Laboratorní cvičení z lékařské biochemie

Transkript

1 Laboratorní cvičení z lékařské biochemie 2. ročník, všeobecné lékařství ZIMNÍ SEMESTR 2019/2020 Ústav lékařské chemie a biochemie Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova Podpořeno projektem Zvýšení kvality vzdělávání na UK a jeho relevance pro potřeby trhu práce Reg.č.: CZ /0.0/0.0/16_015/

2 Pravidla bezpečnosti a ochrany zdraví při práci 1. Do laboratoře mají přístup pouze studenti, kteří jsou rozvrhem hodin vypsáni na příslušná praktika. Jakékoliv návštěvy jsou zakázány. 2. Studenti jsou povinni před nástupem do praktik teoreticky ovládat úlohy, které budou prakticky provádět. Přinesou si laboratorní plášť a pracovní návod. Praktikování bez pláště je nepřípustné. Vlasy musí být upraveny tak, aby nemohlo dojít k úrazu při práci s kahanem. Svrchní oděvy, tašky, batohy a ostatní zavazadla studenti odloží na místě k tomu určeném. 3. Veškeré odchody z praktik jsou povoleny pouze s výslovným svolením asistenta vedoucího praktika. 4. V laboratoři je povoleno provádět pouze ty práce, které jsou náplní praktického cvičení. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit, dále přechovávat potraviny a používat laboratorní nádobí a zařízení k jiným účelům, než jsou určeny. 5. Pro práce, při nichž může dojít k úniku škodlivých chemických látek do ovzduší, se musí zabezpečit odsávání. Práce s látkami dýmavými, dráždivými, zapáchajícími, jedovatými plyny a parami, stejně jako žíhání a spalování je dovoleno provádět jen v digestořích. 6. Při nasazování balónku na skleněnou pipetu je nutné dbát zvýšené opatrnosti. Střepy a jiné odpadky s ostrými hranami musí být odkládány do zvláštní nádoby s označením SKLO. 7. Do výlevek lze vylévat jen rozpouštědla s vodou dokonale mísitelná, dostatečně zředěná (nejméně 1:10), v množství nejvýše 0,5 litru a vodné roztoky kyselin a zásad zředěné nejméně 1:30. S vodou nemísitelná rozpouštědla, jedy, kyseliny a louhy nad uvedenou koncentraci a látky, které uvolňují jedovaté a dráždivé plyny, do výlevek vylévat nelze. Tyto látky se likvidují do zvláštní odpadní nádoby. 8. Při ředění se kyseliny zásadně vlévají do vody, nikoliv naopak. 9. Je zakázáno nasávat roztoky do pipet ústy. Musí být použito příslušných pomůcek (balónek). 10. Rozlité kyseliny je nutno ihned spláchnout vodou, případně neutralizovat práškovou sodou. Rozlité zásady stačí jen důkladně spláchnout vodou. 11. Při rozlití hořlavých kapalin se musí okamžitě zhasnout všechny kahany, vypnout elektrický proud a zajistit účinné větrání. Rozlitá kapalina se nechá vsáknout do vhodného porézního materiálu, který se odklidí na bezpečné místo. 12. Při zahřívání kapalin v baňkách se musí zabránit utajenému varu alespoň tak, že se do baňky vloží varný kamínek. 13. Před zahájením práce je nutno zkontrolovat stav všech přístrojů a zařízení, případné závady a nedostatky nahlásit asistentovi nebo laborantce. 14. Posluchačům je zásadně zakázána jakákoliv svévolná manipulace s elektrickou instalací, s přístrojovým vybavením a materiálem. Zapnutí přístroje a zapálení plynových kahanů se děje až po souhlasu asistenta nebo laborantky. 15. Obsluha laboratorní centrifugy musí být prováděna jen v přítomnosti asistenta nebo laborantky. Centrifugační nádobky musí být dokonale vyváženy, víko centrifugy při chodu bezpečně uzavřeno. 16. Při úniku plynných paliv (zemní plyn) musí být uzavřen přívod plynu, vypnut elektrický proud a účinně větráno. 17. Zapálené kahany nelze nechat hořet bez dozoru. Prošlehne-li plamen dovnitř, musí se okamžitě uzavřít přívod plynu a kahan seřídit. 18. Jakékoliv nehody, úrazy, požití chemikálií apod. je nutno ihned nahlásit vedoucímu asistentovi. 19. Hrubé porušení uvedených pravidel, vyplývající z nekázně či neznalosti, má za následek vykázání posluchače z praktických cvičení se sankcí neomluvené absence. 20. Studenti musí být seznámeni s klasifikací látek toxických, kancerogenních, mutagenních a toxických pro reprodukci. Bezpečnostní listy jednotlivých látek jsou k dispozici v praktikárnách. 21. Studenti musí být seznámeni s pravidly bezpečnosti práce s látkami vysoce toxickými (označeny T+) používanými ve studentské laboratoři (např. rtuť, kyanid draselný, ethidium bromid, dusičnan rtuťnatý). V Plzni dne 16. září 2016 Ing. Václav Babuška, Ph.D. zástupce vedoucího ústavu

3 ROZPIS ÚLOH Nácvik pipetování: strana 4 Pipetování destilované vody s kontrolou vážením Zjištění hustoty roztoku Příprava roztoku a jeho přesné rozpipetování do více zkumavek Pipetování velkých objemů Optické metody: strana 6 Spektrofotometrické stanovení koncentrace měďnatých iontů Identifikace acidobazického indikátoru pomocí absorpčního spektra Stanovení koncentrace Cl - Chromatografie: strana 10 Papírová chromatografie aminokyselin Dělení rostlinných pigmentů chromatografií na tenké vrstvě Dělení barevné směsi gelovou chromatografií Potenciometrie: strana 23 Potenciometrické měření ph Demonstrace funkce pufrů Potenciometrická titrace - stanovení koncentrace HCl - stanovení koncentrace CH 3COOH - stanovení isoelektrického bodu aminokyseliny Osmolalita, osmóza, dialýza: strana 34 Demonstrace osmózy Kryoskopické měření osmolality Sledování rychlosti dialýzy Antioxidanty: strana 45 Měření celkové antioxidační kapacity Enzymologie I: strana 51 Specifita enzymů (sacharáza, α-amyláza) Závislost aktivity -amylázy na ph prostředí Stanovení α-amylázy v moči (EPS, Wohlgemuthova metoda) Enzymologie II: strana 58 Stanovení Michaelisovy konstanty kyselé fosfatázy Sledování aktivity katalázy Enzymologie III: strana 61 Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy v séru Sledování aktivity aminotransferáz ALT a AST v jaterním extraktu Stanovení aktivity alkalické fosfatázy v séru Enzymologie IV: strana 66 Kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenázy malonátem Stanovení aktivity aldolázy Sledování aktivity mléčné xanthin-oxidoreduktázy

4 Nácvik pipetování 1) Pipetování destilované vody s kontrolou vážením a) Pipetování větších objemů, pipety s fixním objemem Na misku vah položte prázdnou malou kádinku, do níž budete pipetovat destilovanou vodu, a stiskněte tlačítko pro tárování (vynulování hmotnosti na vahách položené nádobky, v níž vážíme). Kádinku přeneste z misky vah na pracovní stůl a postupně do ní napipetujte destilovanou vodu v následujících objemech: 3 x 2000 l 2 x 500 l Pro pipetování 2 ml (=2000 l) použijete pipetu s fixním objemem a příslušnou špičku (velká bílá). Je třeba překontrolovat, že spojení špičky s pipetou těsní. Pipety, které budete používat, se nasazováním a sundáváním špičky snadno v místě připojení špičky povolí, pak netěsní a pipetovaná kapalina ze špičky vytéká! Podobně budete pipetovat 0,5 ml (=500 l), pipetou s fixním objemem a příslušnou špičku (modrá). Po dokončení pipetování kádinku položte na misku vah a odečtěte hmotnost napipetované destilované vody. Srovnejte skutečný navážený výsledek s očekávanou hodnotou vypočítanou součtem pipetovaných objemů a přepočtem objemu na hmotnost přes hustotu. Uvažujte hustotu destilované vody při teplotě v laboratoři rovnu =1,000 g/cm 3. Očekávaný objem Očekávaná hmotnost Skutečný výsledek b) Pipetování menších objemů, pipety s nastavitelným objemem Na misku vah položte prázdnou malou plastovou zkumavku, tzv. eppendorfku, do níž budete pipetovat destilovanou vodu, a stiskněte tlačítko pro tárování. Otevřenou eppendorfku si vezměte do ruky a postupně do ní napipetujte destilovanou vodu v následujících objemech: 375 l 25 l Pro pipetování 375 l použijete pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu l a příslušnou špičku (modrá). Pro pipetování 25 l použijete pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu l a příslušnou špičku (žlutá). Po dokončení pipetování eppendorfku uzavřete a položte na misku vah. Odečtěte hmotnost napipetované destilované vody. Srovnejte skutečný navážený výsledek s očekávanou hodnotou vypočítanou součtem pipetovaných objemů a přepočtem objemu na hmotnost přes hustotu. Uvažujte hustotu destilované vody při teplotě v laboratoři rovnu =1,000 g/cm 3. Očekávaný objem Očekávaná hmotnost Skutečný výsledek 4

5 2) Zjištění hustoty roztoku Na misku vah položte prázdnou eppendorfku a stiskněte tlačítko pro tárování. Do eppendorfky napipetujte přesně 1,000 ml (=1000 l) roztoku, jehož hustotu máte za úkol zjistit. Pro pipetování 1000 l použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu l a příslušnou špičku (modrá). Eppendorfku uzavřete, položte na misku vah a odečtěte hmotnost napipetovaného roztoku. Ze známého objemu a hmotnosti spočítejte hustotu. Objem Hmotnost Hustota 3) Příprava roztoku a jeho přesné rozpipetování do více zkumavek Do eppendorfky napipetujte: 93 l destilované vody 7 l barevného roztoku Pro pipetování 93 l použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu l a příslušnou špičku (žlutá). Pro pipetování 7 l použijte pipetu s nastavitelným objemem v rozsahu 0,5-10 l a příslušnou špičku (malá bílá). Přidáváte velmi malý objem. Ústí špičky je třeba ponořit pod hladinu roztoku, který už je v eppendorfce. Během přidávání těchto 7 l výsledný roztok i promícháte. Čtěte níže! Obsah eppendorfky promíchejte. Pro tento účel nejlépe poslouží tzv. propipetování, tj. opakované "nasávání a vypouštění" do špičky pipety, pohyb roztoku ve špičce "nahoru dolů". V našem případě je roztok barevný, měli byste přímo vidět, zda už je dostatečně promíchaný. Dejte pozor, aby špička po jejím vytáhnutí zpod hladiny na konci propipetovávání byla prázdná! Do stojánku si připravte 5 mikrozkumavek a do každé napipetujte přesně 20 l připraveného roztoku. 100 l 5 x 20 l Zhodnoťte, jak přesně jste pipetovali. 4) Pipetování velkých objemů Do titrační baňky napipetujte: přidejte: 10,0 ml destilované vody 5,0 ml 0,1 M HCl 5 kapek indikátoru (methylová červeň) Pro pipetování 10,0 ml destilované vody použijte skleněnou pipetu s balónkem. 5,0 ml 0,1 M HCl přidejte z dávkovače. Dávkovač je určen pro odměřování agresivních reagencií. Jde o nádobu opatřenou pístem, na němž lze nastavit požadovaný objem. Pro vaší úlohu je objem 5,0 ml již nastaven, pouze k výtokové trubičce přistavíte titrační baňku. Celý píst se vytáhne na doraz nahoru a pak se pomalu stlačí zpět dolů. V posledním kroku přidáte 5 kapek indikátoru (methylová červeň). 5

6 Optické metody 1) Spektrofotometrické stanovení koncentrace měďnatých iontů Hydratované ionty [Cu(H 2O) 4] 2+ jsou modré, ale pro fotometrické stanovení je toto zbarvení málo intenzivní a musí být zvýrazněno vhodným činidlem. Tím může být roztok amoniaku, který dává sytě modrý tetraamminměďnatý komplex. [Cu(H 2O) 4] NH 3 [Cu(NH 3) 4] H 2O Stanovení koncentrace provedete pomocí kalibrační křivky. Ředěním roztoku o známé koncentraci vytvoříte několik kalibračních roztoků a proměříte jejich absorbance při optimální vlnové délce (maximum absorpčního spektra). Funkci A = f(c) vynesete do grafu, čímž současně prověříte platnost Lambertova-Beerova zákona. Grafickým vyjádřením musí být přímka procházející počátkem. Z křivky odečtete koncentrace zkoumaných vzorků. Provedení: Do stojánku si připravte suché zkumavky a označte čísly: 1 až 10 kalibrační roztoky 0 porovnávací roztok ( BLANK ) vz 1, vz 2, vz 3, vz 4 vzorky Podle tabulky si připravte kalibrační roztoky ředěním základního roztoku vodou. Základní roztok obsahuje 25 mmol Cu 2+ /l. Na přesném pipetování velmi záleží. Číslo roztoku Základní roztok H2O c(cu 2+ ) - ml ml mmol/l 0-5,0 1 0,5 4,5 2 1,0 4,0 3 1,5 3,5 4 2,0 3,0 5 2,5 2,5 6 3,0 2,0 7 3,5 1,5 8 4,0 1,0 9 4,5 0,5 10 5,0 - Nyní přidejte ke všem kalibračním roztokům i porovnávacímu roztoku 5 ml roztoku amoniaku. Použijte automatický dávkovač. Současně si připravte také roztoky vzorků (5 ml předloženého vzorku smíchejte s 5 ml amoniaku). Všechny roztoky promíchejte opakovaným převracením zkumavek. Nechte 10 minut stát. Vyhledejte optimální vlnovou délku. Měření proveďte na spektrofotometru proti porovnávacímu roztoku. Z kalibračního roztoku číslo 5 odlijte potřebné množství do jedné kyvety a druhou naplňte destilovanou vodou. Vložte do spektrofotometru a zjistěte absorbance pro vlnové délky 400, 450, 500, 550, 600, 650 a 700 nm. Maximum 6

7 absorbance ukazuje na optimální vlnovou délku, při níž provedete měření ostatních kalibračních roztoků a vzorků. Optimální vlnová délka použitého záření (pro kalibrační roztok č. 5): vlnová délka [nm] absorbance Absorbance zadejte do příslušné tabulky v počítači. Soubor označen Cu ionty. Vypočítejte koncentraci kalibračních roztoků a zapište do tabulky v počítači. Číslo roztoku koncentrace absorbance - mmol/l Poté dostanete kalibrační křivku. Všechny body by měly ležet na přímce. Odchylky mohou být způsobeny chybami a nepřesností při přípravě roztoků, neboť podmínky platnosti Lambertova-Beerova zákona nebyly porušeny. Z kalibrační křivky odečtěte koncentrace předložených vzorků. vzorek absorbance koncentrace č. - mmol/l Kalibrační křivku a výsledky přiložte k protokolu. Použité roztoky a činidla: 1. Základní roztok Cu 2+ (c = 25 mmol/l): 6,25 g CuSO 4. 5 H 2O rozpustit ve vodě na 1 l roztoku 2. Amoniak (c = 3 mol/l) 3. Destilovaná voda 7

