Rychlost vzniku produktu podle rovnice Michaelise-Mentenové: je maximální rychlost max je maxim i saturaci substrátem: v = K = (k + k )/k

Transkript

1 ENZYMOVÉ BIOSENSORY

2 BIOKATALYTICKÉ SENSORY rekognikační prvek je enzym = bílkovina, která biokatalyticky přemění určitý specifický substrát na produkt. V nejjednodušším případě lze popsat schématem: k Enzym + Substrát 1 k Enzym-Substrát 2 Enzym + Produkt k-1 Rychlost vzniku produktu podle rovnice Michaelise-Mentenov Mentenové: v = V K max m + S [ S] V max je maximáln lní rychlost při i saturaci substrátem: tem: K m = (k -1 + k 2 )/k 1

3 Pro enzymové sensory platí upravená rovnice Michaelise-Mentenov Mentenové: Rychlost v nín vystupuje jako měřm ěřený signál Snaha udržet koncentraci substrátu tu mnohem nižší než je K m, protože e pak závisz visí odezva lineárn rně na koncentraci substrátu, tu, pro [S] < < K m a [S] v jmenovateli zanedbat Při i imobilizaci enzymů v biosensorech dochází obvykle ke změně K m, takže e se dád určit jen zdánliv nlivá hodnota. v = V K max m + S [ S]

4 Typ biorekognikační vrstvy purifikovaný enzym biologický materiál l (buňky, tkáňov ové řezy) jeden enzym nebo dva i více, v které spolu kooperují-katalyzuj katalyzují následné reakce nebo recyklační procesy

5 stanovení substrátů stanovení inhibitorů stanovení aktivity enzymů

6 Stanovení substrátů ANALYT PŘEVODNÍK substrát t imobilizovaného enzymů elektroda nebo optický systém

7 Příklady stanovení látek jako substrátů sacharidy alkoholy a fenoly kyseliny aminokyseliny dusíkaté látky purinové báze estery a amidy triglyceridy fosfolipidy penicilin

8 GLUKOSA Sacharidy Význam: Hodnoty. Léčba: v klinické biochemie v potravinářstv ství normáln lní: : 5 mm, patologické: : aža 50 mm inzulin Požadavky na biosensor: rozsah: do 20 mm, limit detekce 0,1 mm koncentrace glukosy v krvi není stabilní,, ale klesá za hodinu aža o 10% stabilizace pomocí NaF a detergentů

9 GLUKOSA Biorekognikační vrstva glukosaoxidasa EC Aspergillus niger Penicillinum notatum dimer se dvěma FAD kovalentně vázaný na podjednotky 16% glykosylových zbytků M r 160 kda specifická aktivita 200 U/mg (i více, poměrně stabilní) oxiduje pouze β-formu glukosodehydrogenasa EC , PQQ Acinetobacter calcoaceticus snadno přenáší elektrony na mediátory (ferrocen) má vysoké číslo přeměny, poskytuje nejvyšší signál pyranosaoxidasa = glukosa-2-oxidasa nevýhoda: reaguje s dalšími sacharidy

10

11 GALAKTOSA klinické biochemii Galaktosemie: chybí galaktosa-1-fosf fosfáturidyltransferasa (enzym pro metabolismus galaktosy v dětskd tském m věku v -průjem, zástava z růstu, r mentáln lní redardace) je potenciáln lně toxická při i poruchách odbourávání hladina v séru: s pod 0,25 mm Biorekognikační vrstva: galaktosoxidasa EC , kuproprotein má afinitu k oběma anomerům

12 FRUKTOSA potravinářský průmysl (alternativní sladidlo) klinická biochemie intolerance fruktosy způsoben sobená chyběním aldolasy, štěpící v játrech j fruktosa-1-fosf fosfát. Hromadící se fruktosa vede k inhibici fosfoglukomutasy poruše e přemp eměny glykogenu na glukosu, což se projeví hypoglykemií po zátěžz ěži i fruktosou. Onemocnění poškozen kození CNS,jater, porucha růstu, r poškozen kození ledvin Řešení: vynechání fruktosy a sacharosy ve stravě

