách (<100 mg/kg), v etn mlé ných výrobk, nep edstavují pro zdravého lov ka významné riziko, protože jsou v lidském st evním traktu metabolizovány inností detoxika ních enzym. Vysoká množství však mohou vyvolat psychoaktivní a vazoaktivní ú inky (kolísání krevního tlaku, bolesti hlavy, migrény, zvracení, dýchací potíže aj.). Histamin, tyramin a fenyletylamin mohou tyto ú inky vyvolávat p ímo. Putrescin a kadaverin samy o sob nep sobí p íliš toxicky, mohou však zvyšovat nežádoucí ú inky dalších biogenních amin 1, 2. Vzhledem ke krátké dob použitelnosti lze p edpokládat pom rn nízké koncentrace biogenních amin v tvarohu, a to i v p ípad, že ve výrobku byly p ítomny mikroorganizmy, které jsou silnými producenty t chto potenciáln nebezpe ných slou enin. Tvaroh však m že být použit k výrob dalších potravin a pokrm. Mikroorganizmy pocházející z tvarohu pak mohou rozvíjet svou metabolickou aktivitu a produkovat vyšší koncentrace biogenních amin v potravin, kde se jejich zvýšené obsahy nep edpokládají. Cílem práce bylo posoudit intenzitu produkce biogenních amin mikroorganizmy izolovanými v pr b hu výroby tvarohu. Materiál a metodika Pro posouzení produkce biogenních amin byly získány vzorky syrového mléka (1), pasterovaného mléka (odb r za pastérem) (2), pasterovaného mléka ve standardiza ním tanku (3), mléka p ed zakysáním (4), tvarohoviny p ed krájením (5), tvarohového zrna (6), tvarohu ve spot ebitelském balení po 1 dni skladování a tvarohu ve spot ebitelském balení po 25 dnech skladování. Vzorky byly získány ze 4 šarží. Vzorky byly podrobeny rutinní mikrobiologické analýze. Vybrané kolonie byly izolovány do BHI bujónu a kultivovány h p i 25 C (kvasinky), 37 C (Enterobacteriaceae, stafylokoky) nebo 30 C (ostatní mikroorganismy). P idáno bylo 20 % (v/v) sterilního glycerolu a kmeny byly zamraženy p i -43 C pro další použití. Identifikace vzork byla provedena metodou MALDI-TOF MS pomocí p ístroje Bruker Autoflex Speed (Bruker Daltonics, SRN) a databáze Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, SRN) po p edb žném za azení izolát do jednotlivých skupin mikroorganism. Vizualizace proteinových profil byla provedena programem mmass

188 U identifikovaných grampozitivních a gramnegativních bakterií byl metodou polymerázové et zové reakce proveden skríning detekce p ítomnosti gen pro dekarboxylázové enzymy podle de las Rivas et al. 4 a podle Marcobal et al. 5 Dekarboxylázová aktivita jednotlivých mikroorganizm byla posuzována po jejich kultivaci v modifikovaných bujónech, které mají podpo it produkci BA anebo PA. Kultivace probíhala p i 30 C po dobu 48 hodin. Každý izolát byl kultivován šestkrát. Bujón po kultivaci testovaných bakterií byl centrifugován (4000 g; 22±1 C; 20 minut) a získaný supernatant byl z ed n v pom ru 1:1 (v/v) s kyselinou chloristou (1,2 mol/l). Získaná sm s byla filtrována (porozita filtru 0,45 m) a filtrát byl podroben derivatizaci 6. Pro stanovení obsahu biogenních amin ve vzorcích získaných b hem výroby a skladování tvaroh byla použita lyofilizovaná hmota. Trojnásobná extrakce BA a PA z lyofilizované hmoty byla provedena roztokem kyseliny chloristé (0,6 mol/l). Zfiltrovaný extrakt (porozita filtru 0,45 m) byl již p ímo použit pro následnou derivatizaci. Obsah osmi amin (histaminu, tyraminu, fenyethylaminu, tryptaminu, putrescinu, kadaverinu, sperminu a spermidinu) byl stanoven metodou kapalinové chromatografie (p ístroje LabAlliance, USA a Agilent Technologies, Agilent, USA) po p edchozí derivatizaci dansylchloridem. Postup derivatizace BA a PA pomocí dansylchloridu byl proveden podle Dadáková et al. 7 Jako interní standard byl použit 1,7-heptandiamin. Chromatografická separace (ZORBAX Eclipse XDB-C18, 50 x 3.0 mm, 1.8 m, Agilent Technologies) a detekce (spektrofotometricky = 254 nm) byla provedena podle Dadákové et al. 7 Výsledky Vývoj obsahu biogenních amin b hem výroby a skladování tvarohu je znázorn n na Obrázku 1. V pr b hu výroby ani skladování tvaroh nebyla detekována p ítomnost histaminu, fenyletylaminu, tryptainu, kadaverinu ani sperminu. Obsah spermidinu ve všech analyzovaných vzorcích byl velmi nízký a nedosáhl 1 mg/kg. Také tyramin a putrescin se ve vzorcích vyskytovaly pouze v nízkých koncentracích. U obou biogenních amin však byl patrný rostoucí trend zejména v pr b hu 25denního skladování. Intenzivní nár st byl pozorován v p ípad tyraminu. Jeho koncentrace se v pr b hu skladování tvarohu navýšila na více jak trojnásobnou hodnotu, což lze p isoudit k aktivit p ítomné mikroflóry. Vzhledem k nízké skladovací teplot (4 8 C) a také krátké dob skladování však byla detekována celkov nízká množství biogenních amin, což lze o ekávat u produktu vyrobeného za vysokých hygienických podmínek. Obsah BA (mg/kg) Fáze odb ru vzork tyramin putrescin spermidin Obr. 1. Obsah biogenních amin ve vzorcích b hem výroby a skladování tvarohu 188

189 Z jednotlivých fází odb r vzork (1 až 8) bylo celkem izolováno a identifikováno 123 mikroorganizm, u kterých byla prokázána produkce biogenních amin. Schopnost významné produkce jednoho, anebo dokonce sou asn více biogenních aminu byla detekována u 52 % získaných izolát (hodnoty obsahu konkrétního biogenního aminu nad 200 mg/l). Takto vysokou schopnost produkce biogenních amin je možno považovat za potenciáln problematickou. Na druhou stranu produkce histaminu a spermidinu byla u studovaných izolát zaznamenána pouze z ídka. U tém 87 % všech izolát nebyla prokázána produkce histaminu. P ibližn 11 % izolát produkovalo histamin do 10 mg/l r stového media. Pouze jeden izolát identifikovaný jako Citrobacter freundii produkoval histamin nad 100 mg/l. U 119 izolát nebyla v r stových mediích prokázána produkce spermidinu. Pouze 4 izoláty produkovaly spermidin v množství do 10 mg/l. U více jak dvou t etin izolát byla prokázána produkce tryptaminu. V p ípad 39 mikroorganizm byla detekována množství tryptaminu v rozp tí 10 až 50 mg/l, 46 izolát produkovala tryptamin do 10 mg/l. U všech testovaných izolát byla prokázána produkce sperminu, p i emž 8 izolát bylo ozna eno jako st ední producenti sperminu (detekovaná množství v rozp tí 50 až 100 mg/l). Více jak 56 % mikroorganizm syntetizovalo spermin v koncentracích 10 až 50 mg/l. Produkce spermidinu izolovanými mikroorganizmy byla velmi omezená. Pouze 4 izoláty v r stovém mediu produkovaly spermidin a to do koncentrace 10 mg/l. U více jak 55 % testovaných mikroorganizm byla prokázána produkce kadaverinu, z toho 44 % jej produkovalo v koncentracích do 10 mg/l. V p ípad 7 % izolát byla detekována koncentrace v rozp tí 10 až 50 mg/l. Po 25 dnech skladování tvarohu byl izolován Bacillus licheniformis se silnou produkcí kadaverinu (v množství 100 až 200 mg/l). Jako velmi silní producenti byli ozna eni také zástupci Klebsiella oxytoca (izoláty z tvarohoviny) a Pseudomonas sp. (1 izolát z pasterovaného mléka), u kterých byla detekována množství nad 200 mg/l. Izolované mikroorganizmy projevily prokazateln nejvyšší schopnost metabolizovat putrescin a tyramin, což také koreluje s výsledky obsah biogenních amin vzork suroviny, meziprodukt a finálních tvaroh. P ibližn 75 % všech izolát v r stových bujonech projevilo schopnost produkce putrescinu, p i emž více jak 11 % izolát putrescin produkovalo v koncentracích vyšších jak 100 mg/l. Celkem 9 mikroorganizm s vysokou produkcí putrescinu bylo izolováno z mléka po pastera ním záh evu. Z tohoto zjišt ní lze usoudit, že pastera ní záh ev nemusí významn eliminovat p ítomnost putrescin produkujících mikroorganizm v surovin. Další možné vysv tlení lze nalézt v sekundární kontaminaci po tepelném ošet ení mléka 8. Schopnost produkce putrescinu byla také pozorována u mikroorganizm izolovaných z tvarohoviny, tvarohového zrna a také finálního produktu. Jako významní producenti putrescinu byli identifikováni Bacillus licheniformis, Serratia fonticola, Pseudomonas jesseni, Acinetobacter johnsonii, Enterococcus faecium. U všech izolát byla prokázána schopnost produkce tyraminu, p i emž 59 mikroorganizm (celkem 48 % všech izolát ) v r stovém mediu metabolizovalo množství nad 100 mg/l. Z posouzení schopnosti produkce biogenních amin izolovanými mikroorganizmy ze vzork tvaroh (Tabulka I a II) lze usoudit, že mezi významné producenty tyraminu pat í zástupci bakterií mlé ného kvašení (zejména rodu Enterococcus). Vyšší záchyt bakterií mlé ného kvašení s vysokou produkcí tyraminu ve srovnání s ostatní mikroflórou lze p isoudit m n vhodným r stovým podmínkám (p edevším nízké hodnot ph tvarohu) 8. V p ípad využití tvarohu jako suroviny pro výrobu potraviny s delší dobou trvanlivosti pak m že dojít k p enesení mikroorganizm produkujících biogenní aminy. Následn m že v pr b hu skladování této potraviny docházet k akumulaci biogenních amin aktivitou p ítomné mikroflóry do potenciáln rizikových hodnot 9. Po p íjmu vyššího množství biogenních amin nap. kombinací r zných potravin, které obsahují jejich zvýšená množství, pak m že dojít k zahlcení detoxika ního systému ve st evním traktu konzumenta a ohrožení zdravotního stavu. 189

190 Tabulka I Produkce biogenních amin vybraných izolát získaných 1. den po výrob tvaroh Izolovaný mikroorganizmus Histamin Fenyletylamin Tyramin Tryptamin Putrescin Kadaverin Spermidin Spermin Lactococcus lactis ND ND ND ++ Leuconostoc sp. ND ND ++ ND ND ND ND ++ Enterococcus faecium ND + Enterococcus faecium ND ND ++ Enterococcus faecium ND ND ++ Enterococcus faecalis ND ND ND + + Enterococcus faecalis ND ND + Enterococcus faecium ND ND + + ND + Enterococcus faecium ND ND ND ND ND + Enterococcus sp. ND ND ND ND + Enterococcus sp. ND ND + ND + Enterococcus sp. ND ND ND + ND + Bacillus licheniformis ND ND ND ++ Bacillus licheniformis ND ND ND ++ Bacillus licheniformis ND ND ++ ND + ND ND ++ Pseudomonas sp. ND ND + Candida sp. ND ND ND ++ Produkce biogenních amin u jednotlivých izolát byla zhodnocena pomocí interval : ND nebylo detekováno; + pod 1 mg/l; až 50 mg/l; až 100 mg/l; až 200 mg/l; nad 200 mg/l

191 Tabulka II Produkce biogenních amin vybraných izolát získaných 25. den po výrob tvaroh Izolovaný mikroorganizmus Histamin Fenyletylamin Tyramin Tryptamin Putrescin Kadaverin Spermidin Spermin Streptococcus sp. ND ND ++ ND ND ND ND ++ Lactobacillus sp. ND ND ND ND ND + Leuconostoc ND ND +++ ND ND ND ND ++ pseudomesenteroides Lactobacillus ND ND ++ ND ND ++ Lactobacillus sp. ND ND ND ND ND + Enterococcus italicus ND ND ND ND ND ND +++ Enterococcus faecium ND ND + Enterococcus faecium ND ND + Enterococcus faecium ND ND ++ Enterococcus faecium ND ND + + ND + Enterococcus faecium ND ND ND ND ND + Enterococcus faecium ND ND + ND ++ Bacillus licheniformis ND ND ++ Bacillus licheniformis + ND ND ++ Bacillus licheniformis ND ND ++ Staphylococcus epidermidis ND ND ++ Streptococcus sp. ND ND ++ ND ND ND ND ++ Produkce biogenních amin u jednotlivých izolát byla zhodnocena pomocí interval : ND nebylo detekováno; + pod 1 mg/l; až 50 mg/l; až 100 mg/l; až 200 mg/l; nad 200 mg/l

192 Záv r Obsah biogenních amin byl sledován v pr b hu výroby tvarohu, a to od suroviny (syrového mléka), p es tepeln ošet ené mléko, tvarohovinu p ed krájením, tvarohové zrno až po finální tvaroh po výrob, resp. po 25 dnech skladování. Ve vzorcích byl zjišt n pouze malý obsah tyraminu, putrescinu a spermidinu, který nep edstavuje toxikologicky významné riziko. Nízké obsahy biogenních amin lze o ekávat vzhledem k nízké skladovací teplot (4 8 C) a krátké dob skladování. Ze suroviny, meziprodukt i finálních produkt bylo celkem izolováno 123 mikroorganizm, u kterých byla následn zjiš ována schopnost produkce biogenních amin. Metodou in vitro byla u t chto izolát prokázána široká produkce biogenních amin (histaminu, fenyletylaminu, tyraminu, tryptaminu, putrescinu, kadaverinu, spermidinu a sperminu). P ibližn 52 % izolát projevilo schopnost významné produkce jednoho anebo dokonce sou asn více biogenních amin (koncentrace sledovaného biogenního aminu nad 200 mg/l r stového média). Takto vysoké hodnoty lze považovat ze strany bezpe nosti potravin za závažné. Vzhledem k tomu, že se tvaroh využívá jako surovina p i výrob celé ady dalších potravin a pokrm, m že p edstavovat vektor kontaminace producent biogenních amin. Následn m že dojít aktivitou t chto mikroorganizm k vysoké kumulaci biogenních amin a tím k ohrožení bezpe nosti spot ebitele. Pod kování: Práce vznikla za podpory projektu NAZV KUS QJ Použitá literatura: 1. Halász, A., Baráth, Á., Simon-Sarkadi, L., Holzapfel, W. Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends Food Sci. Technol. 5, Silla Santos, M.H. Biogenic amines: their importance in food. Int. J. Food Microbiol. 29, Strohalm M., Kavan D., Novák P., Volný M., Havlí ek V. (2010): mmass 3: s cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Analytical Chemistry, 82, de las Rivas, B., Marcobal Á., Carrascosa A. V., Muñoz, R. PCR detection of foodborne bacteria producing the biogenic amines histamine, tyramine, putrescine and cadaverine. J.Food Protect. 69, Marcobal, Á., de las Rivas, B., Moreno-Arribas, V., Muñoz, R. Multiplex PCR method for the simultaneous detection of histamine-, tyramine-, and putrescine-producing lactic acid bacteria in foods. J.Food Protect. 68, Lorencová, E., Bu ková, L., Matoulková, D., Dráb, V., Pleva, P., Kubá, V., Bu ka, F. Production of biogenic amines by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from dairy products and beer. Int. J.Food Sci. Technol. 47, Dadáková, E., K ížek, P., Pelikánová, T. Determination of biogenic amines in foods using ultraperformance liquid chromatography (UPLC). Food Chem. 116, Kousta, M., Mataragas, M., Skandamis, P., Drosinos, E. Prevalence and source of cheese contamination with pathogens at the farm and processing levels. Food Control. 21, Flasarová, R., Pachlová, V., Bu ková, L., Menšíková, A., Georgová, N., Dráb, V., Bu ka, F. Biogenic amine production by Lactococcus lactis subsp. cremoris strain in the model systém of Dutch-type cheese. Food Chem.194, Kontaktní adresa: doc. Ing. Vendula Pachlová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín, nám. T.G. Masaryka 5555, Zlín, tel.: , pachlova@ft.utb.cz 192