8 2) Identifikace acidobazického indikátoru pomocí absorpčního spektra Absorpční spektrum je závislost absorbance na vlnové délce (nebo vlnočtu) světelného záření. Obvykle je to křivka s jedním nebo několika maximy, jejichž poloha je charakteristická pro každou látku. Absorpční spektra slouží k identifikaci látek nebo ke kontrole jejich čistoty. Často se pracuje v ultrafialové nebo v infračervené oblasti, v níž zejména organické sloučeniny dávají velmi bohatá spektra s charakteristickými maximy, která odpovídají jednotlivým vazbám a funkčním skupinám. Spektra se využívají v různých oborech. Např. v organické chemii při studiu struktury složitých molekul, v analytické chemii při studiu stechiometrie komplexů, ve farmacii při kontrole léků a drog, v soudním lékařství k průkazu karbonylhemoglobinu a v mnoha dalších teoretických i aplikovaných oborech. Provedení: Acidobazické indikátory jsou organická barviva různého složení, která mění svou strukturu (a tím i zbarvení) v závislosti na ph prostředí. Obě formy mají ve viditelné oblasti spektra charakteristické maximum, které může posloužit k identifikaci indikátoru. Na pracovním stole máte roztoky acidobazického indikátoru ve vodě (ph = 7). Pomocí roztoku kyseliny sírové převeďte indikátor do kyselé formy. Ve zkumavce označené K smíchejte 1 ml vzorku a 1 ml roztoku H2SO4 (c = 0,05 mol/l). Pomocí tetraboritanu sodného převeďte indikátor do formy zásadité. Ve zkumavce Z smíchejte 1 ml vzorku a 1 ml roztoku Na2B4O7 (c = 0,05 mol/l). Měření spektra proveďte na spektrofotometru, jako porovnávací roztok použijte destilovanou vodu. Změřte absorbance v rozsahu vlnových délek 400 až 700 nm. Hodnoty plynule zvyšujte po 10 nm. vlnová délka A (kys. prostř.) A (zás.prostř.) vlnová délka A (kys. prostř.) A (zás.prostř.) nm - - nm

9 Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen AB indikátor. Získáte absorpční spektrum indikátoru, v němž odečtěte polohu maxima (v nm). V atlasu spekter vyhledejte indikátor, jehož maxima se pro obě formy nacházejí při stejných vlnových délkách jako u vašeho vzorku. K protokolu přiložte graf a uveďte název indikátoru. Použité roztoky a činidla: 1. Kyselina sírová (c = 0,05 mol/l), ph = 1 2. Tetraboritan sodný (c = 0,05 mol/l), ph = 9,2 3. Roztoky acidobazických indikátorů ve vodě 3) Stanovení koncentrace Cl - Činidlo pro stanovení koncentrace Cl - obsahuje Hg(SCN) 2 a Fe(NO 3) 3. Chloridové anionty reagují s Hg(SCN) 2 za vzniku bezbarvého nedisociovaného komplexu [HgCl 2] a uvolněné ionty SCN - poskytují s ionty Fe 3+ červený komplex vhodný k spektrofotometrickému stanovení. Provedení: Ve stojánku máte 3 malé suché zkumavky, označte je vz (vzorek), st (standard) a 0 (porovnávací roztok). Do zkumavek podle tabulky pečlivě odpipetujte (na dno, roztok nesmí zůstat ve špičce!) uvedené roztoky: Zkumavka 1 (vzorek) Zkumavka 2 (standard) Zkumavka 3 (porovnávací roztok) 20 µl analyzovaného séra (je v eppendorfce) 20 µl standardu Cl - (cst = 100 mmol/l) 20 µl destilované vody Do všech třech zkumavek odpipetujte po 2,0 ml činidla. Obsah zkumavek promíchejte. Vzorky pečlivě promíchejte a po 5 minutách změřte na fotometru absorbanci vzorku (Av) a standardu (Ast) proti porovnávacímu roztoku při 450 nm. vzorek standard absorbance Koncentraci Cl - vypočítáte podle vztahu: x cst cvz = mmol/l 9

10 Chromatografie 1) Papírová chromatografie aminokyselin Dělení probíhá na chromatografickém papíře, který je nosičem stacionární fáze, tj. vody, která je v množství asi 5% trvale vázaná na celulosu. Pro méně náročné práce může být nahrazen papírem filtračním, který na rozdíl od papíru chromatografického nemá tak přesně definované vlastnosti. Mobilní fází jsou různá organická rozpouštědla nebo jejich směsi s určitým podílem vody, aby nedocházelo k vymývání stacionární fáze z nosiče. Vzorky se nanášejí na start kapilární mikropipetou v objemu 2 až 10 l. Během nanášení se rozpouštědlo odpařuje, aby se vzorek zkoncentroval do skvrny o malém průměru. Vyvíjení se provádí ve skleněných uzavřených komorách. Dojde-li čelo na konec papíru, chromatogram se vyjme, usuší a podle potřeby vyvolá. (Postříká se vhodným činidlem, které dává se všemi vzorky výraznou barevnou reakci). Někdy se použije UV-detekce. Řada látek (často přírodního původu) vykazuje v UV-světle barevnou fluorescenci. K vyhodnocení se použije hodnota retardačního faktoru Rf a provede se srovnání s paralelně nanesenými standardy. R f A B Příprava chromatogramu: Na pracovním stole máte připraven chromatografický papír o velikosti cm. Určete střed a kolem středu opište kružnici o průměru přibližně 2,5 cm (můžete použít připravenou šablonu). Na kružnici naznačte lehce šest bodů tak, aby jednotlivé body byly po kružnici rovnoměrně rozloženy. Jednotlivé body, na které se budou nanášet vzorky, očíslujte (použijte měkkou tužku, nikoliv propisovací nebo fix!) Na body označené čísly 1 až 4 naneste standardy. Standardy jsou ve stojánku na pracovním stole. K nanášení použijte Pasteurovy pipety. Na bod označený číslem 5 naneste směs standardů, na bod číslo 6 jeden z neznámých vzorků. Standardy, směs i vzorek naneste 3x na stejné místo. Mezi jednotlivými kapkami stále odpařujte rozpouštědlo (použijte k tomu fén nebo infralampu), aby vzorek zůstal na malé ploše. Průměr skvrny by neměl přesáhnout 10

11 0,5 cm. Jednotlivé vzorky nanesené na kružnici se nesmí dotýkat nebo dokonce překrývat. Na kvalitní a pečlivé práci při nanášení vzorků závisí i dobrý výsledek experimentu. Do středu kruhu udělejte malý otvor (např. hrotem tužky), jímž provléknete knot (pevně stočený proužek chromatografického papíru). Vyvíjení a detekce: Pracujte pouze v digestoři! Do Petriho misky s připravenou vyvíjecí směsí (n- butanol kyselina octová - voda 4:1:1) vložte chromatogram tak, aby knot zasahoval do vyvíjecí směsi. Lehce přiklopte horní misku a pozorujte radiální postup rozpouštědla. Vyvíjení trvá asi 1 hodinu. Chromatogram Vyvíjecí komora Dojde-li čelo k okraji misky, vyvíjení ukončete. Chromatogram vyjměte, pinzetou odstraňte knot a ihned, dokud je papír ještě vlhký, tužkou označte polohu čela. Pak nechte chromatogram v digestoři usušit. Suchý chromatogram stejnoměrně z vhodné vzdálenosti postříkejte činidlem pro detekci aminokyselin (roztok ninhydrinu v acetonu). Pracujte pouze v digestoři, použijte ochranné rukavice! Snažte se, aby celá plocha mezi startem a čelem (místo, kde putovala mobilní fáze a kde lze očekávat, že se budou nacházet složky vzorku) byla rovnoměrně zvlhčena. Nechte v digestoři uschnout před rozsvícenou infralampou ve vzdálenosti asi 30 cm (chromatogram můžete opřít o zadní stěnu digestoře) a pak zahřejte asi na 80 o C přiblížením chromatogramu těsně k infralampě (celá plocha musí být postupně zahřáta). Objeví se modrofialové skvrny aminokyselin. Najděte jejich těžiště a změřte potřebné vzdálenosti pro výpočet Rf. Porovnáním výsledků určete neznámou aminokyselinu. Chromatogram přiložte k protokolu, hodnoty Rf zapište do tabulky. 11

12 Pozice Aminokyselina Rf (jednotlivých vzorků) 1 Lysin 2 Glycin 3 Alanin 4 Isoleucin 5 Směs aminokyselin Vzorek Použité roztoky a činidla: 1. Vyvíjecí soustava: n-butanol - kyselina octová - voda (4:1:1) 2. Detekční činidlo: ninhydrin (0,2 g ninhydrinu a 0,5 ml konc. kys. octové doplnit acetonem na 100 ml) 3. Standardní roztoky: lysin (0,2% roztok v 30% ethanolu) glycin (0,2% roztok v 30% ethanolu) alanin (0,2 roztok v 30% ethanolu) isoleucin (0,2% roztok v 30% ethanolu) 12

13 2) Dělení rostlinných pigmentů chromatografií na tenké vrstvě Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Tenkovrstvá chromatografie představuje velmi jednoduchou, ale značně účinnou chromatografickou metodu, jejíž podstatou je rozdělení jednotlivých složek směsi na základě jejich odlišné interakce se sorbentem, který je nanesen v tenké vrstvě na pevnou podložku. Mobilní fází je organické rozpouštědlo o vhodné polaritě. Volba nejvhodnějšího sorbentu, detekčního činidla a rozpouštědla závisí na typu dělené směsi. TLC slouží především ke sledování průběhu reakcí a je ukazatelem čistoty produktů. Tenká vrstva stacionární fáze je tvořena buď volně sypaným sorbentem, nebo sorbentem fixovaným vhodným pojivem (škrob nebo sádra). V současnosti jsou častěji využívány fixované tenké vrstvy, se kterými je dobrá manipulace, a které poskytují dobře reprodukovatelné výsledky. Tyto vrstvy jsou připravovány rozprostřením suspenze sorbentu v rozpouštědle na vhodnou podložku (hliníková nebo plastová fólie). Vlastní chromatografie se provádí obvykle vzestupným způsobem tak, aby nanesený vzorek nebyl ponořen do kapaliny, ale rozpouštědlo se na úroveň startu dostalo jen vzlínáním. Chromatografická komora musí být po celou dobu vzlínání rozpouštědla těsně uzavřena, aby nedocházelo k úniku par a tím k nežádoucím okrajovým jevům, které nepříznivě ovlivňují průběh dělení. Destička s tenkou vrstvou se z chromatografické komory vyjme ve chvíli, kdy čelo rozpouštědla dospěje několik milimetrů od jejího horního okraje. Poté se provede vyhodnocení chromatogramu, které je nejjednodušší u barevných látek, protože tam je přímo vidět poloha získané stopy. V případě, že se jedná o látky bezbarvé, je potřeba získané stopy zviditelnit detekčním činidlem, které při reakci se stanovovanou látkou vytváří barevnou stopu. Rostlinné pigmenty V listech zelených rostlin se vyskytuje větší počet lipofilních barviv, jejichž charakteristickou vlastností je rozpustnost v nepolárních rozpouštědlech. Chemicky i funkčně jsou velmi různorodá, jejich společným rysem je větší počet konjugovaných dvojných vazeb v molekule. Většina těchto barviv souvisí s fotosyntézou, přičemž rozhodující význam mají chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy, které se uplatňují při zachycování a přeměně světelné energie. Chlorofyly jsou cyklické tetrapyrroly s centrálním atomem hořčíku, karotenoidy zahrnují xantofyly a karoteny. Uveďte jiný cyklický tetrapyrol, jeho centrální atom a oxidační stupeň. 13

14 Pokud budeme sledovat, které vlnové délky určité barvivo absorbuje, získáme tzv. absorpční spektrum. Toto spektrum vykazuje maxima (tzv. píky), která jsou typická pro danou látku. Ideální je sledování absorpčního spektra ve viditelné oblasti, což je dostatečné pro identifikaci několika barviv obsažených v listech. Rozkladnými produkty chlorofylu jsou feofytiny, karotenoidy přecházejí přes epoxidy na bezbarvé sloučeniny. Rychlého rozdělení listových barviv lze dosáhnout chromatografií na tenké vrstvě, kde adsorbentem je oxid křemičitý fixovaný pomocí škrobového pojidla na hliníkovou destičku (Silufol). Složky směsi se dělí na základě rozdílné adsorpční afinity stacionární fáze k molekulám rozpuštěných látek. Po rozdělení extraktu lze jednotlivé složky vymýt (= eluovat) z nosiče organickými rozpouštědly a spektrofotometricky stanovit. Přinesete si rostlinný materiál ("zelené části" list, jehličí, stonek) ze dvou druhů zelených rostlin. Doporučuji tis ze zahrady fakulty (stačí krátká větvička s jehličím, cca 5 cm), jako druhý vzorek nějaký zelený list. Materiál a chemikálie: 1. vzorky rostlinného materiálu 2. třecí misky s tloučkem 3. uhličitan vápenatý, skleněné střípky 4. aceton, ethanol 5. vyvíjecí směs => benzín : petroléter : aceton (4 : 1 : 2) 6. stojan se zkumavkami, automatické pipety (1ml, 2 ml a 3ml), skleněný váleček s Pasteurovými pipetami 7. silikagelová deska Silufol, vyvíjecí chromatografická komora 8. spektrofotometr Příprava vzorku Vzorek rostlinného materiálu jemně nastříhejte do třecí misky - čím menší kousky, tím lépe se vám budou homogenizovat. Přímo do misky přidejte na špičku lžičky uhličitanu vápenatého, který zabrání nežádoucímu snižování ph v průběhu homogenizace, malé množství mořského písku nebo skleněných střípků a rozetřete s malým množstvím acetonu (1 až 2 ml), abyste získali koncentrovaný extrakt. Aceton je těkavé rozpouštědlo, pokud se před zahájením nanášení vzorku odpaří, je nutné ho do třecí misky opět malé množství přidat. Cílem je nanášet koncentrovaný extrakt směsi barviv, a tedy acetonu je třeba dávat jen tolik, kolik je nezbytně nutné k nasátí extraktu do kapiláry. Pro ochranu očí použijte ochranné brýle! Stejným způsobem zpracujte i druhý rostlinný materiál ve druhé třecí misce. Napište strukturní vzorce uhličitanu vápenatého acetonu a isopropanolu 14

