Rh systém. Rh systém. Geny. Nejkomplexnější a nejvíce polymorfní Rh antigeny patří k nejvíce imunogenním. Mgr. HanaTereza Bolcková

Transkript

1 Rh systém Rh systém Nejkomplexnější a nejvíce polymorfní Rh antigeny patří k nejvíce imunogenním Mgr. HanaTereza Bolcková Geny RH lokus - 1.chromozóm 2 Geny geny kódujícírhproteiny vysoce homologní na 1.chromozómu (1p34-36) RHCE gen-rh CcEeprotein RHD gen-rhd protein Příbuzný gen (cca 40% sekvenčníhomologie) RHAG na 6.chromozómu (6p11-21) Rh glykoprotein Počet exonů: RHD 10, RHCE 10, RHAG 10 1

2 Rh protein family Rh protein family RhAG protein předek Rh proteinů 40% sekvenční homologie s Rh proteiny RhCcEe protein antigeny C c E e C w RhDprotein antigen D Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2 Rh komplex Rhproteiny(RhD protein, RhCcEcprotein) všechny Rh antigeny Rh glykoprotein(rhag) 2 Rh proteiny (RhD, RhCcEe) +2 Rh glykoproteiny (RhAG) uspořádány v tetramerickou strukturu +Rh související proteiny: LW-glykoprotein-adhezivnímolekula ICAM4,ligandpro integrin LFA-1 Integrin asociovaný protein(iap-cd47) GlykophorinB nesoucíantigeny S,s,U (u Rh null redukována hlavně exprese U antigenu) Fy glykoprotein pouze částečná souvislost, z Duffy antigenůu Rh null chybípouze Fy5 Bílkovina pásu 3(Band 3; anion exchanger,ae1 nesoucí antigeny systému Diego pouze částečná souvislost (vzájemnéovlivněníoptimálníexprese obou systémů) 2

3 Exprese struktur Rh systému Rozpustná forma: ne Tkáně: erytroidně specifické Exprese struktur Rhsystému během erytropoezy Rhantigeny se objevujíjižv ranéerytropoeze Anti-D se váže na asi 3% BFU-E, 68% CFU-E a na všechna pozdější vývojová stádia síla vazby postupnězesiluje 25% proerytroblasty, 50-60% erytroblasty, 75% normoblasty, 100% maturované erytrocyty Na fetálníchbuňkách jsou Rhantigeny prokazovány od šestého gestačního týdne. Rh antigeny Jsou lokalizovány na proteinech RhDa RhCcEe Frekvence výskytu se někdy liší podle dané populace Antigeny Rh systému Počet antigenů: 45 D, C, E, c, e, C w f, Ce, G, C G, CE, c-like, ce, Ce-like HFA: Hr 0, Hr, hr S, Rh29, hr B, Hr B, C-like, Nou, Sec, Dav, LFA: V, C x, E w, VS, hr H,Rh35, Be a, Rh42- Thornton, Crawford, JAL, STEM, MAR, LFA u variantních D: D w, Go a, Rh32, Har, Evans, Tar, Riv, FPTT, BARC 3

4 Rh antigeny Počty antigenů na erytrocyt: u normálníexprese D ; C/c a E/e cca Jsou závisléna geno-a fenotypovémuspořádání(např. při C v trans pozici je exprese D slabší, nežpři C v cis pozici; CcEeantigeny jsou exprimoványve větším počtu u D-nežu D+) A dále na homo-nebo heterozygociipro daný antigen (tzv. efekt dávky) Zvýšenépočty D antigenu jsou nalézány na krvinkách s chyběním některých nebo všech C/c a E/e antigenů(d- -/ D ) Sníženépočty (v řádůtisícůažstovek) jsou u slabých D antigenůa u některých typůd variant D antigen soubor epitopů na povrchu extramembranózní části Rh D proteinu. Epitopem je určité seskupení několika aminokyselin polypeptidovéhořetězce,konformačnězávisléna prostorovém uspořádání celého proteinu Monoklonálními protilátkami je v současné době rozeznáváno více než.30 různých epitopů Slabéa variantnírhd antigeny a monoklonální protilátky Rozšířenípoznatkůo membránovém uspořádání RhD proteinu a stále dochází (s produkcí nových monoklonálních protilátek) k upřesňováníklasifikace RhD variant D antigen Ostatníerytrocytovéantigeny většiny proteinových systémů výskyt v alelických párech rozdílem většinou jediná aminokyselina podstatněnižšíimunogenicitaantigen pozitivních krvinek pro antigen-negativní jedince 4