13 Biorekognikační vrstva fruktosodehydrogenasa (mikrobiáln lního původu) p membránov nově vázaný enzym přenp enášející elektrony na umělé akceptory např.ferrikyanid

14 SACHAROSA Význam: potravinářstv ství a cukrovarnictví (v cukrovce je obsah 15 aža 25%) Biorekognikační vrstva: je třeba t imobilizovat několik n enzymů: INVERTASA (EC ) hydrolýza sacharosy na α-glukosu a fruktosu MUTAROTASA (EC ) urychluje ustavení rovnováhy mezi oběma anomery glukosy (spont( spontálně pomalu) GLUKOSAOXIDASA (EC ) oxiduje β-anomer glukosy za vzniku H 2 O 2

15 LAKTOSA = MLÉČNÝ CUKR β-d-galaktosyl-4-o-glukosa) glukosa) V lidském m mléku: 0,3 aža 0,6 mm V kravském m mléku: 0,25 aža 0,28 mm Analýza v potravinářstv ství určen ení obsahu sušen eného mléka v produktech. Biorekognikační vrstva: β-galaktosidasa (EC ) poskytuje oba monosacharidy pak se použije jeden z následujn sledujících: ch: galaktosoxidasa (EC ) nebo glukosaoxidasa (EC )

16 MALTOSA Význam: klinické biochemii při p i stanovení aktivity α-amylasy (onemocnění slinivky) Biorekognikační vrstva α-glukosidasa (EC ) z kvasinek hydrolýza na dvě α-glukosy mutarotasa (EC ) z vepřových ledvin přeměna α-glukosy na β-glukosu glukosaoxidasa (EC ) oxidace glukosy na kyselinu glukonovou peroxid vodíku

17 škrob alfa amylasa dextriny + maltosa + maltotriosy maltosa alfa a glukosidas 2 α-d-glukosa α-d-glukosa mutarotasa β-d-glukosa β-d-glukosa + O 2 glukosaoxidasa D-glukonolakton + H 2 O 2

18 ŠKROB amylosa amylopektin spojení glukosových molekul a-1,4 vazbami

19 Význam: stanovení v obilí,, rýži, bramborách Biorekognikační vrstva: nejprve je nutné provést hydrolýzu glukoamylasou (EC ) exo-1,4 1,4-α-glukosidasa, α-amylasu (EC ), která produkuje maltosu + dextriny (4 aža 12 glukosových jednotek) α- glukosidasa (EC ), která přemění maltosu na dvě glukosy (α)( mutarotasa (EC ) katalyzuje přemp eměnu α-glukosy na β-glukosu, glukosaoxidasa (EC ) oxiduje glukosu za vzniku peroxidu vodíku a kyseliny glukonové Problém: velikost molekuly škrobu reaktoru

20 VITAMÍN N C kyselina askorbová Význam: stanovení v potravinách, ovoci, v preparátech Biorekognikační vrstva: askorbátoxidasa (EC ) kuproprotein oxiduje vitamín n C na dehydroaskorbovou kyselinu, vzniká však jen voda, lze tedy použít t pouze kyslíkovou kovou elektrodu větší citlivosti lze dosáhnout zpětnou chemickou redukcí vznikající dehydroaskorbové kyseliny např.. cysteinem

21 HO H OH HO O O OH + ½ O 2 askorbátod HO H OH O O O O + H 2 O

22 Alkoholy a fenoly ETHANOL Význam: v alkoholických nápojn pojích klinická praxe, při p i kontrole řidičů vhodné použit ití biosensorů,, jsou snadno přenosnp enosné pokusy měřm ěřit vydechovaný vzduch- nadějn jné Biorekognikační vrstva alkoholoxidasa (EC ) mikrobiáln lní (Pichia pastoris) spec. aktivita bývá 40 U/mg

23 CHOLESTEROL Význam: klinická praxe (ukládá se ve stěnách cév) c při i kardiovaskulárn rních chorobách nejčast astější příčina morbidity obyvatelstva (1/2 všech v úmrtí) 3,5 aža 5,2 mm (6,5 = 2, 7,4=4) potravinářstv ství Biorekognikační vrstva: Cholesteroloxidasa (EC ) produkce peroxidu vodíku, cholesterol volný, pokud je třeba t stanovit formu vázanou v esterech, přidp idává se navíc cholesterolesterhydrolasa (EC ), pak je vhodné pracovat v prostřed edí detergentu (Triton X-100, X deoxycholát) ) nebo v organickém rozpouštědle.