15 Příprava vyvíjecí soustavy Ve vyvíjecí komoře máte připravenu vyvíjecí směs benzín : petroléter : aceton v poměru složek 4 : 1 : 2. Komora musí být uzavřena skleněnou deskou, aby před vlastním pokusem byla nasycena parami směsi. Máte-li vyvíjecí komoru o obdélníkové základně 25 x 10 cm, kolik ml vyvíjecí směsi potřebujete, aby linie startu, která je dva centimetry od spodního okraje, byla půl centimetru nad hladinou? A máte-li připravit toto množství vyvíjecí směsi ve výše uvedeném poměru, kolik budete potřebovat ml jednotlivých složek? 15

16 Nanášení vzorku Budete pracovat se dvěma silufolovými deskami. Na kratší straně silufolových desek asi 2 cm od dolního okraje naznačte lehce tužkou start. Dbejte na to, abyste přitom neporušili tenkou vrstvu oxidu křemičitého! Vzorky budete nanášet skleněnými kapilárami, které jsou ponořeny v čistícím roztoku ve skleněném válečku. Před použitím kapiláru osušte dotknutím se savého papíru nebo buničiny. Na start první z desek naneste acetonový extrakt prvního vzorku jako tenkou čárku cca 1,5 cm dlouhou. Vedle naneste druhou kapilárou acetonový extrakt druhého vzorku. Po každém nanesení vyčkejte zaschnutí. Po zaschnutí se nanášení na stejné místo 3-4 zopakuje, aby se dosáhlo dostatečné sytosti. Pozor, extrakt má tendenci se rozpíjet, a proto dbejte na to, aby proužky vzorků byly co nejužší. Po dokončení nanášení by neměly zasahovat od startu dále jak 3 mm nahoru/dolů. Nanášení provádějte dostatečně pomalu! Snažte se, aby mezi oběma dvěma vzorky byla krátká mezera (cca 5-10 mm). Vzorky nanášejte tak, aby byla mezera (cca 5 mm) i mezi okrajem destičky a naneseným vzorkem (viz obrázek). tenkou čárku. Obdobně připravíte i druhou desku, na kterou budete nanášet pouze vzorek tisu jako dlouhou Vyvíjení Vložte do vyvíjecí komory připravené silufolové destičky s nanesenými vzorky. Destičky opřete šikmo o stěnu komory tak, aby byly dolní okraje ponořeny ve vyvíjecí směsi. Start nesmí být v žádném případě ponořen! Komoru pečlivě uzavřete. Vyvíjení ukončete ve chvíli, kdy dojde čelo rozpouštědla asi 1 cm pod horní okraj destičky. Po vyjmutí destiček označte tužkou místo, kam rozpouštědlo doputovalo, a destičky vysušte. Na základě znalosti hlavních barviv obsažených v rostlinných materiálech přiřaďte jednotlivým barevným frakcím názvy pigmentů (ne všechny zóny z obrázku musí být přítomny, nebo naopak se mohou vyskytnout i jiné). 16

17 8 carotene 7 pheophytin 6 chlorophyll a 5 chlorophyll b Sem překreslete nebo vlepte chromatogram (1. destičku) 4 lutein 3 lutein-5,6-epoxide 2 violaxanthin 1 neoxanthin START 17

18 Měření absorpčního spektra Na druhé desce vyberte jednu ze zelených frakcí. Proužek vystřihněte a barvivo eluujte 3 ml ethanolu, dokud nedojde k úplnému odbarvení silufolu Proměřte absorpční spektrum této frakce na spektrofotometru od 350 do 700 nm. Jako porovnávací roztok použijte destilovanou vodu. Naměřené spektrum vložte do protokolu a určete vlnové délky jednotlivých maxim. Porovnáním se spektry jednotlivých pigmentů určete, zda frakce obsahuje chlorofyl a nebo chlorofyl b. vlnová délka vlnová délka vlnová délka A A nm nm nm A 18

19 Číslo frakce Absorpční maximum/maxima (nm) Barva Hodnota Rf Název pigmentu Vysvětlete následující pojmy Stacionární fáze Mobilní fáze Absorpční spektrum Závěr 19

20 3) Dělení barevné směsi gelovou chromatografií Úkol: Oddělte dextranovou modř od chromanu draselného. Co jsou to dextrany? Dextranová modř Barva Molární hmotnost ~ g/mol Chroman draselný Barva Molární hmotnost vzorec: co je přítomno v roztoku: g/mol Na pracovním stole máte připravenou kolonu naplněnou stacionární fází - gelem Sephadex (polysacharid dextranového typu). Odzátkujte kolonu, otevřete kohout a kapalinu nad gelem nechte vytéci. Ponechte jen malou vrstvu nad gelem (asi 1 mm). Do ní pipetou naneste 0,5 ml barevné směsi (dextranová modř a chroman draselný). Pipetu s nasazenou modrou špičkou je třeba vsunout opatrně do kolony tak, aby špička byla těsně nad povrchem gelu (hladinou kapaliny v koloně). Obsah špičky vyprazdňujte velmi pomalu! Barviva nesmí ulpět na stěně kolony! Barva směsi: Pootevřete kohout a směs nechte pomalu vsáknout. Do skleněné pipety (s nasazeným balónkem) si připravte asi 3 ml elučního roztoku (fyziologický roztok; 0,9% NaCl). Pipetu vsuňte do kolony tak, aby její ústí bylo těsně nad hladinou, pomalu a velmi opatrně přidávejte eluční roztok. Povrch gelu se nesmí zvířit! Současně kohoutem nastavujte rychlost průtoku kolonou, aby se nad gelem přidávaný eluční roztok nehromadil, 1 až 2 kapky za sekundu. Roztok, který vytéká z kolony (tzv. eluát), jímejte do odpadní nádobky. Jakmile dojde roztok v pipetě, zavřete kohout kolony, v klidu si prohlédněte, co se v koloně děje a připravte se na pokračování promývání a jímání barevných frakcí. Popište pozorované změny v koloně: 20

21 Získání eluční křivky Máte nacvičený postup promývání kolony. Ujistěte se, že víte, co budete v následujících minutách dělat! Číst návod v průběhu práce je pozdě! Skleněnou pipetu naplňte po maximální objem elučním roztokem. Připravte se k zahájení experimentu pipetu vsuňte do kolony. V okamžiku zahájení eluce (přidávání roztoku z pipety za současné regulace rychlosti průtoku kohoutem) začněte měřit eluční čas (pusťte stopky v průběhu eluce je nebudete vypínat, jen si zaznamenáte příslušné časy. Eluát jímejte zatím do odpadní nádobky. Sledujte po celou dobu průběh dělení. V okamžiku, kdy se v eluátu objeví první barevná frakce, zaznamenejte čas (v sekundách), kdy začala tato frakce vytékat. Současně ji zachytávejte do kalibrované zkumavky. (použijte tenčí zkumavku objem 10 ml) Pravděpodobně nedosáhnete dokonalého oddělení obou složek. Jakmile se vám barva roztoku vytékajícího z kolony přestane zdát "čistá", ukončete jímání první frakce a zaznamenejte čas. Vytékající směs můžete jímat do zvláštní zkumavky. V okamžiku, kdy se v eluátu objeví čistá druhá barevná frakce, zaznamenejte čas, kdy začala vytékat. Současně ji zachytávejte do druhé kalibrované zkumavky. (použijte širší zkumavku objem 20 ml) Zaznamenejte čas ukončení vytékání druhé frakce. V kalibrovaných zkumavkách odečtěte objemy zachycených frakcí. Frakce číslo Barva Látka Objem

22 Vysvětlete pořadí eluovaných barviv: Ukončení experimentu, úklid pracoviště Nakonec kolonu promyjte dostatečným množstvím elučního roztoku (nesmí v ní zůstat stopy barviv). Nad gelem ponechte asi 5 cm vrstvu roztoku, aby nedošlo k vyschnutí gelu. Kolonu uzavřete zátkou. 22

23 1) Potenciometrické měření ph Potenciometrie K určení ph lze použít více jednoduchých metod (indikátorové papírky, kolorimetrické metody), avšak pro exaktní práci je přesnost těchto stanovení nedostatečná. Proto jsou laboratoře vybaveny ph-metry, jimiž lze dosáhnout běžně přesnosti 0,01 ph, u dražších přístrojů i vyšší. Na pracovním stole máte připravený ph-metr s kombinovanou elektrodou. Do čisté kádinky přelijte vzorek, ponořte elektrody a na ph-metru odečtěte hodnotu ph. Mezi měřeními jednotlivých vzorků musíte elektrody vždy opláchnout destilovanou vodou. Pro měření jednotlivých vzorků použijte vždy čistou kádinku. Vzorky vracejte vždy zpět do zásobní lahvičky. Po změření všech vzorků elektrody důkladně opláchněte destilovanou vodou, otřete a vložte zpět do ochranného krytu s uchovávacím roztokem. Vzorek číslo Hodnota ph zjištěná pomocí indikátorového papírku Hodnota ph zjištěná pomocí ph-metru 23

24 2) Demonstrace funkce pufrů Pufry jsou roztoky, které si zachovávají ph i při působení různých vnějších vlivů (přidávání malých množství kyselin nebo zásad). Na pracovním stole máte dvě skleněné lahve s modrým víčkem. V jedné je deionizovaná (ultračistá) voda, ve druhé je fosfátový pufr o ph blízkém 7. Voda Pomocí odměrného válce odměřte 50 ml deionizované vody, přelijte do čisté kádinky a změřte ph pomocí ph metru. Hodnotu zaznamenejte. Vodu z kádinky vylijte. Stejným odměrným válcem odměřte dalších 50 ml deionizované vody, přelijte do stejné kádinky a znovu změřte ph. Elektrody po druhém měření nechte ponořené v kádince a do kádinky připipetujte 100 μl roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l. Obsah kádinky opatrně zamíchejte. Chvíli počkejte a zapište, na jakou hodnotu se změnilo ph. ph deionizované vody měření 1 měření 2 ph o přidání HCl Vyjádřete se k ph deionizované vody a ke změně v ph způsobené přidáním malého množství HCl: Pufr Pomocí odměrného válce odměřte 50 ml fosfátového pufru, přelijte do čisté kádinky a změřte ph pomocí ph metru. Hodnotu zaznamenejte. Pufr z kádinky vylijte. Stejným odměrným válcem odměřte dalších 50 ml pufru, přelijte do stejné kádinky a znovu změřte ph. Elektrody po druhém měření nechte ponořené v kádince a do kádinky připipetujte 100 μl roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 0,1 mol/l. Obsah kádinky opatrně zamíchejte. Chvíli počkejte a zapište hodnotu, na kterou se změnilo ph. ph pufru měření 1 měření 2 ph o přidání HCl Vyjádřete se ke stálosti ph pufru a ke změně v ph způsobené přidáním malého množství HCl: 24

25 Závěr: 25

26 3) Potenciometrická titrace Pro neutralizační titrace je možno použít elektrody vhodné pro měření ph, např. kombinaci elektrody skleněné a kalomelové. Obecně není třeba ph-metr při potenciometrické titraci kalibrovat, neboť pro určení ekvivalentního bodu je rozhodující změna potenciálu. Načrtněte titrační křivku silné kyseliny: Načrtněte titrační křivku slabé kyseliny: Úkoly 1) Určete graficky koncentraci vzorku silné kyseliny. 2) Určete výpočtem koncentraci vzorku slabé kyseliny. 3) Určete izoelektrický bod aminokyseliny. 1. Určení koncentrace vzorku silné kyseliny graficky: Potenciometrická titrace: Odpipetujte do kádinky přesně 10,0 ml předloženého vzorku silné kyseliny, vložte míchací tělísko a kádinku postavte na elektromagnetickou míchačku. Byretu naplňte titračním roztokem NaOH a umístěte ji tak, aby bylo možno přidávat titrační roztok do kádinky se vzorkem. Elektrodu vložte do kádinky se vzorkem tak, aby byla měrná plocha zcela ponořena v roztoku. Bude-li to nutné, zvyšte hladinu přidáním destilované vody. Elektroda se nesmí dotýkat dna ani stěn nádobky. Zapněte míchání a seřiďte rychlost. Tělísko se musí volně otáčet, nesmí narážet do elektrody ani stěn kádinky. Na stupnici odečtěte výchozí hodnotu ph a zahajte titraci. Přidávejte titrační roztok po 0,5 ml a titraci ukončete, až bude docházet po přidání titračního činidla k minimálním změnám ph (spotřeba titračního roztoku 10 ml). Důležité je, abyste zachytili celý průběh titrační křivky a neukončili titraci předčasně. Spotřeby zapisujte do přiložené tabulky. 26

27 spotřeba ml 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 ph silné kyseliny Po získání potřebných hodnot vypněte míchání, vyjměte elektrodu, pečlivě ji opláchněte a osušte. Vyhodnocení Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen Titrace. Titrační křivku vzorku vytiskněte. Metodou podle Kohna a Zítka nebo grafickou metodou určete bod ekvivalence. Odečtěte přibližnou spotřebu titračního činidla a hodnotu ph. Metoda podle Kohna a Zítka: Titrační křivkou se vede přímka tak, aby ji protla ve třech bodech. Snažíme se, aby vymezené plochy nad i pod přímkou byly stejné. 27

28 Grafická metoda: Vedou se dvě rovnoběžky, které se dotýkají titrační křivky v její nejzakřivenější části, tj. prakticky prodlužují počáteční a závěrečnou část křivky. Vzdálenost mezi rovnoběžkami se rozpůlí a průsečík půlící rovnoběžky s titrační křivkou udává polohu inflexního bodu. Jeho průmět na osu x (stejně jako v předchozí metodě) udává spotřebu titračního činidla v bodě ekvivalence. Pro výpočet látkové a hmotnostní koncentrace vzorku použijte známé vztahy: cv. Vv = ct. Vt. f v = cv. Mv Vzorec a název stanovované silné kyseliny: Napište reakci silné kyseliny s titračním činidlem: Výpočet koncentrace silné kyseliny: 28

29 2. Určení koncentrace vzorku slabé kyseliny výpočtem: Postup uvedený pod bodem Potenciometrická titrace zopakujte se vzorkem slabé kyseliny. Naměřené hodnoty zapište do následující tabulky. spotřeba ml ph slabé kyseliny ph 2 ph 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 29

