reprint Hodnocení chondroitin sulfátu v potravinových doplňcích v České republice ročník 4 4/2008 stránka

Transkript

1 copyright 2008 Farmakon Press, spol. s r.o reprint ročník 4 4/2008 stránka odnocení chondroitin sulfátu v potravinových doplňcích v České republice Nicola Volpi, Francesca Maccari Department of Biologia Animale, Biological Chemistry Section, University of Modena and Reggio Emilia, Itálie

2

3 farmakoterapeutické postupy odnocení chondroitin sulfátu v potravinových doplňcích v České republice Nicola Volpi, Francesca Maccari Department of Biologia Animale, Biological Chemistry Section, University of Modena and Reggio Emilia, Itálie Úvod Chondroitin sulfát (CS) je velmi komplexní polydisperzní přirozený glykosaminoglykan (GAG), vysoce heterogenní z hlediska relativní molekulové hmotnosti, hustoty elektrického náboje, struktury a biologické a farmakologické aktivity, tvořený alternujícími sekvencemi kyseliny D-glukuronové a odlišně sulfatovanými zbytky N-acetyl-D-galaktosaminu, které jsou spojeny β(1 3) vazbami. 1,2 Jsou známy formy CS s odlišnými sacharidovými řetězci založenými na disacharidech. Častěji se vyskytují polymery CS chondroitin-4- -sulfát, CSA, tvořený disacharidy se sulfatovanou 4-hydroxylovou skupinou, a chondroitin-6-sulfát, CSC, tvořený převážně disacharidovou jednotkou sulfatovanou v poloze 6 N- acetyl-d-galaktosaminu (obrázek 1). Třebaže známé vzorky CS jsou složeny převážně z různých procentních podílů těchto dvou druhů disacharidových jednotek, je také možné, že v polysacharidových řetězcích jsou v různém procentu obrázek 1 Struktura jednotlivých typů chondroitinu C - R 3 C 2 R 2 R 1 NCC 3 R 1 = R 2 = R 3 = : nesulfatovaný chondroitin R 1 = S 3 a R 2 = R 3 = : chondroitin-4-sulfát, CSA R 2 = S 3 a R 1 = R 3 = : chondroitin-6-sulfát, CSC R 2 = R 3 = S 3 a R 1 = : chondroitin-2,6-disulfát, CSD R 1 = R 2 = S 3 a R 3 = : chondroitin-4,6-disulfát, CSE R 1 = R 3 = S 3 a R 2 = : chondroitin-2,4-disulfát, CSB R 1 = R 2 = R 3 = S 3 : chondroitin trisulfát zastoupeny disacharidy s různým počtem a pozicí sulfátových skupin (obrázek 1). Evropská liga proti revmatismu European League Against Rheumatism EULAR 3,4 doporučuje CS v Evropě jako SYSADA pro léčbu artrózy (A) kolena, kyčle a ruky. 5 7 Navíc se CS samotný, nebo v kombinaci s glukosaminem používá jako potravinový doplněk. 7,8 To vedlo ke zvýšení jak počtu farmaceutických přípravků s obsahem CS, tak i jejich lékových forem tablet a kaplet, tobolek, očních roztoků a tekutých přípravků V předchozích studiích bylo popsáno stanovení CS v surovinách a různých nutraceutických přípravcích; 9 10 čistota a kvalita těchto přípravků obecně neodpovídaly specifikacím uvedeným v označení produktů. V tomto článku popisujeme stanovení obsahu CS, jeho kvality a možného původu v několika českých vzorcích nutraceutik pomocí stejných analytických postupů, jaké se používají pro hodnocení CS v potravinových doplňcích v USA. 11 Materiál a metody Na českém trhu byly získány různé vzorky potravinových doplňků ve formě tablet nebo tobolek obsahující CS v různých formulacích a množstvích (tabulka 1). V těchto analýzách byl jako standard použit referenční standard pro CS Evropského lékopisu (EPCS), vyráběný firmou Bioiberica ( a schválený Evropskou lékopisnou komisí v roce 2004 jako chemická referenční látka (Chemical Reference Substance CRS). Tento standard CS se vyrábí z bovinní chrupavky analyzované pomocí PLC, 12 avýrobce deklaruje obsah CS převyšující 98 %. 12 Pomocí gelové chromatografie (gel-permeation) byly připraveny frakce CS s odlišnými hodnotami molekulové hmotnosti v analýze PSEC, a tyto frakce byly následně hodnoceny pomocí analytického odstředění vysokými rychlostmi. 13 Chondroitináza ABC, chondroitin ABC lyáza z Proteus vulgaris (EC ), 0,5 2 jednotky/mg, a chondroitináza ACII, chondroitin AC lyáza z Arthrobacter aurescens (EC ) byly získány od firmy Sigma. Nenasycené 418

