STANOVENÍ ANTIGENU A TOXINU Clostridium difficile

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta STANOVENÍ ANTIGENU A TOXINU Clostridium difficile DVĚMA RŮZNÝMI ANALYTICKÝMI METODAMI Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Šárka Vojáčková Autor: Renata Šloufová Brno, duben

2 Jméno a příjmení autora: Renata Šloufová Název bakalářské práce: Stanovení antigenu a toxinu Clostridium difficile dvěma různými analytickými metodami Pracoviště: Oddělení klinické biochemie, mikrobiologie a imunologie Nemocnice Jihlava Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Šárka Vojáčková Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Toxigenní kmeny Clostridium difficile mohou vlivem patologického pomnožení vyvolat zánět střevní sliznice, který se v plně rozvinuté formě manifestuje jako pseudomembranózní kolitida. Tyto toxigenní bakterie jsou původci nozokomiálních infekcí, které je nutno rychle diagnostikovat a eliminovat cílenou léčbou. V laboratorní diagnostice se nejčastěji využívá průkaz antigenu GDH a toxinů A a B. V praktické části se proto zaměřuji na stanovení těchto dvou substancí dvěma různými metodami: rychlou membránovou enzymovou imunoanalýzou a chemiluminiscenčním stanovením. Klíčová slova: Clostridium difficile, antigen GDH, toxiny A a B, membránová enzymová imunoanalýza, chemiluminiscenční imunoanalýza Souhlasím, aby práce byla půjčovaná ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Šárky Vojáčkové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Jihlavě dne. 3

4 Poděkování Chtěla bych poděkovat MUDr. Šárce Vojáčkové za poskytnutí odborných konzultací při vypracování mé bakalářské práce, především za cenné rady a připomínky. Velice ji děkuji za ochotu, vstřícnost a věnovaný čas. Děkuji celému kolektivu OKBMI za podporu a vytvoření optimálních pracovních podmínek během mého bakalářského studia. V neposlední řadě bych chtěla vyjádřit díky svému manželovi, dcerkám a přátelům za velkou trpělivost, pomoc a podporu, kterou mi po celou dobu studia poskytovali. 4

5 Použité symboly a zkratky ATB - antibiotika CD - Clostridium difficile CDAD - Clostridium difficile Associated Diarrhea CDI - Clostridium difficile infection CI - interval spolehlivosti CV - variační koeficient DNA - deoxyribonukleová kyselina ELISA - Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay FBT - fekální bakterioterapie GDH - glutamát dehydrogenáza GIT - gastro intestinální trakt HCl - kyselina chlorovodíková IVD MD - in vitro diagnostic medical devices NPV - negativní prediktivní hodnota ODN - oddělení dlouhodobě nemocných OKBMI - oddělení klinické biochemie, mikrobiologie a imunologie PCR - polymerázová řetězová reakce PPV - pozitivní prediktivní hodnota RLU - relativní světelné jednotky RNA - ribonukleová kyselina rrna - ribosomální ribonukleová kyselina SD - směrodatná odchylka 5

6 Obsah Obsah... 6 I. TEORETICKÁ ČÁST Úvod Cíle práce Anatomie a fyziologie tlustého střeva Základní znaky a funkce tlustého střeva Anatomická stavba stěny tlustého střeva Střevní mikroflóra Vývoj osídlení lidského organismu bakteriální mikroflórou Fyziologie mikroflóry trávicího traktu Rod Clostridium Obecná morfologie klostridií Metabolismus klostridií Toxigenita klostridií Clostridium difficile Základní charakteristika Genetické poznatky Onemocnění vyvolaná Clostridium difficile Rizikové faktory pro vznik onemocnění Antibiotická léčba Imobilita Vliv imunitního systému Patogeneze onemocnění Klinický obraz onemocnění Postantibiotické průjmy a kolitidy Pseudomembranózní kolitida Toxický megakolon Rekurentní onemocnění Léčba Antibiotika Metronidazol Vankomycin

7 Nové antibiotické preparáty Probiotika Fekální bakterioterapie Kolektomie Nozokomiální nákaza Prevence Laboratorní diagnostika Clostridium difficile Odběr a uchovávání vzorku Kultivační vyšetření Průkaz glutamát dehydrogenázy Průkaz toxinů A a B Průkaz cytotoxicity Průkaz genů pro tvorbu toxinů Zobrazovací metody Endoskopická diagnostika Sonografická diagnostika II. PRAKTICKÁ ČÁST Rychlá membránová enzymová imunoanalýza Princip testu Reagencie a potřebný materiál Odběr a stabilita vzorku Příprava vzorku Vlastní provedení testu Hodnocení testu Omezení testu Kontrola kvality Chemiluminiscenční imunoanalytické stanovení ( CLIA ) Princip testu Reagencie a potřebný materiál Odběr a stabilita vzorku Příprava vzorku Měření na analyzátoru LIAISON Analyzer Nejdůležitější komponenty analyzátoru Princip měření