30 Vyhodnocení Přesnou hodnotu spotřeby, kterou použijete pro výpočet koncentrace vzorku, určíte početně. Naměřené hodnoty zadejte do tabulky v počítači. Soubor označen Titrace. Titrační křivku vzorku vytiskněte. Do tabulky doplňte vypočítané rozdíly po sobě jdoucích hodnot ph (tzv. první diference, ph) a pak rozdíl těchto diferencí (tzv. druhá diference, 2 ph ). Spotřeba v ekvivalentním bodě se vypočítá ze vztahu: 2 Δ ph Vt V 2 2 Δ ph Δ ph ΔV, kde Vt je hledaná spotřeba V + je objem titračního roztoku odpovídající poslední kladné druhé diferenci 2 ph + je poslední kladná druhá diference 2 ph - je první záporná druhá diference V je rozdíl objemů TR, mezi nimiž se provádí interpolace (tj. rozdíl objemů mezi poslední kladnou a první zápornou druhou diferencí) Pro výpočet látkové a hmotnostní koncentrace vzorku použijte známé vztahy: cv. Vv = ct. Vt. f v = cv. Mv Vzorec a název stanovované slabé kyseliny: Napište reakci slabé kyseliny s titračním činidlem: Výpočet koncentrace slabé kyseliny: 30

31 3. Určení izoelektrického bodu aminokyseliny: Aminokyseliny obsahují přinejmenším dvě disociovatelné skupiny, karboxylovou COOH (kyselý charakter) a aminovou NH2 (zásaditý charakter). U aminokyselin dochází ke vnitřní interakci mezi těmito skupinami za vzniku obojetného iontu (amfiontu). Tato interakce se projevuje při hodnotě ph (specifické pro každou aminokyselinu) označované jako izoelektrický bod pi. Molekula se v tomto stavu chová navenek elektricky neutrálně. Jelikož mají aminokyseliny iontovou strukturu, vykazují vlastnosti iontových sloučenin - jsou tuhé, bezbarvé, rozpustné ve vodě, mají vyšší bod tání (resp. rozkladu) a jejich částice se pohybují ve stejnosměrném elektrickém poli (tento děj se nazývá iontoforesa). Isoelektrické ph u aminokyselin, které mají dvě disociovatelné skupiny, leží uprostřed hodnot pk na obou stranách izoiontového uspořádání: Co je izoelektrický bod? Kolik disociovatelných skupin má aminokyselina lysin? Napište vzorec glycinu zobrazující ionizaci v izoelektrickém bodě: 31

32 Postup uvedený pod bodem Potenciometrická titrace zopakujte se vzorkem aminokyseliny. Titrujte do spotřeby titračního činidla 20 ml. Naměřené hodnoty zapište do tabulky v počítači. Soubor označen Aminokyselina. Titrační křivku vzorku vytiskněte. Metodou podle Kohna a Zítka nebo grafickou metodou určete bod ekvivalence. Odečtěte hodnotu ph, která odpovídá izoelektrickému bodu (IEB) dané aminokyseliny. Do protokolu uveďte všechny naměřené údaje seřazené v přehledné tabulce, graf titrační křivky s ekvivalentním bodem a odpovídající hodnotou ph v IEB. spotřeba ml ph - Výpočet pi stanovované aminokyseliny: spotřeba ml 0, ,5 10,5 1,0 11,0 1,5 11,5 2,0 12,0 2,5 12,5 3,0 13,0 3,5 13,5 4,0 14,0 4,5 14,5 5,0 15,0 5,5 15,5 6,0 16,0 6,5 16,5 7,0 17,0 7,5 17,5 8,0 18,0 8,5 18,5 9,0 19,0 9,5 19,5 10,0 20,0 ph - 32

33 Závěr: Použité roztoky a činidla: 1. Titrační roztok NaOH (c = 100 mmol/l) 2. Vzorky kyselin: silná kyselina (HCl) slabá kyselina (kys. octová) aminokyselina (hydrochlorid aminokyseliny) 33

34 1) Demonstrace osmózy Osmóza Osmolalita, osmóza, dialýza Jsou-li dva různě koncentrované roztoky od sebe odděleny semipermeabilní membránou propustnou pouze pro molekuly rozpouštědla, dochází k tomu, že část rozpouštědla přejde z místa menší koncentrace do místa vyšší koncentrace tak, aby se rozdíl koncentrací vyrovnal. Tento jev se nazývá osmóza. Osmózu lze kvantifikovat pomocí osmotickéko tlaku (), tlaku, který je nutno vyvinout na koncentrovanější roztok, aby se zabránilo osmóze. Mechanismus vzniku osmotického tlaku není zatím zcela jasný, není však vyvolán přímo rozpuštěnou látkou, ale snížením aktivity rozpouštědla přítomností rozpuštěné látky v roztoku. Osmotický tlak závisí především na počtu částic rozpuštěných v roztoku a prakticky nezávisí na jejich druhu, velikosti a náboji. Pro vyjádření osmotických poměrů v roztoku se proto zavádí pojem osmolalita, druh koncentrace nezávislý na teplotě a na vlastnostech rozpuštěných látek (velikosti molekul). Osmolalita vyjadřuje celkové látkové množství všech osmoticky aktivních částic rozpuštěných v jednotkové hmotnosti čistého rozpouštědla. Jednotkou je mol/kg, resp. mmol/kg, pro něž se ve starší literatuře používalo označení Osmol/kg, resp. mosmol/kg. 1 mol látky v 1 kg vody představuje roztok s osmolalitou: glukosa 1 mol/kg NaCl (při 100% disociaci) 2 mol/kg NaCl (při 86% disociaci v krevní plasmě) 1,86 mol/kg AgCl (nerozpustný ve vodě) 0 mol/kg Osmolalitě 1 mol/kg odpovídá osmotický tlak 2,7 MPa. Velikost osmotického tlaku jednotlivých součástí biologických systémů a roztoků, které se do nich aplikují, se obvykle posuzuje vzhledem k určitému standardu, kterým byla v lidské fyziologii zvolena krevní plasma. K vyjádření rozdílu osmotického tlaku se často používá termín tonicita. Roztok, který má stejný osmotický tlak jako plasma, se nazývá izotonický, roztok s nižším osmotickým tlakem hypotonický a s vyšším osmotickým tlakem hypertonický. Osmóza má nesmírný význam v biologických soustavách, neboť se podílí na transportu vody mezi buňkou a extracelulární tekutinou. Rostliny navíc osmózou přijímají vodu. U živočichů reaguje každá buňka na osmotickou změnu prostředí změnou svého objemu. Nachází-li se buňka v hypertonickém prostředí, dochází k přechodu vody z buňky do okolí, což má za následek její smršťování a současně se obsah buňky koncentruje. Tento jev byl ne zcela vhodně nazván plasmolýza. Nachází-li se buňka naopak v prostředí hypotonickém, dochází k nasávání vody do buňky, plasma se tím zřeďuje a buňka současně zvětšuje svůj objem, může dojít až k destrukci buněčné membrány. V případě erytrocytů se tento jev nazývá hemolýza. Biologické membrány však nelze považovat za ideální semipermeabilní membrány, ale jsou to složité dvojvrstvy a vícevrstvy, kterými některé látky volně prostupují a jiné jsou přenášeny aktivním transportem. Osmotické poměry se v medicíně často zkoumají v souvislosti se zachováním stálosti vnitřního prostředí organismu a zjišťují se v krevní plasmě nebo v moči. Osmolalita plasmy je za fyziologických podmínek mmol/kg vody, čemuž odpovídá osmotický tlak 0,78 MPa. Osmotický tlak odpovídající bílkovinné složce plasmy má název onkotický tlak a činí cca 0,3 % celkového osmotického tlaku plasmy. Osmolalita moči se nachází v podstatně širším rozmezí ( mmol/kg vody), protože stálost osmotických poměrů v organismu udržují především ledviny. Praktický význam má i tzv. reverzní osmóza. Při tomto ději se působí tlakem na roztok, který je od čistého rozpouštědla oddělen polopropustnou membránou. Při dostatečném tlaku dochází k opačnému toku rozpouštědla než u osmózy, rozpouštědlo (nejčastěji voda) přechází z prostředí roztoku do prostředí rozpouštědla. Tímto způsoben je možno připravovat tzv. deionizovanou vodu, která nahrazuje vodu destilovanou. Přítomnost osmoticky aktivní látky v roztoku mění i další, tzv. koligativní vlastnosti (vlastnosti prakticky závislé pouze na počtu částic), např. snížení tenze par nad roztokem, zvýšení bodu varu roztoku (ebulioskopický efekt), snížení bodu tuhnutí roztoku (kryoskopický efekt). Toho se využívá při měření osmolality pomocí přístrojů osmometrů. 34

35 Demonstrace osmózy Pokusíme se realizovat klasický experiment demonstrující osmózu, jehož princip je znázorněný na obrázku. Roztok o větší osmolalitě nasává přes polopropustnou membránu vodu, a dochází tak k vzestupu jeho hladiny. Teoreticky by se měl vzestup hladiny zastavit, až hydrostatický tlak sloupce vyrovná osmotický tlak roztoku. π = h g h... výška sloupce hustota kapaliny g... gravitační konstanta 1. Na širší část trubice upevněte připravený celofán, který bude sloužit jako polopropustná membrána. 2. Trubici ponořte membránou dolů do kádinky s destilovanou vodou tak, aby hladina vody v kádince dosahovala do úrovně značky. 3. Do trubice opatrně pipetou přeneste takové množství nasyceného roztoku sacharózy, aby hladiny kapalin v trubici a v kádince byly ve stejné úrovni. Roztok sacharózy byl pro lepší viditelnost obarven modrým potravinářským barvivem. 4. Na stopkách začněte měřit čas. Zaznamenejte dobu, za kterou vystoupí hladina v kapiláře až na její vrchol přecházející v rozšířenou baňku. Doba: minut Rozdíl hladin výška sloupce (mm): Proč používáme právě sacharózu? Celofán, který používáme jako membránu, se rozhodně nechová jako ideální teoretická semipermeabilní membrána, nepropouští jen rozpouštědlo (vodu), ale bohužel i další malé částice velikosti Na + a Cl - iontů, proto pro tento demonstrační pokus nemůžeme použít roztok NaCl případně CaCl 2 (běžné soli velice dobře rozpustné ve vodě, vezmeme-li dále v úvahu nízkou molární hmotnost iontů vzniklých disociací, dojdeme k závěru, že jsou to ideální látky pro přípravu roztoků o vysoké osmolalitě). Sacharóza (C 12H 22O 11) už má dost velkou molekulu, aby póry v našem celofánu neprošla. Je to cukr s extrémní rozpustností ve vodě, což umožní také připravit celkem "koncentrovaný" roztok. 35

36 36

37 2) Kryoskopické měření osmolality Pojmenování metody pochází od starořeckých slov krýos, znamenající led, mráz, zima, ale také hrůza a skopeo, které znamená pozoruji. Princip metody je založen na fyzikálním jevu, popsaném francouzským fyzikálním chemikem François-Marie Raoultem ( ). Ten odvodil zákonitosti, ovlivňující tlakové poměry ve vícesložkových soustavách a vyslovil je v postulátech: 1. tlak syté páry nad roztokem, 2. zvýšení teploty varu roztoku 3. snížení teploty tuhnutí roztoku. Z posledního vyplývá, že teplota tuhnutí roztoku klesá v závislosti na koncentraci, v něm, rozpuštěné látky. obr. Grafické vyjádření průběhu teplotních změn při kryoskopii obr. Iniciace promrznutí vzorku, kapkou zledovatělou na jehle Osmometr (kryoskop) je v principu velmi citlivý teploměr s rozlišitelností 0,001 C, což odpovídá rozlišitelnosti měření 1,2 mmol/kg, přičemž 1 mmol/kg tak odpovídá 0, C. Měřený roztok se rychle podchladí. Potom se, zevním zásahem, přivodí okamžité promrznutí vzorku v celém jeho objemu. Tím se uvolní skupenské teplo tuhnutí, načež se, po následujícím teplotním sedle, měří snížení bodu tuhnutí roztoku odpovídající jeho osmolalitě. Souvislosti: - snížení teploty tuhnutí roztoku, čistému rozpouštědlu, je přímo úměrné koncentraci rozpuštěné látky - vlastnost závisí na počtu částic, nikoli na jejich identitě - rozdíl teplot tání čistého rozpouštědla a roztoku je přímo úměrný osmolalitě a nepřímo úměrný molární hmotnosti rozpuštěné látky 37

38 a) Připrava 250 ml Ringerova roztoku Fyziologický roztok v podobě 0,9% NaCl obsahuje pouze Na + a Cl - ionty. V krevní plazmě jsou přítomny ale i jiné ionty. V praxi se používají i infúzní roztoky trochu více odpovídající složení krevní plazmy. Jedním z nich je Ringerův roztok. 1. Postupně navažte pomocí plastové váženky a přeneste navážená množství do téže 250 ml Erlenmayerovy baňky: chlorid sodný chlorid draselný chlorid vápenatý 2,150 g 0,075 g 0,083 g 2. Do téže Erlenmayerovy baňky spláchněte i nepozorovatelné zbytky z váženky pomocí střičky s destilovanou vodou. 3. Přidejte destilovanou vodu do objemu asi tak ml a krouživým mícháním dokonale rozpusťte obsah. 4. Pomocí nálevky přelijte obsah Erlenmayerovy baňky do 250 ml odměrné baňky. Erlenmayerovu baňku alespoň 2x propláchněte malým množstvím vody, vše pořád slejvejte do odměrné baňky. 5. Destilovanou vodou (ze střičky) doplňte odměrnou baňku přesně po rysku (tj. na objem 250 ml). 6. Odměrnou baňku uzavřete zátkou a důkladně obsah promíchejte. Jaká je látková koncentrace jednotlivých iontů v připraveném roztoku? M(NaCl) = 58,45 g/mol M(KCl) = 74,56 g/mol M(CaCl2. 2H2O) = 146,99 g/mol Na + mmol/l K + mmol/l Ca 2+ mmol/l Cl - mmol/l Výsledek Jakou má tento roztok osmolalitu (osmolaritu)? 38

39 b) Měření osmolality moderním osmometrem Máme k dispozici moderní osmometr, přístroj pro kryoskopické stanovení celkové osmolality ve vodných roztocích s dotykovým LCD. Používá velmi citlivý teploměr s rozlišitelností 0,001 C, což odpovídá ve výsledku osmolality rozlišitelnosti 1-2 mmol/kg. Pracuje se s objemy vzorků 50 µl, doba měření je cca 1 min. Měření je snadné a rychlé, proto proměříme více vzorků. Příprava vzorků: Destilovaná voda je k dispozici v laboratoři Ringerův roztok máme připraveno Ringerův roztok + ethanol Odměrným válcem odměřte co nejpřesněji 50 ml Ringerova roztoku, přelijte do kádinky a připipetujte 0,25 ml 40% alkoholického nápoje. Spočítejte, jaký vzestup osmolality (osmolarity) by měl tento přídavek ethanolu způsobit: Ringerův roztok + glukóza Odměrným válcem odměřte co nejpřesněji 50 ml Ringerova roztoku, přelijte do kádinky. Odvažte pomocí váženky 270 mg glukózy a tu rozpusťte v roztoku v kádince. Spočítejte, jaký vzestup osmolality (osmolarity) by měl tento přídavek glukózy způsobit: Vzorek Destilovaná voda Ringerův roztok Ringerův roztok + ethanol Ringerův roztok + glukóza Změřená osmolalita mmol/kg mmol/kg mmol/kg mmol/kg 39