24 CHOLIN Význam: Enzym: často se měřm ěří při i studiu nervové funkce Cholinoxidasa (EC ) Alcaligenes sp. produkuje betain a 2 molekuly peroxidu vodíku HC OH COO- 2 CH CH 3 3 cholinoxidasa C N + C N + CH CH H 3 H 2 2 CH CH 3 cholin 3 betain H 2 O 2

25 FENOLY Význam: Enzymy: stanovení v průmyslových odpadních vodách v některých n potravinách (oleje) průmyslov myslové produkty tyrosinasa (EC ) fenoloxidasa nebo polyfenoloxidasa, kuproprotein izolovaný ze žampionů,, je možné použít t přímop tkáňový řez. Působí na fenol, jednoduché substituované fenoly, katechol, chlorfenoly. Oxidace jde přes p katechol na o-chinon, o který spontáln lně polymeruje (tmavne) lakasa (EC ) izoluje se z houby Polyporus versicolor, kuproprotein,, působp sobí hlavně na hydrochinon a p-difenoly.

26 Karboxylové kyseliny a aminokyseliny Kyselina mléčná (L-lakt laktát) t) kyselina jablečná kyselina oxaloctová kyselina močov ová kyselina isocitronová aminokyseliny: lysin, kyselina glutamová mastné kyseliny kyselina siřičit itá

27 KYSELINA MLÉČNÁ = L-LAKTL LAKTÁT Význam: Enzymy: -v v klinické medicíně (koncentrace v séru s pro rozlišen ení acidóz) norma: 2,7 mm -ve sportovní medicíně ukazatel trénovanosti (nárůst koncentrace nastává jako reakce na zátěžz ěž) -v v potravinářsk ském m průmyslu mléčné kvašen ení ( v jogurtech a vínu). v laktátoxidasa toxidasa (EC ) LOD z bakterie Pediococcus, flavoprotein produkující H 2 O 2 cytochrom b 2 (EC ) dehydrogenasa izoluje se z kvasinek, akceptorem je ferrikyanid a další mediátory laktátmonoxygenasa tmonoxygenasa (EC ) produkce acetát+co t+co 2, používala se před p LOD

28 Při i mléčném m kvašen ení může e vznikat i D-forma laktátu tu Stanovení se provádí pomocí D-laktátdehydrogenasytdehydrogenasy (NAD + -dependetní) Laktátdehydrogenasa tdehydrogenasa (EC ) ze svalu savců má jako koenzym NAD +, pro analýzu biosensory se prakticky nepoužívá.

29 KYSELINA JABLEČNÁ Význam: Enzym: stanovení v ovoci, ve víně v (hodnocení kvality) malátdehydrogenasa (NAD +, EC ) Bacillus subtilis Malát + NAD + oxalacetát + NADH + H +

30 KYSELINA OXALOCTOVÁ Význam: klinická biochemie, v moči i při p hyperoxalurii zvýšen ené vylučov ování kyseliny šťavelové v moči (dědi dičné poruchy, nadbytek vitamínu C, nedostatek vápnv pníku) Kyselina šťavelová v moči i vzniká z 10% z potravy 30% přemp eměnou kyseliny askorbové 60% endogenní vzniklá při i metabolismu aminokyselin Enzymy: oxalátoxidasa (EC ) katalyzuje reakci: (COOH) 2 + O 2 2CO 2 + H 2 O 2

31 KYSELINA MOČOV OVÁ Význam: Enzym: klinická biochemie, hematologické poruchy, dna (kyselina močov ová se ukládá v kloubech) v séru s 0,14 aža 0,4 mm urikasa (EC ) urátoxidasa toxidasa,, obsahuje Cu oxiduje kyselinu močovou ovou na allantoin a peroxid vodíku O H N O N H H N O N H kyselina močová O H N N H O N H NH 2 +O 2 + H 2 O + CO 2 +H 2 O 2 allantoin O