8 14.6. Hodnocení testu Omezení testu Kalibrace metody Kontrola kvality Validace a verifikace metody Vzájemné porovnání a vyhodnocení obou testů Kazuistika Diskuze Závěr Seznam použité literatury Přílohy

9 I. TEORETICKÁ ČÁST 1. Úvod Clostridium difficile, grampozitivní anaerobní sporulující tyčinka, patří k běžným komenzálům sliznice tlustého střeva člověka i zvířat. V případě patogenního pomnožení Clostridium difficile, nejčastěji vlivem dlouhodobě užívaných širokospektrých antibiotik, dochází k potlačení běžné střevní flóry a k poškození střevní sliznice toxiny, které patogenní klostridium produkuje. Jedná se o produkci toxinu A, který způsobí destrukci buněk střevního epitelu a produkci toxinu B, který má nekrotizující účinky na střevní buňky. Clostridium difficile se dostává do popředí jako původce nozokomiálních nákaz především u dlouhodobě hospitalizovaných pacientů. Způsobuje průjmy, které mohou vést k rozvoji pseudomembranózní kolitidy nebo až ke vzniku toxického megakolonu, který může končit smrtí pacienta. Názvosloví onemocnění vyvolaného infekci Clostridium difficile není jednotné, v anglosaské literatuře se nemoc označuje pojmem Clostridium difficile infection (CDI), ale můžeme se setkat v zahraniční literatuře s označením Clostridium difficile associated diarrhea (CDAD). V české literatuře se užívá označení kolitida vyvolaná Clostridium difficile. V posledních letech stoupá nejen incidence CDI, ale i počet léčebných selhání a u třetiny případů dochází k rekurenci choroby. Ve vyspělých zemích Ameriky, Asie a Evropy je zaznamenán zvýšený výskyt infekcí vyvolaných toxigenními kmeny. I v České republice je zaznamenán vzestup počtu případů CDI. V současnosti za nejvýznamnější patogenní Clostridium difficile je považován kmen NAP1/027, který patří mezi hypertoxigenní bakterie s vysokou rezistencí vůči antibiotikům, s větší odolností spor vůči dezinfekčním prostředkům a vysokou produkcí toxinů A i B. Léčba infekcí vyvolaných toxigenními kmeny Clostridium difficile vyžaduje komplexní přístup. Důležitá je cílená volba antibiotik, kdy výběr antibiotických přípravků vychází ze závažnosti a rozsahu onemocnění. Vznik rezistentních kmenů Clostridium difficile a nárůst recidiv onemocnění je předmětem výzkumu nových léčebných přípravků a alternativních přístupů léčby. Důsledná prevence onemocnění CDI spočívá v rozvaze volby a užívání antibiotik při léčbě primárních onemocnění. Včasná a správná identifikace toxigenních kmenů Clostridium difficile se stává nepostradatelnou součástí rutinní bakteriologické diagnostiky a přispívá k úspěšné léčitelnosti 9

10 onemocnění, snižuje mortalitu a má i zásadní epidemiologický význam, Rozhodující roli v laboratorní diagnostice hraje průkaz toxinů A a B ve stolici pacienta různými analytickými metodami a postupy. Podle současných doporučení je preferováno využití dvoj a více stupňových algoritmů, především v souvislosti s rozdílnou citlivostí analytických metod. Doporučuje se testovat ve vzorku přítomnost enzymu GDH pro vyloučení netoxigenních kmenů Clostridium difficile a zároveň přítomnost toxinů A a B, který potvrdí nebo vyloučí pozitivitu toxigenního kmene. Kromě těchto stanovení se v diagnostice klostridiových infekcí uplatňují zobrazovací metody (endoskopie, počítačová tomografie), histologický průkaz a alternativní vyšetřovací metody, kdy smyslem těchto doplňkových metod je získat co nejrychlejší a nejspolehlivější výsledek. Důsledné a aktivní vyhledávání CDI je důležité pro monitorování výskytu chorob, závažnosti onemocnění a zjišťování změn v epidemiologii. 2. Cíle práce 1. Shrnutí poznatků v problematice střevních infekcí způsobených toxigenními kmeny Clostridium difficile s důrazem na rizikové faktory vzniku, možnosti léčby a prevence. 2. Laboratorní diagnostika Clostridium difficile s podrobným zaměřením na dva možné způsoby detekce toxigenních bakterií, metodou rychlé membránové enzymové imunoanalýzy a metodou chemiluminiscenční imunoanalýzy 3. Testování skupiny pacientů oběma vyšetřovacími metodami, vzájemné porovnání a přínos těchto metod v diagnostice Clostridium difficile v Nemocnici Jihlava 10

