Návody Laboratoř sladařství a pivovarství Technologické cvičení

Transkript

1 Návody Laboratoř sladařství a pivovarství Technologické cvičení Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu 1. Rozbor ječmene 1.1 Mechanické a chemické rozbory Stanovení obsahu vody Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene Stanovení absolutní hmotnosti ječmene 1.2 Fyziologické rozbory Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu 2. Rozbor sladu 2.1 Smyslové zkoušky Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu 2.2 Fyzikálně-chemické rozbory Obsah vody ve sladu Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny a stanovení extraktu sladu Stanovení zcukření sladiny Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny Stanovení ph a barvy sladiny Stanovení aminodusíku sladiny Stanovení sacharidických složek sladiny metodou HPLC Stanovení volných aminokyselin sladiny metodou HPLC 3. Rozbor vody 3.1 Neutralizační kapacita Stanovení zjevné a celkové alkality 3.2 Tvrdost vody Stanovení celkové tvrdosti Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku 3.3 Výpočet zbytkové alkality vody 4. Rozbor chmele 4.1 Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu 4.2 Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC 4.3 Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC 5 Rozbor pivovarských kvasnic 5.1 Provozní mikrobiologická kontrola

2 5.2 Stanovení viability kvasnic barvícími technikami Barvení methylenovou modří metodou podle EBC Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru 5.3 Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem 5.4 Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR 5.5 Charakterizace bakteriální kontaminace metodou FISH Část B: Výroba piva 1. Příprava mladiny 2. Mikrobiologická kontrola várečných kvasnic 2.1 Posouzení kvasnic podle makroskopických znaků 2.2 Stanovení vitality a viability kvasnic 3. Rozbor mladiny 3.1 Stanovení ph a barvy mladiny 3.2 Stanovení extraktu mladiny 3.3 Stanovení celkových hořkých látek podle EBC 4. Zakvašení a hlavní kvašení 4.1 Stanovení ph, zdánlivého extraktu a počtu buněk ve vznosu 5. Dokvašování piva 5.1 Stanovení ph, zdánlivého extraktu a obsahu vicinálních diketonů 6. Analytické hodnocení hotového piva 6.1 Stanovení zdánlivého a skutečného extraktu, obsahu alkohol a původní koncentrace mladiny 6.2 Stanovení sacharidů metodou HPLC 6.3 Stanovení celkových hořkých látek podle EBC 6.4 Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC 6.5 Stanovení volných aminokyselin piva metodou HPLC 7. Senzorické hodnocení hotového piva Použité literární zdroje: 1. Basařová G. a kol.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, Praha 1992 (1. díl), 1993 (2. a 3. díl) 2. ANALYTICA EBC, European Brewery Convention, Zoeterwoude Kosař K. a kol.: Technologie výroby sladu a piva, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha Uvedené odborné časopisy a publikace

3 Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu 1. Rozbor ječmene 1.1 Mechanické a chemické rozbory Stanovení obsahu vody Princip: Rozemletý zvážený ječmen se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový úbytek Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky Pracovní postup: Vzorek ječmene se rozemele na moučku. Do navažovačky uzavřené víčkem se s přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a rozemletý vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu vody. Suší se tři hodiny při teplotě 105 až 107 C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době se navažovačka vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a přesností ± 0,001 g. V případě, že obsah vody v ječmeni je vyšší než 15%, musí se 100 g ječmene (celá zrna) předsoušet v drátěném košíčku při teplotě 50 C po dobu 3 až 4 hodin. Po předsoušení se opět zváží a vypočte se úbytek vody. Pak se ječmen rozemele a voda se stanoví popsaným způsobem. Výpočet a vyhodnocení: v A*100 G kde v obsah vody (%), G navážka rozemletého ječmene (g), A úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g). Běžné hodnoty: Obsah vody ječmene je běžně 12 až 15%, u přímého výkupu nejvýše 17%. Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta s.r.o., Praha 1993, s Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene Princip: přesný objem ječmene se zváží a vypočte se hmotnost 100 l ječmene Přístroje a zařízení: objemová váha podle EBC Pracovní postup: Odměrná nádobka se upevní do kovové podložky přístroje, který je ustaven do vodorovné polohy. Zářez v horní části se uzavře srovnávacím nožem s válcovým běhounem a nasadí se plnicí válec. Vrchní násypný válec se uzavře záklopkou, naplní ječmenem, nasadí na plnicí nádobu, záklopka se otevře a zrno samovolně vypadává do plnicího válce. Po naplnění se vysune srovnávací nůž a válcový běhoun s ječmenem spadne do měrného válce. Pak se zvolna vsune nůž zpět do zářezu, přebytečný ječmen se z plnicího válce vysype, válec se sejme a vyjme se srovnávací nůž. Odměrný válec se uchytí za vahadlo váhy a zváží se s přesností na ± 0,5g. Výpočet a vyhodnocení:

4 Pro výpočet objemové hmotnosti se používají tabulky (tab. 2.3, 2.4, Pivovarskosladařská analytika, s. 157,160), kde podle zjištěné hmotnosti se najde hmotnost hektolitrová, která se udává v kg na jedno desetinné místo. Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být větší než 1,0g. Běžné hodnoty: Objemová hmotnost u jarních ječmenů se pohybuje od 68 do 75 kg. Závisí na mnoha faktorech (odrůdě, obsahu vody, ročníku apod.) a dosahuje někdy 65 až 78 kg. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s Stanovení absolutní hmotnosti ječmene Princip: zváží se 500 zrn a hodnota se přepočte na sušinu Přístroje a zařízení: Petriho miska, analytické váhy, pinzeta Pracovní postup: naváží se 40 g ± 0,1 g ječmene a vysype do počítacího aparátu. Z napočítaných 500 zrn se odstraní půlky a cizí zrna, doplní se zrny ječmene a zváží. Výpočet a vyhodnocení: H G * 2*(100 v) 100 kde H hmotnost 1000 zrn v sušině (g), G hmotnost původních 500 zrn (g), v obsah vody ječmene (%). Výsledky se uvádějí v gramech na jedno desetinné místo. Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 1,0 g. Běžné hodnoty: (v přepočtu na sušinu ječmene) Lehké ječmeny 37 až 40 g Střední ječmeny 41 až 44 g Těžké ječmeny 45 g a výše. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s Fyziologické rozbory Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu Princip: stanoví se klíčivá energie zrn se 4 a 8 ml vody při teplotě 15 a 17 C Přístroje a zařízení: termostat Pracovní postup: Odpočítá se dvakrát 100 zrn. Dvě Petriho misky se vyloží dvěma vrstvami filtračního papíru a na každou se rovnoměrně rozloží 100 zrn. Do jedné misky se pipetou přidají 4 ml vody, do druhé 8 ml vody (v obou případech vodovodní voda). Zrna se přikryjí víčkem a ponechají se pět dnů při teplotě 15 až 17 C v termostatu. Pak se nevyklíčená zrna spočítají.