4 farmakoterapeutické postupy CS/DS disacharidy ( Di-0S: UA-[1 3]-GalNAc, Di-6S: UA-[1 3]-GalNAc-6S, Di-4S: UA-[1 3]-GalNAc-4S, Di-2,6diS: UA-2S-[1 3]-GalNAc-6S, Di-4,6diS: UA- [1 3]-GalNAc-4S,6S, Di-2,4diS: UA-2S-[1 3]-GalNAc- 4S) byly získány od firmy Seikagaku. Agaróza s vysokým rozlišením, schválená pro molekulární biologii, byla získána od společnosti Sigma. Všechna další reagencia měla kvalitu požadovanou pro analytická vyšetření. Všechna použitá nutraceutika obsahovala různá množství dalších přísad, zejména glukosamin, kolagen, vitaminy a/nebo (tabulka 1). Analýza byla prováděna v pečlivě připravených výchozích (pracovních) roztocích (10 mg/ml) všech přípravků. Nebyla prováděna žádná předběžná příprava, s výjimkou odstředění ( otáček/min po dobu 10 minut) k odstranění nerozpustných materiálů, pocházejících převážně z pomocných látek a solí obsažených v přípravcích, a proteolýzy k odstranění možných rušivých bílkovin. Referenční standard EPCS byl rozpuštěn ve vodě s cílem připravit autentický roztok CS (10 mg/ml). Analytické techniky, které byly použity při kvantitativním a kvalitativním hodnocení CS v potravinových doplňcích, již byly podrobně popsány. 11 Pro kvantitativní analýzu byla provedena elektroforéza na agarózovém gelu a byla použita PLC k separaci nenasycených disacharidů CS získaných působením chondroitináz ABS a ACII. 11,14 17 Tyto metody byly validovány podle průmyslových směrnic Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of ealth and uman Services, Amerického úřadu pro potraviny a léčiva (Food and Drug Administration FDA), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM), které byly publikovány v květnu 2001, 18 se zahrnutím limitů pro specificitu, linearitu, detekci (LD) a kvantifikaci (LQ), a zkoušek přesnosti, správnosti, zotavení a robustnosti (viz 11 ). Dále byla použita PLC disacharidů CS s cílem posoudit možný původ CS v nutraceutických přípravcích. 11,12,19 Stanovení parametrů molekulové hmotnosti CS bylo provedeno pomocí vysokoúčinné gelové chromatografie (high-performance size-exclusion chromatography PSEC) Výsledky 419 tabulka 1 Přehled složení a uvedeného obsahu chondroitin sulfátu u analyzovaných vzorků potravinových doplňků Vzorek Uvedený obsah Složení chondroitin sulfátu A 250 mg/kapsle Glukosamin Sacharidy B 250 mg/tableta Glukosamin C 25 mg/tableta Glukosamin D 200 mg/tableta Glukosamin E 200 mg/tableta Glukosamin F 67 mg/kapsle Glukosamin Vitamin C Vitamin E G 200 mg/tableta Glukosamin 400 mg/tableta Glukosamin I 25 mg/tableta Glukosamin L 75 mg/tableta Glukosamin Jako první krok byl na základě zjištění skutečné hmotnosti tablet/tobolek stanoven přesný teoretický obsah CS, s opakováním postupu s cílem získat statistické kolísání a vypočítat teoretický procentní podíl CS ve všech potravinových doplňcích. Deklarované procentní podíly CS byly zjištěny od 1,5 až do 47,2. Po separaci CS obsaženého v deseti nutraceuticích byla provedena kvantifikace pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, bez natrávení proteázami a při natrávení proteázami, a odstředění k odstranění nerozpustného materiálu. Kvalitativní výsledky získané tímto analytickým přístupem jsou uvedeny v tabulce 2. Vzorky potravinových doplňků CS byly zpracovány přidáním chondroitináz ABC a ACII, což vedlo ve skutečnosti ke vzniku stejných disacharidů a byla potvrzena nepřítomnost kyseliny iduronové a dermatan sulfátu, která byla popsána na základě elektroforézy na agarózovém gelu. bsahový vzorec nenasycených disacharidů ve vzorcích nutraceutik s obsahem CS uvádí tabulka 2. Je tedy zřejmé, že pro přípravu nutraceutik byl použit CS různého původu: bovinní, prasečí a z paryb (tj. ryb s chrupavčitým skeletem). 11,12,19 SAX-PLC byla použita také pro kvantitativní stanovení (tabulka 2) disacharidů konstituujících CS. 11 Získané relevantní výsledky jsou víceméně shodné s výsledky získanými elektroforézou. Nakonec byly u omezeného počtu (pro velmi nízký obsah CS) z deseti posuzovaných vzorků nutraceutik stanoveny parametry molekulové hmotnosti, zejména MW n, MW w, MW z, a polydisperzita (tabulka 2). Tento analytický přístup však ukazuje na možnou přítomnost depolymerizovaného nebo degradovaného CS. Bylo dokonce zjištěno, že hodnoty molekulové hmotnosti CS v nutraceuticích jsou podobné těmto hodnotám ve vzorcích CS purifikovaných z prasečích nebo bovinních chrupavek a z paryb, 12 což potvrzuje, že tyto polymery nebyly v průběhu přípravy potravinových doplňků degradovány. Za zmínku stojí, že ve vzorku L byla detekcí v agarózovém gelu, analýzou disacharidů a vyšetřením PSEC zjištěna přítomnost příbližně 2 % kyseliny hyaluronové s vysokou molekulovou hmotností.