193 PRODUKCE BIOGENNÍCH AMIN U BAKTERIÍ S PROBIOTICKÝM POTENCIÁLEM Lorencová Eva 1), Bu ková Leona 2), Kavková Miloslava 3), Bu ka František 1) 1) Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, UTB ve Zlín 2) Ústav inženýrství ochrany životního prost edí, Fakulta technologická UTB ve Zlín 3) Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o. Biogenic amines production by bacteria with probiotic potential Summary: The ability of probiotic cultures of Bifidobacterium and Lactobacillus to produce biogenic amines could be considered a contrastive feature to the beneficial dietary effect on human health. The aim of this study was to evaluate the decarboxylase activity of Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239 and Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 influenced by selected factors (temperature, ph, the contents of NaCl, glucose and lactose) at in vitro conditions. The kinetics of the biogenic amine production under the above-mentioned conditions was also monitored. The biogenic amine content detection was carried out in the supernatants of inoculated broth (MRS enriched with amino acids: arginine, ornithine, lysine, tyrosine after the cultivation). RP-HPLC after the precolumn derivatisation with dansyl chloride was used. Strains of L. rhamnosus CCDM 289 and B. animalis subsp. lactis CCDM 239 were able to produce tyramine and putrescine. L. rhamnosus CCDM 289 produced larger amounts of biogenic amines (<40 mg/l sum of the both amines). In most cases, the low concentrations of tyramine were monitored (<15 mg/l). Simultaneously, it was found out that the addition of certain fermentable saccharide concentrations and NaCl in their mutual combination seemed to have supporting effect on the decarboxylase activity of the tested Bifidobacterium. Úvod Probiotické bakterie jsou p idávány do potravin díky jejich p íznivému, dietetickolé ebnému p sobení (Marteau et al., 2002; Kneifel a Salmien, 2011). V literatu e však existují strohé zmínky, že i druhy bakterií mlé ného kvašení, jejichž kmeny jsou považovány za probiotické, mohou produkovat detekovatelná množství biogenních amin (Burdychová, 2007; Sládková, 2007). K takovým mikroorganizm m náleží nap. Lactobacillus acidophilus nebo Lactobacillus rhamnosus (Priyadarshani a Rakshit, 2011). Potenciál tvo it biogenní aminy mají i typicky probiotické bakterie rodu Bifidobacterium (Burdychová, 2007; Sládková, 2007). Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární alifatické, aromatické nebo heterocyklické bazické slou eniny odvozené od aminokyselin. Jsou významnými slou eninami, které se vyskytují v živých organizmech jako metabolické meziprodukty a produkty, které vykazují biologickou aktivitu. Základní podmínkou vzniku biogenních amin je p ítomnost aminokyselin v daném substrátu, p ítomnost mikroorganizm s dekarboxylázovou aktivitou a vhodné podmínky pro r st a množení mikroorganizm. (Fernández et al., 2007; Landete et al., 2007; Bover-Cid et al., 2008). Tvorba biogenních amin bakteriemi m že být ovlivn na mnohými vn jšími faktory, které mohou ovliv ovat zejména kinetiku dekarboxylázových reakcí. Mezi vn jší faktory, které ovliv ují tvorbu biogenních amin u bakterií, pat í teplota a ph prost edí, aero-/anaerobióza, dostupnost zdroj uhlíku (nap. glukózy), p ítomnost r stových faktor, r stová fáze bun k, koncentrace NaCl (vodní aktivita) aj. (Gardini et al., 2001, 2005; Santos et al., 2003; Greif et al., 2006; Bover-Cid et al., 2008; Emborg and Dalgaard, 2008). Krom výše zmín ných faktor mohou produkci biogenních amin ovliv ovat další chemické látky, nap. etanol, n které sacharidy, fenolické slou eniny nebo oxid si i itý (Gardini et al., 2005; Alberto et al., 2007; Mazzoli et al., 2009). P vodcem zvýšené koncentrace biogenních amin v potravinách m že být nejen kontaminující mikroflóra, ale také zákysové (startérové) kultury bakterií mlé ného kvašení s proteolytickými enzymy, dekarboxylázami a dalšími enzymy (nap. transaminázami, oxygenázami nebo metyltrasferázami), které se tvorby biogenních amin ú astní (Halász et al., 1994; Silla- Santos, 1996; Burdychová a Komprda, 2007). Pro bezpe nost potravin má tedy velký význam testovat dekarboxylázovou aktivitu zákysových kultur a zjiš ovat, jestli, a za jakých podmínek, mohou zvyšovat obsah biogenních amin ve výrobcích (Hassaïne et al., 2009). Mikroorganizmy, které za podmínek obdobných chemickému složení a technologickému procesu daného výrobku, produkují signifikantní množství biogenních amin, by m ly být preventivn vy azeny z používání 193

194 jako zákysové kultury (Suzzi a Gardini, 2003; Bu ková et al., 2009). Stejn tak by pro technologické ú ely bylo vhodné znát kinetiku tvorby biogenních amin za podobných podmínek prost edí, které mohou nastat b hem technologického procesu výroby fermentovaných mlé ných výrobk. Cílem této studie bylo za modelových podmínek sledovat efekt n kolika faktor vn jšího prost edí (teplota, p ídavek aminokyselin, koncentrace laktózy a ph) na produkci biogenních amin u 2 kmen bakterií s probiotickým potenciálem, Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 a Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239. U t chto kmen byly studovány vlivy vn jších faktor, jež by mohly v rámci technologického procesu významn ji ovlivnit množství vytvo ených biogenních amin ve výrobku. Testovaný rozsah hodnot zkoušených faktor byl volen tak, aby mohly být výsledky aplikovány na technologickou praxi fermentovaných výrobk. Materiál a metody Vliv faktor prost edí na produkci biogenních amin byl testován u 2 kmen s probiotickým potenciálem, Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 a Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239. Oba kmeny byly získány ze Sbírky kultur mléká ských mikroorganizm Laktoflora (CCDM). Produkce biogenních amin byla u výše zmín ných kmen sledována v závislosti na t chto faktorech prost edí: teplota 10 C a 37 C, ph 4 7, p ídavek laktózy a glukózy v koncentracích 0 2 % (w/v), p ídavek glycerolu 0 5 % (w/v), p ídavek NaCl 0 2 % (w/v). Kultivace výše zmín ných kmen, probíhala v dekarboxyla ním médiu MRS bujónu s p ídavkem 0,3 % (w/v) aminokyselin argininu, ornitinu, lyzinu a tyrozinu p i teplot 37 ± 2 C po dobu 48 hodin a p i teplot 10 ± 1 C v rozmezí 1 až 15 dn. P íslušné kultiva ní médium o objemu 5 ml bylo zao kováno vždy 25 l suspenze bakterií narostených p es noc v MRS bujónu s p ídavkem 0,3 % (w/v) p íslušných aminokyselin. Kultiva ní médium bylo obohaceno o látky, jejichž vliv na produkci biogenních amin byl sledován. Ú elem experimentu bylo také sledovat kinetiku produkce biogenních amin. V tomto p ípad se celkový po et odb r u p íslušného kmene p i sledování ur itého faktoru pohyboval v rozsahu 8-10 odb r. Odb r vzork pro analýzy probíhal tak, že vždy byly náhodn odebrány od každého kmene a každé úrovn faktoru 2 zkumavky. Celý experiment byl opakován t ikrát. Bujón po kultivaci testovaných bakterií byl centrifugován (3 421 x g; 22±1 C; 20 minut) a získaný supernatant byl z ed n v pom ru 1:1 (v/v) kyselinou chloristou (1,2 mol/l). Metodou kapalinové chromatografie (p ístroje LabAlliance a Agilent Technologies) byl po p edchozí derivatizaci dansylchloridem stanoven obsah BA. Derivatizace, chromatografická separace (ZORBAX Eclipse XDB-C18, 150 x 4,6 mm, 3,5 m, Agilent Technologies) a detekce (spektrofotometricky; = 254 nm) byly provedeny podle Dadákové et al. (2009). Každý supernatant byl extrahován t ikrát (3 samostatné extrakce), každý extrakt dvakrát derivatizován a každá derivatizovaná sm s t ikrát nanesena na kolonu (n = 18). Meze detekce se pro jednotlivé aminy pohybovaly v rozmezí 0,14-1,09 mg/l. Pro vyhodnocení kinetiky produkce biogenních amin byl aplikován Gompertz v model Zwieteringa et al. (1990). Závislost obsahu sledovaného biogenního aminu (y) [mg/l] na ase (t) byla vyjád ena jako: kde: BA je maximální rychlost produkce biogenního aminu [h -1 ]; BA je doba prodlení [h]; a A BA je asymptota definovaná jako maximální produkce biogenního aminu. Pro výpo et parametr BA, BA a A BA byla použita nelineární regresní analýza (Marquardt- Levenburgova metoda) pro následující podmínky BA > 0, BA > 0 a A BA > 0. Vypo ítané parametry Gompertzových model (lag fáze, maximální vyprodukované množství a lag fáze produkce biogenního aminu) byly podrobeny statistickému testování pomocí Mann-Whitney testu. 194

195 Výsledky a diskuze Aminogenní aktivita probiotické kultury Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239, resp. její schopnost produkovat detekovatelná množství n kterých biogenních amin, m že být chápána jako negativní projev, který je opa ný k pozitivnímu probiotickému p sobení kmene v lidském organizmu. Na základ výsledk p edb žných test, kdy byla pozorována vyšší tvorba tyraminu, byla zvolena pro ú ely sledování kinetiky produkce fixní hodnota ph (ph 4,5). Dané ph se nejvíce p ibližuje ph mlé ných fermentovaných výrobk, p i jejichž výrob práv testovaný kmen nalézá uplatn ní. Kinetika produkce byla vyhodnocena jen u tyraminu, jelikož tvorba ostatních biogenních amin byla nízká nebo také p íliš kolísavá. Tvorba tyraminu testovaným kmenem byla p i 10 C rovn ž zanedbatelná (množství <2 mg/l), p i emž ostatní biogenní aminy nebyly detekovány. B hem 48 hodinové kultivace byl sledován významný vzestup obsahu tyraminu v analyzovaných supernatantech, a to u všech kombinací koncentrací laktózy a NaCl (P<0,05). Ve v tšin p ípad b hem prvních 6 hodin nedocházelo ke statisticky významným zm nám obsahu tohoto biogenního aminu (P>0,05). K signifikantním nár st m obsahu tyraminu docházelo až po 24 hodinách, i v n kterých p ípadech až po 48 hodinách kultivace (P<0,05, data nejsou uvedena). Maximální hodnoty produkce tyraminu ani po 48 hodinách nedosahovaly 20 mg/l (Obr. 1). Jak je vid t z obrázk 1 3, samostatný p ídavek soli nezp sobil potla ení maximální produkce tyraminu. Naopak v n kterých p ípadech (2% p ídavek NaCl bez laktózy) zp sobil podporu produkce tyraminu. Jev, kdy sodné ionty hrají esenciální roli v tyrozindekarboxylázové aktivit a v zapojení do regulace intracelulárního ph, byl již uveden ve studii Pereira et al. (2009). Obr. 1. Maximální produkce (A) tyraminu Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239 p i 37 C v MRS s p ídavky laktózy, soli a ph 4,5. Kombinace faktor nap. 0/2 0% p ídavek laktózy (w/v) a 2% p ídavek NaCl (w/v). Až sou asný p ídavek laktózy a soli snížil celkovou produkci tyraminu. Tento efekt však nebylo možné pozorovat p i 0,5% koncentraci laktózy v prost edí (Obr. 1). Obdobný ú inek prokazoval i samostatný p ídavek 0,5 % (w/v) laktózy. Nejmén p íhodné podmínky pro tyrozindekarboxylázovou aktivitu pak zjevn vytvo ila 0,5% koncentrace laktózy (w/v) s 2 % NaCl (w/v) v dekarboxyla ním médiu. Nejvíce tyraminu bylo detekováno v médiích se samostatným p ídavkem soli nebo v bujónu s 0,25 % laktózy (w/v) bez p ídavku soli, i obecn v médiích, které obsahovaly pouze laktózu (Obr. 1). Rychlost produkce byla také viditeln ovlivn na faktory, kdy byl nejpomaleji tvo en tyramin za podmínek 0,5% koncentrace laktózy bez ohledu na koncentraci soli (Obr. 2). K nár stu rychlosti celkové produkce tyraminu docházelo p i nejvyšší testované koncentraci laktózy, kdy ani délka lag fáze nebyla významn prodlužována p ídavkem soli (Obr. 3). Obecn lze íci, že produkce biogenních amin m la délku lag fáze ve v tšin p ípad dlouhou max. 10 hodin (Obr. 3). Nejkratší dobu lag fáze produkce tyraminu vykazoval vzorek supernatantu s 0,5 % laktózy bez p ídavku soli, avšak maximální vyprodukované množství bylo u této kombinace faktor nejnižší. 195

196 Obr. 2: R stová rychlost ( m ) produkce tyraminu Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239 p i 37 C v MRS s p ídavky laktózy, soli a ph 4,5. Kombinace faktor nap. 0/2 0% p ídavek laktózy (w/v) a 2% p ídavek NaCl (w/v). Obr. 3: Délka lag fáze ( ) produkce tyraminu Bifidobacterium animalis subsp. lactis CCDM 239 p i 37 C v MRS s p ídavky laktózy, soli a ph 4,5. Kombinace faktor nap. 0/2 0% p ídavek laktózy (w/v) a 2% p ídavek NaCl (w/v). Testovaný kmen sice nevykazoval výrazn jší produkci žádného z biogenních amin, avšak i samotný potenciál produkovat detekovatelná množství tyraminu p i teplot 37 C, p edstavuje zajímavé zjišt ní. Zvlášt pro ú elnou implementaci této kultury do výroby jogurtových mlék a jogurt, které fermentují p i vyšší teplot. Tato skute nost m že p edstavovat riziko, že by i funk ní mlé né výrobky mohly být zdroji, by malých koncentrací, tyraminu. Koncentrace tyraminu (<16 mg/l), které by mohl být kmen B. animalis subsp. lactis CCDM 239 schopen vyprodukovat za optimálních podmínek (p ítomnost prekurzor, prebiotik, výhodných nutri ních dispozic) i v reálném systému, by mohly ohrozit pouze citlivé jedince, osoby farmakologicky lé ené nebo p i sou asném požití v tšího množství alkoholu. V supernatantu po kultivaci Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 bylo možné v pr b hu asu pozorovat nár st obsahu tyraminu a putrescinu. Maximální vyprodukovaná množství nep esáhla ani u jednoho ze jmenovaných biogenních amin 15 mg/l (bez ohledu na kombinaci úrovní sledovaných faktor ). Vliv na produkci biogenních amin (zvlášt tyraminu, Obr. 4 a 5), stejn jako na r st kultury, m la teplota, kdy nižší teplota zp sobila pokles v produkci (P<0,05). U putrescinu nebyly zm ny v závislosti na teplot tak výrazné. 196