5 Výpočet a vyhodnocení: Počet vyklíčených zrn udává přímo klíčivou energii. Uvádí se klíčivá energie při 4 ml a 8 ml vody. citlivost na vodu = (klíčivá energie při 4 m.) - (klíčivá energie při 8 ml) Hodnoty se udávají v procentech v celých číslech. Ječmen se podle citlivosti na vodu hodnotí jako do 10 % velmi málo citlivý 11 až 25 % málo citlivý 26 až 45 % citlivý nad 45 % velmi citlivý Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Rozbor sladu 2.1 Smyslové zkoušky Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn Princip: zahrnuje smyslové posouzení čistoty vůně a vzhledu zrna a znečištění Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu Princip: příčným řezem se zrna rozříznou a vizuálně se stanoví podíl moučnatých, polosklovitých a sklovitých zrn a vyjádří se jejich procentické podíly Přístroje a zařízení: farinatom na příčný řez zrna Výpočet a vyhodnocení: Výsledek se udává v procentech moučnatých, sklovitých a polosklovitých zrn v celých číslech. Světlé slady mají mít moučnatých zrn nejméně 95 %, sklovitých zrn nejvýše 2 %, tmavé slady moučnatých zrn nejméně 93 %, sklovitých nejvýše 4 až 6 %. Někdy se uvádí tzv. průměrná hodnota sklovitosti, která se vypočte vynásobením počtu jednotlivých zrn dále uvedeným koeficientem: sklovitá zrna -1, polosklovitá zrna - 0,5, zrna se sklovitými špičkami - 0,25. Součet udává průměrnou sklovitost v procentech. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Fyzikálně-chemické rozbory Obsah vody ve sladu Princip: rozemletý zvážený slad se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový úbytek Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky

6 Pracovní postup: Vzorek sladu se rozemele na moučku. Do váženky uzavřené víčkem se s přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a rozemletý vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu vody. Suší se tři hodiny při teplotě 105 až 107 C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době se navažovačka vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a přesností ± 0,001 gramu. Výpočet a vyhodnocení: v A*100 G kde v obsah vody (%), G navážka rozemletého sladu (g), A úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g). Běžné hodnoty: Obsah vody ve sladu je v rozsahu 3 až 5% podle typu vyráběného sladu Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny a stanovení extraktu sladu Princip: Rmutováním jemně rozemletého sladu standardním rmutovacím, tzv.kongresním postupem se získá sladina, ve které se stanoví relativní hustorta v Reischauerově pyknometru (se stanovenou vodní hodnotou) za předepsaných podmínek. V tabulkách se k hodnotám relativní hustoty najde hodnota extraktu sladiny - hmotnostní zlomek extraktu sladiny (%). Přístroje a zařízení: mlýnek Miag nebo DLFU seřízený na 90% ± 1% moučky rmutovací lázeň (frekvence otáčení míchadel 80 až 100 min -1 ) kádinky o objemu 500 ml nálevky, průměr 150 mm skládané filtry, průměr 320 mm (Scheicher-Schull č /2) pyknometr podle Reischauera nebo denzitometr vodní lázeň na 20 C ± 0,05 C pro temperaci pyknometrů sádrová destička pro stanovení zcukření. Chemikálie a roztoky: jodový roztok, c (½I 2 ) =0,02 mol.l -1 Pracovní postup: Extrakt sladu se stanoví ve sladině připravené tzv. kongresním postupem, což je standardním způsobem provedený infúzní rmutovací postup s jemné rozemletým sladem (podíl moučky 90 % ± 1 %). Hodnota stanoveného extraktu informuje o obsahu extraktivních látek ve sladu a o předpokladu jejich uvolnění v procesu rmutování. Získaná kongresní sladina se používá pro stanovení řady dalších analytických znaků sladu: zcukření, stékání, barvy, čirosti, viskozity, ph, rozpustných dusíkatých látek apod. Přibližně 60 g sladu se rozemele na předepsaném mlýnku a 50 g ± 0,05 g rozemletého vzorku se naváží do rmutovací kádinky. Za stálého míchání se vzorek přelije 150 ml destilované vody 45 C teplé a tyčinka se opláchne 50

7 ml stejně teplé vody. Rmutovací kádinka se ihned vloží do rmutovací lázně na teplotu 45 C, zapojí se míchadla a při teplotě 45 C se rmutuje 30 minut. Pak se teplota zvyšuje na 70 C a to tak, že se každou minutu zvýší teploty rmutu o 1 C, tzn. za 25 minut se dosáhne 70 C. Po dosažení této teploty se přidá 100 ml destilované vody 70 C teplé a od tohoto okamžiku za 10 minut se odebere vzorek na zkoušku zcukření. Teplota 70 C se udržuje l hodinu. Pak se rmut ochladí během 10 až 15 minut ve rmutovací lázni studenou vodou na teplotu asi 20 C. Míchadla se opláchnou destilovanou vodou, rmutovací kádinky se vně dokonale osuší a obsah se dováží na 450 g destilovanou vodou. Po dokonalém promíchání se rmut nalije na skládaný filtr. Prvních 100 ml filtrátu se vrací zpět na filtr. Filtrace je ukončena, když obsah filtru (mláto) popraská, jinak se filtrace ukončí po dvou hodinách. Filtrát se promíchá a ihned se stanoví relativní hustota. Zbylý podíl se bere na další stanovení. Relativní hustota se stanoví pyknometricky s přesností ± 0,0005 nebo densitometricky. Výpočet a vyhodnocení: K stanovené relativní hustotě (pyknometricky nebo denzitometrem) se vyhledá v tab. 3.5 (Pivovarsko-sladařská analytika, s. 319) hmotnostní zlomek extraktu v g na 100 g sladiny (%) a vypočte se obsah extraktu v původním sladu a v sušině sladu podle následujících vztahů E p E s P( v 800) 100 P 100E p 100 v Kde E p je obsah extraktu v původním sladu (%), P hmotnostní zlomek extraktu sladiny odečtený z tab. 3.5 (%), v obsah vody ve sladu (%), E s extrakt v sušině sladu (%). Výsledky se uvádějí v procentech na jedno desetinné místo. Přesnost stanovení: rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nemá být větší než 0,3%, rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 0,6%. Běžné hodnoty: Světlé slady: Tmavé slady: Nakuřované slady: 79,0 až 82,0% v sušině 76,5 až 78,0% v sušině 79,0 až 82,0% v sušině Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Stanovení zcukření sladiny Princip: Vzorek sladiny reaguje s roztokem jodu a posuzuje se míra rozštěpení škrobu Chemikálie a zařízení: Sádrová destička, jodový roztok, c (1/2 I 2 = 0, 02 mol.l -1 ) Pracovní postup: Kontrola 10 minut po dosažení teploty 70 C, při zcukření po přídavku jodového roztoku ke kapce vzorku kanárkově žluté zabarvení. Zcukření 10 až 15 minut velmi dobré, 10 až 15 minut dobré, 15 až 20 minut - vyhovující, nad 20 minut nevyhovující. Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s. 250