5 farmakoterapeutické postupy čení přípravku. To znamená, že čtyři ze zkoumaných potravinových doplňků obsahovaly přibližně 0 až 1 % CS, na rozdíl od údajů dekladovaných v označení, které byly 47 %, 17 %, 12 % a 6 %, a dva přípravky skutečně obsahovaly % uváděného CS. bsahový vzorec disacharidů použitý k určení původu CS a parametry molekulové hmotnosti ke zjištění nepřítomnosti degradace byly hodnoceny ve vzorcích, v nichž byl detekován CS. Nalezený CS měl vysokou molekulovou hmotnost, což ukazuje, že během přípravy potravinových doplňků nedošlo k degradaci, a jeho původ byl převážně bovinní a prasečí. Pouze jeden pocházel z paryb, v jednom případě nebyl původ prokázán pro velmi nízký obsah CS. CS je podobně jako další přirozené polysacharidy získáván ze zvířat extrakčními a purifikačními procesy, 1,2,12 aje známou skutečností, že jeho struktura se mění podle tkáně, orgánu a zvířecího druhu. 1,2,12 To znamená, že celkový biologický a farmakologický účinek těchto látek je ovlivňován zdrojovým materiálem, výrobními procesy, přítomností znečišťujících látek a mnoha dalšími faktory. Na základě těchto analytických výsledků lze říci, že kvalita (zejména obsah CS) několika českých dietních doplňků je špatná, a za zmínku stojí, že klinické studie a účinnost CS byly hodnoceny při použití velmi čistého produktu, který měl specifické vlastnosti a fyzikálně-chemické charakteristiky požadované různými národními ústavy zdraví (NI). 1,3,4 Nejde však zdaleka o první zprávu o kvalitě CS v potravinových doplňcích. odnocení kvality surovin a hotových přípravků vytabulka 2 Kvalitativní výsledky obsahu jednotlivých vzorků Parametry Potravinové doplňky A B C D E F G I L Udaný obsah 47,2 % 16,9 % 1,5 % 12,4 % 24,1 % 12,3 % 12,3 % 30,7 % 1,6 % 6,0 % chondroitin sulfátu bsah chondroitin sulfátu Agaróza-gel 0,12 % 0,34 % 1,54 % 0,62 % 10,20 % 4,87 % 10,12 % 28,50 % 1,36 % 0,75 % SAX-PLC < 0,20 % 0,74 % 2,71 % 0,67 % 11,42 % 3,00 % 12,85 % 28,56 % 1,09 % 1,93 % Průměr < 0,2 % 0,9 % 2,1 % 0,9 % 10,7 % 3,9 % 11,8 % 29,1 % 1,4 % 0,8 % Parametry molekulové hmotnosti MW n Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno MW w Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno MW z Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Disperzita Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno 2,8577 Nezjištěno 2,0212 2,3796 4,0029 Nezjištěno Disacharidy Di-0s Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno 6,9 7,4 Nezjištěno Di-6s Nezjištěno 27,1 17,7 38,0 44,5 33,0 21,8 20,9 16,0 20,3 Di-4s Nezjištěno 72,9 82,3 62,0 33,0 67,0 78,2 72,2 76,6 79,7 Di-2,6dis Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno 19,4 Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Di-4,6dis Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno 1,5 Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Di-2,4dis Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno 1,6 Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno R Nezjištěno 1,00 1,00 1,00 1,22 1,00 1,00 0,93 0,94 1,0 Poměr 4s/6s Nezjištěno 2,69 4,65 1,63 0,74 2,03 3,59 3,45 4,79 3,93 Původ Nezjištěno ovězí/ Vepřový ovězí Rybí ovězí Vepřový Vepřový Vepřový Vepřový Vepřový Diskuse V dřívější studii 11 jsme kvantifikovali a popsali CS přítomný v několika nutraceutických přípravcích ve formě kaplet, tablet a tobolek distribuovaných na americkém trhu pomocí specifické a senzitivní elektroforézy na agarózovém gelu a PLC analýz. Metody elektroforézy a SAX-PLC byly validovány a byla potvrzena jejich použitelnost při kvantifikaci CS v hotových přípravcích, a to i v přítomnosti různých přísad a pomocných látek. Za zmínku stojí, že kvantitativní stanovení byla provedena při použití vysoce čistého referenčního standardu CS vyhovujícího Evropskému lékopisu, který má v podstatě stejné vlastnosti jako vzorky CS v potravinových doplňcích. bsah CS vyráběného z bovinní chrupavky je v tomto referenčním standardu dokonce vyšší než 98 %. 12 bsah CS v deseti českých dietních doplňcích byl stanoven bez jakéhokoliv zpracování, nebo po proteolýze, jejímž cílem bylo odstranit bílkoviny, které by mohly narušit stanovení obsahu CS výsledky byly velmi podobné. Bylo zejména zjištěno, že vzorek A, deklarující 47% obsah CS, neobsahuje prakticky žádný CS, tj. méně než 0,2 %. Vzorek B obsahoval přibližně 1 % (deklarováno 17 %), vzorek D přibližně 1 % (deklarováno 12 %), vzorek E přibližně 11 % (deklarováno 24 %), vzorek F přibližně 4 % (deklarováno 12 %) a vzorek L přibližně 1 % (deklarováno 6 %). V tomto posledním vzorku byla nalezena asi 2 % kyseliny hyaluronové. Vzorky C, G, a I odpovídaly specifikacím uvedeným v ozna- 420