197 Obr. 4: Maximální produkce (A) tyraminu kmenem Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 p i 37 C v MRS s p ídavky glycerolu (0-5 %, v/v) a úpravou ph. Kombinace faktor nap. 5/6 5% p ídavek glycerolu (v/v), ph 6. Obr. 5: Maximální produkce (A) tyraminu kmenem Lactobacillus rhamnosus CCDM 289 p i 10 C v MRS s p ídavky glycerolu (0-5 %, v/v) a úpravou ph. Kombinace faktor nap. 5/6 5% p ídavek glycerolu (v/v), ph 6. S p ídavky glycerolu p i 37 C byl kmen L. rhamnosus CCDM 289 schopen tvo it více tyraminu (Obr. 4), ale mén produkoval putrescin. Celkovou produkci tyraminu podpo ilo nej ast ji ph 5 a ph 6 (P<0,05; Obr. 4), nejvyšší vyprodukované množství ale bylo detekováno v médiu s inicia ním ph 4 (5% (v/v) p ídavek glycerolu, 37 C, produkce 12,0±0,3 mg/l). Putrescin byl v médiu produkován do maximální výše 8,0±0,3 mg/l (t=37 C, bez p ídavku glycerolu, ph 4). U tvorby putrescinu nelze hovo it o jednozna ném trendu v rámci p sobení inicia ních ph. Velmi asto ale byla produkce putrescinu podpo ena p i nejnižším zkoušeném ph (P<0,05). Z ejm se jednalo o obranu p ed acidifikací bu ky. Tuto teorii uvedl ve své studii Molenaar et al. (1993). Z vývoje ph kultiva ního prost edí je totiž patrné, že se u v tšiny vzork s inicia ní hodnotou ph 4 hodnota ph prost edí dále snižovala. Bez ohledu na teplotu kultivace byla doba lag fáze tvorby tyraminu nejdelší p i ph 4 (P<0,05), i když p i stejném ph byla detekována nejvyšší produkce. Délka lag fáze produkce putrescinu p i se teplot 37 C zkracovala p ídavkem glycerolu. Bez p ídavk glycerolu dosahovala tém 30 hodin (ph 4), zatímco nap. v prost edí s 3 % (v/v) glycerolu netrvala ani 0,1 h. Rychlost produkce tyraminu byla nejvíce podpo ena p ídavkem 1 a 3 % (v/v) glycerolu v médiích s inicia ním ph 5 a 6 (P<0,05) p i obou testovaných teplotách. Na základ relativn nízké produkce biogenních amin za podmínek in vitro lze konstatovat, že testovaný kmen L. rhamnosus CCDM 289 nelze ozna it za kmen p edstavující riziko pro spot ebitele, co se tý e fyziologického významu vyprodukovaného množství biogenních amin, které je schopen za testovaných podmínek uvolnit do kultiva ního prost edí. 197

198 Pod kování: Tato práce vznikla s finan ní podporou Národní agentury pro zem d lský výzkum, projekt QJ programu Komplexní udržitelné systémy v zem d lství Použitá literatura: Alberto, M.R., Arena, M.E., Manca De Nadra, M.C. Putrescine production from agmatine by Lactobacillus hilgardii: Effect of phenolic compounds. Food Control. 2007, 18, Bover-Cid, S., Miguélez-Arrizado, M.J., Becker, B., Holzapfel, W.H., Vidal-Carou, M.C. Amino acid decarboxylation by Lactobacillus curvatus CTC273 affected by the ph and glucose availability. Food Microbiology. 2008, 25, Bu ková, L., Bu ka, F., Hlobilová, M., Va átková, Z., Nováková, D., Dráb, V. Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus. European Food Research and Technology. 2009, 229, Burdychová, R. Mikrobiologická detekce probiotických mikroorganism ve fermentovaných mlé ných výrobcích. Acta Universitatis, Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, 2007, 54, Burdychová, R., Komprda, T.. Biogenic amine-forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiology Letters. 2007, 276, Dadáková, E., K ížek, P., Pelikánová, T. Determination of biogenic amines in foods using ultra-performance liquid chromatography (UPLC). Food Chemistry. 2009, 116, Emborg, J., Dalgaard, P. Modelling the effect of temperature, carbon dioxide, water activity and ph on growth and histamine formation on Morganella psychrotolerans. International Journal of Food Microbiology. 2008, 128, Fernández, M., Linares, D.M., Rodríguez, A., Alvarez, M.A. Factors affecting tyramine production in Enterococcus durans IPLA 655. Applied Microbiology and Biotechnology. 2007, 73, Gardini, F., Zaccarelli, A., Belleti, N., Faustini, F., Cavazza, A., Martuscelli, M., Mastrocola, D., Suzzi, G. Factors influencing biogenic amine production by a strain of Oenococcus oeni in a model system. Food Control. 2005, 16, Greif, G., Greifová, M., Karovi ová, J. Effects of NaCl concentration and initial ph value on biogenic amine formation dynamics by Enterobacter spp. bacteria in model conditions. Journal of Food and Nutrition Research. 2006, 45, Halász, A., Baráth, A., Simon-Sakardi, L. Holzapfel, W. Biogenic amines and their production by microorganisms in food. Trends in Food Science and Technology. 1994, 5, Hassaïne, O., Zadi-Karam, H., Karam, N. Evaluation of biogenic amines formation by proteolytic enterococci strains isolated from raw dromedary milks from Southern Algeria. Journal of Food Safety. 2009, 29, Kneifel, W, Salmien, S. Probiotics and Health Claims. Iowa: Wiley-Blackwell Landete, J. M., Ferrer, S., Pardo, I. Biogenic amine production by lactic acid bacteria, acetic bacteria and yeast isolated from wine. Food Control. 2007, 18, Marteau, P., Seksik, P., Jian, R. Probiotics and intestinal health effects: a clinical perspective. British Journal of Nutrition. 2002, 88, Mazzoli, R., Lamberti, C., Coisson, J.D., Purrotti, M., Arlorio, M., Giuffrida, M.G., Giunta, C., Pessione, E. Influence of ethanol, malate and arginine on histamine production of Lactobacillus hilgardii isolated from Italian red wine. Amino Acids. 2009, 36, Molenaar, D., Bosscher, J.S., Brink, B.T. Driessen, A.J.M., Konings, W.N. Generation of a proton motive force by histidine decarboxylation and electrogenic histidine/histamine antiport in Lactobacillus buchneri. Journal of Bacteriology. 1993, 175, Pereira, C.I., Matos, D., San Romão, M.V. Crespo, M.T.B. Dual role for the tyrosine decarboxylation pathway in Enterococcus faecium E17: response to an acid challenge and generation of a proton motive force. Applied and Environmental Microbiology. 2009, 75,

199 Priyadarshani, D., Rakshit, S.K. Screening selected strains of probiotic lactic acid bacteria for their ability to produce biogenic amines (histamine and tyramine). International Journal of Food Science and Technology. 2011, 46, Santos, W.C., Souza, M.R., Cerqueira, M.M.O.P., Glória, M.B.A. Bioactive amine formation in milk by Lactococcus in the presence or not of rennet and NaCl at 20 and 32 C. Food Chemistry. 2003, 81, Silla-Santos, H.S.M. Biogenic amines: their importance in foods. Food Microbiology. 1996, 29, Sládková, P., Komprda, T., Burdychová, R. Skríning startovacích a probiotických kultur ur ených pro výrobu fermentovaných masných výrobk na schopnost tvorby biogenních amin. MendelNet'07 Agro. 1. vyd. MZLU v Brn Suzzi, G. Gardini, F. Biogenic amines in dry fermented sausages: A review. International Journal of Food Microbiology. 2003, 88, Zwietering, M., Jogenburger, I., Rombouts, F., Van 'T Riet, A.K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Enviromental Microbiology. 1990, 6, Kontaktní adresa: Doc. RNDr. Leona Bu ková, Ph.D., Ústav inženýrství ochrany životního prost edí, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín, nám. Vavre kova 275, Zlín, tel.: , bunkova@ft.utb.cz. 199

200 200

201 POROVNANIE FYZIKÁLNYCH A FYZIKÁLNO-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ VYBRANÝCH SLOVENSKÝCH A GRÉCKYCH SYROV Di áková Zuzana, Dudriková Eva, Kasapian Martha Ústav hygieny a technologie mlieka, Katedra hygieny a technologie potravín, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach Comparison of physical and physicochemical properties of selected Slovak and Greek cheeses Summary: The goal of presented work was to compare some physical and physicochemical properties of selected Slovak and Greek cheeses. Selection consisted of 15 various types of cheese from various regions of Greece. These were similar to the selected range of typical 13 Slovak cheeses. Dry matter, fat, ph, water activity, salt content, and colour of the cheeses were evaluated. Analysed were always two samples, which were processed in duplicate. Dry matter in the cheese was determined by drying to constant weight at 103 C. Fat was analyzed by butyrometric Gerber method, sodium chloride content was determined by Mohr argentometric method. For water activity estimating Labmaster-aw machine was used. The colours of cheese was expressed in CieLab scale using parameters L*, a*, b* which were measured by CM 410 colorimeter. Comparing the results, it was found that the average value of dry matter content, fat and salt were lower in Slovak cheese. Similar were the average values of ph and fat in dry matter. Variations were also found in colour. In Greek cheeses predominate cheeses from goat and sheep milk which can be seen mainly on the parameters a * and b *, which have significantly lower values compared to the Slovak cheeses in which the representation of sheep and goat cheeses are lower. The most apparent differences were found in the water activity. The average value of water activity in Greek cheeses was (with a range from to 0.889), whereas a w average in Slovak cheeses was (with a range from to 0.943). Úvod História výroby syrov má dlhé korene a siaha do ias antiky. Z Blízkeho východu a Stredomoria sa postupne toto umenie rozšírilo do celého sveta. Syry predstavujú ve kú skupinu mlie nych výrobkov, ktoré sú svojou druhovou rozmanitos ou predur ené k neustálej popularite medzi spotrebite mi. 1,2 Napriek všeobecnej globalizácii si mnohé krajiny uchovávajú svoje tradi né receptúry výroby syrov a najmä v posledných rokoch pribúdajú na trhu syry s chráneným zemepisným ozna ením a chráneným ozna ením pôvodu. Medzi krajiny, ktoré sa pýšia mnohými práve takýmito druhmi patrí aj Grécko. V aka svojim prírodným a klimatickým podmienkam dáva rozšírený chov oviec, kôz a rovnako i hovädzieho dobytka predpoklady na produkciu širokého sortimentu syrov. 3,4 Pod a agentúry Eurostas v Grécku v roku 2014 vyprodukovali 190 tisíc ton syrov, zatia o na Slovensku 33 tisíc ton. 5 Významná je rovnako tradi ne vysoká konzumácia syrov v Grécku, ktorá je v porovnaní so Slovenskom dvojnásobne vyššia a predstavuje 23,4 kg na osobu a rok (na Slovensku10,3 kg na osobu a rok). 6 Cie om práce bolo v spolupráci s našimi zahrani nými študentmi porovna vybrané typické slovenské syry so známymi syrmi z ich krajín a tento príspevok sa venuje gréckym syrom. Materiál a metódy Na analýzy bolo vybraných 15 rozmanitých druhov dovezených gréckych syrov a 13 vzoriek slovenských syrov zakúpených v obchodnej sieti v Košiciach. Výber tvorili syry z rôznych druhov mlieka a pochádzali z rôznych regiónov Grécka. K nim bola zvolená podobná škála typických slovenských syrov. V práci boli porovnávané hodnoty obsahu sušiny, vody, tuku, tuku v sušine, ph, vodná aktivita, obsah soli a farba syrov. Analyzované boli vždy dve vzorky, ktoré boli spracované v dvoch paralelkách. Sušina v syroch bola stanovená sušením do konštantnej hmotnosti pri 102 C (±2 C). 7 Tuk bol analyzovaný Gerberovou butyrometrickou metódou, so bola stanovená argentometricky pod a Mohra. 8 Na meranie vodnej aktivity bol použitý prístroj LabMaster. 9 Farba syrov bola vyjadrená v CieLab škále pomocou parametrov L* a* b*, ktoré boli namerané kolorimetrom CM

202 Tabulka Preh ad analyzovaných druhov syrov Slovenské syry Grécke syry 1 Karpatský bochník zrejúci Graviera z Kréty 2 Vrchár jemný a ovocný Mastelo z Chiosu 3 Záhorácky syr Havran Ementaler Ladotiri z Mytilini 4 Vršatec Feta ov ia 5 Slovenský biely syr Feta kozia 6 Mlie na kocka Chaloumi monastiriou 7 Kozí syr erstvý s pažítkou Chaloumi syr kozí a ov í 8 Ov í syr erstvý s pažítkou Tiraki Tiniako 9 Ov í syr zrejúci Kaseri z Mitilini 10 Kaškaval kravský neúdený Touloumotyri 11 Tekovský salámový syr Suchá Mizithra z Kréty 12 Parenica zo Zázrivej Pecorino Karali 13 Zrejúci Záhorácky syr Havran Gaviera z Tinosu 14 Kefalotiri Karali z Epirus 15 Katiki Domokou Výsledky a diskusia Porovnaním získaných výsledkov boli zistené ur ité odlišnosti. V hodnotení farebných parametrov (grafy ozna ené ako obrázok 1) boli minimálne rozdiely v parametri L* v jasnosti. (Priemerná hodnota L* v slovenských syroch 87,24 s rozpätím od 76,47 do 94,97; v gréckych syroch priemerná hodnota 87,73 s rozpätím od 79,87 do 94,08). V gréckych syroch prevažujú syry z kozieho a ov ieho mlieka o možno vidie hlavne na parametroch a* a b* ( ervená a žltá farba), ktoré majú výrazne nižšie hodnoty v porovnaní so slovenskými syrmi, v ktorých je zastúpenie ov ích a kozích syrov nižšie (priemerná hodnota a* v slovenských syroch bola -1,96 s rozpätím od -5,18 do 2,92; v gréckych syroch priemerná hodnota a* -3,18 s rozpätím od -5,76 do 1,55; priemerná hodnota b* v slovenských syroch bola 24,13 s rozpätím od 13,61 do 34,96; v gréckych syroch priemerná hodnota b* 20,40 s rozpätím od 11,91 do 30,67). 11 Porovnaním základných fyzikálno chemických parametrov sa zistilo, že priemerné hodnoty sušiny a tuku boli nižšie v slovenských syroch (grafy na obrázku 2). (Priemer sušiny v slovenských syroch bol 51,37 % s rozpätím od 30,38 do 67,39 %; v gréckych bola sušina 58,87 % s rozsahom 26,40 až 76 %; obsah tuku v slovenských 25,73 s rozsahom od 14 do 37%; v gréckych bol priemerný obsah celkového tuku v syre 30,20 % s rozpätím od 12 do 43,5 %). Ke že boli slovenské syry celkovo menej vyzreté, mali aj nižší priemerný obsah soli 2,44 % v porovnaní s 2,82 % v gréckych syroch. (V slovenských však bolo rozpätie obsahu soli širšie, od 0,17 % v Mlie nej kocke do 5,6 % v Slovenskom bielom syre). Naproti tomu ve mi podobné výsledky boli v priemerných hodnotách obsahu tuku v sušine a ph (grafy na obrázku 3 a 4), kde mala priemerná hodnota obsahu tuku v sušine v slovenských syroch 50,06% a v gréckych bola 51,19 %. Priemerná hodnota ph v slovenských syroch dosiahla 5,30, v gréckych bolo priemerné ph 5,24. Najmarkantnejšie rozdiely však boli zistené v hodnotách vodnej aktivity. Priemerná hodnota a w v gréckych syroch bola 0,851 (s rozsahom od 0,799 do 0,889), zatia o v slovenských syroch bol priemer a w bol 0,913 (s rozsahom od 0,858 do 0,943). 202

203 100 L* Slov L* Gr 4 a* Slov a* Gr 40 b* Slov b* Gr average min max -8 average min max 0 average min max Obr. 1. Porovnanie priemerných hodnôt farebných charakteristík L* a* b* v syroch % sušina slov % sušina gr % tuk slov % tuk gr average min max average min max Obr. 2. Porovnanie priemerných hodnôt obsahu sušiny a obsahu tuku v syroch % TVS slov % TVS gr 6 % NaCl slov % NaCl gr average min max average min max Obr. 3. Porovnanie priemerných hodnôt tuku v sušine a obsahu NaCl v syroch 7 1,00 ph Slov ph Gr aw Slov aw Gr 6 0,95 5 0,90 4 0,85 3 0, ,75 0 0,70 average min max average min max Obr. 4. Porovnanie priemerných hodnôt ph a aktivity vody v syroch 203