5 D antigen Výskyt v populacích: Kavkazská 85% Černošská 92% Asijská 99% Am.indiáni 99% D antigen Počet molekul na erytrocytu: BěžnéD fenotypy SlabéD fenotypy ZesílenéD fenotypy D antigen efekt enzymů D antigen Ficin/Papain Trypsin α-chymotrypsin Pronáza Sialidáza DTT 200 mm Cloroquine (RT) Kyselé prostředí Resistentní( ) Resistentní( ) Resistentní( ) Resistentní( ) Resistentní( ) Resistentní Resistentní Resistentní Klinický význam aloprotilátek: Transfuzní reakce: mírné až těžké/akutní nebo pozdní HON: mírné až těžké 5

6 D antigen D antigen In vitro charakteristika aloprotilátek: Třída Ig:většina IgG, některáigm (IgA vzácně) Optimální technika: NAT, enzymy Vazba komplementu: velmi vzácně Autoprotilátky Ano, mohou působit jako mimikující aloprotilátky Více než200 RhD alel variantní D slabéd DEL D negativní nefunkční alely RhD gen Variantní D antigeny Změny RHD genu, kterése promítajído extramembranózní části RhD proteinu Lineární změna D epitopů Změna 3-dimezionální konformace smyčky 6

7 Variantní D antigeny Chybíněkteréepitopy(proti kterým mohou jedinci s D variantou vytvářet protilátky) Docházík novému tvaru RhDproteinu, který někdy bývározeznáván imunitním systémem jedincůs normálními antigeny jako nový antigen(lfa) Variantní D antigeny Definovány variantníd II ažvii příčina substituce jedné extracelulární aminokyseliny DII a DVII (DMH, DFW, DHR, D MHI, DNU, DNB) hybridní RHD-CE-D alely DIII, IV, V, VI každá obsahuje několik subtypů Variantní D antigeny Síla exprese D variant je velice rozdílná Od téměř normálních počtů kopií RhD(var)proteinu (DNB,D III,D VItypIII ) Ažpo značnou redukci(d VItypI ) v závislosti na tom, zda danázměna proteinu ovlivníjeho zabudovánído membránového tetrameru s RhAG či nikoliv Variantní D antigeny Osoby s variantním D proteinem mohou tvořit alloanti-d Nejčastější a zřejmě klinicky nejvýznamnější (popsánypotransfuzníreakce i těžkéhon) je varianta D VI. 7

8 Variantní D antigeny Mapování RhD epitopů Dřívebyly variantníantigeny identifikovány testováním erytrocytůdobře charakterizovanými polyklonálními anti-d tvořené osobami s variantním D A takétestováním anti-d pacienta proti erytrocytům se známým variantním antigenem Variantní D antigeny Mapování RhD epitopů Nyní Lidské monoklonální protilátky se používají ke klasifikaci variantních D antigenůpodle exprimovaných epitopů Původnímodel 8 a 9 epitopůrozšířen na 16, 30, 37 epitopů Většina epitopů konformačně závislých Slabéa variantnírhd antigeny a monoklonální protilátky Na povrchu RhD proteinu se nachází velké množství D epitopů vazebných míst pro jednotlivé monoklonální protilátky Velikost jednoho epitopu může odpovídat cca 5 aminokyselinám Epitopy určeny jednak sekvencíaminokyselin (primárnístrukturou), ale takévzájemným prostorovým uspořádáním extramembranózních smyček RhD proteinu (sekundárnía terciálnístrukturou) Slabéa variantnírhd antigeny a monoklonální protilátky Monoklonálníprotilátky reagujípouze s jedním epitopem - pokud je u D varianty bodovámutace ve vazebném místě monoklonální protilátky negativní reakce 8

9 D antigen Imunologická jedinečnost a velmi silná imunogenicita D antigenu u D-jedincůchybícelý RhDprotein majípouze RhCcEeproteiny, kterése lišíod RhD aminokyselinami. jejich imunitnísystém dobře rozpoznávád+ erytrocyty (kterémají navíc RhDprotein) cca D-80% jedincůpo kontaktu s D+erytrocyty vytváří anti-d protilátky. Variantní D antigeny téměřu všech D variantjižbyl definován monoklonálními protilátkami příslušný epitopový deficit (chybění reakce) pouze varianta D III může prozatím být serologicky detekována pouze na základě nereaktivity s polyklonální protilátkou anti- D produkovanou jedincem s variantou D III. Variantní D antigeny Variantní D D varianty zpočátku rozpoznávány na základěanti-d aloimunizace v poslednídobějsou častěji zjišťovány při zjištěníslabých a diskrepantních nálezůpři stanovování Rh(D) a následném testování panelem monoklonálních protilátek ve specializovaných laboratořích 9