32 KYSELINA ISOCITRONOVÁ Vzniká jako vedlejší produkt při p i fermentační výrobě kyseliny citronové. Enzym: isocitrátdehydrogenasa tdehydrogenasa (EC ) (NADP + )

33 AMINOKYSELINY Význam: Enzym: je možné stanovit jako sumu v potravinách oxidasa L-aminokyselin L (EC ) pro L-aminokyselinyL oxidasa D-aminokyselin D (EC ) pro D-aminokyselinyD

34 LYSIN Význam: Enzymy: esenciáln lní,, je přidp idáván n do krmných směsí lysin-α-oxidasa (EC ), dekarboxylující z Trichoderma viridae lysindekarboxylasa (EC ) z Escherichia coli, Bacterium cadaveris produkuje CO 2 a kadaverin, který lze stanovit pomocí diaminoxidasy (EC ) z hrachu lysin-α-oxidasa L-lysin + O 2 + H 2 O 6-amino-2-oxohexanoat + NH 3 + H 2 O 2 lysin kadaverin + CO 2 lysindekarboxylasa

35 KYSELINA GLUTAMOVÁ Význam: Enzymy: je součást stí polévkových kořen ení,, sojové omáčky. glutamátoxidasa toxidasa (EC ) flavoprotein produkuje z glutamátu tu NH 3, CO 2, α-oxoglutarát a peroxid vodíku. glutamátdehydrogenasa tdehydrogenasa (L-glutam glutamát: : NAD(P) + oxidoreduktasa(deaminuj deaminující) ) z jater) měla uplatnění dřív v před p objevem oxidasy. L-glutamát +O 2 +H 2 O 2-oxoglutar2 oxoglutarát+ + NH 3 + H 2 O 2

36 MASTNÉ KYSELINY Význam: Enzymy: kyselina olejová a palmitová se analyzují v krvi, v potravinách indikují denaturaci tukových (olejových) složek acyl-coa CoA-syntasa v přítomnosti p ATP a CoA převede mastnou kyselinu na příslup slušný acyl-coa CoA,, na který účinkuje acyl-coa CoA-oxidasa oxidasa (EC ), oxidací vzniká dvojná vazba a současn asně se produkuje peroxid vodíku

37 acylcoa-oxidasa acylcoa + kyslík trans-2,3-dehydroacylcoa peroxid vodíku acylcoa-oxidasa acylcoa + O 2 trans-2,3-dehydroacylcoa + H 2 O 2

38 KYSELINA SIŘIČIT ITÁ Význam: Enzym: obsah se stanovuje ve víněv sulfitoxidasa (EC ) oxidací vzniká peroxid vodíku Některé další anorganické kyseliny lze stanovit na principu detekce inhibitorů (viz dále). d sulfitoxidasa siřičitan + O 2 + H 2 O síran + H 2 O 2

39 Dusíkaté sloučeniny močovina ovina aminy a polyaminy kreatin a kreatinin purinové base

40 MOČOVINA OVINA Význam: Enzym: -klinická biochemie indikátor funkce ledvin norma: 3,6 aža 9 mm -zemědělství:: stanovení krmné dávky na základz kladě znalosti koncentrace močoviny oviny v kravském m mléku ureasa (EC ) absolutně specifická katalyzuje: H 2 N-CO-NH 2 + H 2 O + 2H + ureasa CO 2 + 2NH + 4 potenciometrie konduktometrie

41 AMINY A POLYAMINY Význam: Enzymy: kadaverin a putrescin = diaminy, které vznikají působením m mikroorganismů na potraviny bílkovinného složen ení (sýry, maso, ovoce, sojová omáčka, pivo, víno), v indikátor čerstvosti potravin klinická biochemie histamin (alergická reakce) polyaminy (spermin a spermidin) indikátory některých karcinomů aminoxidasa (EC ), AO polyaminy (EC ), PAO katalyzují: AO, PAO RCH 2 NH 2 + O 2 + H 2 O RCHO + H 2 O 2 + NH 3