6 farmakoterapeutické postupy znělo žalostně na korejském trhu, 10 a hodnocení dvanácti přípravků v Japonsku zjistilo velké kolísání původu CS a obecně se neshodovalo s nároky v označení produktů v případech, kde byly deklarovány. 20 Jde o důležitý bod, vzhledem ke známému kolísání biologických a farmakologických vlastností v závislosti na složení, absorpci po perorálním podání, parametry biologické dostupnosti a farmakokinetické parametry mohou být ovlivněny odlišnými strukturálními charakteristikami a původem, 21,22 a je zde zejména možné riziko druhově specifických nemocí. Byla dokonce formulována přísná zákonná omezení, jejichž úkolem je zajistit, že materiál získaný ze savců určený k výrobě léků bude připraven ze zdravých savců, neboť je zde riziko přenosu bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), slintavky a kulhavky, šíření ptačí chřipky a dalších zvířecích nemocí. Nejsou však žádná jasně vymezená omezení pro původ obsahových látek v nutraceuticích. Původ těchto látek v přírodních přípravcích je nejdůležitějším faktorem pro zajištění kvality, a tím bezpečnosti a účinnosti. Užívání CS jako nutraceutika je rozšířené. S rostoucím počtem přípravků obsahujících CS je na místě požadavek zavést přísnější a přesnější hodnocení a přísnější zákonné požadavky na kontrolu kvality ve vztahu k výrobě produktů vysoké kvality. Regulační požadavky by navíc měly být prosazovány ve vztahu k výrobcům, a sledovat cíl, aby tito výrobci uváděli správně obsahové látky a jejich původ, a měly by být zákonně prosazeny speciální a přesné analytické postupy kontroly produktů vysoké kvality, jejichž provádění by měly zajišťovat laboratoře pro kontrolu kvality, které by potvrzovaly čistotu a nároky v označení CS v surovinách a nutraceuticích. Kvalita českých potravinových doplňků je v současné době velmi špatná a zákazník nemá možnost ověření obsahu a původu CS. Po dobu čekání na přísnější právní úpravy pro kontrolu kvality důrazně doporučujeme používat místo obecných potravinových doplňků farmaceutické přípravky schválené národním ústavem zdraví v příslušné zemi. Literatura 1 Volpi N, ed. Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity. Amsterdam, Boston, eidelberg, London, New York, xford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo, Academic Press, Sugahara K, Mikami T, Uyama T, et al. Recent advances in the structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. Curr pin Struct Biol 2003;13: Jordan KM, Arden NK, Doherty M, et al. EULAR Recommendations 2003: an evidence based approach to the management of knee osteoarthritis: Report of a Task Force of the Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutic Trials (ESCISIT). Ann Rheum Dis 2003;62: Zhang W, Moskowitz RW, Nuki G, et al. ARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis, part I: critical appraisal of existing treatment guidelines and systematic review of current research evidence. steoarthritis Cartilage 