11 3. Anatomie a fyziologie tlustého střeva 3.1. Základní znaky a funkce tlustého střeva Tlusté střevo (intestinum crassum) se nachází podél zadní stěny dutiny pobřišnicové a obkružuje kličky tenkého střeva. Jde o konečný úsek trávicí trubice a navazuje na tenké střevo. Je dlouhé asi 1,5 m. Člení se na 6 úseků: začíná od ileocékální chlopně slepým střevem (intestinum caecum) s červovitým přívěskem (apendix vermiformis), pokračuje vzestupným tračníkem (colon ascendens) vzhůru a přechází v přímý tračník (colon transversum ), který je nejdelším úsekem tlustého střeva. Probíhá napříč dutinou peritoneální až ke slezině, kde pokračuje jako sestupný tračník (colon descendens), který sestupuje do jámy kyčelní, kde přechází v esovitou kličku (colon sigmoideum). Odtud přechází do středu malé pánve v terminální úsek tlustého střeva konečník (rektum), který ústí na povrch otvorem řitním (Holibkova, 2010). Obrázek č. 1 Anatomická stavba tlustého střeva Zdroj : (Holibkova, 2010) 11

12 Hlavní funkcí tlustého střeva je definitivní úprava střevního obsahu, kdy postupnou resorpcí vody, pasivní absorpcí nízkomolekulárních elektrolytů a účinkem kvasných a hnilobných střevních mikrobů vzniká trávenina s obsahem nestrávených a nestravitelných zbytků potravy. Tyto zbytky stravy společně s dalšími exkrety se posunují do oblasti ampuly, místa rozšíření terminální části střeva. Do této části střeva se dostane střevní obsah za hodin po příjmu potravy (Wilhelm, 2010) Anatomická stavba stěny tlustého střeva Sliznice tlustého střeva je bledá, podstatně méně členěná než sliznice tenkého střeva, intestinální klky v tlustém střevu chybějí. Sliznice je kryta jednovrstevným cylindrickým epitelem. Obsahuje hojně Lieberkűhnovy krypty, ale bez Panethových buněk, méně enterocytů, endokrinní buňky, pohárkové buňky, které produkují hlen a chrání střevo před poškozením. Slizniční vazivo obsahuje solitární lymfatické uzlíky, nejvíce jich je ve slepém střevu. Podslizniční vazivo je řídké a obsahuje hustou cévní a nervou pleteň. Svalová vrstva je složena z vnitřní cirkulární a zevní longitudinální vrstvy hladké svaloviny, která je velmi tenká. Seróza vybíhá v stopkaté výrůstky, jejichž podkladem je tukové vazivo (Vacek, 1995). Obrázek č. 2 Stavba stěny tlustého střeva Zdroj : 12