42 KREATIN A KREATININ Význam: klinická biochemie, posouzení funkce ledvin CH 3 N O kreatinin NH NH 2 + E 1 CH 3 N O NH O ++ NH 3 N-methylhydantoin E 1 kreatininiminohydrolasa (EC ) potenciometrie

43 kreatinin O NH CH 3 N NH 2 + E 2 E 2 = kreatininamidohydrolasa (EC ) E 3 = kreatinamidinohydrolasa (EC ) H 2 N HN kreatin N C H2 COO- CH 3 E 3 H N C COO- H2 sarkosin CH 3 E 4 Formaldehyd, glycin + H 2 O 2 E 4 = sarkosinoxidasa (EC ) peroxidová elektroda

44 PURINOVÉ BÁZE Význam: Enzymy: slouží v Japonsku jako indikátor čerstvosti rybího masa. Při P i kažen ení masa probíhá hydrolytický rozklad ATP, nakonec se oxiduje až na kyselinu močovou. ovou. Nastávaj vají změny kvality a chuti masa. Byl vyvinut čtyřkanálový biosensor: 1) Xantinoxidasa (EC ) (XOD) 2) XOD + Nukleosidfosforylasa (EC ) 3) jako Nukleotidasa5 (EC ) 4) jako 3 + AMP deaminasa (EC )

45 PRINCIP BIOSENSORU ATP ATPasa ADP+ P i Myokinasa AMP+ P i AMP deaminasa IMP + NH 3 Inosin + P i 5 Nukleotidasa Kyselina močov ová xanthin Hypoxantin +ribosa-1-p i Nukleosidfosforylasa xantinoxidasa xantinoxidasa

46 Postupně se určí hladiny všech v metabolitů v tkáni. Navíc c se dopočítá obsah ATP/ADP (výchozí množstv ství je konstantní a známé). Vypočítá se procentuáln lní podíl xanthinu a hypoxanthinu k sumě všech metabolitů tzv. faktor čerstvosti K Podle velikosti se pak maso klasifikuje jako: Velmi čerstvé Čerstvé Kazící se K je menší jak 10% K je menší jak 40% K je většív jak 40%

47 Estery a amidy Acetylcholin Fosfolipidy Triglyceridy Glycerol Penicilin

48 ACETYLCHOLIN Význam: Enzymy: slouží jako mediátor přenosu vzruchů v nervové soustavě acetylcholinesterasa (EC ) z krvinek nebo elektrického úhoře AChE štěpí na kyselinu octovou a cholin (lze spojit s ph sensorem) cholinoxidasa (EC ChOD) stanovení cholinu,, produkuje 2 molekuly H 2 O 2 Arthrobacter globiformis HC OH COO- 2 CH CH 3 3 N + cholinoxidasa C CH 3 H 2 C H 2 cholin N + CH 3 CH 3 betain CH H 2 O 2

49 FOSFOLIPIDY Význam: Enzym: v krevní plazmě 2,5 aža 3 mm, hlavně fosfatidylcholin po hydrolýze fosfolipasou (EC ) vzniklý cholin se stanoví pomocí ChOD cholinoxidasa (EC )

50 TRIGLYCERIDY Význam: Enzymy: klinická biochemie: vyskytují se v séru: s normáln lně: : 0,35 aža 1,7 mm, vyšší hodnoty: hyperlipidemie lipasa (EC ) hydrolýza triglyceridů na mastné kyseliny a glycerol, který lze stanovit: 1) glyceroldehydrogenasa (EC ), oxidací se produkuje NADH 2) glycerol se převede p pomocí glycerolkinasy (EC ) na glycerolfosfát,který se katalyticky přeměňuje pomocí glycerolfosfátoxidasy

51 PENICILIN Význam: Enzymy: je biosensory stanovován n během b fermentační výroby. dva enzymy: β-laktamasa (Penicilinasa) (EC ) penicilinamidasa (EC ) oba se spojují s ph sensory

52 Stanovení penicilinu RCONH S N O penicilin Typ penicilinu: (R=): G C 6 H 5 CH 2 - V..CHOCH- CH 3 CH 3 COOH H 2 N O N RCO laktamasa S CH 3 N CH 3 COOH O N S CH 3 CH 3 COOH Peniciloinová penicilinamidasa kyselina 6-APS + R-COOH