2007;15: Volpi N. The pathobiology of osteoarthritis and the rationale for the use of chondroitin sulfate for its treatment. Curr Drug Targets Immune Endocr Metab Disord 2004;4: Volpi N. Therapeutic applications of glycosaminoglycans. Curr Med Chem 2006;13: Sarzi-Puttini P, Cimmino MA, Scarpa R, et al. steoarthritis: an overview of the disease and its treatment strategies. Semin Arthritis Rheum 2005:35(1 Suppl 1): McAlindon TE, LaValley MP, Gulin JP, et al. Glucosamine and chondroitin for treatment of osteoarthritis: a systematic quality assessment and meta-analysis. JAMA 2000;283: Sim JS, Jun G, Toida T, et al. Quantitative analysis of chondroitin sulfate in raw materials, ophthalmic solutions, soft capsules and liquid preparations. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2005;818: Sim JS, Im AR, Cho SM, et al. Evaluation of chondroitin sulfate in shark cartilage powder as a dietary supplement: Raw materials and finished products. Food Chem 2007;101: Volpi N, Maccari F. Quantitative and qualitative evaluation of chondroitin sulfate in dietary supplements. Food Anal Chem In press. 12 Volpi N. Analytical aspects of pharmaceutical grade chondroitin sulfates. J Pharm Sci 2007;96: Volpi N, Bolognani L. Glycosaminoglycans and proteins: different behaviour in size exclusion-high performance liquid chromatography. J Chromatogr 1993;630: Volpi N. Disaccharide analysis and molecular mass determination to microgram level of single sulfated glycosaminoglycan species in mixtures following agarose-gel electrophoresis. Anal Biochem 1999;273: Volpi N, Maccari F. Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides. J Chrom B 2006;834: Volpi N, Maccari F, Titze J. Simultaneous detection of submicrogram quantities of hyaluronic acid and dermatan sulfate on agarose-gel by sequential staining with toluidine blue and Stains-All. J Chrom B 2005;820: Volpi N, Maccari F. Detection of submicrogram quantities of glycosaminoglycans on agarose-gels by sequential staining with toluidine blue and Stains-All. Electrophoresis 2002;23: Biopharmaceutics Coordinating Committee in the Center for Drug Evaluation and Research (CDER) in cooperation with the Center for Veterinary Medicine (CVM) at the Food and Drug Administration. Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. May Volpi N. Disaccharide mapping of chondroitin sulfate of different origins by high-performance capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography. Carbohydr Polym 2004;55: Sakai S, take E, Toida T, et al. Identification of the origin of chondroitin sulfate in health foods. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007;55: Volpi N. ral bioavailability of chondroitin sulfate (Condrosulf ) and its constituents in healthy male volunteers. steoarthritis Cartilage 2002;10: Volpi N. ral absorption and bioavailability of ichthyic origin chondroitin sulfate in healthy male volunteers. steoarthritis Cartilage 2003;11:

7

8