8 2.2.4 Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny Princip: Vůně kongresní sladiny udává, zda slad je připraven ze zdravého ječmene a nezávadným technologickým postupem. Čirost sladiny ukazuje na dobré rozluštění a dostatečné odležení sladu. Rychlé stékání je znakem dobrého rozluštění sladu a dokonalého zcukření sladiny a je důležité především z hlediska scezování sladiny. Pracovní postup: Kontrola vůně v průběhu rmutování, kontrola čirosti při stékání sladiny, doba stékání se posuzuje během filtrace. Stupnice hodnocení čirosti je: čirá, opalizující, kalná. Normální stékání u kongresních sladin je do 1 hodiny, pomalé do 2 hodin, špatné nad 2 hodiny Stanovení ph a barvy kongresní sladiny Princip: Měření ph sladiny je důležité pro posouzení rozluštění sladu. Hodnota ph ovlivňuje některé analytické ukazatele - extrakt, Kolbachovo číslo, relativní extrakt při teplotě 45 C, barvu apod. Kyselejší sladiny zvyšují vyloužitelnost látek během rmutování. ph se měří v kongresní sladině po filtraci, nejpozději do 30 minut. Výsledky se udávají na dvě desetinná místa. Běžné hodnoty ph kongresní sladiny světlého sladu jsou 5,6 až 6,0. Barva se stanovuje spektrofotometricky podle EBC ve zfiltrovaném vzorku při 430 nm Chemikálie a zařízení: ph-metr, spektrofotometr, zařízení pro membránovou filtraci, membránové filtry (0,45 µm), křemelina Pracovní postup: Vzorek se zfiltruje přes membránu (při hodnotě zákalu vyšší než 1 jednotka EBC s přídavkem 0,1 % křemeliny) a změří se absorbance při 430 nm. Barva vzorku se vypočte podle vztahu B = 25. f. A 430 Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252, Stanovení aminodusíku sladiny ninhydrinovou metodou Princip: Metoda ninhydrinová je založena na oxidační dekarboxylaci aminokyselin při ph 6,7 a následné reakci neredukované a redukované formy ninhydrinu Chemikálie a zařízení: ninhydrinové činidlo, ředící roztok, standarní roztok (glycin), reagenční baňky, vodní lázeň, spektrofotometr Pracovní postup: Vzorek sladiny (mladiny) se 100krát ředí, po přídavku ninhydrinového činidla (2 ml vzorku + 1 ml činidla) se ponechá 16 minut ve vroucí vodní lázni, ochladí, přidá zřeďovací roztok (5 ml) a po 10 minutách se proti slepému pokusu změří absorbance při 570 nm. Výpočet obsahu aminodusíku zahrnuje naměřenou hodnotu absorbance zmenšenou o hodnotu slepého pokusu, zřeďovací faktor a hodnotu absorbance standardního roztoku aminokyseliny glycinu. Průměrný obsah volného aminodusíku je 150 až 250 mg/l sladiny. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s.532

9 2.2.7 Stanovení sacharidických složek sladiny pomocí HPLC Princip: Stanovení sacharidů metodou HPLC-RIDK. Mono- a oligosacharidy obsažené ve sladině, mladině, případně hotovém pivu se dělí na ionexové koloně v Ag + cyklu a detekují refraktometricky. Přístroje a zařízení: kapalinový chromatograf Agilent 1100 s refraktometrickým detektorem kolona Phenomenex Rezex RSO Oligosacharides 200x10 mm s předkolonkou mikrofiltr s acetátcelulosovými filtry (0,45m) třepačka Chromatografické podmínky: mobilní fáze: odplyněná demineralizovaná voda teplota kolony: 80C průtok mob. fáze: 0,4 ml/min Chemikálie: glukóza, fruktóza a maltóza (vše p.a.) Software: Agilent Chemstation Pracovní postup: Pro kalibraci je třeba připravit 3 kalibrační roztoky maltózy, glukózy a fruktózy v koncentracích 1, 2 a 5 g/litr. Vzorek se přefiltruje za pomocí mikrofiltru, v případě prokvašené mladiny a hotového piva je třeba vzorek též předem vytřepat po dobu 15 min. Následně se vzorek převede do vialky v autosampleru, další postup je již automatizován a řízen softwarově. Sacharidy se na koloně dělí podle své molekulové hmotnosti a z kolony jsou vymývány sestupně podle počtu glukózových jednotek, manosacharidy pak v pořadí glukóza,fruktóza. Výsledky jsou vyhodnoceny pomocí kalibračních křivek, přičemž v případě maltoriózy a vyšších sacharidů se používá kalibrační křivka maltózy. Výsledky se obvykle vyjadřují v g/l a pohybují se v rozmezí 1-5 g/l u piv a 1-80 g/l u mladin a sladin (záleží na původní koncentraci extraktu a použité technologii). Literatura: Ondroušek, S., Dostálek, P.: Vliv technologie na vznik a využití sacharidů při výrobě mladiny a piva, Kvasny Prum. 33(11), 1987, Stanovení volných aminokyselin sladiny HPLC Přehled metod stanovení aminokyselin obsahuje metody klasické, založené na spektrofotometrickém měření, a moderní, využívající HPLC, GC, GPC a HIC. V dnešní době je většina analýz HPLC uskutečňována v systémech s reverzní fází (RP-HPLC), kde stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze polární rozpouštědlo. Princip stanovení: Aminokyseliny jsou před vlastním stanovením formou předkolonové nebo postkolonové derivatizace převedeny na vhodný derivát, dostatečně stabilní a neintegrující s nosičem.

10 Metoda AccQTag využívá AccQTag fluorescenčního činidla, převádějícího primární a sekundární aminokyseliny na stabilní fluorescenční deriváty. Následuje detekce fluorescenčním nebo PDA detektorem. Chemikálie a zařízení: Waters Alliance HPLC systém, se separačním modulem Součástí systému jsou dvě nezávisle řízené pumpy v sériovém uspořádání se zpětnými ventily k izokratickým a gradientovým operacím, autosampler, dávkovací injekční stříkačky o objemu 25, 250 a l, dávkovací smyčky, disketová jednotka. Režim externího řízení je zajištěn chromatografickým programem Empower. Pracovní režim: Derivatizační činidlo: Waters AccQ Fluor Reagenční činidlo (6-aminoquinolyl-Ahydroxysuccinimidyl karbamát) Standard: Waters Amino Acid Hydrolysate Standard Kolona: Waters AccQ Tag Amino Acid kolona Nova-Pak C 18, 4 μm Rozměr kolony: 150 x 3,9 mm Temperace kolony: 37 C Detektor: Waters Multi 2475 fluorescenční detektor s excitací 250 mm, emisí při 395 nm Eluenty: A borátový pufr (vodný roztok) B acetonitril (čistota HPLC grade) C Milli-Q voda (18 MΩ) Gradient: Čas Průtok (min) (ml.min -1 ) %A %B %C počáteční 1, ,5 1, , , ,5 1, , , , Nástřik na kolonu: Vnitřní standard: Doba analýzy: Stabilizace kolony: Způsob vyhodnocení: 5 μl vzorku (koncentrace aminokyselin pmolů) kyselina α-aminomáselná 36 min 9 min na začátku, 15 min na nový vzorek program Empower Spektrum stanovitelných základních aminokyselin: kyselina asparagová, serin, kyselina glutamová, glycin, histidin, arginin, threonin, alanin, prolin, cystein, tyrosin, valin, methionin, lysin, isoleucin, leucin, phenylalanin. Pracovní postup zahrnuje deproteinaci vzorku (metanol, vymražení), odpaření, zpětné naředění roztokem HCl o koncentraci 0,1 mol.l -1, přídavek vnitřního standardu, derivatizaci a převedení