204 Záver V práci boli porovnávané rôzne druhy slovenských a gréckych syrov. Napriek tomu možno zovšeobecni, že popri ve mi podobných priemerných hodnotách obsahu tuku v sušine a hodnotách ph sú v slovenských syroch nižšie priemerné hodnoty obsahu sušiny, obsahu celkového tuku aj NaCl. Odlišnosti boli zistené aj vo farbe. V gréckych syroch prevažujú syry z kozieho a ov ieho mlieka o možno vidie hlavne na parametroch a* a b* ( ervená a žltá farba), ktoré majú výrazne nižšie hodnoty v porovnaní so slovenskými syrmi, v ktorých je zastúpenie ov ích a kozích syrov nižšie. Najmarkantnejšie rozdiely však boli zistené v hodnotách vodnej aktivity. Priemerná hodnota a w v gréckych syroch bola 0,851 (s rozsahom od 0,799 do 0,889), zatia o v slovenských syroch bol priemer a w 0,913 (s rozsahom od 0,858 do 0,943). Nízke hodnoty vodnej aktivity zabezpe ujú vyššiu trvanlivos gréckych syrov. Po akovanie: Práca bola podporená grantom KEGA 005-UVLF-4/2015 Použitá literatúra: 1. Keresteš, J.: Syry, výživa a zdravie. Eminent, 2007, 176 pp. 2. Semjon, B., Ma a, P., Ma ová, J.: Kvalitatívne hodnotenie syrov z nízkodohrievanej syreniny po as skladovania. Slovenský veterinársky asopis. ISSN , 2015, 40, p Panagou, E.Z., Nychas, G.J.E., Sofos. J.N.: Types of traditional Greek foods and their safety. Food Control, 2013, 29, p Pappa, E.C., Kandarakis, I.G., Anifantakis, E.M., Zerfiridis, G.K.: Influence of types of milk and culture on the manufacturing practices, composition and sensory characteristics of Teleme during ripening. Food Control, 2006, 17, p Eurostas, 2014, Retrieved: , 6. Canadian Dairy Information Centre: Total and Retail Cheese Consumption Kilograms per Capita Retrieved: , 7. STN :1965/Z6 (570107) Methods of test for cheese, curds, creams and spreads. Publication date: Ardö, Y., Polychroniadou, A.: Laboratory manual for chemical analysis of cheese. COST 95. Improvement of the quality of the production of raw milk cheeses. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 1999, ISBN , 144 pp. 9. Zigerlig, C.: Water in dairy products with special reference on cheese products Retrieved: , KONICA MINOLTA: Accurate communication of colour, KONICA MINOLTA SENSING, INC., (preklad pre PRAGOLAB: JanVšianský), 2006, 62 pp. 11. Buffa, M., Trujillo, A.J., Pavia, M., Guamis, B.: Changes in textural, microstructural, and colour characteristics during ripening of cheeses made from raw, pasteurized or high-pressure-treated goats milk. Int. Dairy J., 2001, 11, p Kontaktní adresa: RNDr. Zuzana Di áková, PhD., Katedra hygieny a technológie potravín, Ústav hygieny a technológie mlieka, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, Košice, Slovenská republika, zuzana.dicakova@uvlf.sk 204

205 VISKOELASTICKÉ VLASTNOSTI A MIKROSTRUKTURA TAVENÝCH SÝR S R ZNÝM OBSAHEM SUŠINY A TUKU V SUŠIN erníková Michaela 1, ihá ková Lada 1, Salek Richardos Nikolaos 1, Nebesá ová Jana 2, Bu ka František 1 1 Univerzita Tomáše Bati ve Zlín, Fakulta technologická, Ústav technologie potravin, 2 Biologické centrum Akademie v d eské republiky, Parazitologický ústav, Laborato elektronové mikroskopie Viscoelastic properties and microstructure of processed cheeses with different dry matter and fat in dry matter content Summary: Viscoelastic properties of model processed cheeses with dry matter content 35 and 45 % (w/w) and with fat in dry matter content 40 and 50 % (w/w) were studied. Followed parameters storage (G ) and loss (G ) modulus in frequency Hz were studied. Strength of gel (A F ) and interaction factor (z) were calculated using Winter model of critical gel. Measurement was supported by microstructure of model processed cheeses. In model samples with higher dry matter content, values of storage and loss moduli were significantly higher in comparison with samples with lower dry matter content (regardless fat in dry matter content) in all frequency range. Intersection point of both curves (G and G ) was focused in higher frequencies by processed cheese with higher fat in dry matter content. Higher dry matter content and lower fat in dry matter content led to development of stronger gel and therefore the product with lower spreadable consistency was obtained. Strength of gel A F and also the parameter z of model processed cheese was significantly (P<0.05) higher in samples with increased dry matter content and with decreased fat of dry matter content. Increasing strength of gel was explained by increasing number of intermolecular interactions in three-dimensional processed cheese system. Úvod Tavené sýry jsou definovány vyhláškou Ministerstva zem d lství. 77/2003 Sb. jako sýry, které jsou tepeln upraveny za p ídavku tavicích solí 1. Vedle r zných druh p írodních sýr a tavicích solí se k výrob tavených sýr používají máslo, voda, dále lze využít tvaroh, smetanu a jiné mlé né i nemlé né suroviny. Konzistence tavených sýr je ovlivn na r znými faktory. Jedním z nich je surovinová skladba, resp. složení a zralost použitých p írodních sýr, obsah sušiny p i konstantním obsahu tuku v sušin, obsah tuku v sušin p i konstantním obsahu sušiny 2,3. Vliv na konzistenci mají také použité tavicí soli, resp. jejich kombinace 4,5 a také použité potraviná ské p ídatné látky (nap. karagenan i pektin) 6,7. Dalšími faktory majícími vliv na konzistenci tavených sýr jsou technologie výroby, p edevším procesní parametry a zp sob chlazení vyrobených tavených sýr 8. Obdobnými faktory je ovlivn na také mikrostruktura tavených sýr, která však není u všech faktor, které ji mohou ovliv ovat popsána. Cílem práce bylo porovnat výsledky dynamické oscila ní reometrie s mikrostrukturou tavených sýr v závislosti na obsahu sušiny a tuku v sušin. Materiál a metodika Tavené sýry s obsahem sušiny 35 a 45 % (w/w) a obsahy 40 a 50 % (w/w) tuku v sušin byly vyráb ny na za ízení Stephan UMC-5 (Stehpan Machinery GmbH, Halmen, Germeny). Tavení probíhalo do teploty 85 C s výdrží jedné minuty. Horká tavenina byla nadávkována do vani ek a uzav ena p iva itelným ví kem. Vzorky byly zchlazeny a skladovány p i teplot 6 ± 2 C po dobu 14 dní do provedení jednotlivých analýz. Vzorky byly podrobeny základní chemické analýze (stanovení ph a obsahu sušiny), dynamické oscila ní reometrii a skenovací elektronové mikroskopii. Hodnoty ph byly m eny p i laboratorní teplot (20 ± 2 C) vpichovým ph metrem (phspear, Eutech instrument, Oakton, Malaysia). Sušina byla stanovena dle SN ISO Viskoelastické vlastnosti byly charakterizovány pomocí rota ního viskozimetru HAAKE 205

206 RheoStress 1 (Thermo Scientific, Czech republic). M ení byla provád na v rozsahu frekvencí 0,01 až 100,00 Hz, v oblasti lineární viskoelasticity s amplitudou smykového nap tí 20 Pa v geometrii deska-deska o pr m ru 35 mm a velikosti št rbiny 1 mm. Na základ m ených parametr elastického (G ) a ztrátového (G ) modulu pružnosti byl vypo ten komplexní modul pružnosti (G*). Pomocí Winterova modelu kritického gelu byla modelována pevnost gelu A F a hodnota z, vyjad ující po et vzájemn interagujících strukturálních jednotek 10,11 (kde reprezentuje použitou frekvenci p i m ení): 1/ z G *( ) Hodnoty uvedených parametr byly získány metodou nejmenších tverc programem Microsoft Ofice Excell (Microsoft Corporation, USA). Výsledky hodnot A F a z byly statisticky srovnávány Wilcoxonovým testem na hladin významnosti = 0, Skenovací elektronová mikroskopie byla provád na po chemické p íprav vzork tavených sýr na skenovacím elektronovém mikroskopu Jeol JSM-7401F (Jeol, UK) na pracovišti Laborato e elektronové mikroskopie Parazitologického ústavu Biologického centra AV R v eských Bud jovicích. P íprava vzork chemickou cestou zahrnovala fixaci v 3,0% roztoku glutaraldehydu, postfixaci 2,0 % oxidem osmi elým, odvodn ní vzorku rostoucí koncentrací etanolu, sušení metodou ke kritickému bodu. P ed vlastním vložením vzork do komory mikroskopu byly tyto pokoveny 20nm vrstvou zlata. Výsledky a diskuze Výsledky základní chemické analýzy potvrdily srovnatelnost jednotlivých vzork tavených sýr. Obsah sušiny se lišil dle požadované hodnoty. Pro vzorky s vypo teným obsahem sušiny 35 % byl reáln zjišt n obsah 36,09 36,80 % (w/w), pro tavené sýry s p edpokládaným obsahem sušiny 45 % (w/w) byla stanovena hodnota sušiny v rozsahu 45,21 46,16 % (w/w). Hodnoty ph jsou pro p ehlednost uvedeny v Tabulce I. Hodnoty elastického (G ) a ztrátového (G ) modulu pružnosti jsou vyneseny do grafu a prezentovány na Obr. 1. Na základ výsledk dynamické oscila ní reometrie lze íci, že hodnoty elastického a ztrátového modulu pružnosti jsou ve zkoumaném rozsahu frekvencí signifikantn (P<0,05) vyšší u produkt s vyšším obsahem sušiny (Obr. 1. ást C, D) ve srovnání s tavenými sýry s nižším obsahem sušiny (Obr. 1. ást A, B). Dále je možné konstatovat, že tavené sýry s vyšším obsahem tuku v sušin (Obr. 1. ást B a D) mají významn (P<0,05) nižší hodnoty obou modul pružnosti v porovnání s výrobky s nižším obsahem tuku (Obr. 1. ást A a C). Elastický modul pružnosti dosahoval vyšších hodnot (P<0,05) než ztrátový modul pružnosti v celém testovaném rozsahu frekvencí u vzork s vyšším obsahem sušiny (bez ohledu na obsah tuku v sušin ). Z toho vyplývá výrazn vyšší podíl elastické (zásobní) složky G v porovnání se složkou ztrátovou G, což je naprosto typické pro hust provázané biopolymerní systémy 13. U tavených sýr s nižším obsahem sušiny dosahoval v nižších frekvencích vyšších hodnot naopak ztrátový modul pružnosti G (P<0,05). K obdobným záv r m došli také Lee a kol. (2105) 14. P edpokládá se, že je-li G > G (v ur itém rozsahu frekvencí, v tomto p ípad nižších) intermolekulární vazby ve zkoumané proteinové matrici (síti) mají v pr b hu oscila ního cyklu dostatek asu k oslabení. P i vyšších frekvencích již ale systém nemá dostatek asu k oslabení intermolekulárních vazeb, za ne se chovat více jako pevná látka (G < G ) 13. P i rostoucí frekvenci bylo u vzork s nižším 35% (w/w) obsahem sušiny zaznamenáno protnutí obou k ivek a hodnoty G p evýšily hodnoty G. Pr se ík obou k ivek (G a G ) byl pozorován ve vyšších frekvencích u taveného sýra s vyšším obsahem tuku v sušin. U vzork s vyšším 45% (w/w) obsahem sušiny k protnutí k ivek elastického a ztrátového modulu pružnosti ve sledovaném rozsahu frekvencí nedošlo. Protnutí G a G by v tomto p ípad bylo možné o ekávat v mnohem nižších než námi sledovaných frekvencí. Z t chto poznatk vyplývá, že vyšší obsah sušiny a nižší obsah tuku v sušin vede k získání pevn jšího gelu a tím k produktu s tužší a mén roztíratelnou konzistencí 15. Uvedené informace lze podpo it i vypo tenými hodnotami parametr A F a z (Tab. I). Se zvyšujícím se obsahem sušiny a se snižujícím se obsahem tuku v sušin signifikantn rostla pevnost gelu A F modelových tavených sýr 206 A F

207 (P<0,05) a zárove rostl parametr z (P<0,05), který vypovídá o po tu strukturních jednotek vzájemn interagujících v proteinové síti, resp. o po tu intermolekulárních vazeb mezi bílkovinami. Zvyšující se pevnost gelu tak byla pravd podobn dána zvyšujícím se po tem interakcí ve studovaném trojrozm rném systému 7,13. Obr. 1. Závislost elastického (G ; plné symboly) a ztrátového (G ; prázdné symboly) modulu pružnosti modelových tavených sýr na frekvenci. ást A: modelové vzorky s 35 % (w/w) obsahu sušiny a 40 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást B modelové vzorky s 35 % (w/w) obsahu sušiny a 50 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást C modelové vzorky s 45 % (w/w) obsahu sušiny a 40 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást D modelové vzorky s 45 % (w/w) obsahu sušiny a 50 % (w/w) obsahu tuku v sušin. Tabulka I Hodnoty pevnosti gelu (A F ; Pa s 1/z ) a interak ního faktoru (z; -) modelových tavených sýr Obsah sušiny (% (w/w)) Obsah tuku v sušin (% (w/w)) ph (aritmetický pr m r ± sm rodatná odchylka) A F (Pa s 1/z ) z (-) ,77 ± 0, ,2 ± 221,8 3,01 ± 0, ,05 ± 0, ,5 ± 79,7 2,26 ± 0, ,71 ± 0, ,1 ± 3390,6 5,14 ± 0, ,97 ± 0, ,3 ± 849,6 4,39 ± 0,19 Výsledky dynamické oscila ní reometrie lze krom hodnot pevnosti gelu A F a faktoru z, podpo it také studiem mikrostruktury vzork modelových tavených sýr. Mikrostruktura jednotlivých typ modelových tavených sýr je prezentována na Obr. 2, tak aby systém azení snímk korespondoval s výsledky viskoelastických vlastností modelových tavených sýr prezentovaných na Obr. 1. Z uvedených mikrofotografií je viditelné, že s rostoucím obsahem tuku v sušin (p i konstantním obsahu sušiny) se zvyšuje pr m r tukových kuli ek a snižuje se jejich po et. Zárove klesá relativní množství bílkovin v systému. U studovaných modelových tavených 207

208 sýr lze analýzou jejich surovinové skladby uvést, že pom r bílkovin a tuku byl u výrobk s 40 % (w/w) obsahu TVS ~ 1,0:0,8 a v p ípad produkt s 50 % (w/w) obsahu TVS ~ 1,0:1,3. Vzhledem k faktu, že bílkoviny (kaseiny) jsou hlavním emulgátorem v této síti, pak jejich nižší relativní množství zp sobí nižší stupe emulgace tuku, který se projeví zv tšením pr m ru tukových kuli ek. V tší tukové kuli ky jsou pak schopny mnohem více porušit kontinuitu proteinové matrice (m k í, roztírateln jší tavený sýr) ve srovnání s v tším po tem menších tukových kuli ek, kdy se tavený sýr se jeví pevn jší a h e roztíratelný 8,16,17. P i konstantním obsahu tuku v sušin dochází p i zvyšování obsahu sušiny (v daném p ípad p i absenci p ídavku jiných složek, než p írodní sýry) k navýšení množství p ítomných protein, které zvyšují emulga ní schopnost systému, což se projevilo zmenšením pr m ru tukových kuli ek (Obr. 2 ást C a D, v porovnání s ástí A a B). Obdobn prokázali vliv zvyšující se koncentrace proteinu na snižování velikosti tukových kuli ek v tavených sýrech Lee a kol. 14. Navíc lze p edpokládat, že v tší po et strukturních jednotek kasein rovn ž vytvo í hustší proteinovou sí a zvýší se po et interakcí mezi jednotlivými et zci protein. Tento p edpoklad lze jednozna n podpo it zjišt nými hodnotami pevnosti gelu A F a interak ním faktorem z studovaných tavených sýr (viz výše). Oprávn nost záv r této práce lze podpo it i n kterými, dosud publikovanými pracemi, které rovn ž uvádí, že se zvyšujícím se obsahem sušiny a snižujícím se obsahem tuku v sušin roste tuhost tavených sýr 2,8. Obr. 2. Mikrostruktura modelových tavených sýr, p i zv tšení 5000 krát. ást A: modelové vzorky s 35 % (w/w) obsahu sušiny a 40 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást B: modelové vzorky s 35 % (w/w) obsahu sušiny a 50 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást C: modelové vzorky s 45 % (w/w) obsahu sušiny a 40 % (w/w) obsahu tuku v sušin ; ást D: modelové vzorky s 45 % (w/w) obsahu sušiny a 50 % (w/w) obsahu tuku v sušin. 208