40 3) Sledování rychlosti dialýzy Dialýza je dělící metoda, při níž se uplatňuje difúze a současně polopropustnost membrány. Difúze je nevratný děj, při kterém dochází k transportu částic (iontů, molekul) v prostředí tak, aby došlo k vyrovnání složení ve všech místech této soustavy. Difúze je důsledkem neustálého neuspořádaného pohybu částic hmoty a postupuje ve směru koncentračního spádu, tedy i proti zemské tíži. Rychlost difúze je kromě závislosti na povaze částic rozpuštěné látky a rozpouštědla přímo úměrná koncentračnímu gradientu (koncentračnímu spádu, rozdílu koncentrací). Polopropustná (semipermeabilní) membrána je taková membrána, jejímiž póry mohou projít pouze některé ionty nebo molekuly přítomné v daném prostředí. Membrána je tvořena nejčastěji nabobtnalým celofánem nebo podobnými deriváty celulózy. K difúzi dochází i v případě, je-li roztok určité látky oddělen od čistého rozpouštědla polopropustnou membránou, kterou dané rozpuštěné částice mohou procházet. Rychlost a směr pohybu difundujících částic přes membránu závisí na rozdílu koncentrací dané látky na obou stranách membrány. Látky difundují z místa vyšší koncentrace do místa nižší koncentrace. Dojde-li k vyrovnání koncentrací, ustaví se dynamická rovnováha a děj se zastaví. Obsahuje-li roztok (tzv. dialyzát) směs rozpuštěných látek, z nichž jen některé membránou procházejí do rozpouštědla (tzv. difuzátu), lze tímto způsobem směsi dělit a metoda se nazývá dialýza. Umožňuje vzájemné dělení malých a velkých molekul, často se tak dělí roztoky solí od velkých polymerních molekul (např. polysacharidů, polypeptidů, bílkovin, apod.). Hlavním praktickým využitím dialýzy v medicíně je hemodialýza pacientů se selháním ledvin. K urychlení dělení elektrolytů od neutrálních molekul může být použito elektrické pole (elektrodialýza). Působí-li na dialyzovaný roztok tlak, hovoříme o ultrafiltraci. Na tomto principu vzniká tzv. glomerulární filtrát (primární moč) v ledvině při glomerulární filtraci. Sledování dialyzační rychlosti chloridů přes celofánovou membránu V úloze se sleduje dialyzační rychlost chloridů a současně dělení vysokomolekulární a nízkomolekulární látky (škrob a NaCl). Dialyzační membránu bude tvořit celofán, který vytváří póry o průměru 3 až 4 nm. Jimi snadno projdou ionty, jejichž velikost je i s hydratačním obalem okolo 0,5 nm. Zdůvodněte, proč molekuly škrobu neprochází dialyzační membránou: 40

41 Provedení: Příprava dialyzační nádobky: 1. Na pracovním stole máte ve stojanu upevněnou dialyzační nádobku. Jedná se o skleněnou trubici s celofánem. Do kádinky (objem 250 ml) odměřte 150 ml destilované vody, vložte míchací tělísko, postavte na elektromagnetickou míchačku a nastavte přiměřenou rychlost míchání. 2. Do dialyzační nádobky napipetujte 5 ml 1% roztoku škrobu a 10 ml roztoku NaCl (c = 1,5 mol/l). Připravte si stopky, zapněte míchání a v okamžiku, kdy ponoříte dialyzační nádobku do kádinky tak, aby byl celofán s roztokem ponořen, začněte měřit čas. Sledování dialyzační rychlosti: V čase 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 minut a dále pak v desetiminutových intervalech z kádinky odebírejte vzorky o objemu 2,5 ml (použijte automatickou pístovou pipetu), které průběžně merkurimetricky titrujte. Pokus ukončete, jsou-li tři po sobě jdoucí spotřeby stejné (cca po 90 minutách). Čas (min) Vt (ml) Vdif (ml) cv (mmol/l) nv (mmol) Čas (min) Vt (ml) Vdif (ml) cv (mmol/l) nv (mmol) Stanovení chloridů: Chloridy se stanoví merkurimetrickou titrací. Merkurimetrie patří mezi komplexotvorné metody. Titrační roztok /Hg(NO3)2/ tvoří se vzorkem (ionty Cl - ) rozpustný, ale nedisociovaný komplex [HgCl2]: Hg Cl - [HgCl2] ft = nv/nt = 2/1 K indikaci ekvivalentního bodu se využívá barevné reakce iontů Hg 2+ s difenylkarbazidem. Na konci titrace se objeví modrofialové zabarvení. Při titraci dodržujte bezpečnostní opatření, protože roztok Hg(NO3)2 je toxický! Po skončení vaší práce vylejte veškerý odpad do speciální lahve! 41

42 K odebranému vzorku přidejte 2,5 ml destilované vody a 0,3 ml indikátoru a ztitrujte roztokem Hg(NO3)2 do vzniku světlefialového zabarvení. Z nalezených spotřeb vypočítejte koncentraci jednotlivých vzorků a látkové množství chloridů prošlých celofánovou membránou (v mmol): c v c.v.f t V t v t mmol/l n v cv.vdif mmol, za Vdif se dosazuje objem difuzátu (v litrech), který se průběžně (po odběru vzorků) mění, Vdif = 150 ml, 147,5 ml, Vv = 2,5 ml Ct = 12,5 mmol/l Ověření integrity membrány průkazem škrobu: Po ukončení dialýzy odeberte do malé aglutinační zkumavky asi 0,3 ml roztoku difuzátu a do druhé zkumavky 0,3 ml roztoku dialyzátu. Do obou zkumavek přidejte 3 kapky Lugolova roztoku (roztok jodu) a porovnejte zbarvení. (Škrob se jodem barví modře.) Výsledek pokusu zhodnoťte. 42

43 Vyhodnocení rychlosti dialýzy proveďte graficky. Na milimetrový papír naneste na osu x čas (v minutách), na osu y látkové množství chloridů (mmol). Vynesenými body proložte optimální křivku (dialyzační křivka). Osu x rozdělte na pětiminutové intervaly (čas t1, t2, t3,...) a k těmto hodnotám přiřaďte z dialyzační křivky odpovídající látkové množství chloridů (n1, n2, n3,...), které odečtěte na ose y. (Pro to = 0 je no = 0). Čas (min) nx (mmol) vx (mmol Cl - /min) Čas (min) nx (mmol) vx (mmol Cl - /min) 43

44 Dialyzační rychlost (v) udává látkové množství Cl - prošlé celofánovou membránou za minutu. v1 = (n1 - n0) : 5 [mmol Cl - /min] v2 = (n2 - n1) : 5 v3 = (n3 - n2) : 5, atd. Sestrojte graf dialyzační rychlosti: na osu x naneste čas (min), na osu y vypočítanou rychlost (mmol Cl - /min). V místě, kde křivka protíná osu x odečtěte čas, kdy se vyrovnaly osmotické poměry na obou stranách membrány (dialýza skončila). Dále křivku prodlužte (extrapolujete) tak, aby protla osu y a odečtěte v0 (tzv. počáteční rychlost). Tuto hodnotu nelze přímým měřením zjistit. Může sloužit jako charakteristika daného dialyzačního systému. Grafy spolu s celkovým zhodnocením a vysvětlením výsledků přiložte k protokolu. Použité roztoky a činidla 1. 1% roztok škrobu 2. roztok NaCl (c = 1,5 mol/l) 3. titrační roztok Hg(NO 3) 2 (c = 12,5 mmol/l) 4. difenylkarbazid 5. Lugolův roztok (4 g KI rozpustit ve 100 ml vody a přidat 1,3 g jodu) 44

45 Antioxidanty Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku, ROS (reactive oxygen species) a reaktivní formy dusíku, RNS (reactive nitrogen species), souhrnně označované RONS (Reactive Oxygen and Nitrogen Species). Tyto vysoce reaktivní látky zahrnují jak volné radikály, tak látky neradikálové podoby. Reaktivní formy kyslíku (ROS) Radikály Neradikály superoxidový aniont (superoxid) O2 - peroxid vodíku H2O2 Hydroperoxylový radikál HO2 kyselina chlorná HClO hydroxylový radikál HO ozon O3 peroxylové radikály ROO singletový kyslík 1 O2 alkoxylové radikály RO Reaktivní formy dusíku (RNS) Radikály Neradikály radikál oxidu dusnatého NO kyselina dusitá HNO2 radikál oxidu dusičitého NO2 oxid dusitý N2O3 peroxynitrit ONOO - alkylperoxynitrit RONOO - Volné radikály mohou být definovány jako molekuly, atomy či ionty, schopné samostatné existence mající alespoň jeden volný nepárový elektron ve valenční sféře. Volné radikály vznikají třemi různými způsoby: 1) homolytickým štěpením kovalentní vazby na dvě částice, z nichž každá má jeden elektron, toto štěpení vyžaduje příliš energie, a proto v biologických systémech prakticky nepřichází v úvahu 2) redukcí, tzn. přidáním jednoho elektronu 3) oxidací, tzn. ztrátou jednoho elektronu Reakce volných radikálů často probíhá formou řetězové reakce. Volný radikál se totiž stabilizuje vytržením elektronu z nejbližší molekuly, ze které se tak stává radikál. Tím dochází k propagaci radikálové reakce. Proces je ukončen až reakcí dvou radikálů. Touto oxidací může být postižena kterákoli biomolekula. Ke vzniku volných radikálů v organismu přispívají nejen exogenní vlivy, jako UV nebo X záření, kouření či intoxikace, ale také je vznik volných radikálů běžnou součástí metabolismu. Jedním z procesů, kde dochází v buňce ke vzniku velkého množství volných radikálů, je dýchací řetězec v mitochondriích. 45

46 Volné radikály ale nelze vnímat pouze jako zdroj poškození biomolekul, buněčných struktur, buněk a celých tkání. Volné radikály plní i řadu důležitých fyziologických funkcí. Například fagocyty využívají volné radikály k zabíjení mikroorganismů (jsou vybaveny enzymy NADPH oxidázou, která produkuje superoxid, a myeloperoxidázou, katalyzující syntézu kyseliny chlorné). Dále mohou plnit signální funkci, např. oxid dusnatý, který působí jako lokální mediátor. Nebo se uplatňují při biosyntézách (např. cyklooxygenázou produkovaný superoxidový radikál při biosyntéze prostaglandinů, hydroxylace za katalýzy monooxygenázami). Hlavní reaktivní formy kyslíku jsou meziprodukty redukce kyslíku na vodu. Přijetím jednoho elektronu se molekula kyslíku redukuje na superoxid, O2 + e - O2 - který se dalším elektronem redukuje na peroxid vodíku. O2 - + e - + 2H + H2O2 Superoxid podléhá také spontánní dismutaci, při které jedna jeho molekula poskytuje elektron druhé, takže dochází zároveň k oxidaci i redukci, jejímž produktem je kyslík a peroxid vodíku. Přestože ve vodném prostředí probíhá reakce velkou rychlostí, v biologických organismech je ještě urychlována enzymem superoxiddismutázou (SOD). O2 - + O H + O2 + H2O2 Peroxid vodíku je nejstabilnějším meziproduktem. Jeho reakce s biomolekulami jsou poměrně pomalé, avšak v přítomnosti přechodných kovů (Fe 2+, Cu + ) se ochotně redukuje za vzniku vysoce aktivního, toxického hydroxylového radikálu. H2O2 + Fe 2+ HO + OH + Fe 3+ Tuto redukci peroxidu vodíku v přítomnosti tranzitních kovů nazýváme Fentonova reakce. Hydroxylový radikál je nejnebezpečnější ze všech reaktivních forem kyslíku, neboť jako velmi silné oxidační činidlo vytrhuje elektron z nenasycených mastných kyselin, hydroxyluje aminokyseliny a báze nukleových kyselin. Za normálních okolností jsou reaktivní formy kyslíku v rovnováze s aktivitou tzv. antioxidantů. Podle biologické funkce se antioxidanty dělí na enzymové antioxidační systémy (superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza, glutathiontransferáza, kataláza) a na nízkomolekulární antioxidanty (kyselina askorbová, tokoferoly, karotenoidy, flavonoidy, glutathion, kyselina lipoová, koenzym Q, bilirubin, kyselina močová, atd.). Tyto látky jsou schopny reagovat s volnými radikály, aniž by se radikálová reakce dále propagovala, tj. ukončí existenci radikálu. Vyčerpání antioxidantů vede k poškození tkáně v důsledku procesů označovaných obecně jako tzv. oxidační stres. Míra schopnosti tkáně vzdorovat oxidačnímu stresu je určena jednak množstvím v ní přítomných antioxidantů, jednak jejich druhem. Parametr, který koreluje se schopností tkáně odolávat oxidačnímu stresu, je označován jako antioxidační kapacita. Obsah antioxidantů se stanovuje nepřímo jako tzv. celková antioxidační kapacita (Total Antioxidant Capacity - TAC), která představuje schopnost systému vzdorovat oxidačnímu stresu. 46

47 Měření celkové antioxidační kapacity Celková antioxidační kapacita (Total Antioxidant Capacity - TAC) popisuje souhrnnou schopnost systému vzdorovat oxidačnímu stresu. Pro stanovení celkové antioxidační kapacity existuje více různých metod, každá může ale hodnotit trochu něco jiného. V našich praktických cvičeních budeme používat dvě rozdílné metody: A) TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) Tato metoda vztahuje antioxidační aktivitu vzorku ke standardní látce - Troloxu, což je rozpustný syntetický analog vitaminu E. Principem metody je zhášení uměle připraveného stabilního radikálu ABTS [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)]. Působením peroxodisíranu draselného je ABTS převedeno na svůj stabilní radikál ABTS +. Tento radikál má tyrkysově modrou barvu. Přidáním vzorku s antioxidační aktivitou dochází ke konverzi radikálu zpět na neradikálovou bezbarvou formu, přičemž celková barva přechází na světle zelenou až bezbarvou. Tato změna se měří fotometricky při vlnové délce 734 nm. Trolox (analog vitaminu E) Vznik radikálu ABTS + působením peroxodisíranu; reakce radikálu ABTS + s antioxidantem (AOH) B) FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) Tato metoda popisuje celkovou redukční schopnost vyšetřovaného vzorku. Principem je redukce železitých komplexů Fe 3+ -TPTZ, které jsou téměř bezbarvé, na intenzivně fialové Fe 2+ -TPTZ produkty. Tato změna barvy se měří fotometricky při vlnové délce 593 nm. Výsledek se poté vyjádří jako ekvivalentní množství iontů Fe 2+. TPTZ (2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazin) 47