11 vzorku do vialek autosampleru. Vyhodnocení: Chromatografický program Empower metodou vnitřního standardu umožňuje stanovení aminokyselin v koncentracích pikomoly. Literatura: Instruction Manual Waters AccQ Tag Chemistry Package, Waters Corporation, USA, 1994, Čížková H., Hofta P., Kolouchová I., Dostálek P.: Kvasny Prum. 51, 2005, s Rozbor vody 3.1 Neutralizační kapacita Stanovení zjevné a celkové alkality Princip: Neutralizační kapacita vody udává látkové množství silné kyseliny (c H + ) (kyselinová kapacita) nebo silné zásady (C OH - ) (zásadová kapacita), které po přidání ke zkoumané látce změní její ph na udanou hodnotu. Celková alkalita je zvláštní případ kyselinové neutralizační kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H + ), kterým po přidání ke vzorku vody je dosaženo ph = 4,5. (KNK 4, 5, m-hodnota). Zjevná alkalita je zvláštní případ kyselinové neutralizační kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H + ), kterým po přidání ke vzorku vody je dosaženo ph = 8,3 (KNK 4,5, p-hodnota). Alkalita se stanoví titrací vzorku vody roztokem silné kyseliny. Indikace je vizuální nebo elektrometrická Přístroje a zařízení: - ph-metr - mikrobyrety dělené po 0,05 ml Chemikálie a roztoky: - kyselina chlorovodíková, c(hcl) = 0,1 mol/l - 0,05% roztok fenolftaleinu v 96% ethanolu - 0,05% vodný roztok methyloranže Pracovní postup: Při stanoveni zjevné alkality se přidá ke 100 ml vzorku 0,1 ml fenolftaleinu a titruje se odměrným roztokem HC1 o koncentraci c(hcl) = 0,1 mol/l do odbarvení indikátoru. Při elektrometrické indikaci se titruje do ph = 8,3. Při stanoveni celkové alkality se použije vzorek po stanoveni zjevné alkality. Přidají se 3 kapky roztoku methyloranže a titruje se do cibulového zabarvení. Při elektrometrické indikaci se zvolna dotitrovává do ph = 5,0, až se tato hodnota nemění. Od zjištěné hodnoty se odečte spotřeba na slepý pokus s redestilovanou vodou. Výpočet a vyhodnocení: Zjevná alkalita se vypočte podle vztahu: Ve. c(hcl).10 3 KNK = = c (H + ) 8,3 V kde Ve - je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(hcl) = 0,1 mol/l, c(hcl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do ph = 8,3 mol/l),

12 KNK 8,3 - zjevná alkalita (mmol/l). Celková alkalita se vypočte podle vztahu: Ve. c(hcl) KNK 4,5 = = c (H + ) V kde Ve - je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(hcl) =0,1 mol/l, c(hcl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do ph = 4,5 (mol/l), KNK 4,5 - celová alkalita V (pro obě alkality) - objem vzorku (ml), Výsledky se udávají v mmol/l s přesností na tři desetinná místa pro rozmezí 0,05 až 1,0 mmol/l, pro hodnoty vyšší s přesností na dvě desetinná místa. Metodu lze použít pro stanovení alkality nad 0,05 mmol/l. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Tvrdost vody Tvrdost vody není v literatuře definována jednotně; vychází se buď z hlediska technologického, nebo analytického. Pojem "tvrdost vody" je vztahován v podstatě na obsah iontů vápníku a hořčíku, i když jejich chemické a technologické vlastnosti nejsou rovnocenné. Zastaralé jsou názvy tvrdost přechodná a stálá a způsob kvantitativního vyjadřování tvrdosti ve stupních německých ( N), anglických či amerických. V příslušných tabulkách lze nalézt přepočet dřívějších jednotek (mval/l, N) používaných při analýze vody na současné jednotky (mg/l, mmol/l) Stanovení celkové tvrdosti obsahu iontů vápníku a hořčíku Vápenaté ionty jsou obsaženy ve všech vodách a společně s ionty hořčíku se podílejí na změnách ph při výrobě mladiny a piva. Z hlediska snížení ph vlivem Ca 2+ a Mg 2+.má mít varní voda nízkou celkovou alkalitu a současně vyšší obsah Ca 2+. Ionty vápníku ovlivňují také aktivitu α-amylasy (EC ), podporují sedimentaci kvasinek a pravděpodobně stimulují vznik chladového zákalu. Ionty hořčíku se uplatňují v mnoha případech jako aktivátory enzymových reakcí. Jejich přítomnost může také působit negativně na chuť piva, jestliže koncentrace je vyšší než 65 mg/l. Princip: V prostředí ph = 10 tvoří kyselina ethylendiamintetraoctová nebo její disodná sůl (chelaton 3) nejprve s vápenatými a potom s horečnatými ionty cheláty. Vymizení Mg 2+ je indikováno barevnou změnou eriochromové černi T. Spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 je úměrná koncentraci Ca 2+ a Mg 2+. Chemikálie a roztoky: - kyselina chlorovodíková, c (HCl)) = 0,1 mol/l - 96 % ethanol - 0,5 % vodný roztok methylčerveně - odměrný roztok chelatonu 3, c (EDTA) = 0, 05 mol/l - roztok eriochromové černi T - tlumivý roztok ph = 10

13 Pracovní postup: Ke 100 ml vzorku vody se po zrušení celkové alkality ekvivalentním množstvím zředěné HCl (c = 0,1 mol/l) přidá 5 ml tlumivého roztoku a po promíchání ještě 5 kapek roztoku indikátoru. Potom se titruje roztokem chelatonu 3 do jasně modrého zbarvení. Výpočet a vyhodnocení: Celkový obsah Ca 2+ a Mg 2+ se vypočte podle vztahu: a.c.10 3 X = V kde X a V c - je celkové množství iontů vápníku a hořčíku (mmol/l) (tzv. tvrdost), - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml), - objem vzorku odebraného k analýze (ml), - koncentrace chelatonu 3 (mol/l). Přesnost stanovení je při titraci 0,05 mmol/l, která je zároveň spodní hranicí pro zjištění koncentrace Ca 2+ + Mg 2+. Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku Princip: V alkalickém prostředí (ph = 12 až 13) tvoří vápenaté ionty chelát s chelatonem 3 (disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové - EDTA). Konec titrace je indikován barevnou změnou indikátoru. Spotřeba odměrného roztoku chelatomu 3 je úměrná koncentraci vápenatých iontů Chemikálie a roztoky: - hydroxid draselný, roztok přibližně o c(koh) 5,0 mol/l - kyselina chlorovodíková, c(hcl) =0,1 mol/l - chelaton 3, c(edta) =0,05 mol/l - indikátorová směs fluorexonu, thymoftalexonu a murexidu Pracovní postup: Objem odměřeného vzorku s obsahem Ca 2+ od 2 do 20 mg se upraví přídavkem destilované vody na objem asi 150 ml. U vzorků s celkovou alkalitou větší než 5 mmol/l se přidá ekvivalentní množství kyseliny chlorovodíkové, c(hcl) = 0,1 mol/l, povaří 3 minuty a po ochlazení se připipetují 2,0 ml roztoku KOH, c(koh) = 5 mol/l. Po promíchání a přídavku indikátorové směsi do zřetelně zeleného odstínu se titruje chelatonem 3 do fialově růžového zbarvení. Výpočet a vyhodnocení: a.c.10 3 X = V Kde X - je koncentrace iontů vápníku (mmol/l), a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml),