10 Charakteristika variantních D fenotypů Charakteristika variantních D fenotypů Fenotyp II IIIa Asociovaný haplotyp Ce Ce G+ D epitopy epd1,(2),3,5,6/7,8 epd1-9 Etnický původ Kavkazský Černošský Fenotyp Va Asociovaný haplotyp ce, Ce,cE D epitopy epd2,3,4,6/7,8,9 Etnický původ Kavkazský, Černošský, Japonský IIIb Ce G- epd1-9 Černošský Vb C w e Neznámo IIIc Ce epd1-9 Kavkazský VI type I ce epd3,4,9 Kavkazský IVa ce epd4,5,6/7, 8 Černošský VI type II Ce epd3,4,9 Kavkazský, Japonský IVb(heterogenní) Ce,cE epd5,6/7,8 Kavkazský, Japonský VII Ce epd1,2,3,4,5.6/7,9 Kavkazský Charakteristika variantních D fenotypů Slabé a variantní D antigeny Fenoty p VII DFR DBT Asociovaný haplotyp Ce Ce>cE Ce>(C)(e) a ce D epitopy epd1,2,3,4,5.6/7,9 epd(1),(2),3,4,(5),6 /7,9 epd (6/7),8 Etnický původ Kavkazský Kavkazský Kavkazský Černošský Japonský Frekvence výskytu abnormálních D antigenů: 1% všech D+ z toho 10% představujíd varianty R 0 Har c(e) epd(5),(6/7) Kavkazský 10

11 Slabé D antigeny Slabé D antigeny Změny RHD genu, kterése promítajído transmembránovéa intracelulárníčásti RhD proteinu exprese sníženého množství D antigenů (obvykle méněnež5000 D antigenůna erytrocyt) D antigen nezměněn Původně popsáno 16 typů Dweak V současnosti počet Dweak typů včetně subtypů: 80 Slabé D antigeny Slabé D antigeny Nejčastější D weak v evropské a kavkazské populaci D weak typ 1, 2, 3, 4.0/4.1 95% všech typů D weak Jedinci se slabými D antigeny se neimunizují normálním D antigenem Výjimky: D weaktyp 15, D weaktyp 4.2 (DAR), D weaktyp 7 Nebyla zaznamenána aloimunizace u Dweaktyp 1 až4.1 Pozorovány nízkotitrové autoprotilátky 11

12 DEL D negativní Velmi slaběexprimovaný D antigen 200 nebo méněkopiíd antigenu na RBC Vzácné v evropské populaci Až 30% D-negativních ve východoasijské populaci NejběžnějšíD negativníhaplotyp ve všech populacích je způsoben delecírdh genu v kavkazské populaci téměř výhradně Existují i jiné D negativní haplotypy: nefunkčnírhd alely částév Afrických populacích Vzácné delece fenotypů Dc- ChybíE e D-- chybí C,c,E,e ufenotypud--/d--je tak vysoký počet D antigenů, že docházík aglutinaci těchto krvinek i účinkem inkompletních(igg) anti-d protilátek Zvláštní formy Rh fenotypů Rh null Na membráněery chybírhd i RhCE protein Příčina: 2 nefunkční RHCE alely spolu s RHD deletovaným haplotypem amorfní typ Defekt v RHAG alelách -regulátorový typ exprese Rh proteinůvyžaduje přítomnost RhAG proteinu 12

13 Zvláštní formy Rh fenotypů Rh mod Polymorfismus RhC/c a RhE/e Rh antigeny jsou velmi zeslabenéa prokazatelné jen nejcitlivějšími metodami (Rh mod ) alelicképáry antigenů-majípodklad ve změnách nukleotidů RHCE genu Substituce nukleotidů v RHCE: E/e 6 substitucí změna 4 aminokyselin C/c -1 substituce změna 1 aminokyseliny VariantníE antigeny: I, II, III, D v type III Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2 C/c a E/e antigeny pravděpodobný mechanismus vzniku genůje rozdílný RHCE (Ce)gen vznikl zřejměrekombinacís nahrazením prvních dvou exonůrhce(ce) exonyz RHD RHCE(cE) gen vznikl.bodovou mutací(ce) genu G antigen RhD a RhC proteiny nesou G antigen, který souvisí s částí na druhé extracelulární smyčce kódované exonem 2 Konformačně závislý Klinický význam: Transfuzní reakce: žádné až těžké HON: žádnéažtěžké 13