48 Úloha 1: Vytvoření kalibračních křivek Kalibrační křivka pro metodu TEAC bude v praktikárně k dispozici už hotová. Zpracujete jen kalibrační křivku pro metodu FRAP. Vytvořte kalibrační křivku pro metodu FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) 1) Do malých očíslovaných zkumavek připravte ředěním kalibrační roztoky síranu železnatého ze zásobního roztoku o koncentraci cfeso4 = 1 mmol/l. Vypočítejte výslednou koncentraci kalibračních roztoků. 2) Do paralelních zkumavek napipetujte 2 ml činidla FRAP. Z připravených kalibračních roztoků odeberte 50 l a přidejte je do zkumavek s činidlem v intervalu 30 sekund tak, že přesně po 10 minutách změříte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 593 nm. (Při přidání 50 l ze zkumavky 0 spustíte stopky, které necháte běžet, po 30 sekundách přidáváte 50 l z kalibračního roztoku 1 do paralelní zkumavky 1, atd. Přesně po 10 minutách provedete nulování na slepý vzorek, v 10 minut a 30 sekund první měření absorbance vzorku 1, atd.) číslo zkumavky zás. roztok FeSO 4 (l) destilovaná voda (l) c FeSO4 (mmol/l) 0 A ) Vytvořte kalibrační graf A 593 = funkce cfeso4 osa y A 593, osa x cfeso4 48

49 Úloha 2: Měření celkové antioxidační kapacity různých vzorků Dvěma metodami (TEAC a FRAP) změříte celkovou antioxidační kapacitu třech různých vzorků, nejdřív věnujte čas jejich přípravě: vzorek 1 krevní sérum už je připraveno k použití vzorek 2 sliny Odběr se provádí nejdříve 30 minut po jídle. Vyšetřovaná osoba si vloží do úst sací váleček. Mírným žvýkáním nebo převalováním v ústech po dobu 1 minuty dojde k nasátí slin do válečku. Vatový váleček se vloží zpět do příslušné centrifugační zkumavky Salivette, která se uzavře víčkem. K získání vzorku slin se provede odstředění (2 minuty, ot./min.). vzorek 3 antioxidační preparát ("tableta") Ve třecí misce rozetřete tabletu antioxidačního preparátu. Prášek přesypte do malé kádinky a rozpusťte v 5 ml destilované vody. Pro odstranění pevných částí přefiltrujte vzniklou suspenzi přes filtrační papír v nálevce do čisté zkumavky. Z takto vzniklého vzorku přepipetujte 1 ml do kádinky a zřeďte 100 ml destilované vody. Takto zředěný roztok antioxidačního preparátu bude sloužit jako vzorek. A) Metoda TEAC Do očíslovaných zkumavek napipetujte po 2 ml činidla ABTS. Ze vzorků přidávejte (s intervalem přesně 1 minuta) do příslušných zkumavek vždy po 50 l podle tabulky. Přesně po 10 minutách změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 734 nm. Z kalibrační křivky pro TEAC odečtěte odpovídající hodnoty koncentrace troloxu. číslo zkumavky - vzorek sérum 2 - sliny 3 - tableta činidlo ABTS (l) vzorek (l) dest. voda (l) A c TROLOX (mmol/l) 0 B) Metoda FRAP Do očíslovaných zkumavek napipetujte po 2 ml činidla FRAP. Ze vzorků přidávejte (s intervalem přesně 1 minuta) do příslušných zkumavek vždy po 50 l. Přesně po 10 minutách změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 593 nm. Z kalibrační křivky pro FRAP odečtěte odpovídající hodnoty koncentrace FeSO4. číslo zkumavky - vzorek sérum 2 - sliny 3 - tableta činidlo FRAP (l) vzorek (l) dest. voda (l) A c FeSO4 (mmol/l) 0 49

50 Úloha 3: Měření celkové antioxidační kapacity roztoků vitamínu C Do malých očíslovaných zkumavek připravte ředěním zásobního roztoku (c=1 mmol/l) vitamínu C roztoky vitamínu C o různé koncentraci. číslo zkumavky zás. roztok vit. C (l) dest. voda (l) c vitamín C (mmol/l) 0 A) Metoda TEAC Do nových zkumavek napipetujte po 2 ml činidla ABTS. Z připravených vzorků různých koncentrací vitamínu C odeberte 50 l a přidejte je s intervalem 1 minuta do zkumavek s činidlem. Přesně po 10 minutách od přidání změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 734 nm. Z kalibrační křivky pro TEAC odečtěte hodnoty koncentrace troloxu. číslo zkumavky činidlo ABTS (l) vzorek vit. C (l) A c TROLOX (mmol/l) 0 B) Metoda FRAP Do nových zkumavek napipetujte po 2 ml činidla FRAP. Z připravených vzorků různých koncentrací vitamínu C odeberte 50 l a přidejte je s intervalem 1 minuta do zkumavek s činidlem. Přesně po 10 minutách od přidání změřte absorbanci proti slepému vzorku (zkumavka č. 0) při 593 nm. Z kalibrační křivky pro FRAP odečtěte hodnoty koncentrace FeSO4. číslo zkumavky činidlo FRAP (l) vzorek vit. C (l) A c FeSO4 (mmol/l) 0 50

51 Enzymologie I 1) Specifita enzymů (sacharáza, α-amyláza) Princip: Sacharáza je enzym, který štěpí disacharid sacharózu na glukózu a fruktózu. Sacharáza vzniká v enterocytech tenkého střeva. Sacharáza z kvasnic (invertáza) je zaměřena na β- glykosidovou vazbu (jde o β-fruktofuranosidázu, její systematický název je β-dfruktofuranosid-fruktohydroláza). Tím se liší od sacharázové aktivity tenkého střeva savců, která patří mezi α-glykosidázy. α-amyláza štěpí α-1,4-glukosidové vazby polysacharidů. Výsledkem hydrolytického štěpení škrobu je maltóza. Maltóza je redukující cukr. Redukující sacharidy jsou schopny za vyšších teplot redukovat ionty těžkých kovů (např. Ag+, Cu2+, Bi3+). Enzymová hydrolýza škrobu prochází různými stádii, která se projeví také reakcí s jodem. Škrob se barví jódem temně modře, štěpné polysacharidy dextriny fialově (amylodextrin), purpurově až červeně (erytrodextrin), popř. se nebarví jódem vůbec (achrodextrin). Současně přibývá redukujících cukrů ve směsi. Roztoky: roztok škrobu pekařské kvasnice Lugolův roztok (roztok jodu roztok jódu v jodidu draselném) roztok Fehling I a Fehling II Provedení: 1. Příprava enzymového preparátu sacharázy: Na hodinovém sklíčku máte přibližně 0,5 g kvasnic, ke kterému přidejte 2 ml destilované vody a pomocí tyčinky rozpusťe. 2. Příprava enzymového preparátu -amylázy: viz návod k úloze: Závislost aktivity -amylázy na ph prostředí 3. Připravte si sadu 8 zkumavek, do kterých napipetujte roztoky dle tabulky. Lihovým fixem zkumavky očíslujte a označte je tak, abyste si je poznali (iniciály). ENZYM SUBSTRÁT amyláza 0,5 0,5 0, sacharáza ,5 0,5 0,5 - - destil. voda ,5 0,5 POVAŘENÍ - - ANO - - ANO škrob 2,0-2,0-2,0-2,0 - sacharóza - 2,0-2,0-2,0-2,0 Všechny zkumavky inkubujte 30 minut ve vodní lázni při 37 o C. Obsah každé zkumavky rozdělte přibližně na 2 poloviny. (do paralelní řady 8 zkumavek přelijte vždy asi polovinu obsahu příslušné zkumavky) 51

52 Jedna sada zkumavek: Proveďte Fehlingovu reakci: smíchejte 2 ml roztoku Fehling I a 2 ml roztoku Fehling II, do každé zkumavky přidejte 0,5 ml Fehlingova roztoku a povařte. Druhá sada zkumavek: Přidejte 5 ml destilované vody, kapku jodu a promíchejte. Výsledek Fehlingovy reakce Zbarvení vzniklé s jodem Úkoly: a) Zdůvodněte výsledky Fehlingovy reakce a reakce s jodem v jednotlivých zkumavkách. b) Do protokolu zapište ve strukturních vzorcích schéma hydrolýzy škrobu -amylázou a sacharózy kvasničnou sacharázou. Vyznačte vazby, které uvedené enzymy hydrolyzují. 52

53 2) Závislost aktivity -amylázy na ph prostředí Princip: Závislost aktivity enzymu na ph má obvykle Gaussovo rozložení a proto enzym vykazuje maximální aktivitu v relativně úzkém rozmezí hodnot ph. Tato oblast se označuje jako optimální rozmezí ph pro daný enzym, někdy se vztahuje přímo ke konkrétní hodnotě ph. Obvykle se však uvádí rozmezí hodnot ph, kdy se s 95% pravděpodobností dosáhne jeho maximální aktivity. Slinná α-amyláza se inaktivuje při ph 4,0 a nižším, což znamená, že v kyselém prostředí žaludku se její účinek zastaví. Pankreatická α-amyláza má ph optimum 7,1. Roztoky: 1% roztok škrobu (nepufrovaný) roztok jodu Na2HPO4 (0,2 mol/l) kyselina citronová (0,1 mol/l) Provedení: 1. Do sady 7 zkumavek připravených ve stojánku napipetujte složky pufrů podle tabulky. Lihovým fixem zkumavky očíslujte a označte je tak, abyste si je poznali (iniciály). Číslo zkumavky Na2HPO4 (ml) kys. citronová (ml) ph 1 2,9 2,1 5,6 2 3,1 1,9 6,0 3 3,5 1,5 6,4 4 3,8 1,2 6,8 5 4,3 0,7 7,2 6 4,7 0,3 7,6 7 4,9 0,1 7,8 2. Do každé zkumavky přidejte 1 ml roztoku škrobu. 3. Příprava enzymového preparátu -amylázy: Odběr slin provedete pomocí soupravy Salivette. Odzátkujte zkumavku, vyjměte z vrchní části žvýkací váleček a jemně žvýkejte nebo převalujte v ústech po dobu asi 1 minuty, aby došlo k nasátí slin do válečku. Vatový váleček pak vložte zpět do příslušné centrifugační zkumavky a uzavřete víčkem. Zkumavku odevzdejte laborantce. K získání vzorku slin se provede odstředění po dobu 3 minut při rychlosti 2000 ot./min. Všechny sliny nepipetujte do čisté zkumavky a přidejte 6 ml destilované vody, otáčením zkumavky obsah promíchejte. Tím získáte zředěnou slinu, kterou budete používat jako enzymový preparát -amylázy (i pro úlohu: Specifita enzymů!). 4. Do každé ze sedmi připravených zkumavek (obsahujících stejné množství substrátu škrobu, ale lišících se v ph) napipetujte 0,5 ml připraveného enzymového preparátu -amylázy. 5. Celou sadu sedmi zkumavek umístěte do vodní lázně zahřáté na 37 o C. Od okamžiku vložení do vodní lázně začněte měřit čas. 53

54 6. Aktivita -amylázy v připraveném enzymovém preparátu se může vzorek od vzorku velmi lišit. Pro vyhodnocení experimentu bude nutné ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni odebírat opakovaně vzorky v časových intervalech zhruba 5-10 minut (v žádném případě ne delších!). 7. Odběr vzorků a vyhodnocování: Z každé zkumavky inkubované ve vodní lázni odpipetujte 1 ml roztoku do další čisté označené zkumavky. Zbytek směsi nechte dále inkubovat ve vodní lázni (pro případné další odběry). K odebraným vzorkům přidejte 5 ml destilované vody, kapátkem kapku roztoku jodu a důkladně obsah zkumavek promíchejte. Proveďte zhodnocení. Není-li vyhodnocení ještě možné (ve všech zkumavkách je stále přítomen nehydrolyzovaný škrob), pokračujte v odběrech nových vzorků ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni (viz bod 6 návodu). Otázky: a) Které ph je pro aktivitu -amylázy nejvhodnější? b) Jaké barvu poskytuje jod se škrobem a jaké barvy vznikají s hydrolytickými produkty? Uveďte pořadí, v jakém se vyskytují s postupující hydrolýzou. 54

55 3) Stanovení α-amylázy v moči a) EPS Princip: Pro stanovení enzymové aktivity α-amylázy se používá syntetický substrát 4-nitrofenylmaltoheptaosid-etyliden. α-amyláza jej štěpí na menší oligosacharidy, které jsou hydrolyzovány α glukosidázou za uvolnění 4-nitrofenolu. Katalytická koncentrace je určena stupněm vzniku 4-nitrofenolu a měří se při 405 nm. Roztoky: pracovní roztok (4-nitrofenyl-maltoheptaosid-etyliden) vzorek vlastní moči Provedení: 1. Fotometr ECOM E 6125 zapněte hlavním vypínačem na zadní straně a zapněte i tiskárnu. 2. Pomocí tlačítka ABSORBANCE zvolte šipkami vlnovou délku 405nm a potvrďte tlačítkem ENTER. 3. Několikrát propláchněte kyvetu fotometru destilovanou vodou. 4. Proveďte měření slepého vzorku (destilovaná voda) BLANK a potvrďte tlačítkem ENTER. Kyvetu opět několikrát propláchněte destilovanou vodou. 5. Příprava vzorku: Do zkumavky Eppendorf automatickou pipetou pipetujte: 20 µl vzorku moči a 1000 µl pracovního roztoku, promíchejte a vpravte do kyvety, na stopkách spusťte čas. Ve 2., 3., 4., 5. minutě stlačte tlačítko ENTER (tisk absorbance A), respektive odečtěte absorbanci na displeji fotometru. 6. Po měření vzorku moči jej odstraňte z kyvety a několikrát kyvetu propláchněte destilovanou vodou. 7. Zkontrolujte vytištění výsledků, vypněte fotometr. Výpočet: Ze získaných hodnot absorbancí vypočítejte průměr A/min a dosazením do vzorce stanovte aktivitu α-amylázy ve vzorku moči (měření při reakční teplotě 37⁰C). A1= A3 A2 A2= A4 A3 průměr A /min = A3= A5 A4 µkat/l = A /min x 105,9 (koeficient přepočtu) Referenční hodnoty (při 37⁰): do 20 µkat/l 55