14 c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3 (mmol/l), V - objem vzorku (ml). Výsledek se udává v mg Ca 2+ na 1 litr vzorku s přesností na jedno desetinné místo, při vyjádření výsledků v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa. Pro přepočet platí: 1 mmol Ca 2+ odpovídá 40,08 mg Ca 2+ nebo 1 mg Ca 2+ odpovídá 0,02495 mmol Ca 2+. Metodu lze použít pro stanovení Ca 2+ v koncentracích 10 až 200 mg/l. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Stanovení obsahu hořčíku Princip: Koncentrace iontů hořčíku se vypočítá z výsledku stanovení celkového množství Ca 2+ + Mg 2+, a výsledku stanovení Ca 2+. Výpočet a vyhodnocení: a.c.10 3 b.c.10 3 X = V 1 V 2 Kde X - je koncentrace iontů hořčíku(mmol/l), a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca 2+ + Mg 2+ (ml), b - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca 2+ (ml) c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3 (mmol/l), V 1 - objem vzorku při stanovení Ca 2+ + Mg 2+ (ml) V 2 - objem vzorku při stanovení Ca 2+ (ml). Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa, při vyjádření výsledků v mg/l s přesností na jedno desetinné místa. Pro přepočet platí: 1 mmol Mg 2+ odpovídá 24,32 mg Mg 2+, 1 mg Mg 2+ odpovídá 0,0411 mmol Mg 2+ Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Výpočet zbytkové alkality vody Princip: Sole varní vody ovlivňují významně ph rmutů a sladiny tím, jak reagují s rozpustnými solemi ze sladu. Předpokládaný účinek solí určuje hodnota zbytkové alkality Ra, která je definována jako rozdíl celkové alkality a vyrovnané alkality, přičemž vyrovnaná alkalita se rovná vápníkové tvrdosti lomené 3,5 plus hořečnaté tvrdosti lomené 7. Zbytková alkalita = Celková alkalita Vyrovnaná alkalita R a = Tk (T Ca + 0,5 T Mg )/ 3,5

15 Pro 12% světlou čistě sladovou mladinu se předpokládaná hodnota ph vypočte podle vztahu: ph = K + f.ra kde K je 5,5 (ph sladiny připravené z destilované vody a f je faktor = 0, 17 pro Ra vyjádřenou v mmol/l nebo = 0,03 pro Ra vyjádřenou ve n Literatura: Basařová G., Čepička J.: Sladařství a pivovarství, skriptum, SNTL Praha 1986, s Rozbor chmele 4.1 Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu Princip: konduktometrická hodnota vyjadřuje obsah α-hořkých kyselin stanovených na základě reakce s kationty Pb 2+ Konec titrace je indikován konduktometricky. Zařízení a chemikálie: toluen, methanol, roztok octanu olovnatého c = 4 %, konduktometr Přístroje a zařízení: - konduktometr s příslušenstvím - magnetická míchačka Chemikálie a roztoky: - toluen p.a. - methanol p.a. - 4 % methanolový roztok octanu olovnatého Pracovní postup: 7,5 g chmelové drti nebo 1,5 g extraktu se vpraví do láhve s patentním uzávěrem, přidá se 50 ml toluenu a směs se třepe na třepačce 90 minut. Po vytřepání se obsah láhve přefiltruje přes skládaný papírový filtr do podstavené kuželové baňky obsahu 250 ml. 10 ml eluátu se odpipetuje do 150 ml kádinky a přidá se 75 ml methanolu. Do roztoku se ponoří konduktometrická elektroda a za současného míchání na elektromagnetické míchačce se přidává po 0,2 ml 4% met. roztok octanu olovnatého. Po každém přidání a promíchání se měří vodivost roztoku konduktometrem. Tímto způsobem se pokračuje až do spotřeby 2 až 5 ml titračního roztoku, v závislosti na obsahu -hořkých kyselin v analyzovaném chmelu. Naměřené hodnoty se vynesou do souřadnicového systému na milimetrový papír a sestrojí se křivka charakteru paraboly. Proložením přímek rameny paraboly se získá průsečík, který je bodem ekvivalence. Bod ekvivalence se promítne na souřadnici spotřeby titračního roztoku a získaný údaj se násobí faktorem 2,54. Toto číslo udává % -hořkých kyselin v původním chmelu. Při konduktometrickém stanovení je nutné, aby všechny tři proužky na elektrodě byly ponořeny do roztoku. Rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nesmí být větší než 0,3 %. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin chmele a chmelových výrobků pomocí HPLC

16 Upravená metodika podle Analytica-EBC, Method 7.7 Princip: Chmel, chmelové granule jsou extrahovány směsí ether/methanol a kyselinou chlorovodíkovou. a -kyseliny chmele rozpuštěné v etherové fázi jsou rozděleny pomocí chromatografie na reverzní fázi se spektrofotometrickou detekcí při 314 nm. Chemikálie: Diethylether, prostý peroxidů, p.a. Methanol, p.a. Methanol pro HPLC super gradient Kyselina fosforečná, 85%, = 1,71 Kyselina chlorovodíková, c(hcl) = 0,1 mol/l Eluční činidlo A: methanol/millipore voda/fosforečná kyselina v poměru 85 : 17 : 0,25 (v/v/v) cca 250 ml na 1 vzorek chmele (6 nástřiků) a standard (4 nástřiky) Eluční činidlo B: millipore voda (používá se pouze se Shutdown metodou!!!) Standardní chmelový extrakt se známým množstvím a -kyselin (Labor Veritas, Zürich, Switzerland), používá se jako externí standard, skladování při -18 C v mrazáku v pivovarské laboratoři, stabilita 1 rok Přístroje a materiál: Váhy AND Třepačka (oranžová) Ultrazvuková lázeň (hladina vody po naplnění cca 3 cm pod okraj) Skleněná 250 ml láhev se závitem, gumovým tešněním a hliníkovým víčkem (pozn.: po práci víčko a těsnění ponořte do teplé vody s Jarem) Odměrné baňky 50 ml a 100 ml Pipeta Biohit na 2x 5 ml Pipeta na ether Brand handy step s 50 ml zásobníkem (krok 5) Odměrný válec na těkavé kapaliny 100 ml HPLC Waters W2690 s PDA detektorem W2996 HPLC kolona Waters Nova-Pak 250 x 4.6 mm, C18 s guard kolonkou nebo Phenomenex Gemini 250 x 2.0 mm, C18 s guard kolonkou. Použití této HPLC-MS kolony diskutovat s Ing. Dostálkem (je u ní potřeba dávat větší pozor na čistotu rozpouštědel, nastřikovaná množství a tlaky). Bomba s N 2 na převrstvení Pracovní postup: Příprava externího standardu Navažte 0,5 g standardního extraktu (m cs ) do 50 ml kádinky (vraťte standard do mrazáku) a přidejte 30 ml methanolu a rozpusťte pomocí ultrazvuku. Převeďte roztok extraktu do 100 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Uzavřete baňku a vzniklý roztok opatrně promíchejte. Z tohoto roztoku odpipetujte 10 ml do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem a promíchejte. Případný zákal odstraňte filtrací přes membránu 0,45 m (Millipore). Roztok je připraven jako vzorek pro stanovení pomocí HPLC a metody externího