14 f antigen složený antigen exprimovanýna ery majících c a e ve stejném haplotypu (cis) např. R 1 r (DCe/dce), R 0 R 0 Dce/Dce neníexprimován pokud c a e se vyskytujína oddělených haplotypech (trans) např. R 1 R 2 (DCe/DcE) anti-f je častou součástí anti-c nebo anti-e sér Klinický význam: Transfuzní reakce: mírné/pozdní/hemoglobinurie HON: mírné Rh u pacientů s myeolidní leukémií Pacienti s akutnínebo chronickou myeloidníleukemií, myeloidnímetaplasií, polycytémií nebo myelofibrózou Příležitostněmají2 populace ery s různým Rh Ostatní Rh antigeny Většinou buďantigeny o vysokéfrekvenci výskytu(hfa-high frequency antigen) Nebo antigeny o nízké frekvenci výskytu(lfa-low frequency antigen) Některéz nich jsou závisléna určitékombinaci jiných antigenůrhcceeproteinu, cožsvědčío jejich konformační povaze Některé jsou společné všem Rh antigenům(chybí pouze u Rh null ), jsou tedy lokalizovány na identických aminokyselinových sekvencích RhDa RhCcEe proteinů. Detekce RhD antigenů 14

15 Slabé a variantní RhD antigeny - vyšetřování Detekce slabých a variantních RhD antigenů je velmi závislána použitých diagnostických sérech a vzhledem k množstvímožných reakcíu variantních antigenůnemůže být v každém případě stoprocentně informativní Kompromis mezi možnostmi diagnostiky, rutinníproveditelnostítestua klinickou významností výsledků Detekce RhD antigenů Současná doporučení požadují při určování RhD zohlednit účel, pro který je prováděno, zda je o: dárce krve novorozence příjemce transfuze těhotnou ženu Detekce RhD antigenů Dárce krve: Detekce pokud možno všech typů RhD antigenu normální, variantní i slabé antigeny Dvojíurčeníaglutinačním testem (2 různáséra, monoklonální diagnostika- proti různým epitopům) Určení slabých D pomocí IgG protilátek a NAT Pokud jsou používány monoklonálníigg protilátky, mělo by být užito více klonůa kombinace antiepitopových specifitpoužitých IgG a IgM by měla pokrýt celé spektrum RhD variant) Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components 14th edition 2008 Chapter: Blood group serology Směrnice pro přípravu, použití a kontrolu kvality krevních produktů Kapitola: serologie krevních skupin 15

16 2. Kontrola kvality pro stanovení krevních skupin Kontrolovaný parametr: 3. stanovení RhD Minimální požadavky pro testování Dvojí testování s použitím dvou anti-d reagentů různých klonů nebo šarží použití NAT pro potvrzení D weak (slabé D) u dárců, kde to je požadováno. Musí být zajištěno, že systém rozeznává nejdůležitější D varianty (zejména D varianty kategorie DVI) jako Rh (D) positivní pokud ABO a RhD je již známo, je dostatečný jeden test Imunohematologickávyšetřenív těhotenství a po porodu DoporučeníSpolečnosti pro transfuznílékařstvíčls JEP š. STL2010_06 ze dne verze 3 (2010_06) Pracovnískupina STL: DuškováD., KubánkováH., Masopust J., Pejchalová A., Písačka M. Zpracování pro účely této přednášky Mgr. Hana Tereza Bolcková Detekce RhD antigenů Vyšetření plodu Novorozenec: Test Metoda a diagnostika (min. požadavky) Komentář ABO Aglutinogeny 2x. 2 různé klony pro každé dg. Sérum. Jen v případě kordocentézy prováděné u susp. anémie způsobené HON a před IUT. D D w 2 monoklonální dg. séra anti-d třídy IgM s různými klony, která nedetekují variantu D VI. Není vhodné dg. sérum anti- CDE. Jen v případě kordocentézy prováděné u susp. anémie způsobené HON a před IUT Nevyšetřuje se 16