56 b) Wohlgemuthova metoda -amyláza je produkována především pankreatem a také ve slinných žlázách a normálně je odváděna do zažívacího traktu. Do krve se dostává fyziologicky jen nepatrné množství. Vzhledem k tomu, že -amyláza má poměrně malou molekulu, prochází glomerulární filtrací do moči. Princip: -amyláza štěpí škrob, jehož hydrolýzu sledujeme reakcí s jodem. Moč zředíme geometrickou řadou a zjišťujeme poslední zředění, v němž ještě došlo k hydrolýze škrobu. Výhodou metody je to, že nevyžaduje téměř žádné laboratorní zařízení. Roztoky: fyziologický roztok (0,9% NaCl) roztok škrobu roztok jodu vzorek vlastní moči Provedení: Ředění moči geometrickou řadou (kvocient ½) 1. Ve stojánku máte 10 zkumavek. Do všech kromě první dejte 1 ml fyziologického roztoku. Jak můžete postupovat: Pomocí skleněné pipety (10 ml) a balónku - Skleněnou pipetu naplňte po horní značku (tj. bude v ní 10 ml), do jednotlivých zkumavek budete upouštět vždy po 1 ml. Tedy jedno naplnění pipety bude stačit na všech 9 zkumavek. K dispozici je i automatická pipeta (1000 l) s příslušnou špičkou. Fyziologický roztok (1 ml) 2. Do 1. a 2. zkumavky odměřte po 1 ml moči (skleněná pipeta - tenká - na objem 1ml, balónek). Moč (1ml) 56

57 3. Obsah 2. zkumavky promíchejte a přeneste z ní 1 ml do 3. zkumavky, opět promíchejte a 1 ml přeneste do 4. zkumavky atd., takže po promíchání se přenáší vždy 1 ml do následující zkumavky, z poslední zkumavky pak odebraný přebytečný 1 ml vylijte do odpadu. 1 ml Tím jste dosáhli geometrického ředění (s kvocientem ½), tzn. že v každé další zkumavce je vždy poloviční koncentrace než v té předcházející viz obr.: 1 ½ ¼ atd. 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x atd. ř. ř. ř. ř. ř. ř. ř. 4. Do každé zkumavky přidejte 2 ml roztoku škrobu a nechte celou řadu zkumavek inkubovat 15 minut ve vodní lázni při 45C. 5. Vyjměte zkumavky z vodní lázně, nechte je vychladnout. 6. Do každé zkumavky přidejte kapku roztoku jodu a obsah promíchejte. V posledních zkumavkách zpravidla zůstane nehydrolyzovaný škrob, takže se v nich vyvine tmavě modré zbarvení jodoškrobové reakce. Zajímá nás poslední zkumavka, v níž ještě proběhla hydrolýza, tj. v níž není přítomno modročerné zbarvení. Výpočet: Výsledek se udává ve Wohlgemuthových jednotkách (W.j.). Při postupu, který jsme použili, získáte výsledek tak, že faktor ředění v poslední zkumavce, kde ještě proběhla hydrolýza, vynásobíte dvěma. Př.: jedná-li se o zkumavku č.4: ředění 8x 8 x 2 = 16 W.j. Wohlgemuthovy jednotky (W.j.) numericky odpovídají přibližně μkat amylázy / l. 57

58 Enzymologie II 1) Stanovení Michaelisovy konstanty kyselé fosfatázy Princip: Fosfatázy štěpí esterové vazby fosforečné kyseliny, takže uvolňují fosfát a příslušný alkohol. Pro sledování enzymové aktivity je výhodné použít syntetický substrát, který umožní přímé fotometrické stanovení: + + O 2 N PO - 2 H O 4 2 O 2 N OH HPO 2-4 p-nitrofenylfosfát p-nitrofenol (bezbarvý) (žlutý v alkalickém prostředí) Reakci provedeme při různých koncentracích substrátu a budeme sledovat závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu a graficky vyjádříme v systému dvojích reciprokých hodnot. Roztoky: citrátový pufr ph 4,96 (přibližně 0,01 mol/l) roztok substrátu (4-nitrofenolát, sodná sůl) 2,5 mmol/l v citrátovém pufru inhibiční roztok (0,1 mol/l NaOH 0,03 mol/l EDTA) roztok enzymu (kyselá fosfatáza v eppendorfce ) Provedení: Přečtěte celý návod před zahájením vlastní práce K dosažení dobrých výsledků je nutné pipetovat přesné objemy roztoků a dodržovat dobu inkubace! 1. Do stojánku připravte a označte 10 zkumavek. 2. Mechanickými mikropipetami napipetujte podle následující tabulky nejdříve citrátový pufr a teprve potom substrát (lze použít stejnou špičku na pipetu), po dokončení práce špičku vyhoďte. Zkumavka č Citrátový pufr [l] Substrát [l] Sadu zkumavek umístěte do vodní lázně 37C teplé a nechte je předehřát 5 minut. Mezitím přineste enzym z ledničky (kyselá fosfatáza v Eppendorf zkumavce), připravte stopky a pipetu na 50 l s čistou špičkou. 4. Další práci zorganizujte tak, že jeden student(ka) pipetuje enzym a druhý student(ka) měří čas a hlásí jej tak, aby pipetování enzymu proběhlo v naprosto přesných 20 sekundových intervalech. Pipetující student/ka nejprve nasaje roztok enzymu do špičky pipety, pak vyjme první zkumavku z vodní lázně, zavede špičku pipety do zkumavky asi 0,5 cm nad hladinu, ale substrátu se nesmí dotknout. Z této vzdálenosti vypustí enzym do roztoku substrátu (nikoliv tedy na stěnu zkumavky) a ve stejný 58

59 moment druhý student/ka stiskne stopky. Zkumavkou pak lehce zatřepe a okamžitě ji vrátí do vodní lázně. Stopky necháme běžet po celou dobu pokusu. 5. Připravte další enzym a druhou zkumavku, do které přesně za 20 sekund rovněž přidejte enzym a tak pokračujte. Intervaly mezi jednotlivými zkumavkami musí být vždy stejné 6. Připravte inhibiční roztok, který ukončí enzymovou reakci. Láhev je opatřena dávkovačem. Přesně za 10 minut od přidání enzymu do první zkumavky přidejte do téže zkumavky 2 ml inhibičního roztoku a promíchejte. Zkumavku již nevracejte do vodní lázně. Do dalších zkumavek přidávejte inhibiční roztok přesně ve stejných intervalech, jako jsme přidávali enzym, takže ve všech zkumavkách probíhá reakce naprosto stejnou dobu, tj. 10 minut. Po zpracování všech zkumavek stopky zastavte. 7. Změřte absorbanci všech vzorků proti vodě při 405nm na fotometru. Měřte od 1. do 10. zkumavky bez vyplachování kyvet, pouze je vylejte a obrácením a kontaktem s buničinou odsajte tekutinu. 8. Změřené hodnoty vložte do tabulky v počítači. Vypočítejte a vložte též koncentraci substrátu (p-nitrofenylfosfát) v každém reakčním vzorku. Koncentrace základního roztoku substrátu je 2,5 mmol/l. Změřená absorbance je úměrná enzymové reakční rychlosti v každé zkumavce, protože reakční rychlost znamená množství přeměněného substrátu za jednotku času. V tomto případě výsledek představuje množství produktu vzniklého za 10 minut. Program vytvoří Lineweaverův-Burkův graf, tj. závislost 1/v na 1/[S] a zobrazí rovnici pro danou přímku. Výpočet: Michaelisovu konstantu zjistěte výpočtem z rovnice nebo odečtením z grafu, kde ovšem čteme hodnotu -1/KM. Zpracujte konečný protokol, jehož částí je výtisk tabulky a grafu. 59

60 2) Sledování aktivity katalázy Princip: Kataláza erytrocytů je součástí systému, který odbourává nežádoucí reaktivní formy kyslíku, respektive jejich produkty. Kataláza uvolněná z erytrocytů rozkládá peroxid vodíku. Koncentraci substrátu, tj. peroxidu vodíku, stanovujeme manganometricky. Roztoky: roztok substrátu (0,01 mol/l peroxidu vodíku v 0,1 mol/l fosforečnanového pufru ph 6,8) odměrný roztok KMnO4 (0,32 g KMnO4 do 1l) kyselina sírová (1 mol/l) roztok enzymu (hemolyzovaná krev 100x zředěná) Provedení: 1. Připravte si 10 titračních baněk, které označíte 0-9 a do každé připravíte 2,5 ml kyseliny sírové. Kyselina sírová zastaví později enzymovou reakci a je rovněž nezbytná pro manganometrické stanovení. 2. Připravte enzymovou reakci: Do 100 ml Erlenmayerovy baňky odměřte 60 ml roztoku substrátu (pufrovaný roztok peroxidu vodíku) a vložte též magnetické míchadlo. Postavte na magnetickou míchačku, zapněte ji a seřiďte míchání. 3. Připravte si 5 ml pipetu na odběr vzorků a proveďte první odběr, tj. přenesete 5 ml substrátu do titrační baňky č. 0. Pipeta se nesmí kontaminovat kyselinou sírovou, jinak by se nedala použít pro další odběry. 4. Odměřte 1 ml roztoku enzymu (hemolyzovaná krev 100x zředěná) a přidejte k substrátu. V okamžiku přidání stiskněte stopky a nechte je běžet. 5. Připravte si 5 ml pipetu pro odebírání vzorků a odebírejte vzorky v minutových intervalech a ihned přenášejte do připravených titračních baněk. Rozhodujícím okamžikem není moment odebrání, nýbrž okamžik vypuštění obsahu pipety do baňky s kyselinou sírovou, která zastavuje reakci. Tzn., že vzorek nasajete několik sekund před celou minutou a obsah pipety vypustíte do baňky přesně v určený moment. Všechny vzorky titrujte pomocí manganistanu a stanovte koncentraci substrátu (peroxidu vodíku) v jednotlivých vzorcích. 6. Zopakujte celý pokus s desetkrát zředěným roztokem enzymu, tzn. celkové zředění je 1000x, (1ml roztoku enzymu + 9 ml vody nebo přidejte k substrátu pouze 0,1 ml roztoku enzymu). 7. Hodnoty získané titrací vložte do tabulky v počítači připravené v programu Excel. Program doplní hodnoty v tabulce a vytvoří grafické vyjádření změn koncentrací substrátu na čase a změn rychlosti enzymové reakce na čase. 8. Posuďte kinetiku a pokuste se odhadnout řád reakce. 9. Výtisk počítačového zpracování připojte k vašemu protokolu. 60

61 Enzymologie III 1) Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy v séru Princip: Laktátdehydrogenáza katalyzuje přeměnu pyruvátu na laktát za současné oxidace NADH na NAD +. Rychlost úbytku absorbance NADH při 340nm se využívá ke kinetickému stanovení aktivity enzymu. Roztoky: pracovní roztok - 4 ml činidla R1 (tris 127 mmol/l, ph 7,2, NaCl 323 mmol/l, pyruvát 2,5 mmol/l) a 1 ml R2 (NADH 6,6 mmol/l) sérový standard vyšetřované sérum Provedení: 1. Zapněte fotometr Libra S 6 + (vyhřívaný na 37 C). Dle přiloženého návodu nastavte vlnovou délku 340nm. 2. Do fotometru vložte skleněnou kyvetu určenou pro měření LDH. 3. Pomocí pipety 1000 µl napipetujte do kyvety slepý vzorek (destilovaná voda) a proveďte měření slepého vzorku A = 0, Skleněnou kyvetu vyprázdněte a vložte zpět do fotometru. 5. Stanovení aktivity standardu: Do eppendorfky napipetujte 20 μl standardu a 1000 μl pracovního roztoku, spusťte stopky, promíchejte roztok 2x nasátím do pipety na 1000 μl a neprodleně vpravte do kyvety. Na konci 2., 3., 4. a 5. minuty stlačte zelené tlačítko (pro měření absorbance) a na displeji fotometru odečtěte absorbanci. Po změření standardu obsah odstraňte a kyvetu několikrát propláchněte destilovanou vodou. 6. Stanovení aktivity vzorku: Do eppendorfky napipetujte 20 μl vzorku a 1000 μl pracovního roztoku, spusťte stopky, promíchejte roztok 2x nasátím do pipety na 1000 μl a neprodleně vpravte do kyvety. Na konci 2., 3., 4. a 5. minuty stlačte zelené tlačítko (pro měření absorbance) a na displeji fotometru odečtěte absorbanci. Po analýze vzorku obsah odstraňte a kyvetu několikrát propláchněte destilovanou vodou. 7. Získané hodnoty zadejte do připravené tabulky v počítači (LD, letní semestr). 61

62 2) Sledování aktivity aminotransferáz ALT a AST v jaterním extraktu Princip: Metoda je založena na rozdílné světelné absorpci 2,4-dinitrofenylhydrazonů kys. 2-oxoglutarové a pyrohroznové, která vzniká u reakce ALT přímo, u reakce AST po spontánní dekarboxylaci oxalacetátu. Při sledování aktivity jaterního enzymového preparátu demonstrujeme pouze přítomnost aminotransferáz, při vyšetření séra určujeme aktivitu z kalibrační křivky, sestrojené podle absorpcí různě koncentrovaných hydrazonů pyrohroznové kyseliny. Roztoky: substrát ALT (DL-alanin, 2-oxoglutarát, fosfátový pufr ph 7,4) substrát AST (L-aspartát, 2-oxoglutarát, fosfátový pufr ph 7,4) roztok 2,4-dinitrofenylhydrazinu (DNP-hydrazin rozpuštěný za horka v HCl) NaOH (0,4 mol/l) fosforečnanový pufr, ph 7,4 Provedení: 1. Do 4 připravených zkumavek napipetujte roztoky dle tabulky: ALT AST pokusná porovnávací pokusná porovnávací substrát ALT 0,50 ml 0,50 ml - - substrát AST - - 0,50 ml 0,50 ml 2. Zkumavky preinkubujte 10 minut při 37 o C ve vodní lázni. 3. Příprava jaterního extraktu (enzymového preparátu) (1x pro celý pracovní stůl): Asi 1 cm 3 jaterní tkáně (už připraveno na pracovním stole) rozdrťte v třecí misce, přidejte 5 ml fosforečnanového pufru a ještě chvíli pokračujte v homogenizaci. Celý obsah třecí misky ( homogenát ) přeneste do centrifugační zkumavky a zkumavku odevzdejte laborantce (odstředění 5min/2000 ot.). Supernatant použijete jako enzymový preparát. 4. Do vlastních pokusných zkumavek přidejte získaný enzymový preparát (jaterní extrakt): jaterní extrakt 0,10 ml - 0,10 ml - 5. Všechny 4 zkumavky inkubujte 30 minut při 37 o C, pak přidejte do všech zkumavek roztok dinitrofenylhydrazinu: dinitrofenylhydrazin 0,50 ml 0,50 ml 0,50 ml 0,50 ml 6. Obsah zkumavek promíchejte a nechte stát 15 minut. 62