17 standardu. Skladujte tento roztok v lednici, převrstvěte jej dusíkem a chraňte jej před světlem alobalem. Roztok je stabilní 24 hodin. Odpipetujte cca 1 ml do vialky s víčkem a těsním (Waters) a vložte ji do karuselu HPLC autosampleru a pozici si zazanamenejte, budete ji potřebovat při vyplňování tabulky pro nástřik vzorků. Pozn.: Nastřikujte vzorek standardu nejméně 2krát před a 2krát po reálných vzorcích, stačí opakovaný nástřik z jedné vialky. Příprava vzorků chmele Rozmělněte vzorek chmele či chmelových granulí v laboratorním mlýnku. Doba mletí 2 minuty. Každý vzorek chmele připravte 3krát k nástřiku (3x extra navážka a extrakce). Navažte přesně přibližně 10 g jemně namletého chmele (m s ) do 250 ml skleněné láhve se závitem. Přidejte 20 ml methanolu a 100 ml diethyletheru. Zavřete opatrně láhev víčkem s gumovým těsněním a intenzivně třepejte 30 minut na třepačce umístěné v digestoři. Poté opatrně otevřete láhev (pracujte v digestoři), přidejte 40 ml 0,1 mol/l HCl. Opatrně uzavřete láhev a třepejte nejméně 10 minut při optimálně intenzitě (tak aby extrakční činidlo nesmáčelo gumové těsnění). Nechte láhev stát 10 minut aby se oddělili obě fáze. Opatrně odpipetujte 5,0 ml etherové fáze pipetou Brand handy step do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Opatrně promíchejte. Odpipetujte cca 1 ml do vialkek s víčky a těsněním (Waters) a vložte je do karuselu HPLC autosampleru, pozici si zaznamenejte. Případný zákal zfiltrujte pomocí 0,45 m či 0,22 m mikrofiltru a stříkačky. Chromatografické stanovení V okně nastavte vlevo metodu EBC_7_7 a vpravo chromatografický systém Aliance PDA pokud budete analyzovat. Pozn.: Pokud jen vyhodnocujete výledky tak nastavte No system. Překontrolujte správnost nastavení metody. Klikněte na záložku View Method a nahoře v lište File, pak Open method set EBC77_1. Pak přepněte v záložce View Method na Instrument a klikněte na tlačítko W2690/5 a zkontrolujte průtok mobilní fáze v záložce Flow (Isocratic, Total Flow 0.550, %A 100.0, Low Limit 50.0 a High Limit ). Zároveň překontrolujte, že eluční roztok je v láhvi A, a že je v něm zcela ponořena hadička s fritou, popsaná jako Solvent A!!! Poté klikněte na tlačítko W2996 a překontrolujte nastavení PDA detektoru (2D Data Collection, Method channel lambda 314.0, Method channel bandwith 1.2, Sampling Rate 1.0 a zaškrtnout Digital Filter ) Před vlastní analýzou je potřeba zavodnit cestu A pomocí stříkačky a programu. Eluční činidlo přefiltrujte přes 0,45 m acetát-celulosovou membránu Sartorius a nalijte do čistě vymyté 1 l láhve, popište složením mobilky, jménem a datem. Láhev dobře utěsněte parafínovou folií. Po najetí základní obrazovky na Allianci stiskněte Menu/Status poté Direct Functions a dále na Dry Prime, otevřete cestu A tlačítkem Open A, povolte zavodňovací šroub (otevřít spodní dvířka a povolit doleva šroub mezi pumpami) a ručně zavodněte cestu stříkačkou (stačí cca 10 ml), poté utáhněte šroub a stiskněte tlačítko Continue. Vyčkejte na promytí cest. Následně stiskněte Direct Functions, zkontrolujte máte-li v láhvi za přístrojem (vedou k ní dvě hadičky zelená a Seal wash in ) dostatek oplachové kapaliny (30-50% methanol) a poté stiskněte tlačítko Wet Prime. Vyčkejte na promytí součástí přístroje. Equilibrujte kolonu elučním činidlem A nejméně 30 min před nastříknutím vzorků. Přepněte se do záložky Run Samples, pokud není oranžové tlačítko View Acquisition, tak na něj klikněte. Stiskněte tlačítko Press to equilibrate system/monitor baseline, a zadejte Instrument Method ebc77 a stiskněte tlačítko Equilibrate/Monitor. Přepnutím tlačítka Control Panel v záložce Run Samples můžete sledovat základní linii = baseline. Pokud je rovná baseline, tak můžete

18 nastřikovat, viz postup níže. Každý vzorek nejméně 2krát. Tj. z jednoho vzorku chmele nejméně 6 nástřiků + 4 nástřiky na kalibraci. Přepněte se do záložky Run Samples poté máte 2 možnosti: 1. Vypište v záložce Samples tyto parametry Vial =číslo vialky, SampleName = popis vzorku, Inj Vol = nastřikovaný objem (Waters Nova-Pak 10 l, Phenomenex Gemini 2,5 l), # of Injs = počet nástřiků, Function = vyberte funkci (nejčastěji se používá Inject Samples, Inject Standard, clear calibration a equlibrate), Method Set/Report Method = vyberte EBC77_1, Run Time(Minutes) = doba analýzy (40 pro kolonu Phenomenex), ostatní parametry nepřenastavujte. Doporučuji mít v prvním řádku jen Function vybrat Clear Calibration a Method Set/Report Method vybrat EBC77_1. 2. Použít některé z předchozích stanovení a přepsat je podle aktuálních pozic v karuselu. Klikněte na File v horní liště, poté New Sample Set a poté Using Sample Set Method, vybrat např. ebc77_4 a stisknout tlačítko Open.Poté přepište podle aktuálního stavu. Po nastavení tabulky stiskněte tlačítko Press to run the current sample set method (zkumavky s zelenou šipkou) v panelu View Acquisition. V následujícím okně vyplňte Name for this sample set = napište název celého setu vzorků, Run Mode = vyplňte Run and Process, Shutdown Method = vyplňte shutdown_ebc, ostatní nevyplňujte a poté stiskněte tlačítko Run. Naměřená data jsou v záložce Browse Project a poté v záložce Results. Kliknutím na příslušný nástřik se zobrazí jeho chromatogram a po kliknutí na View Acquisition i tabulka s výsledky. Pozn.: Shutdown metoda používá cestu B, tzn. je nutné tuto cestu promýt a připravit stejně jako v případě cesty A. Používejte jen nově připravenou čistou millipore vodu. Průtok mobilní fáze 0,05 ml/min, Low Limit (psi) je tentokrát 0. Vyhřívání kolony není u této metody nutné, pracuje se při laboratorní teplotě. Pro zvýšení přesnosti vyhřejte kolonu na 20 C. Po zapnutí vyberte funkci MAN., vyťukejte 20 a stiskněte ENTER. Po práci vyhřívání vypněte (kolíbka vzadu). Výsledky lze získat buď přímo pomocí software Empower nebo jednoduchým výpočtem z vytištěných chromatogramů. Výpočty: C i DF m m s s C A ic ic A i C i = koncentrace složky i (např. kohumulonu) ve vzorku vyjádřená jako % hm. DF = ředící faktor, 1 pro extrakty, 2 pro chmel a granule m cs = navážka kalibračního extraktu v g C ic = koncentrace složky i v kalibračním standardu vyjádřená jako % hm. A i = plocha píku složky i v analyzovaném vzorku (průměr ze tří ploch) m s = navážka vzorku A ic = plocha píku složky i v analyzovaném standardu (průměr ze 4 ploch) Obsah -kyselin je součtem % hm. kohumulonu a a dvojpíku humulonu a adhumulonu. Obsah -kyselin je součtem % hm. kolupulonu a dvojpíku lupulonu a adlupulonu.

