Buněčné transplantace: značení buněk a zobrazení pomocí MRI. Obsah

Transkript

1 Buněčné transplantace: značení buněk a zobrazení pomocí MRI Obsah Proč potřebujeme zobrazovat buňky? Jaké jsou vhodné značky pro buněčné značení? Jak buňky značit? Jak to funguje? Jak buňky sledovat in vivo? Je informace z MRI dostatečná? Příklady

2 Úvod Pokrok v buněčných transplantacích Pluripotentní buňky- potenciální nástroj léčby? Náhrada poškozené tkáně s omezenou vlastní schopností sebeobnovy Úvod Jak vizualizovat buňky? Využijme MR!

3 Proč nic nevidíme? Úvod Využijme MR! - stejný signál z transplantovaných buněk jako z hostitelské tkáně - nízké rozlišení MRI => není možné zobrazit jednotlivé buňky ale - je možné detekovat i jednu jedinou buňku Úvod

4 Úvod Označenou buňku lze detekovat i při nedostatečném obrazovém rozlišení Úvod

5 Úvod Shluk označených buněk v tkáni snadno odlišíme Úvod MR nástroj pro sledování buňek in vivo Potřebujeme nějaké značky pro buňky!

6 Kontrastní látky Buněčné kontrastní látky Superparamagnetické kontrastní látky => silnýt2a T2*efekt - Oxid železa obalený dextranem - např. MION, Endorem-Feridex, Resovist Paramagnetické kontrastní látky => T1 efekt - Založeny na chelátech Gd Superparamagnetismus Superparamagnetické kontrastní látky - Vysoká magnetická susceptibilita => Vznik lokálních nehomogenit magnetického pole ( homogeneity spoilers ) Defázování protonů difundujících v blízkosti SPM částic dominantní vliv na T2 a T2*

7 Srovnání PM a SPM látek Celulární markery Superparamagnetické kontrastní látky silný T2 a T2* efekt (oxidy železa) Paramagnetické kontrastní látky - dominantní T1 efekt (cheláty Gd) Jaké buňky lze značit kontrastními látkami? Prakticky jakékoliv! Kmenové buňky kostní dřeně potkana Embryonální kmenové buňky potkana Lidské buňky kostní dřeně Lidské hematopoetické buňky CD 34+ Langerhansovy ostrůvky potkana Buňky tumorů, lidské i potkaní

8 Značení buněk Nespecifické značení buněk Kontrastní látka se přidá do média s buněčnou kulturou, je pohlcena fagocytózou Možnost využít transfekční činidla - poly-l-lysin Značení buňek Nespecifické značení buněk Kontrastní látka se přidá do média s buněčnou kulturou, je pohlcena fagocytózou Možnost využít transfekční činidla - poly-l-lysin Arbab AS, et al. Mol Imaging 2004; 3:24-32

9 Značení buněk Přítomnost železa v buňkách, viabilita B A 50µm 500nm C 15µm D 15 µm E 15 µm Značení buněk Specifické značení buněk Vazba kontrastní látky na povrch buňky pomocí vhodně zvoleného antigenu Bulte JW, et al.: Magn Reson Med May;25(1): Jendelová P, et al. Cell Transplant 2005; 14:

10 Značení buňek Elektronová mikroskopie Kolik železa lze do buňky naládovat? Analýza železa (mineralizace + spektrofotometrie, ferrozinový proces atd.) pg železa v jedné buňce (železo internalizováno uvnitř buňky) 0.5 pg železa navázaného na buněčnou membránu

11 MR vizualizace in vitro Suspense buněk v želatině ve zkumavkách Měření v relaxometru a v MR tomografu MR vizualizace in vitro cells per fantom/ 47 cells per image voxel / / / / 9.4 Pinkernelle J et al. Magn Reson Med. 2005;53(5): Ciobanu L et al. Solid State Nucl Magn Reson 2004;25: Dodd SJ et al. Biophys J 1999;76: Foster-Gareau P et al. Magn Reson Med 2003;49: / cells per fantom/ 2.3 cells per image voxel