209 Záv r Z m ení viskoelastických vlastností vyplynulo, že nejtužší a nejmén roztíratelnou konzistenci vykazoval tavený sýr s vyšším 45% (w/w) obsahem sušiny a zárove nižším obsahem tuku v sušin 40 % (w/w). Naopak nejmén pevný a nejlépe roztíratelný byl tavený sýr s nižším obsahem sušiny a zárove vyšším obsahem tuku v sušin (tavený sýr s 35 % (w/w) sušiny a 50 % (w/w) tuku v sušin ). Výsledky m ení viskoelastických vlastností korelovaly s hodnocením mikrostruktury tavených sýr. Ze získaných snímk bylo z ejmé, že se zvyšujícím se obsahem tuku v sušin obsahoval tavený sýr v tší tukové kuli ky (p i stejném obsahu sušiny). Se zvyšujícím se obsahem sušiny taveného sýra se naopak velikost tukových kuli ek snižovala. Pod kování: Práce byla podpo ena projektem Interní grantové agentury Univerzity Tomáše Bati ve Zlín (IGA/FT/2016/003) financovaného ze zdroj specifického výzkumu univerzity. Použitá literatura: 1. eská republika. Vyhláška 77/2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mlé né výrobky, mražené krémy, jedlé tuky a oleje. In: Sbírka zákon GUINEE, T. P., CARI, M., KALÁB, M. Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese products. Cheese: Chemistry, Physics and Mircobiology (eds FOX, P.F., McSWEENEY, P. L. H., COGAN, T. M., GUINEE, T. P.) Volume 2: Major cheese groups. 3rd ed. London: Elsevier Applied Science. 2004, BU KA, F., DOUDOVÁ, L., WEISEROVÁ, E., KUCHA, D., PONÍŽIL, P., ZA ALOVÁ, D., NAGYOVÁ, G., PACHLOVÁ, V., MICHÁLEK, J. The effect of ternary emulsifying salt composition and cheese maturity on the textural properties of processed cheese. International Dairy Journal, 2013, 29, 1, NAGYOVÁ, G., BU KA, F., SALEK, R. N., ERNÍKOVÁ, M., MAN ÍK, P., GR BER, T., KUCHA, D. Use of sodium polyphosphates with different linear lengths in the production of spreadable processed cheese. Journal of Dairy Science, 2014, 97, SALEK, R. N., ERNÍKOVÁ, M., NAGYOVÁ, G., KUCHA, D., BA OVÁ, H., MINAR ÍKOVÁ, L., BU KA, F. The effect of composition of ternary mixtures containing phosphate and citrate emulsifying salts on selected textural properties of spreadable processed cheese. International Dairy Journal, 2015, 44, ERNÍKOVÁ, M., BU KA, F., PAVLÍNEK, V., B EZINA, P., HRAB, J., VALÁŠEK, P. Effect of carrageenan type on viscoelastic properties of processed cheese. Food Hydrocolloids. 2008, 22, MACK, I., BU KA, F., PAVLÍNEK, V., LECIÁNOVÁ, P., HRAB, J. The effect of pectin concentration on viscoelastic and sensory properties of processed cheese. International Journal of Food Sciece and Technology, 2008, 43, KAPOOR, R. a L. E. METZGER. Process Cheese: Scientific and technological aspects A review. Comprehensive review in Food Science and Food Safety. 2008, vol. 7, p ANONYM. SN ISO 5534, Sýry a tavené sýry Stanovení obsahu celkové sušiny (Referen ní metoda). Praha: eský normaliza ní institut. 10. WINTER, H. H. a F. CHAMBON. Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point. Journal of Rheology, 1986, 30, MARTÍNEZ-RUVALCABA, A., E. CHORNET a D. RODRIGUE (). Viscoelastic properties of dispersed chitosan/xanthan hydrogels. Carbohydrate Polymers. 2007, 67, K ÍŽ, O., BU KA, F. a HRAB, J. Senzorická analýza potravin II. Statistické metody [skripta]. 1. vyd. Zlín: UTB, 2007, 127 s. ISBN CUNHA, C. R., R. GRIMALDI, M. R. ALCANTARA a W. H. VIOTTO. Effect of the type of fat on rheology, functional properties and sensory acceptance of spreadable cheese analogue. International Journal of Dairy Technology, 2013, 66, 1,

210 14. LEE, S. K., KLOSTERMAYER, H., SKELTE, G.A. Effect of fat and protein-in-water concentration on the properties of modell processed cheese. International Dairy Journal. 2015, 50, GUINEE, T. P., O CALLAGHAN, D. J. Effect of increasing the protein-to-fat ratio and reducing fat content on the chemical and physical properties of processed cheese product. Journal of Dairy Science. 2013, 96, LEE, S. K., R. J. BUWALDA, S. R. EUSTON, E. A. FOEGEDING a A. B. McKENA (2003). Changes in the rheology and microstructure of processed cheese during cooking. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 36, NORONHA, N., E. D. O RIORDAN a M. O SULLIVAN (2008). Influence of pro-cessing parameters on the texture and microstructure of imitation cheese. European Food Research and Technology, 226, Kontaktní adresa: MVDr. Michaela erníková, Ph.D. Ústav technologie potravin, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín, nám. T. G. Masaryka 5555, Zlín, tel , cernikova@ft.utb.cz 210

211 MOŽNOSTI OPTIMALIZACE BALENÍ SÝR EIDAMSKÉHO A EMENTÁLSKÉHO TYPU V MODIFIKOVANÉ ATMOSFÉ E Vápenka Lukáš, Anna Slezáková, Šviráková Eva Ústav konzervace potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Optimisation options for packaging of Edam and Emmentaler types of cheeses in modified atmosphere Summary: This study was focused on the current state of the systems using of modified atmosphere packaging for cheeses, description of present issue in the Czech Republic and design of possibilities for packaging cheeses in order to selection of polymer films and modified atmosphere gas composition in a package. Conditions of commercially packaged Emmentaler type of cheeses and Edam type of cheeses were studied according to functional parameters (oxygen permeability of a film) and the composition of atmosphere inside the package. For optimization of packaging was used three types of films: polyamide/aluminium/polyethylene terephthalate; polyamide/polyethylene; polyethylene films and four types of modified atmosphere: % CO 2 /N 2 = 20/80; 50/50; 80/20; 100/0. The PA/PE film was the most suitable film for packaging of sliced Edam and Emmentaler types of cheeses was selected. The cheeses from the PA/PE packaging contained from (100 % of carbon dioxide in modified atmosphere) to CFU g -1 (20 % of carbon dioxide in modified atmosphere). Obtained results can be applied in different branches in food industry. Balení v modifikované atmosfé e (MA), které p isp lo k významnému rozvoji syntetických polymerních obalových materiál, pat í již n kolik desítek let k b žn využívaným systém m balení umož ujících významné prodloužení trvanlivosti balených výrobk v rámci tzv. p ekážkového efektu 1,2. V praxi je tento systém balení asto aplikován bez p edchozí optimalizace a to pouze na základ doporu ení dodavatele této technologie do potraviná ského podniku. V p ípadech balení opracovaných potravin m že v rámci t chto doporu ení docházet k realizaci balení, která využívají p edimenzované obaly a to p edevším z hlediska jejich bariérových vlastností, jenž následn zvyšují cenu použitého obalového materiálu 3. Pro balení plátkovaných sýr v MA jsou využívány výhradn sm sné atmosféry N 2 a CO 2 eliminující p ístup O 2 k baleným plátk m sýru, které jsou náchylné na r st plísní jakožto striktních aerob 4. Aplikací CO 2 dochází zárove k áste nému potla ení r stu p ítomných mikroorganism. Ústav konzervace potravin Vysoké školy chemicko-technologické v Praze se touto problematikou zabývá již více než 15 let. Optimalizace balení sýr v modifikované atmosfé e je komplexní problém zahrnující adu faktor. Krom funk ních parametr obalu, tj. volby obalového materiálu s vhodnou propustností pro plyny a vlhkost, jeho rozm r a volby pom ru mezi vnit ním objemem atd., je z uvedeného pohledu významná i zdravotní bezpe nost a jakost baleného sýru, v etn hygienické úrovn výrobního provozu a další. Materiály a metody Pr zkum trhu V tržní síti bylo zakoupeno 10 vzork plátkovaného sýru eidamského typu (typ plastová miska p ekrytá m kkou fólií: 8 vzork ; typ sá ek z m kké fólie: 2 balení a 10 vzork plátkovaného sýru ementálského typu (pouze typ miska p ekrytá m kkou fólií). Zakoupeny byly pouze výrobky balené v ochranné atmosfé e. Integrita každého zakoupeného balení byla kontrolována p ístrojem Leak Pointer (PBI Dansensor A/S, Dánsko). Složení modifikované atmosféry zakoupených vzork bylo zm eno na p ístroji Check Mate II 9900 (PBI Dansensor A/S, Dánsko). Propustnost m kkých vrchních fólií pro O 2 byla m ena na p ístroji OX-TRAN 2/20 MH (Mocon Inc., USA), p i teplot 23 C a relativní vlhkosti (RH) 75 %. 211

212 Vliv systému balení v MA na kvalitu skladovaných sýr Obaly pro testování Vrstvená fólie typu PET/Al/PE (polyethylentereftalát, hliník, polyethylen), tlouš ka: 120 μm, propustnost pro O 2 : < 0,5 ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 p i 75% RH a teplot 23 C, výrobce neznámý. Vrstvená fólie typu PA/PE (polyamid/polyethylen), tlouš ka: 50 μm, propustnost pro O 2 : 44,2 ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 p i 75 % RH a teplot 23 C, výrobce neznámý. Polyetylenová fólie (PE), tlouš ka: 117 μm, propustnost pro O 2 : 1642 ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 p i 75 % RH a teplot 23 C, výrobce: neznámý. Kombinace MA (složení atmosfér jsou vyjad ována jako objemový podíl v %) Eidamský typ: % CO 2 /N 2 : 20/80; 50/50; 100/0. Ementálský typ: % CO 2 /N 2 : 20/80; 80/20; 100/0. Vzorky sýr (ementálského a eidamského typu dodaných od výrobce) byly za sterilních podmínek zabaleny do p íslušných obalových materiál (eidamský typ: dva obaly typu PET/Al/PE a PE; ementálský typ: t i obaly typu PET/Al/PE, PA/PE a PE) s danými kombinacemi MA na bali ce S-100 DGT (Tecnovac, Itálie) se sm šova em plyn MAP Mix 9000 (PBI Dansensor A/S, Dánsko). Integrita, složení MA a propustnost obal byla testována stejným zp sobem jako p i pr zkumu trhu. Z mikrobiologických stanovení bylo provedeno stanovení po tu kvasinek a plísní na chloramfenikolovém agar s dichloranem a bengálskou ervení (DRBC) za podmínek kultivace: teplota 25 C ± 1 C po dobu 5 dní, aerobn ( SN ISO ). P íprava mikrobiologických roztok a p d byla provedena dle SN EN ISO Senzorické hodnocení vlivu 100% atmosféry CO 2 provedlo 18 hodnotitel tzv. trojúhelníkovou zkouškou proti sýr m zabaleným v atmosfé e s 50 % CO 2. Panel hodnotitel se skládal z 10 žen a 8 muž ve v ku od 23 do 32 let. Výsledky senzorické zkoušky byly vyhodnoceny dle normy SN EN ISO Výsledky Výsledky pr zkumu trhu jsou uvedeny v tabulce I a II. Na základ provedeného pr zkumu bylo zjišt no, že pro balení plátkovaných sýr eidamského typu jsou používány fólie s propustnostmi pro O 2 v rozmezí od 8,8 do 63 ml m -2 d -1 0,1MPa -1 a atmosféry s obsahem CO 2 od 20,0 do 52,2 %. V p ípad sýr ementálského typu byly propustnosti použitých fólií v rozmezí od 4,8 do 113 ml m -2 d -1 0,1MPa -1 a zm ené obsahy CO2 se pohybovali od 14 do 77 %. U žádného z balení nebyla porušena integrita obalu. U sýr eidamského typu byla pro dv balení (vzorek 3 a 9) významn se odlišující v propustnosti pro O 2 od ostatních fólií. Uvedené fólie m li excelentní bariérové vlastnosti proti pronikání O 2, p i emž konstrukce t chto obal m že být neekonomická z d vodu použití zbyte n drahého obalového materiálu s velmi nízkou propustností. Naproti tomu u jiných balení (vzorek 2 v tabulce II) je možné pochybovat o jejich ú innosti s ohledem na naopak velmi vysokou propustnost obalu pro O 2. V baleních sýr ementálského typu nebyl O 2 p ítomen, s výjimkou již zmín ného vzorku 2, kde byl nam eno residuální množství 0,1 % O 2. Vzorek 2 byl výjime ný i vzhledem k nejnižší koncentraci CO 2 (19,7 %) a vysoké koncentraci N 2. Nízký obsah O 2 neodpovídající vysoké propustnosti obalu lze p i ítat jeho možné spot eb p ítomnou mikroflórou nebo oxidací složek sýru. Z výsledk je dále patrné, že u výrobk balených do fólií o vysoké propustnosti pro plyny se vyskytovala nižší koncentrace CO 2, ten se totiž mohl snadn ji uvol ovat do okolí. Výsledky stanovení zm n složení MA, zjišt ného po tu kvasinek a plísní v pr b hu 4týdenního skladování balených sýr, pro která byly použity t i typy obalových materiál o r zné propustnosti, jsou uvedeny na obrázcích 1 a