63 7. Do všech zkumavek napipetujte roztok NaOH: NaOH 5,00 ml 5,00 ml 5,00 ml 5,00 ml 8. Jaterní extrakt přidejte i do porovnávacích zkumavek: jaterní extrakt - 0,10 ml - 0,10 ml 9. Obsah zkumavek promíchejte. Na spektrofotometru při nastavené vlnové délce 506nm změřte za 5 minut absorbanci zkumavky č.1 proti zkumavce č.2 (odpovídá aktivitě ALT) a absorbanci zkumavky č.3 proti zkumavce č.4 (odpovídá aktivitě AST). 10. Výslednou hodnotu aktivity ALT a AST odečtěte z kalibračních grafů. 11. Výsledek zhodnoťte. Referenční hodnoty: AST, ALT do 0,67 μkat/l 63

64 3) Stanovení aktivity alkalické fosfatázy v séru Princip: Alkalická fosfatáza (alkalická fosfohydroláza monoesterů kys. trihydrogenfosforečné) štěpí 4- nitrofenylfosfát na 4-nitrofenol a trihydrogenfosfát. Mírou aktivity enzymu je množství uvolněného 4-nitrofenolu, který se stanovuje fotometricky v alkalickém prostředí. Roztoky: pufr (roztok báze a hydrochloridu methylglutaminu s MgSO4) substrát (dvojamonná sůl 4-nitrofenylfosfátu s glukózou) zředěný roztok inhibitoru (Chelaton 3 v NaOH) sérum (sérum najdete v malé plastové zkumavce - Eppendorf zkumavka) Provedení: 1. Do 2 připravených zkumavek napipetujte roztoky dle tabulky: Při pipetování malého objemu séra je třeba pracovat velice pečlivě, dbát na to, aby se sérum dostalo na dno zkumavky - sérum nesmí ulpět na stěně zkumavky! zkumavka č.1 vzorek zkumavka č.2 porovnávací roztok pufr 1,00 ml 1,00 ml sérum 0,02 ml - 2. Obsah zkumavek promíchejte a přeinkubujte 5 minut při 37 o C ve vodní lázni. 3. Přidejte do obou zkumavek substrát: substrát 0,20 ml 0,20 ml 4. Inkubujte přesně 10 minut při 37 o C, pak enzymovou reakci zastavte přidáním inhibitoru: inhibitor 0,50 ml 0,50 ml 5. Do zkumavky obsahující porovnávací roztok přidejte 0,02 ml séra: sérum - 0,02 ml Tím dosáhnete toho, že obě zkumavky obsahují to samé. Ale do zkumavky obsahující porovnávací roztok bylo sérum přidáno až po přidání inhibitoru. Enzym obsažený ve vyšetřovaném séru tedy zpracovával substrát pouze ve zkumavce č.1, čím více enzymu je ve vyšetřovaném séru přítomno, tím více substrátu se ve zkumavce č.1 přeměnilo na barevný produkt. 6. Obsah zkumavek promíchejte. Na spektrofotometru při nastavené vlnové délce 420nm změřte absorbanci (A) vzorku (zkumavka č.1) proti porovnávacímu roztoku (zkumavka č.2). 64

65 Výpočet: Výpočet katalytické koncentrace ALP ve vyšetřovaném séru: Výsledek zhodnoťte. ALP (kat/l) = A 10,236 Referenční hodnota: do 2,30 kat/l dospělý do 7,00 kat/l dítě 65

66 Enzymologie IV 1) Kompetitivní inhibice sukcinátdehydrogenázy malonátem Princip: Aktivitu sukcinátdehydrogenázy budeme demonstrovat přímo na mitochondriích, a to pomocí umělého přenašeče elektronů. Jako elektronový akceptor poslouží ferrikyanid draselný, ( červená krevní sůl ), který se přijetím elektronů redukuje na ferrokyanid draselný ( žlutá krevní sůl ). Tento přechod můžeme dobře fotometricky sledovat, je provázen blednutím žlutého roztoku ferrikyanidu. Vzhledem k tomu, že v mitochondriích jsou přítomny všechny články terminálních oxidací, je třeba zabránit přestupu elektronů z redukované formy koenzymu přirozenou cestou, tj. přes koenzym Q a cytochromy na kyslík. Tuto cestu zablokujeme v našem experimentu kyanidem draselným, který selektivně inhibuje cytochromový systém. sukcinát KCN 1/2 O2 sukcinátdehydrogenáza 2e - cytochromy fumarát O 2- [Fe 3+ (CN)6] [Fe 2+ (CN)6] (sytě žlutý) (světle žlutý) Na takto uspořádaném pokusu můžeme snadno sledovat kinetiku enzymové reakce i účinky inhibitorů, např. kompetičního inhibitoru sukcinátdehydrogenázy, malonátu. (Ten se mj. uplatnil při objevu metabolitů citrátového cyklu.) Roztoky: ph roztoků je upraveno na 7,2 sukcinát (jantaran) sodný (0,2 mol/l) kyanid draselný (0,1 mol/l) ferrikyanid draselný (0,01 mol/l) malonát sodný (0,01 mol/l) fosforečnanový pufr ph 7,2 (0,1 mol/l) vzorek zmraženého srdce k přípravě enzymového preparátu Provedení: 1. Do 250 ml kádinky připravte kostky ledu, které vyjměte z mrazničky, proudem vody je uvolněte ze zásobníku, přidejte trochu studené vody a máte tak připravenu ledovou lázeň pro přípravu enzymového preparátu. 2. V kalibrované zkumavce nařeďte fosforečnanový pufr 5x destilovanou vodou (2ml pufru + 8 ml destilované vody), promíchejte a umístěte do ledové lázně. 3. Příprava tkáňového homogenátu ze zmražené srdeční tkáně: Preparát mitochondrií nesmí obsahovat červené krevní a svalové barvivo (interferuje při fotometrii), proto je nutno ještě před vlastní homogenizací zbavit tkáň krve a hemoglobinu. Svalovinu rozstříhejte na kousky do vychlazené třecí misky, tlakem pestíku 66

67 rozdrťte a 2-3x suspendujte v ledovém zředěném fosfátovém pufru. Tkáňovou drť přeneste do vychlazené centrifugační zkumavky a krátce odstřeďte (5min/2000 ot.). V průběhu přípravy preparátu mitochondrií jeden student ze skupiny připraví reakční roztoky (bod 5 tohoto návodu). 4. Supernatant opatrně slijte do odpadu a sediment, který již musí být bezbarvý, vraťte do třecí misky ke konečné homogenizaci, kterou usnadníte přidáním skleněných střípků (použijte ochranné brýle!). Ke tkáňové drti pak přidejte asi 3 ml vychlazeného zředěného fosforečnanového pufru, rozmíchejte a přeneste do centrifugační zkumavky. Odstřeďujte 5 minut při 2000 otáčkách. Po odstředění opatrně slijte supernatant, tvořený především suspenzí mitochondrií. Ta představuje náš enzymový preparát sukcinátdehydrogenázy. Mitochondrie jsou velmi choulostivé struktury, a proto je uchovávejte v ledové lázni. 5. Příprava základního roztoku: V Erlenmayerově baňce smíchejte 3 ml kyanidu, 3 ml ferrikyanidu a 10 ml fosforečnanového pufru (neředěného). 6. Do reakčních zkumavek pipetujte roztoky podle schématu: Zkumavky základní roztok (ml) 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml - jantaran (ml) 1,0 ml 1,0 ml - - malonát (ml) - 0,5 ml 0,5 ml - destilovaná voda (ml) 0,5 ml - 1,0 ml 3,5 ml 7. Zapněte fotometr, nastavte vlnovou délku 415nm, a připravte celkem 3 fotometrické kyvety a stopky. K fotometru přeneste reakční zkumavky 1 4 ve stojánku, enzymový preparát v ledové lázni a pipetu na 0,5 ml. 8. Do zkumavky č.4 (destilovaná voda) přidejte 0,5 ml enzymového preparátu, promíchejte a nalijte do kyvety. Tím jste připravili slepý vzorek, proti němuž nastavte fotometr na nulovou absorbanci. Zbylé dvě fotometrické kyvety označte na boku (matná plocha) číslicemi 1 a Do zkumavky č.1 přidejte rovněž 0,5 ml enzymového preparátu, promíchejte a ihned naplňte kyvetu č. 1 a změřte její absorbanci v čase 0. V okamžiku změření spusťte stopky. Další student provede ihned zápis hodnoty absorbance, protože ta se rychle mění (klesá). 10. Rychle napipetujte 0,5 ml enzymového preparátu též do reakční zkumavky č.2, promíchejte, naplňte kyvetu č.2, vložte do fotometru místo kyvety č.1 a změřte absorbanci v kyvetě č.2. Okamžik měření musí být přesně 30 sekund po změření zkumavky č Pak opět kyvety vyměňte a připravte se na změření absorbance v kyvetě č.1 přesně 60 sekund po prvém měření. Měřte tedy každou kyvetu v jednominutových intervalech, se vzájemným posunem o 30 sekund. Celkem proveďte 20 měření každé kyvety. 67

68 12. Zpracujte ještě reakční zkumavku č.3, která je kontrolní, neboť neobsahuje substrát, pouze inhibitor. I k ní přidejte 0,5 ml enzymového preparátu a měřte v minutových intervalech. Zde nepozorujeme pokles absorbance, jen nepatrný, který představuje systematickou chybu metody. 13. Hodnoty absorbance všech 3 reakcí zapište do tabulky v programu Excel, který pak graficky reakci zpracuje. 14. Proveďte vyhodnocení a závěr. 15. Pečlivě vymyjte kyvety, pipety a ostatní nádobí, uveďte pracoviště do pořádku. 68

69 2) Stanovení aktivity aldolázy Princip: Aldoláza štěpí fruktózu-1,6-bisfosfát na glyceraldehyd-3-p a dihydroxyaceton-p, které dokážeme reakcí s dinitrofenylhydrazinem. Hemolýza ovlivňuje výsledky vyplavením enzymu z červených krvinek. Roztoky: roztok fruktóza-1,6-bisfosfát (0,02 mol/l) o ph 7,4 roztok kys. monojodoctové (0,002 mol/l, pomocí NaOH upraveno ph na 7,4) roztok hydrazinsulfátu (ph upraveno na 7,4) kollidinový pufr (2,4,6-trimethylpyridine, úprava ph na 7,4) roztok dinitrofenylhydrazinu ve 2M HCl kys. trichloroctová roztok NaOH (3%) sérum hemolyzované sérum Provedení: 1. Napipetujte do 4 centrifugačních zkumavek: zkumavka č. 1 pokusná zkumavka č. 2 slepá zkumavka č. 3 pokusná zkumavka č. 4 slepá kollidinový pufr 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml sérum 0,2 ml 0,2 ml - - hemol. sérum - - 0,2 ml 0,2 ml hydrazinsulfát 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml kys. monojodoctová 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml kys. trichloroctová - 0,4 ml - 0,4 ml 2. Zkumavky promíchejte, nechte předehřát 5 minut ve vodní lázni 37 C teplé. 3. Do všech zkumavek přidejte 0,1 ml roztoku fruktóza-1,6-bisfosfát, promíchejte a inkubujte ve vodní lázni při 37 C 20 min. Ve zkumavkách s přidanou kys. trichloroctovou reakce neprobíhá. 4. Po ukončení inkubace přidejte 0,4 ml kys. trichloroctové i do zkumavek č. 1 a 3. Sraženinu proteinů odstraňte ve všech zkumavkách odstředěním (10 min/2500 ot.). 5. Připravíme 4 stejně označené tenkostěnné zkumavky. Ze supernatantu po odstředění odebereme po 0,5 ml a přeneseme do těchto nových zkumavek. Mezi jednotlivými odběry pipetu vyplachujeme nasátím destilované vody. 6. Do všech zkumavek odměříme 0,5 ml 3% roztoku NaOH a směs necháme stát 5 min při laboratorní teplotě. 69

70 7. Nyní přidáme do každé zkumavky 0,5 ml dinitrofenylhydrazinu a důkladně promícháme. Zkumavky přeneseme do vodní lázně 37 C teplé, po 5 minutové inkubaci přidáme ještě 3 ml 3% NaOH a vzorky ponecháme dalších 5 minut stát při laboratorní teplotě. 8. Intenzitu zbarvení zjistíme proměřením pokusných zkumavek proti slepým v 1 cm kyvetách při 540nm. Výpočet aktivity aldolázy: [μkat/l] = A x 0,98 Zhodnoťte své výsledky a určete, o kolik procent se liší aktivita aldolázy v hemolyzovaném séru. Referenční hodnota: do 50 nkat/l 70

71 3) Sledování aktivity mléčné xanthinoxidoreduktázy Princip: Xanthinoxidoreduktáza (XOR) je komplexní molybden obsahující flavoprotein. Xanthinoxidoreduktáza v mléce oxiduje v tomto pokusu formaldehyd na kyselinu mravenčí a elektrony předává methylenové modři, která tím přechází na redukovanou (bezbarvou) leukoformu. Jestliže obsah zkumavky protřepeme, vzdušný kyslík regeneruje leukoformu na původní oxidovanou methylenovou modř. To můžeme opakovat až do vyčerpání formaldehydu. Popsanou reakci je možno použít jako jednoduchý test na pasterizaci či povaření mléka. Vyšší teploty způsobí denaturaci xanthinoxidázy, takže přidání formaldehydu odbarvení methylenové modři nemůže vyvolat. Roztoky: roztok methylenové modři 0,01% roztok formaldehydu 2,0% nepasterizované mléko Provedení: 1. Odměřte do 4 zkumavek: Zkumavky Čerstvé mléko 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Zkumavky č. 3 a 4 povařte nad kahanem (opatrně!), čímž zdenaturujeme enzym. Dále přidávejte dle schématu: Methylenová modř 5 kapek 5 kapek 5 kapek 5 kapek Formaldehyd 5 kapek - 5 kapek - 2. Všechny zkumavky protřepejte a umístěte do vodní lázně 37º C. Sledujte, ve které zkumavce dojde k odbarvení a zdůvodněte proč. 3. Zkumavku, ve které došlo k úplnému odbarvení, vyjměte z lázně a energicky protřepejte až do zmodrání obsahu. Pak pokračujte v inkubaci. 4. Vyčkejte opět do úplného odbarvení, znovu protřepejte. Celý cyklus opakujte několikrát, až se methylenová modř přestane odbarvovat v důsledku úplného vyčerpání zásoby substrátu. 5. Přesvědčte se, že po přidání několika dalších kapek formaldehydu počne reakce probíhat znovu. 71