19 C = C coh + C n+adh C = C col + C n+adl Výsledky se vyjadřují jako % hm. na jedno desetinné místo. Literatura: Analytica-EBC, Method 7.7, European Brewery Convention, Zoeterwode Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC Princip metody: Polyfenoly reagují se železitými ionty v alkalickém roztoku za vzniku červeného barevného komplexu, jehož intenzita se měří spektrofotometricky při vlnové délce 600 nm. Přístroje a zařízení: - spektrofotometr UNICAM laboratorní třepačka Chemikálie a roztoky: - roztok karboxymethylcelulosy (CMC/EDTA): 10 g karboxymethylcelulosy a 2 g EDTA (ethylendiamintetraacetátdisodný Chelaton III) se rozpustí v destilované vodě v 1000 ml odměrné baňce - 3,5 % vodní roztok citrátu železitoamonného: 3,5 g citrátu železitoamonného se rozpustí v 100 ml odměrné baňce (roztok je stálý asi týden) - roztok amoniaku: 1 díl koncentrovaného amoniaku a 2 díly destilované vody Pracovní postup: Do odměrné baňky o objemu 25 ml se k 10 ml chmelového výluhu přidá 8 ml roztoku CMC/EDTA a 0,5 ml roztoku citrátu železitoamonného. Po důkladném promíchání se přidá 0,5 ml amoniaku, promíchá se a doplní destilovanou vodou ke značce. Za deset minut se změří absorbance v 1 cm kyvetách při vlnové délce 600 nm proti slepému pokusu. Ke slepému pokusu se odpipetuje 10 ml chmelového výluhu, 8 ml roztoku CMC/EDTA, 0,5 ml zředěného roztoku amoniaku a po důkladném promíchání se doplní destilovanou vodou ke značce. Výpočet a vyhodnocení: Obsah celkových polyfenolů (CP) v měřeném roztoku se vypočte z rovnice: CP = A 600 x 820 (mg/l), kde A 600 je rozdíl absorbancí vzorku a slepého pokusu při 600 nm. 5 Rozbor pivovarských kvasnic 5.1 Provozní mikrobiologická kontrola Termín kvasnice se používá pro větší množství biomasy pivovarských kvasinek, pokud se popisují jednotlivé buňky nebo jejich vlastností používá se termín kvasinky. Prvními ukazateli kvality kvasnic bývá posouzení makroskopických, mikroskopických znaků a celkové vyhodnocení znečištění kvasnic( várečných - použitých na zakvašení). Jako hlavní

20 kvalitativní vlastnosti kvasnic se pak hodnotí jejich viabilita a vitalita. Termín viabilita nebo počet viabilních buněk (viability count) označuje počet buněk v populaci, které jsou schopné růstu a dalšího rozmnožování. Stanovuje se několika metodami s odlišným principem. Nejpřesnější (ale i časově nejnáročnější) jsou metody založené na buněčné replikaci, nejrozšířenější jsou metody založené na barvení a méně používané jsou metody jejichž principem je měření obsahu některých buněčných složek, adenosin trifosfátu (ATP), či redukované formy nikotinamid dinukleitidu (NADH). Termín vitalita poukazuje na fyziologický stav populace nebo na její metabolickou aktivitu. Vitalita se v laboratorních podmínkách nejčastěji sleduje testy založenými na metabolické aktivitě kvasinek (acidifikační test, intraceluární ph, rychlost spotřeby kyslíku atd.) nebo metodami založenými na měření některých buněčných složek jako jsou zásobní látky (glykogen, trehalosa atd.) nebo ATP či NADH. 5.2 Stanovení viability kvasnic barvícími technikami. Barvení methylenovou modří metodou podle EBC Princip: Živé buňky kvasinek redukují alkalický roztok methylenové modři na bezbarvou formu, mrtvé buňky kvasinek se barví modře. Přesnost stanovení závisí na ph, jehož optimum pro reprodukovatelné stanovení je 9,5-10,5. Materiál: Bürkerova počítací komůrka, methylenová modř, mikroskop Pracovní postup: V kapce roztoku methylenové modře se rozmíchají kvasnice očkovací jehlou nebo tenkou skleněnou tyčinkou tak, aby vznikl preparát s počitatelným množstvím buněk v políčku Bürkerovy komůrky nebo v zorném poli. Po přikrytí krycím sklem se ihned spočítají tmavě modře zbarvené buňky a ostatní kvasinky. Methylenová modř buňky usmrcuje a počet mrtvých buněk s časem roste. Prohlédne se nejméně 20 políček a výsledek se vyjádří v procentech mrtvých buněk z celkového počtu kvasinek. Metoda je spolehlivá, dodrží-li se předepsané podmínky a pracuje-li se rychle. Kvasinky musí být v suspenzi dobře rozptýlené, preparát musí mít předepsanou hustotu ( buněk v zorném poli), jinak se získají chybné výsledky. Násadní kvasnice mají obsahovat méně než 5 % mrtvých buněk Literatura: Šavel J.: Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL Praha 1980, s. 88 Smart K., A., Chambers K., M.: J. Am. Soc. Brew. Chem. 57 (1), 1999, s Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru Princip: Při průtokové cytometrii jsou jednotlivé buňky unášeny laminárním proudem kapaliny do měrné cely kde je ozáří světelný zdroj, kterým je obvykle laserový paprsek přesně definovaných parametrů. Světelný zdroj je zaostřen na proud kapaliny, nesoucí analyzovaný vzorek. Světelný paprsek se při průchodu jednotlivými buňkami buť pohltí, rozptýlý nebo u obarveného vzorku emituje fluorescenční záření měří se tedy veličiny: úhel rozptylu, snímaný v přímém směru od světelného zdroje (forward angle FSC), odpovídající velikosti buněk, úhel rozptylu, snímaný pod úhlem 90 od světelného zdroje (side angle SSC), popisující granularitu buňky, a fluorescence pro různé vlnové délky (fluorescence je také snímána pod úhlem 90 od světelného zdroje). Z těchto měřených veličin získáme informace o počtu procházejících jedinců, jejich tvaru, velikosti, morfologii a vitalitě. Vzniklé signály jsou jednotlivě zesíleny fotonásobiči, detekovány a registrovány pomocí pulzního analyzátoru napětí. Buňky mohou být analyzovány při velmi vysokých rychlostech průchodu měrnou celou, dosahujících až několik tisíc buněk za sekundu, avšak za optimální je považováno rychlost v řádu stovek.