213 Tabulka I Zjišt né parametry balení sýr eidamského typu z pr zkumu trhu. íslo vzorku Integrita obalu Tlouš ka fólie (μm) Složení MAP Propustnost a O 2 CO 2 N 2 O 2 (%) (%) (%) (ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 ) ,5 0,0 41,5 58,4 45, ,1 0,0 52,2 47,8 47, ,2 0,0 20,0 80,0 2, ,8 0,0 35,7 64,3 26, ,8 0,0 37,5 62,5 56, ,6 0,0 43,9 56,1 35, ,4 0,0 34,5 66,0 60, ,8 0,0 32,4 67,6 45, ,2 0,0 23,3 76,7 8, ,4 0,0 35,9 64,1 63,2 + ozna uje, že integrita obalu z stala neporušena a propustnost m kké vrchní m kké fólie Tabulka II Zjišt né parametry balení sýr ementálského typu z pr zkumu trhu. íslo vzorku Integrita obalu Složení MAP Propustnost a Tlouš ka fólie O 2 CO 2 N 2 O 2 (μm) (%) (%) (%) (ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 ) ,1 0,0 50,0 50,0 7, ,4 0,1 19,7 80,2 113, ,3 0,0 45,0 55,0 36, ,9 0,0 60,3 39,6 14, ,6 0,0 45,4 54,6 35, ,6 0,0 52,0 48,0 35, ,4 0,0 77,0 23,0 4, ,6 1,5 14,0 84,5 103, ,4 0,0 66,2 33,8 36, ,6 0,6 25,2 74,3 49,2 + ozna uje, že integrita obalu z stala neporušena a propustnost vrchní m kké fólie Z hlediska zm n složení atmosféry docházelo u balení PET/Al/PE a PA/PE k zachování podobného složení atmosféry v porovnání s po áte ním složením MA po celou dobu skladovacího pokusu. Oba typy balení taktéž vykazovaly podobné inhibi ní ú inky na r st kvasinek a plísní. U obou typ balení bylo tedy dosaženo podobných ú ink na balenou potravinu i p es to, že obal s vrstvou hliníku je absolutní bariérou pro permanentní plyny, aromatické látky a vlhkost. Cena obalových materiál na bázi polymer s bariérovými vlastnostmi podobnými materiál m s hliníkovou vrstvou je však p íliš vysoká. Dosta ujícím obalem pro testované balení sýr ementálského typu v MA je tedy materiál PA/PE s propustností pro O 2 : 44,2 ml m -2 d -1 0,1 MPa -1 (p i 75 % RH a teplot 23 C). Jelikož pro balení eidamského typu nebyl obal z PA/PE testován, lze tvrdit, že obal z PET/Al/PE byl vyhovující a PE obal nevyhovující. Z výsledk dále vyplývá, že v p ípad balení sýr do 100% atmosféry CO 2 dochází ihned po zabalení k ustálení vnit ní atmosféry, která neodpovídá 100 % CO 2. Tento jev byl zp soben p edevším rozpušt ním ásti CO 2 ve výrobku. Použitá 100% atmosféra CO 2 u balených sýr zp sobila vznik tzv. pseudovakuového efektu, ke kterému došlo práv vlivem rozpoušt ní CO 2 a vyšší propustnosti obal pro CO 2 než pro ostatní permanentní plyny ve vzdušné atmosfé e. D sledkem toho je poklesu tlaku uvnit obalu a jeho následné smršt ní kolem výrobku, výrobek se poté jeví jako vakuov balený. V p ípad plátkovaných sýr je však toto vakuové 213

214 balení nežádoucí, protože nelze plátky sýru jednoduše odd lit. Nejvhodn jší složení MA bylo 50 % CO 2, 50 % N 2 pro sýr eidamského typu a 80 % CO 2, 20 % N 2 pro sýr ementálského typu. P i t chto MA byly po ty kvasinek a plísní nejnižší. Naproti tomu balení sýr v PE si nedokázala zachovat po áte ní složení atmosféry ani jeden týden. V d sledku t chto rychlých zm n MA byly na zabalených plátcích sýr viditelné nár sty vzdušných mycelií kontaminujících plísní. Z tohoto d vodu nebyla u t chto balení provedeno další mikrobiologické hodnocení. U testovaných balení z PE je dob e vid t (grafy se složením MA pro balení v PE na obrázcích 1 a 2), že k nár stu koncentrace O 2 na cca 20 % v balení došlo už po 1. týdnu skladování, ale následn se koncentrace O 2 snižovala k 10 %. Tento jev je zp sobený p edevším r stem plísní jakožto striktních aerob. Dochází k tomu tak, že O 2, který projde obalovým materiálem, je áste n spot ebován plísn mi nebo jinými aerobními mikroorganismy a jeho celková koncentrace se p i dalším skladování snižuje se zrychlujícím se r stem t chto mikroorganism. Znalost zmín ného jevu je velmi d ležitá p i prvotním posuzování p í iny znehodnocení výrobk balených v MA, u kterých se objevil nežádoucí r st plísní. Velmi asto se totiž provede u t chto výrobk kontrola složení MA atmosféry, p i emž není ve výrobku zjišt no významné množství O 2, které by vysv tlovalo nár st plísní. Tento stav je zp soben tím, že veškerý O 2, který obalem díky jeho propustnosti prochází, je spot ebován aerobními mikroorganismy. Modifikovaná atmosféra Modifikovaná atmosféra CO 2 /N 2 : 50/50 % CO 2 /N 2 : 100/0 % Koncentrace plynu v balení (%) PET/Al/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PET/Al/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PE Doba skladování (týdny) log (KTJ g -1 ) 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Po ty kvasinek a plísní (suma) 3,2 2,6 2,9 2,6 3, Doba skladování (týdny) Obal typu PET/Al/PE log (KTJ g -1 ) 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Po ty kvasinek a plísní (suma) 3,8 2,9 2,5 2,6 1, Délka skladování (týdny) Obal typu PET/Al/PE kyslík (%) oxid uhli itý (%) dusík (%) Obr. 1. Pr b h zm n složení MA a po tu kvasinek a plísní b hem skladování sýr eidamského typu ve dvou typech obal a ve dvou typech modifikovaných atmosfér p i teplot 5 C. 214

215 Modifikovaná atmosféra Modifikovaná atmosféra CO 2 /N 2 : 80/20 % CO 2 /N 2 : 100/0 % Koncentrace plynu v balení (%) PET/Al/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PET/Al/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PA/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PA/PE Doba skladování (týdny) Koncentrace plynu v balení (%) PE Koncentrace plynu v balení (%) PE Doba skladování (týdny) Doba skladování (týdny) 10,0 Po ty kvasinek a plísní (suma) 10,0 Po ty kvasinek a plísní (suma) 8,0 8,0 log (KTJ g -1 ) 6,0 4,0 2,0 4,8 4,5 4,6 4,3 4,1 4,2 4,1 3,7 3,5 4,3 log (KTJ g -1 ) 6,0 4,0 2,0 4,5 4,6 4,3 4,6 4,1 3,9 4,4 3,7 3,8 3,5 0, Doba skladování (týdny) obal typu PET/Al/PE obal typu PA/PE 0, Doba skladování (týdny) obal typu PET/Al/PE obal typu PA/PE kyslík (%) oxid uhli itý (%) dusík (%) Obr. 2. Pr b h zm n složení MA a po tu kvasinek a plísní b hem skladování sýr ementálského typu ve t ech typech obal a ve dvou r zných atmosférách N 2 a CO 2 p i teplot 5 C. Balení obou typ sýr v atmosfé e s 20 % CO 2 a 80 % N 2 vykazovala vyšší nár sty kvasinek a plísní. Po ty ech týdnech skladování dosahovaly tyto nár sty 1, KTJ/g sýru eidamského typu a 2, KTJ/g sýru ementálského typu. Použití tohoto složení MA atmosféry je pro testované typy sýru nevhodné. Z celkem 36 senzorických hodnocení bylo 20 odpov dí nesprávných a 16 správných. Dle tabelovaných hodnot z normy SN ISO pro hladinu pravd podobnosti 95 % bylo 16 správných odpov dí nedosta ujících pro potvrzení p edpokladu, že vzorky mezi sebou m ly po senzorické stránce rozdíly. O ekávaný rozdíl ve vzhledu i v ni nebyl panelem hodnotitel potvrzen. 215

216 Záv r U testovaných komer n vyráb ných vzork sýr ementálského a eidamského typu balených v modifikované atmosfé e byly nalezeny významné rozdíly v propustnosti obal pro O 2 sv d ící o tom, že n kte í výrobci patrn nepodstoupili náležitý vývoj a optimalizaci systému balení. Trvanlivost sýr byla ovlivn na propustností obalu pro plyny. Pro balení testovaných sýr ementálského typu vyhovovaly obaly s propustnostmi P < 50 ml m -2 d -1 0,1MPa -1 (75% relativní vlhkost, teplota 23 C). R st plísní a kvasinek byl do ur ité míry ovlivn n koncentrací CO 2 ve sm si atmosféry aplikované do okolí sýru v balení. Pro inhibici r stu nežádoucí mikroflóry byly ú inné atmosféry s obsahem 50 a více % CO 2. Balení atmosfé e 100% CO 2 neovlivnilo senzoriku balených sýr. Pod kování Tato práce byla financována z ú elové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT. 20/2015: A1_FPBT_2015_002). Auto i d kují spole nosti Madeta a. s. za podporu a spolupráci. Literatura 1. Ben-Yehoshua, S.; Beaudry, R. M.; Fishman, S.; Jayanty, S.; Mir, N. Modified Atmosphere Packaging and Controlled Atmosphere Storage. Environmentally Friendly Technologies for Agricultural Produce Quality; CRC Press:Boca Raton, 2005; str urda, D. Ochrana potravin obalem p ed zm nami vlhkosti. Balení potravin; SNTL: Praha, 1982; kap. 3.2, str Brody, A. L. Commercial uses of active food packaging and modified atmosphere packaging systems. Innovations in Food Packaging; Elsevier: London, 2005; kap. 25, str Khoshgozaran, S.; Azizi, M. H.; Fallah, N. B. Evaluating the effect of modified atmosphere packaging on cheese characteristic: a review. Dairy Science and Technology 2012, 92 (1), SN EN ISO Senzorická analýza - Metodologie - Trojúhelníková zkouška. Praha: Ú ad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, SN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení po tu kvasinek a plísní - ást 1: Technika po ítání kolonií u výrobk s aktivitou vody vyšší než 0,95. Praha: Ú ad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, SN EN ISO 7218 ZM NA A1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Všeobecné požadavky a doporu ení pro mikrobiologické zkoušení. Praha: Ú ad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, Kontaktní adresa Lukáš Vápenka, Ústav konzervace potravin, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 3, Praha 6 Dejvice, vapenkal@vscht.cz 216

217 P ÍPRAVA POTRAVINÁ SKÝCH EMULZÍ POMOCÍ CROSS-FLOW MEMBRÁNOVÉ JEDNOTKY Klojdová Iveta, Št tina Ji í Ústav mléka, tuk a kosmetiky, VŠCHT Praha Preparation of food emulsions by the cross-flow membrane unit Summary: In the membrane emulsification the dispersed phase is pressed through the pores of a microporous membrane, while the continuous phase flows along the membrane surface. Droplets grow at pore openings until, having reached a certain size (which is given by average of pores and interfacial tension), they detach. Surfactant molecules in the continuous face stabilize the newly formed interface. The membranes should be wetted preferably of the continual phase. The structure of the pores should be certain and simple. The distribution of the pores on the membrane surface should enable high production and prevent droplet coalescence. The membrane emulsification is relatively new method which is suitable technique primarily for pharmacy but it starts to use in the food industry too. The advantages of the membrane emulsification compare to conventional homogenisation are higher energy efficiency and better control of the droplet size. This work is focused on the experimental membrane emulsification unit of the TIA company (France). This unit is equipped with two ceramic membranes - the mebrane surface area is 0,1 m 2 and the pore size is 1,4 mm, containers for the dispersed phase (5 dm 3 ) and the continuous phase (10 dm 3 ). Circulation of the dispersed and the continuous phase ensure two pumps with adjustable flow rate dm 3 /h, labour pressure till 4 bar. Performance of this unit depend on viscosity of the dispersed phase, membrane and optimal conditions which are necessary to achievement required droplet size. Úvod Technologie p ímé membránové emulgace byla jako metoda k produkci emulzí a ástic vynalezena v roce 1988 v Japonsku, kdy na ni T. Nakajima a M. Shimizu získali patent. Objevení této metody p ineslo možnost p ípravy emulzí se stejnou velikostí kapek pomocí membrány s jednotnou velikostí pr m ru pór. Od té doby neustále roste zájem o tuto technologii, a to jak v oblasti v decké, tak i v pr myslu. Bylo ud leno mnoho dalších patent, které jsou spojeny p evážn s aplikacemi membránové emulgace p i p íprav specifických produkt jako jsou emulze v/o, o/v, v/o/v i nap íklad polymerních ástic (1). Pro p ípravu více etných emulzí se membránová emulgace používá ve v tším m ítku asi posledních 15 let (2). I v sou asné dob zaujímá Japonsko vedoucí pozici v po tu patent (41%), následuje ína (31%), kde ke zna nému rozvoji technologie a zvýšení po tu patent došlo p evážn v posledních 10 letech. V Evrop byl první patent ud len v roce 1996, bohužel zde nedošlo k významnému rozvoji, a tak nyní zaujímá v rámci celosv tového zastoupení 8% (1). Využití Vzhledem k tomu, že je touto technikou možno p ipravit emulze a ástice o p esn požadované distribuci velikosti ástic, která se pohybuje v rozmezí od nm po μm, lze ji mimo potraviná ství použít i v oblasti medicíny, kosmetiky a dalších pr myslových odv tvích. Nap íklad více etné emulze typu v/o/v mohou být použity pro mikro-enkapsulaci ve farmacii (p ísun protirakovinných p ípravk, hormon, steroid atd.), v kosmetice (krémy s enkapsulovanými ú innými složkami a dalších pr myslových odv tvích. V potraviná ském pr myslu se uplat ují v oblasti redukce energetické hodnoty potravin p edevším snížením obsahu tuku nutného pro výrobní proces dané potraviny, maskování necht ných p íchutí a zlepšení senzorických vlastností výrobku (složka negativn ovliv ující senzorické vlastnosti nep ijde do kontaktu se sliznicí v ústech). Dále p edstavují také možnost, jak enkapsulovat nutri n a zdravotn prosp šné látky v rámci produkce funk ních potravin, které jsou v sou asnosti stále více populární. Zatímco ve vod rozpustné složky (minerály, n které vitamíny, karotenoidy atd.) mohou být za len ny do vnit ní a/nebo vn jší vodné fáze, v tuku rozpustné složky (n které vitamíny, n-3 nenasycené mastné kyseliny, antioxidanty atd.) mohou být v len ny do fáze olejové (1, 3). 217

218 Princip membránové emulgace Principem membránové emulgace je vždy protla ení dispergované fáze skrz póry membrány, zatímco kontinuální fáze proudí kolem povrchu membrány. Kapky nar stají v otev ených pórech membrány, dokud nedosáhnou p esn dané velikosti. Molekuly povrchov aktivní látky p ítomné v kontinuální fázi stabilizují nov vznikající fázové rozhraní, aby se zabránilo bezprost ední koalescenci nov vzniklých kapek (4). Existují dva základní druhy membránové emulgace, a to p ímá membránová emulgace a pre-mix membránová emulgace viz Obr. 1. (1, 2). Obr. 1. Membránová emulgace (1). A) P ímá membránová emulgace: pr chod dispergované fáze p es membránu s mikropóry a její v len ní do kontinuální fáze, B) Premix membránová emulgace: p ipraví se pre-mix, který je následovn protla ován skrz membránu, ihned po pr chodu této hrubé sm si p es membránu se utvá í jemn jší kapky. Cross-flow membránová emulgace Tento proces je založen na principu pr chodu dispergované fáze p es membránu s mikropóry a jejího následného v len ní do kontinuální fáze, která neustále protéká podél povrchu membrány, viz Obr. 2. Kapky rostou na pórech a odtrhávají se, když dosáhnou p esné velikosti, která je ur ena rovnováhou mezi silami p sobícími na kapku (2). Obr. 2. Cross-flow membránová emulgace (1). Dispergovaná fáze je protla ována skrz membránu, kontinuální fáze proudí podél povrchu membrány. Požadavky na membrány Jak bylo již výše uvedeno, cílem této technologie je vyrobit emulze s p esn definovanou distribucí velikosti ástic. K tomu je zapot ebí, aby bylo dané za ízení vybaveno odpovídající membránou (1). Membrány by m ly být vyrobeny z p esn definovaného materiálu a jejich struktura byla být smá ivá p ednostn kontinuální fází (1). Stavba pór by m la být p esná a jednoduchá s definovanou distribucí jejich velikosti. Umíst ní pór na povrchu membrány a porozita by pak m ly umožnit co nejvyšší produkci a zárove zabránit koalescenci (1). Materiál pro výrobu membrán by m l být vysoce mechanicky i chemicky odolný. B žn se nejvíce používá sklo, keramika, polymery a kov (1). 218