17 Detekce RhD antigenů Příjemce transfuze, těhotná Možnost imunizace D- i D variant Ideálně zachytit všechny varianty jako D- nebo na základě diskrepantních reakcí dvou diagnostik Detekovat všechny osoby s D weak (bez rizika imunizace) jako D positivní Není možno zajistit vzhledem k velké heterogenitě reakcí slabých a variantních RhD antigenů Detekce RhD antigenů Příjemce transfuze, těhotná Požadavek Prevence imunizace u varianty nejčastější současně nejvíce disponované k tvorbě protilátek D VI použití takových aglutinačních diagnostik, která nereagujís variantou D VI u negativních výsledkůaglutinačních anti-d diagnostik se u příjemců a těhotných již nepokračuje testem na určení slabých D 2.2 Stanoveníkrevnískupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD)dledoporučeníSTL2011_07. 2 Antigen D (RhD) u příjemce transfuze Každý vzorek se vyšetřuje dvojmo různými monoklonálními diagnostickými séry anti-d třídy IgM, která by neměly detekovat variantu D VI. Pro určení antigenu D se nepoužívá antiglobulinový test. Doporučen ení STL Imunohematologická vyšet etřování v těhotenstvt hotenství a po porodu Vstupní vyšet etření 12. týden AB0 (AG+AGI; opak. AG) D (2x IgM,, ne anti-d VI, ne D w ) (diskrepance ref.. laboratoř) Screening Ab (LISS-NAT) (dg. ery) Identifikace Ab (dg. ery) [fenotyp] 17

18 2.2 Stanoveníkrevnískupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD)dledoporučeníSTL2011_07. 2 Antigen D (RhD) Při vyšetření antigenu D rozlišujeme 3 kategorie výsledků: RhDpozitivní= jasněpozitivníreakce se všemi použitými diagnostickými séry anti-d RhDnegativní= jasněnegativníreakce se všemi použitými diagnostickými séry anti-d D w/v (slabý antigen D/varianta antigenu D) 2.2 Stanoveníkrevnískupiny AB0 a antigenu D (AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07. 2 Antigen D (RhD) D w/v (slabý antigen D/varianta antigenu D) = na slabý antigen D či variantu antigenu D je vhodnémyslet u: slabší reakce všech použitých diagnostických sér anti-d zcela diskrepantních reakcípoužitých diagnostických sér (pozitivní x negativní) rozdílu v síle reakcí použitých diagnostických sér anti-d nečekaného nálezu anti-d imunizace bez autoreakceu osoby se zdánlivě normálním antigenem D diskrepance mezi anamnestickým údajem a současným vyšetřením diskrepance mezi výsledky vyšetřeníjedince postupy doporučenými pro dárce a příjemce krve. Transfuznívýznam D variant a slabých D antigenů Příjemcům s D variantami by měly být podávány D- substituce (prevence anti-d imunizace) Nenímožnéz důvodu značnéheterogenity D variant použít při rutinním testovánítakový postup, který by zaručil detekci všech typů prevence vyhrazena pro variantu D VI (výběr takových anti-d aglutinačních diagnostik IgM, která s touto variantou nereagují) D varianty se silnou expresí a minimální změnou epitopů však budou i nadále určovány jako D+ a budou v riziku aloimunizace(například DNB) Rodinnástudie, preventivníopatřeníu dosud neimunizovaných osob, zejména mladých žen Slaběexprimovanévarianty jsou chráněny před rizikem podání D+ tím, že u příjemců není indikováno stanovení slabých antigenů antiglobulinovým testem Transfuznívýznam D variant a slabých D antigenů Příjemci se slabými D antigeny imunizace nehrozí, protože však rutinnídiagnostika dosud nedovoluje jednoznačnérozlišeníobou kategorií, měli by téždostávat D-substituce (zejména pokud jde o mladéosoby ženského pohlaví a není-li akutní nedostatek D- transuzních přípravků) Pro těhotnéženy s D variantamijsou doporučována stejná opatření jako pro D- matky Pro dárce krve a novorozenceplatí, že určenípřítomnosti D antigenu (slabého či variantního) má být co nejcitlivější a jedince takto určenéje třeba považovat za D+ 18

19 Určení Rh genotypu erytrocytů pacienta CE certifikované diagnostické molekulárněgenotypovacípostupy(diagnostickésoupravy PCR-SSP, microarray BloodChip) ID-karta Typizace Rh D varianty Obsahuje: ID-Karty ID-Anti-D 1-6 ID-karta Typizace Rh D varianty Děkuji za pozornost 19

20 Použitá literatura MarionE. Reid, ChristineLomas-Francis: THE BLOOD GROUP ANTIGEN, Academic Press 1997 Avent.N.D., Reid, M.E.: The Rhe blood group systém: a review. Blood, 2000,č,95,s PísačkaM: Současnépozantky o Rh systému, Transfuze dnes 6, FlegelW.A.: Molecular genetics and clinical applications for RH. Transfus Apher Sci February; 44(1):