12 MR vizualizace in vitro Implantace buněk Injekce buněk do kortexu potkana Potkani v anestézi (inhalace isofluranu ve vzduchu) Imunosuprese: methylprednisolon acetát cyclosporin MR vizualizace in vivo Experimentální MR tomograf 4.7 T, 20 cm Povrchová cívka T2W turbo spin echo sekvence T2*W gradient echo sekvence

13 Implantace buňek do mozku potkana MR vizualizace in vivo Pozorování migrace buněk do experimentální léze Fotochemická léze (interakce bengálské červeně se světlem) v kortexu v levé hemisféře potkana Značené buňky aplikovány do kortexu kontralaterálně, nebo intravenózně

14 Fotochemická léze MR a histologie (barvení železa) 200µm Pozorování migrace Potkani s lézí a značenými buňkami implantovanými kontralaterálně 2 hod. 1 týden 2 týdny po transplantaci

15 Pozorování migrace Potkani s lézí a značenými buňkami implantovanými intravenózně před 1 týden po 2 týdny po Kontrolní pokus Potkani s lézí a aplikovanou čistou kontrastní látkou Den -1 Den 0 Den 7 Den 14 Den 21

16 Histologické ověření Histologie nezbytný krok pro ověření MR výsledků Detekce železa/buněk imunohistochemickými metodami po usmrcení zvířete: Barvení železa (berlínská modř) BrdU (bromodeoxyuridin) obarví se fluorescenčním antigenem GFP (Green Fluorescent Pyridine) NeuN (neuronální marker) GFAP (Glial Fibrilar Acidic Protein). Histologické vyšetření

17 Histologické vyšetření Histologické vyšetření Ko-lokalizace BrDU + NeuN BrDU NeuN BrDU+NeuN

18 Zobrazení specificky značených buněk Lidské buňky CD34+ cells transplantovány do mozku potkana T2W T2*W Zobrazení specificky značených buněk Histologie Místo vpichu Léze

19 Značení nádorových buněk 21 dní po implantaci tumoru Značení nádorových buněk 7 dní po implantaci tumoru sferoidy 21 dní po implantaci tumoru 19

20 Langerhansovy ostrůvky MR zobrazení jednoho ostrůvku in vitro Insulínová granule Lysosom naplněný železem Obrázek izolovaného ostrůvku z electronového mikroskopu Aplikace samotného kontrastu do portální žíly před 10 minut po týden po aplikaci

21 Langerhnasovy ostrůvky výsledky transplantace Značené ostrůvky (2500) transplantovány do jater portální žílou in vivo Hladina glukózy diabetických potkanů: 1 týden 18 týdnů po Tx Glykémie před Tx [mmol/l] 3 dny po Tx [mmol/l] 2 týdny po Tx [mmol/l] 22.0 ± ± ± 0.8 Závěr Magnetická rezonance je užitečný nástroj po detekci vybraných buněk in vivo Pro detekci buněk je nezbytné magnetické značení pomocí vhodné kontrastní látky Vhodné kontrastní látky jsou komerčně dostupné Postupy značení buněk jsou známé, dobře popsané a nepředstavují podstatný problém Značené buňky jsou životaschopné a kontrastní látku si podrží po dostatečně dlouhou dobu Buňky je možné značit specificky (je však nutné počítat s tím, že množství kontrastní látky vázané na membránu je nižší)

22 Závěr K čemu je to dobré? Příklad aplikací: Monitorování úspěšnosti buněčných transplantací Cílené doručení chemoterapie Výzkumné projekty (tumory...) Závěr A co humánní medicína? Klinické testy s buněčnými transplantacemi kmenové buňky do myokardu kmenové buňky do míchy po poranění páteře transplantace Langerhansových ostrůvků