219 Výhody a nevýhody Jako každá technologie má i membránová emulgace své výhody i nevýhody. Lze ovšem uvést, že výhody jsou u této techniky dominantní. Výhody Nejv tší výhodou membránové emulgace je nepochybn možnost produkce ástic, a to i emulzí i více etných emulzí se stejnou velikostí, která je dána velikostí pór membrány. Podmínky procesu jsou mírné, to znamená, že na ástice p sobí menší smykové nap tí než nap íklad p i konven ním postupu-dvoustup ové emulgaci. Membránové emulga ní jednotky jsou navíc dosti flexibilní za ízení, která umož ují obm nu proces. Další velkou p edností t chto za ízení je nižší spot eba elektrické energie (1). Nevýhody Mezi nevýhody pat í pom rn nízká produkce a také zanášení membrán, které vyžaduje jejich pom rn náro né išt ní (1). Popis za ízení Membránová cross-flow emulga ní jednotka na Ústavu mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha umož uje produkci jednoduchých i více etných emulzí. Je vybavena dv ma keramickými membránami o ploše 100 cm 2 s velikostí pór 1,4 μm. Jednotka je vybavena celkem dv ma erpadly a dv ma pumpami, zajiš ujícími jak protla ení dispergované fáze p es membránu a její následné v len ní do fáze kontinuální, tak proud ní fáze kontinuální podél membrány. Peristaltická erpadla umož ují pr tok 90 až 500 dm 3 /h. Rychlost toku kontinuální fáze podél membrány iní 0,6 až 3,5 m/s, pracovní tlak je v rozmezí 0-4 bar. Experiment Pomocí membránové cross-flow emulga ní jednotky na Ústavu mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha byla pokusn p ipravena emulze o/v 40 %, kde byla olejová fáze tvo ena epkovým olejem a vodná fáze obnovenou syrovátkou. Emulgace probíhala za tlaku 4 bar, pr toku dispergované fáze 123 dm 3 /h a pr toku dispergované fáze 500 dm 3 /h. U této p ipravené emulze byla pomocí p ístroje p ístroje Mastersizer 2000 s disperga ní jednotkou Hydro 2000G (Malvern, Velká Británie), který analyzuje velikost ástic laserovou difrakcí, zm ena velikost ástic. Distribu ní k ivka je uvedena na Obr. 3. Obr. 3. Distribuce velikosti ástic emulze o/v 40 %. S ohledem na velikost pór obou membrán je nutné provést další pokusy s r znými modifikacemi nastavení, které by umožnily p ipravit emulzi o menší velikosti ástic. 219

220 Záv r Vzhledem ke zna ným výhodám, které má p ímá membránové emulgace, lze o ekávat i do budoucna její rozvoj a ud lení dalších patent. Nesporn lze za nejv tší výhody této technologie považovat produkci ástic stejné velikosti, nižší spot ebu elektrické energie a také šetrnost celého procesu. Zna nou výhodou je také možnost produkce jak jednoduchých emulzí, tak i emulzí více etných. Pod kování: Za ízení bylo po ízeno v rámci projektu Zvýšení kvality laboratorní výuky student VŠCHT Praha (KvaLab). Použitá literatura: 1. Piacentini E., Drioli E., Giorno L.: Membrane emulsification technology: Twenty-five years of inventions and research through patent survey. Journal of Membrane Science 468, (2014). 2. van der Graaf S., Schroen C.G.P.H., Boom R.M.: Preparation of double emulsions by membrane emulsification a review. Journal of membrane science 251, 7-15 (2005). 3. Cofrades S., Antoniou I., Solas M.T., Herrero A.M., Jiménez-Colmenero F.: Preparation and impal of multiple (water-in-oil-in-water) emulsions in meat systems. Food Chemistry 141, (2013). 4. Charcosset C., Limayem I., Fessi H.: The membrane emulsification process a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 79, (2004). Kontaktní adresa: Klojdová Iveta, Ústav mléka, tuk a kosmetiky VŠCHT Praha, Technická 5, , Praha 6 klojdovi@vscht.cz 220

221 VYUŽITÍ VLÁKNINY V TECHNOLOGII MRAŽENÝCH KRÉM Šustová Kv toslava, Kilián Libor Mendelova univerzita v Brn, Ústav technologie potravin The use of fibre in ice cream technology Summary: The theme of this work is the use of the fiber in ice cream technology and their effect on the sensory quality. The samples of ice cream were prepared with 0.5% of different types of the fiber. The effect of 11 kinds of dietary fiber on the sensory quality was evaluated. Furthermore, amount of water dripping from the samples, the stability and the loss of shape during melting were observed. Samples with fiber under the name 4M HPMC (hydroxypropyl methylcellulose), MCG 611F (microcrystalline cellulose a gel) and WF 200 (wheat fiber) were evaluated as ideal for use in ice cream, the products showed the best sensory and rheological properties. Úvod Suroviny používané pro výrobu mražených krém jsou velice rozmanité. V souvislosti s trendem zdravého životního stylu a zdravé výživy by bylo dobré obohatit mražené krémy o další nutri n významné složky. Takovou složkou je i vláknina, která je v dnešní dob deficitní ve výživ lov ka. Cílem práce bylo sestavení receptury a odzkoušení p ídavku rozli ných druh vlákniny do mražených krém tak, aby byly zachovány senzorické a reologické vlastnosti hotového výrobku. Materiál a metodika Pro náš pokus byla receptura sestavena z mléka, smetany, cukru. Kombinací t chto ingrediencí jsme získali standardní vzorek smetanového mraženého krém. Do receptury smetanového mraženého krému byly dále použity r zné koncentrace vlákniny dodané firmou JRS. Množství vlákniny p idávané do mixu bylo postupn testováno v koncentracích od 0,5 do 4 %. Vyšší koncentrace vlákniny než 0,5 % dávaly finální výrobek velmi tuhé koncentrace. V další etap tedy byly receptury sestaveny jen s 0,5 % vlákniny. Celkem bylo porovnáno 11 smetanových mražených krém s p ídavkem vlákniny viz tabulka 1. Tabulka I Použité druhy vláknin. MC A4M, MC A16M HPMC E 4M, HPMC K 15M BAF 40 MCG 591F, MCG 611F WF 600/30, 600R, 200, 400R Methylcelulózy, rozdíl ve viskozit A4M < A16M Hydroxypropylmethylcelulózy, rozdíl ve viskozit E4M < K15M vláknina z list bambusu sm s mikrokrystalické celulózy a sodné soli karboxymethylcelulózy (NaCMC), rozdíl ve viskozit, objemové hustot a obsahu NaCMC pšeni né vlákniny, rozdíl ve schopnosti vázat vodu, vzestupn 500, 550, 800 a 1100% Výroba mražených krém Sm s byla po promíchání homogenizována ponorným mixérem a následn zpracována ve výrobníku zmrzliny se zabudovaným kompresorem pro udržení konstantn nízké teploty italské zna ky De Longhi s ozna ením ICK8000. Po ukon ení výroby byl mražený krém rozd len na n kolik podíl. První ást se použila na okapovou zkoušku, další ást se p esunula v plastové nádob do mrazáku na krátké zamrazení p ed samotným senzorickým hodnocením. Poslední ást se naplnila do plastového kelímku a následn zamrazila na -18 C, aby mohla být použita po týdnu pro hodnocení stability mraženého krému. Vyrobené mražené krémy byly porovnávány se standardem, který v receptu e nem l žádný obsah vlákniny. 221

222 Okapová zkouška mražených krém Okapová zkouška byla provád na ihned po ukon ení výroby mraženého krému. Vytemperované nerezové kuchy ské sítko bylo napln no v celém jeho objemu mraženým krémem a krém byl zarovnán s vrchní ástí sítka. Sítko bylo umíst no do sklen né nálevky, která byla zasunuta do plastového odm rného válce. Odm rný válec m l objem 100 ml. Množství a konzistence nakapané tekutiny se hodnotila po hodin setrvání mraženého krému p i laboratorní teplot (viz obrázek 1). Obr. 1. Okapová zkouška kone ná fáze po 60 minutách. Senzorické hodnocení mražených krém Senzorické hodnocení bylo provád no vždy po krátkém zamrazení zkušebních vzork v mrazáku. Hodnoceny byly tyto deskriptory: díl í chu (smetanová, po zahušt ném mléce, tu ná, plná, olejovitá, máslová, trpká, škrabavá, kovová, mou ná), viskozita, textura, sladká chu, cizí chu. Deskriptory sladká chu a textura byly hodnoceny p tibodovou stupnicí, viskozita t íbodovou stupnicí. Hodnocení stability mražených krému Vzorek po 7 dnech zamrazení byl umíst n na vytemperované nerezové sítko. Hodnocení probíhalo od po áte ní fáze až po úplné rozte ení nebo prote ení celého obsahu do odm rného válce. Množství nakapané tekutiny a tvar komolého kuželu byly zaznamenány každých 15 minut. Hodnocení bylo ukon eno zpravidla 135 minut od po átku m ení. Na záv r se hodnotila konzistence a množství prote ené tekutiny a vzhled obsahu, který z stal v sítku. Obr. 2. Hodnocení stability mraženého krému. 222

223 Tvar z obalu vyklopeného vále ku mraženého krému byl posuzován tímto zp sobem: tvar beze zm ny + + po átek zakulacování hran + zakulacené hrany + po ínající zm na tvaru zjevná zm na tvaru tém úplná ztráta tvaru úplné rozte ení Výsledky Standard m l pr m rným objem prokapané tekutiny 23,1 ml. Tekutina byla viskozitou blízká mléku a m la nažloutlou barvu. V sítku z stala po jedné hodin bílá hmota sn hovité konzistence. Po 7 dnech zamrazení bylo sledováno množství nakapané tekutiny v odm rném válci a zm na tvaru komolého kuželu v pr b hu tání. Z obrázku 3 m žeme vyhodnotit, že tání standardu za alo po 30 minutách od za átku testu. K nejvyšší rychlosti tání, a tedy k nejnižší stabilit, došlo v asovém rozp tí 45 až 75 minut. Po 120 minutách již nedocházelo k výrazným zm nám v objemu nakapané tekutiny. V pr b hu docházelo ke zm nám tvaru komolého kuželu. Z obrázku 4 je patrné, že po 15 minutách testu je tvar beze zm ny. Po 30 minutách dochází k po átku zakulacování hran. Po átek zm ny tvaru pozorujeme po 45 minutách. Hodina je as, p i kterém již kužel zjevn ztrácí sv j tvar. V následující p lhodin je p vodní tvar tém úpln ztracen. Poslední t i pozorování ( min) m žeme považovat za fáze úplného rozte ení, jelikož tvar se již p íliš nem ní. Obr. 3. Hodnocení stability pomocí množství odkapané tekutiny standard. Obr. 4. Zm na tvaru komolého kuželu v pr b hu hodnocení stability. 223

224 Výsledky senzorického hodnocení Vzorek s MC A4M Vzorek s MC A16M Vzorek s HPMCE 4M Vzorek s HPMCK 15M Vzorek s BAF 40 Vzorek s MCG 591F Vzorky s vlákninou MCG 591F a MCG 611F Vzorky s vlákninou WF 600/30 a WF 600R Obr. 5. Srovnání senzorického profilu standardu a vzork mražených krém s vlákninou. 224

225 Výsledky senzorického profilu a senzorického hodnocení jednotlivých mražených krém s vlákninou jsou uvedeny v obrázku 5 a v tabulce 2. N které vlákniny vyvolávaly u mraženého krému p ílišnou hutnost až naopak výskyt sn hovité textury. Vzorek HPMCE 4M dosáhl nejlepší hodnoty ze všech vzork u textury (1,2). Textura byla velmi jemná, vynikající. U v tšiny vzork nebyl zaznamenán vliv vlákniny na p ítomnost cizí chuti. Po senzorické stránce hodnotitelé ve výsledcích preferovali vzorky s vlákninou HPMCE 4M, MCG 611F a WF 200. Tabulka II Výsledky senzorického hodnocení vyrobených mražených krém s p ídavkem 0,5 % vlákniny. Použitá Viskozita Textura Sladká chu Cizí chu vláknina 2,8 - pr m rn MC A4M 2,8 - hutná až tuhá 2,1 - krémová krupi ná kaše sladká 2,6 - pr m rn našlehaná 2,8 - pr m rn MC A16M 1,8 - krémová krupi ná kaše až hutná a tuhá sladká 2,4 - pr m rn našlehaná 1,2 - velmi jemná, 3,2 - pr m rn HPMCE 4M škrabavá HPMCK 15M BAF 40 až hutná a tuhá 2,6 - pr m rn našlehaná až hutná a tuhá 1,6 - ídká až pr m rn našlehaná vynikající 2,6 - krémová až sn hová 3,6 - sn hová až drsn jší, krupi ková sladká 3,4 - pr m rn sladká 3,2 - pr m rn sladká MCG 591F 2,2 - pr m rn našlehaná 2,4 - krémová 3 - pr m rn sladká nep ítomna nep ítomna um lé sladidlo, olejová MCG 611F 2 - pr m rn našlehaná 3 - sn hová 2,4 - málo sladká nep ítomna WF 600/ pr m rn našlehaná 3 - sn hová 3,4 - pr m rn sladká nep ítomna WF 600R 2 - pr m rn našlehaná 3 - sn hová 3,6 - pr m rn až velmi sladká nep ítomna WF 200 2,6 - pr m rn našlehaná až hutná a tuhá 2,8 - sn hová 3,8 - velmi sladká mou ná WF 400R 2,2 - pr m rn našlehaná 2,4 - krémová 3 - pr m rn sladká nep ítomna Vláknina HPMCE 4M vykazovala ve vzorcích mražených krém zcela jinou stabilitu než standard (viz obrázek 6). Tání za alo kolem 60 minuty testu. Pak byl pr b h tání velice pozvolný s rychlostí prokapání pouze 1,5 2ml/15min. Po 135 minutách bylo zm eno 10 ml tekutiny v odm rném válci, což je 3,5 krát mén než u standardu za stejnou dobu. Ke zjevné zm n tvaru došlo po 60 minutách testu a úpln se vzorek roztekl za 90 minut. Obr. 6. Hodnocení stability standard vs. HPMCE 4M 225

226 Vláknina MCG 611F pat í do stejné skupiny jako vláknina s ozna ením MCG 591F, rozdílné jsou v objemové hmotnosti, viskozit a obsahu sodné soli karboxymethylcelulózy (11,3 18,8 %). U vzorku s MCG 591F byla patrna více olejová chu. K ivka stability vzorku MCG 611F má podobný tvar jako k ivka standardu (viz obrázek 7). Obr. 7. Hodnocení stability standard vs. MCG 591F vs. MCG 611F Vláknina WF 200 má výrazn vyšší vaznost vody než p edchozí vlákniny. V chuti výrobk s touto pšeni nou vlákninou byla patrná mou ná chu a u vzorku byla zaznamenána nejvíce sladká chu ze všech hodnocených vzork. Okapová zkouška byla svou hodnotou 22 ml nejvíce blízká standardu (23 ml). K ivka stability vzorku s vlákninou WF 200 m la nejblíže ke k ivce stability standardu. K ivky se až na hodnocení ve 45 minut tém úpln p ekrývaly. Po 60 minutách testu se komolý kužel u vzorku WF 200 nacházel ve stavu zjevné zm ny tvaru, k úplnému rozte ení došlo až po 135 minutách. Záv r Senzoricky nejlépe byly hodnotiteli vnímány vzorky s vlákninami pod ozna ením HPMCE 4M, MCG 611F a WF 200. Vláknina HPMCE 4M (hydroxypropylmethylcelulóza) vyvolala u mraženého krému velkou stabilitu, kdy výsledek odkapu po 135 minutách byl 10 ml, což je 3,5 krát nižší než u standardu. Vzorek s touto vlákninou dosáhl nejlepší textury, byla ozna ena jako velmi jemná, vynikající. Vláknina MCG 611F (mikrocrystalická celulóza gel) reologické vlastnosti vzorku p íliš nezm nila, pr b h je tém stejný jako standardu. Vláknina potla ila sladkou chu, tudíž byl vzorek pro n které hodnotitele více p ijatelný než standard. Vzorek s pšeni nou vlákninou WF 200 byl vnímán jako nejsladší, jeho okapová zkouška dopadla s množstvím 22 ml tém stejn jako standard (23 ml). Pod kování: P ísp vek vznikl s podporou projektu NAZV KUS QJ Literatura: Literatura dostupná u autora Kontaktní adresa: Prof. Ing. Kv toslava Šustová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova univerzita v Brn, Zem d lská 1, Brno, sustova@mendelu.cz 226