21 Výsledkem analýzy je histogram, který ukazuje rozložení jednotlivých měřených parametrů v rámci buněčné populace. Jestliže se současně měří v jediné buňce více než jeden parametr, lze výsledky vyjádřit též dvou nebo třídimenzionálně histogramem nebo bodovým diagramem pro dvě charakteristiky. Každý bod diagramu odpovídá jedné měřené částici. Mezi nejčastěji používaný bodový diagram v průtokové cytometrií patří tzv. dot plot diagram, který udává závislost dvou korelujících parametrů (vlastností buněk), např. popisuje závislost velikosti buněk (FSC) na jejich granularitě (SSC). Propidium jodidem se barví pouze živé buňky, mrtvé ne. Poznámka: propidium jodid je chemikálie se silným karcinogenním účinkem, proto je při manipulaci nezbytné používat chirurgické rukavice či jinou vhodnou ochranu. Chemikálie a zařízení: Zásobní roztok barviva (10 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), pracovní roztok barviva (1 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), fyziologický fosfátový ústojný roztok PBS, průtokový cytometr (Partec PAS III, výrobce: Partec, GmbH Germany), argoniontový laser, červený filtr FL3 nad 600nm. Pracovní postup: Z hodnocených kvasnic se do odeberou dva vzorky. V jednom se kvasinky po odstředění usmrtí dvouhodinovou fixací v roztoku 70 % ethanolu a poté znovu odstředí a promyjí fosfátovým pufrem. Ze vzorku se přidá několik kapek do měrné kyvety a ta se doplní do dvou třetin fosfátovým pufrem. Do kyvety se nakonec přidá 5 μl barviva a roztok se řádně protřepe. Po vlastní analýze na průtokovém cytometru popsaném výše se vyhodnotí intenzita fluorescence mrtvých buněk. Ta samá procedura, s pochopitelným vynecháním fixačního kroku, je provedena i s druhou částí vzorku. Buňky, které fluoreskují ve stejném rozmezí intenzit jako u fixovaného vzorku jsou poté vyhodnoceny jako mrtvé. Literatura: Hutter K., J., Schaefte J.: Monatsssch. Brauwiss. 50, 1997, s. 444 Howard M.Shapiro: Practical flow citometry. Wiley-Liss publication, 3rd ed., New York, Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem Princip: Acidifikační test je ukazatelem fyziologického stavu kvasnic. Test je založen na schopnosti kvasnic snižovat ph definovaného roztoku, tato schopnost přímo koreluje s fyziologickým stavem populace. Chemikálie: destilovaná voda, 0,05 M roztok hydroxidu draselného a roztok s koncentrací glukosy 20,2 g/l destilované vody. Pracovní postup: Z třikrát odstředěných a promytých kvasnic (3000 ot./min po dobu 10 min) se naváží 9 g do suché 150 ml kádinky. Kvasničná pasta je pak resuspendována ve 100 ml destilované vody vytemperované na 25 O C a s ph upraveným na 6,3 (ph bylo upraveno roztokem hydroxidu draselného). Ihned potom následuje měření ph v minutových intervalech za stálého míchání suspense magnetickým míchadlem. Po uplynutí 10 min, se do proměřovaného roztoku přidá ještě 5 ml glukózového roztoku. Tento roztok je vytemperován na 25 0 C. Po dalších 10 min se odečte poslední hodnota ph a tím je měření ukončeno. Výpočty jsou provedeny podle následujících vztahů: Ap celk. = 6,3 - ph 20

22 AP 10 = 6,3 - ph 10 Kde: AP 20 = ph 10 - ph 20 ph 20 je hodnota ph po 20 min měření ph 10 je hodnota ph po 10 min měření AP 20 je glukózou indukovaná acidifikační schopnost AP 10 je spontánní acidifikační schopnost Ap celk je celková acidifikační schopnost Literatura: Kara B., Simpson W. J., Hammod J. R. M.: J. Ind. Brew., 94, 1988, s Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR Bakteriální kontaminace piva nepředstavuje v dnešní době pro pivovarství vážné nebezpečí. V pivu je nejčastější kontaminace mléčnými bakteriemi. Protože mléčné bakterie zahrnují mnoho druhů, je dosti často problém s jejich přesnou charakterizací. Na 31. Pivovarsko-sladařském semináři v Plzni bylo referováno o nejčastějších izolátech mléčných bakterií v pivu, a tyto izoláty byly na základě biochemických charakteristik zařazeny jako Lactobacillus plantarum. Rod Lactobacillus je charakterizován jako G + nesporotvorné tyčinky. Dělí se na homofermentativní podrod Lactobacillus a heterofermentativní podrod Saccharobacillus. Lactobacillus plantarum patří do podrodu Lactobacillus a tvoří opticky inaktivní kyselinu mléčnou. Je velmi rozšířen v přírodě, účastní se mléčného kvašení rostlinného materiálu (zelí, okurky apod.). Některé potravinářské podniky, jako jsou mlékárny, využívají tuto bakterii jako kulturní mikroorganismus. Její přítomnost v pivu je ovšem kontaminací. Abychom potvrdili, že se jedná skutečně o Lactobacillus plantarum, použili jsme přesnější a specifičtější metodu charakterizace izolátů bakterií, které byly izolovány ve Výzkumném ústavu pivovarském a sladařském v Praze. Pracovní postup: Pracovní postup se skládá z několika kroků. Nejdříve se izoluje samotná gdna z bakterií pomocí kitu a je změřena absorbance pomocí spektrofotometru při vlnové délce λ = 260 nm. Ze zjištěných hodnot je vypočtena koncentrace vyizolované DNA. K určení druhu bakterie je použit speciální kit BrewSave (TAKARA BIO). Pomocí tohoto kitu bylo možné amplifikovat část gdna a podle velikosti amplifikované části určit druh. Použité půdy a způsoby kultivace bakterií rodu Lactobacillus Sterilní nízkotučné mléko pro uchování izolátů laktobacilů v zamraženém stavu při teplotě -20 C. MRS agar (OXOID) s přídavkem aktidionu (0,025 g/l) a β-fenylethanolu (0,3%) k uchování G + a katalázu netvořících laktobacilů MRS bujón (OXOID) k pomnožení izolátů laktobacilů. MRS agar (OXOID) k namnožení izolátů laktobacilů před izolací DNA.