227 Low-fat cheese in Denmark NÍZKOTU NÉ SYRY V DÁNSKU Sudzina František Katedra ekonomiky a managementu, VŠCHT Praha Summary: In the last five years, market with low-fat cheese developed rapidly in Denmark. A major producer in this market is Arla Foods. In the category of cheese with 6% of fat, Arla experimented at the beginning with two versions of sliced cheeze - with 29% and 33% of protein. After a short period, the protein content of sliced cheeze stabilized at 29%. And eventually, Arla does not produce 6% fat slice cheese anymore since late Slowly, it was replaced by 6% fat brick cheeze with 28% of protein. With regards to other producers, Taulov Mejeri (for Coop) produces cheese with 30% of protein, Them, and Thise (for Irma) with 31% of protein. Arla later started producing sliced cheese with 10% fat and 32% protein. Approximately the same proportion of fat is in cheese from Thise - 11 % fat and 28% protein and Them Ost - 11% fat and 30% protein. On the border of semi-skimmed and low-fat cheeses on the Danish market, Arla produces cheeses with 13% fat. The article analyzes relative efficiency of low-fat cheese using data envelopment analysis. Úvod Dánsko je známe produkciou a vývozom potravín. Najvä ším producentom mlieka a mlie nych výrobkov je Arla Foods, družstvo vytvorené spojením švédskej Arly a dánskeho MD Foods v roku Motiváciou pre výber témy bola diskrepancia medzi ponukou syrov v Dánsku a eskej republike, i na Slovensku, kde ani jeden obchodný re azec neponúka syr, ktorý by zodpovedal americkej definícii nízkotu ného jedla [1], teda maximálne 3 gramy tuku na porciu, ktorej ve kos musí by aspo 50 gramov. Pri om o takéto nízkotu né syry by mohli ma záujem spotrebitelia snažiaci sa schnú, i športovci h adajúci alšie potraviny s vysokým obsahom bielkovín a nízkym obsahom tuku. Pod a FDA [2] znamená nízky obsah soli maximálne 140 mg sodíka na 50 g, o je ekvivalentné 0,7% soli. To by bolo užito né hlavne pre udí, ktorí majú problémy s krvným tlakom a kvôli nadbytku soli v strave dlhodobo užívajú diuretiká. No tejto definícii nezodpovedá pravdepodobne ani jeden nízkotu ný dánsky syr. Preto sa príspevok venuje analýze vz ahu obsahu soli a ostatných zložiek nízkotu ných syrov. Vývoj na trhu nízkotu ných syrov v Dánsku Už vyše 5 rokov sa v Dánsku vyrába syr so 6% tuku. Arla Foods vyrába nízkotu né výrobky pod ozna ením Cheasy. Na za iatku Arla testovala dve verzie plátkového syru, s 33% a 29% bielkovín. Obidve verzie vyrábala síce Arla, ale iba verzia s 29% bielkovín mala logo Arly zrete ne uvedené na vie ku. V ponuke zostala len verzia s 29% bielkovín, ku ktorej sa pridala tehlová verzia s 28% bielkovín. A v roku 2015 bol stiahnutý plátkový syr so 6% tuku z výroby. Za iatkom roku 2012 za ala Arla vyrába plátkový syr s 10% bielkovín. V Dánsku existujú syry so 6% tuku aj iných zna iek. Napr. pre obchodný re azec Coop vyrába Taulov Mejeri plátkový syr. Doteraz spomínané syry sú jemné. alšími výrobcami sú Them a Thise. Obidve firmy vyrábajú okrem syra so 6% tuku i syr s 11% tuku a ide o zrejúce tehlové syry. Najbližší vyšší obsah tuku majú syry Arly - 13%, jedna verzia je jemná a druhá zrejúca. Plátkový jemný syr má 27 gramov a plátkový zrejúci syr 28 gramov bielkovín, tehlové verzie zhodne po 26 gramov bielkovín. Materiál a metódy Na hodnotenie syrov bola použitá data envelopment analysis (DEA). DEA je neparametrická metóda založená na vzdialenosti od empiricky zostrojenej hranice produk ných možností. Okrem výhody, že nevyžaduje váhy (na rozdiel od napr. multikriteriálnej rozhodovacej analýzy), umož uje do modelu naraz zaradi viac ako jeden vstup a výstup. Výpo ty budú uskuto nené za predpokladu konštantných výnosov z rozsahu. 227

228 Cie om analýzy je zisti vzdialenos dostupných nízkotu ných syrov od krivky produk ných možností. Ako výstup v terminológii DEA bude použitý obsah bielkovín, pretože to je to, o v syre spotrebitelia chcú. Ako vstup v terminológii DEA bude použitý obsah cukru, tuku a soli, lebo to je to, o v syre spotrebitelia nechcú. Inými slovami, ide o zistenie, aký obsah vstupov (nechcených zložiek) je nutné ma v syre, aby mohol ma príslušný obsah výstupu (chcenej zložky - bielkovín) pri ešte stále prijate nej senzorike. Napriek tomu, že náš model bude ma len jeden výstup, nasledujúca definícia je všeobecná a ráta s možnos ou viac ako jedného výstupu. Nech x ij je i-tý vstup j-tého syra, v i je váha i-tého vstupu, y rj je r-tý výstup j-tého syra a u r je váha r-tého výstupu. Nech n je po et syrov, m je po et vstupov a t je po et výstupov. Potom relatívna efektívnos j 0 -tého syra za konštantných výnosov z rozsahu je [3]: Z pragmatického dôvodu sa tento model zlomkového programovania linearizuje, lebo na lineárnu optimalizáciu sa dá použi Simplexova metóda. Ako metódy zberu dát boli pre tento výskum použité pozorovanie a analýza údajov z internetu. Pozorovania prebehli v rozli ných asoch vo vybraných predajniach jednotlivých obchodných re azcov pôsobiacich v Dánsku. Pri získavaní údajov z internetu boli primárne použité stránky obsahujúce dánsky text v rámci domén.dk a.nu. (Doména.nu bola zavedená pre nordickú úniu, pravdepodobným dôvodom jej užito nosti, okrem jednotnej domény pre nieko ko štátov, je to, že nu znamená teraz v severogermánskych jazykoch a to je dobre využite né v reklamách na povzbudenie potenciálnych zákazníkov, aby išli hne na propagovanú stránku.) Zaujímavým zistením bolo, že pod a informácií dostupných z portálu vaegttab.nu, existujú alšie syry so 6% tuku, a to Gul Kastrup s 31% bielkovín a Kongeå s 45% bielkovín. Tieto neboli zaradené do analýzy, lebo nebolo možné overi ich dostupnos, i vôbec existenciu. alším zaujímavým pozorovaním bolo, že informácie na internete i v obchode nemusia zodpoveda realite. Napr. tehlový syr so 6% tuku od Them má ma 475 gramov, je to tak uvedené v obchode Irma na cenovke i na web stránke re azca, ale na zadnej strane tehly je uvedená istá váha 525 gramov. Na web stránke Irmy naviac nezodpovedá obrázok tejto tehly realite - na internete je obal lenený približne na dve polovice, horná as je farebná a dolná iernobiela, pri om reálne predávaná tehla má na výšku po oboch stranách po pä modrých pruhov. Vä šina obchodných re azcov nemá na svojich web stránkach ceny a vä šinou ani zoznam produktov mimo toho, o sa práve predáva v akcii. Irma umož uje on-line nákup, takže na web stránke má zoznam produktov s cenami. Ale tieto ceny nezodpovedajú úplne cenám v obchode. V prípade troch syrov, na web stránke bol jeden lacnejší o 1,50 DKK, jeden o 1,00 DKK a jeden mal rovnakú cenu. Získané dáta o zložení dánskych nízkotu ných syrov sú uvedené v tabu ke I. Tabu ka I Zloženie dánskych nízkotu ných syrov. Syr Energia Bielkoviny Cukry Tuky So Arla Cheasy 6% 723 kj / 172 kcal 28 0,5 6 1,5 Taulov Mejeri (Coop) 6% 736 kj / 176 kcal 30 1,0 6 1,5 Them 6% 775 kj / 185 kcal 31 1,5 6 2,3 Thise Majeri (Irma) 6% 734 kj / 174 kcal 30 0,1 6 1,6 Arla Cheasy 10% 926 kj / 221 kcal 32 0,5 10 1,2 Them 11% 940 kj / 225 kcal 30 1,5 11 2,2 Thise Majeri (Irma) 11% 885 kj / 211 kcal 28 0,1 11 1,6 228

229 Výsledky Obr. 1 znázor uje závislos obsahu bielkovín od obsahu soli pre dostupné syry so 6% tuku. Úse ka s po iatkom [0; 0] prechádza bodom [1,5; 30], ktorý predstavuje syr s najvyšším pomerom obsahu bielkovín k soli. Táto úse ka predstavuje hranicu produk ných možností za predpokladu konštantných výnosov z rozsahu. obsah bílkovin (%) Taulov Arla 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 obsah soli (%) Thise Them Obr. 1. Obsah soli a bielkovín v syroch so 6% tuku. Interpretácia z poh adu spotrebite a snažiaceho sa o o najnižší príjem soli je zrejmá - najlepší pomer obsahu bielkovín k soli má Taulov. Ak by ten nebol dostupný, celkom prijate né by boli syry od Arly a od Thise. Relatívna efektívnos je uvedená v tabu ke II. Tabu ka II Relatívna efektívnos syrov so 6% tuku bez zoh adnenia obsahu cukru. Syr Relatívna efektívnos Arla Cheasy 6% 0,9333 Taulov Mejeri (Coop) 6% 1,0000 Them 6% 0,6739 Thise Majeri (Irma) 6% 0,9375 Inými slovami, Arla má len 93,33% bielkovín pri rovnakom danom obsahu soli. Prevrátená hodnota (1/0,9333 = 1,0714) hovorí o tom, ko ko viac výstupu, by malo by pri danom vstupe. iže ak by syr Arla zvýšil obsah bielkovín o 7,14%, dostal by sa na hranicu produk ných možností, teda by mal relatívnu efektívnos 1,0. Tu je nutné pripomenú, že ide o zjednodušený model, ktorý nezoh ad uje obsah cukru. Hoci je pravda, že najlepší - Taulov má 1,0 gramu cukru a najhorší - Them má 1,5 gramu cukru, teda nemožno jeho hodnotenie z tabu ky II pripísa na vrub nezoh adnenia obsahu cukru. Tabu ka III obsahuje relatívnu efektívnos všetkých syrov uvedených v tabu ke I a ako vstupy zoh ad uje obsah soli, cukru a tuku. 229

230 Tabu ka III Relatívna efektívnos všetkých nízkotu ných syrov. Syr Relatívna efektívnos Arla Cheasy 6% 0,9556 Taulov Mejeri (Coop) 6% 1,0000 Them 6% 0,9999 Thise Majeri (Irma) 6% 1,0000 Arla Cheasy 10% 1,0000 Them 11% 0,6331 Thise Majeri (Irma) 11% 0,9333 Po zoh adnení celého zloženia, sa ako efektívne javia syry Taulov 6%, Thise 6% a Arla 10%. A slabo-efektívny (v terminológii DEA) je Them 6%. Bolo možné o akáva, že zna ná as syrov bude ma vysoké hodnotenie, lebo bol nízky po et syrov v porovnaní s po tom vstupov a výstupov. Odporú a sa ma aspo trikrát to ko hodnotených produktov ako je sú et vstupov a výstupov [4]. V tomto prípade by to znamenalo aspo 12 syrov, ale to ko ich na trhu nie je. Diskrimina ná sila DEA by sa dala zvýši zavedením podmienky, že každé v i (váha i-tého vstupu) a u r (váha r-tého výstupu) musí by vä šie ako vopred zvolené malé íslo. V prezentovanej analýze sta ilo, že sú nezáporné. alšou možnos ou by bolo stanovi pomery medzi vstupmi, napr. váha pre so má by aspo taká vysoká ako pre cukor. Záver Na základe prvej analýzy je z poh adu podielu bielkovín k soli najlepší Taulov Mejeri 6% predádaný v obchodnom re azci Coop. Na základe druhej analýzy možno konštatova, že všetky syry s výnimkou Them 11% sú efektívne aspo na 93%. Nie je možné hodnoti syry len na základe numerickej analýzy, pretože tá nezoh ad uje senzorické vlastnosti. Kvôli malému po tu dostupných nízkotu ných syrov nebolo možné vykona analýzu jemných a zrelých syrov samostatne. Pri om nemožno vylú i, že náhodný spotrebite napríklad nekonzumuje zrejúce syry. Použitá literatura: 1. FDA CFR, Part Nutrient content claims for fat, fatty acid, and chlolestrol content of foods. Washington, DC: Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. 2. FDA CFR, Part Nutrient content claims for the sodium content of foods.washington, DC: Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. 3. Charnes, A., Cooper, W.W., Rhodes, E Measuring the efficiency of decision making units. European Journal of Operational Research, ro. 2,. 6, 1978, s Bowlin, W.F Measuring Performance: An Introduction to Data Envelopment Analysis (DEA). Journal of Cost Analysis, ro. 3,. 3, s Kontaktní adresa: Mgr. et Mgr. Ing. František Sudzina, Ph.D. Katedra ekonomiky a managementu, VŠCHT Praha Technická 5, Praha 6 sudzinaf@vscht.cz 230

231 REJST ÍK AUTOR Bártová J Bártová Z Ber íková M Bubelová Z Bu ka F , 187, 193, 205 Bu ková L , 193 erníková M urda L , 33, 37, 43, 53, 59 Darmostuk M Detvanová L Di áková Z Doležal M Dostálová L Dubská K Dudriková E , 175, 201 Dvo ák L E er J Felberg J Filip V Flasarová R Fránková A Havlíková Š , 187 Horá ková Š , 89, 129, 141 Houšková K Hrádková I Hrubá M Hyršlová I Chodáková K Ilko V , 163 Jelínková M Kala R Kalhotka L Karolyi L Kavková M Kilián L Klojdová I , 217 Kolesár L Ko orzová A Ko uchová M Ko án J Kosová M Koštejnová D Kou imská L Krausová G Kuchtík J Kvasni ková E Kyselka J Lehotová V Leitnerová D Liptáková D.,... 83, 153 Lorencová E Lovayová V Ma a P Ma ová J Man ušková T Matej eková Z , 147, 153 Medve ová A Merkel A Mühlhansová A , 37, 89, 129, 137, 141 Nebesá ová J N me ková I , 187 Nováková T Nový P Olšanská E Pachlová V , 187 Panovská Z , 163 Pelikánová J Petruláková M Plocková M , 89, 129, 141 Prchalová J P ibyla L Purkrtová S Pytel R , 123 Rada V Rajchl A Remišová S , 47, 59 Ruml T ihá ková L Salek R. N Samková E Semjon B Skalka V.,... 43, 47, 59 Slezáková A Sluková M Sta ková B Sudzina F Sýkora V , 123 Št tina J , 33, 65, 217 Šustová K , 123, 221 Šviráková E , 211 Thomes L Tichovský P Valí ková J Valík , 83, 147, 153 Vanucci L Vápenka L Vokálová H Vrabec M Výrostková J

232 232

233

234

235

236

237

238

239 MILCOM a.s. Váš partner na cest ke kvalit a inovacím. Výzkumný ústav mlékárenský a Laktoflora se sídlem v Praze Závod Tábor Závod servisních služeb Dv r Králové nad Labem Pro více informací o našich produktech a službách navštivte naše webové stránky:

240

241

242

243

244

245

246

247