13 4. Střevní mikroflóra 4.1. Vývoj osídlení lidského organismu bakteriální mikroflórou Lidský plod je za normálních okolností sterilní a prvními mikroorganizmy se začíná osidlovat teprve při průchodu porodními cestami, kdy je vystavený širokému spektru mikroorganizmů vaginální flóry matky. Během krátké doby si vytvoří vlastní fyziologickou mikroflóru, která je závislá na způsobu porodu, okolním prostředí, druhu výživy a která se bude měnit v závislosti na životním stylu a prostředí, ve kterém bude jedinec žít. Velké změny ve složení střevní mikroflóry nastávají po skončení kojení a přechodu na pevnou stravu (Göpfertová, 1997). Mikroflóra tlustého střeva se velmi liší i v různých geografických oblastech, kde je ovlivňována stravovacími návyky. V evropských státech a USA převažují anaerobní gramnegativní bakterie, zejména bakteroidy, v asijských státech to jsou grampozitivní anaeroby, převážně eubakterie (Juránková, 2008) Fyziologie mikroflóry trávicího traktu Trávicí trakt člověka je nejhustěji osídlený mikrobiální ekosystém. Střevní mikroflóra obsahuje množství mikrobů vážící více jak 1kg a zahrnuje více jak 500 druhů. Tento střevní ekosystém se podílí na podpoře správné gastrointestinální funkce, chrání organizmus před infekcemi stimulací imunitního střevního systému, napomáhá udržet bariéru proti obligátním a potenciálním patogenům, ovlivňuje prokrvení a motilitu střevní stěny, podílí se na produkci vitamínů B 12, K 1 a K 2, redukuje bakteriální translokaci. Na regulaci střevní mikroflóry se podílejí sliny s antibakteriálně působícím lysozymem, žaludeční kyselina, enzymy pepsin a lipáza, střevní peristaltika, pravidelná obměna slizničních buněk a tvorba hlenu pohárkovými buňkami. Dysmikrobie, narušená rovnováha mikroflóry, způsobená vedlejšími účinky léků, antibiotik, působením toxinů, účinkem radioterapie či chemoterapie, ale i v důsledku stresu a nedostatečnou výživou, je spojena se vznikem různých autoimunních a metabolických onemocnění (Juránková, 2008). 13

14 5. Rod Clostridium 5.1. Obecná morfologie klostridií Názvem klostridie se označuje skupina bakterií, jejichž společným znakem je citlivost ke kyslíku, schopnost tvořit spory a které mají ve vegetativní formě tvar grampozitivních tyčinek, které jsou různě dlouhé a široké. U některých druhů je prokazatelný pohyb pomocí bičíků, které jsou uloženy po obvodu buňky. Klostridia reagují na úbytek živin či na vliv vysychání tvorbou spory. Díky nim se stávají rezistentnější na teplo, UV záření, dezinfekční prostředky a umožňují klostridiím přežívat dlouhá léta v nepříznivých podmínkách (Bednář, 1996). Buňky klostridií jsou tvořeny buněčnou stěnou, která obsahuje mohutnou vrstvu peptidoglykanu, na který se váže kyselina teichoová. Stěna představuje 20 nm silný val, který hraje hlavní roli při Gramově barvení, kdy se komplex krystalové violeti a lugolu naváže tak pevně, že po odbarvení acetonem nebo alkoholem zůstává buňka stále modrá. Cytoplazmatická membrána je struktura, která obklopuje cytoplazmu, pevně na ni nasedá buněčná stěna. Skládá se z dvojité vrstvy fosfolipidů. Jsou v ní vnořeny bílkoviny, které se uplatňují v přenosu živin do buňky a odvádějí odpadní látky z buňky ven. Dále se podílejí na respiračních pochodech a mají i funkci sekreční, kdy produkují do zevního prostředí z cytoplazmy bakteriální toxiny. Cytoplazma buňky obsahuje organely ribozomy, které jsou důležité pro přepis RNA do struktury proteinů, inkluzní granula, která slouží jako zásobárna živin nebo energie a nukleoid, jaderný ekvivalent, kde je v kruhovitě uspořádaném dvojvláknu DNA uložena genetická informace buňky. Spory, jak jsem již uvedla, se tvoří jako klidové útvary buněk. Podle uložení a tvaru spory v buňce můžeme rozlišit některé druhy klostridií takto: terminální, oválné: Clostridium paraputrificum terminální, kulovité: Clostridium tetaní centrální, oválné: Clostridium novyi, histolyticum subterminální, oválné: většina klostridií, Clostridium botulinum (Votava, 2005) 14

15 5.2. Metabolismus klostridií Pro klostridie je typický anoxibiotický metabolizmus s citlivosti na kyslík, to znamená, že se nemnoží v kontaktu se vzduchem za normálního atmosférického tlaku. Některá klostridia (Clostridium haemolyticum) patří mezi velmi striktní anaeroby, kdy snáší kyslík pouze do 0,5%. Clostridium perfringens je ke kyslíku tolerantněji a může se množit do 5 % kyslíku v prostředí. Důvodem této nesnášenlivosti ke kyslíku je fakt, že klostridia nemají katalázu, cytochromy, cytochromoxidázu a téměř žádnou peroxidázu. Nemají tedy žádné enzymy, které by vzniklé peroxidy a superoxidy štěpily a tyto zplodiny pak buňku otráví. Energii pro své životní procesy získávají z anaerobní glykolýzy nebo fermentace, což je přeměna organických látek na látky jednodušší se vznikem menšího množství energie, než by vzniklo aerobní cestou. Nefermentující klostridie mohou získat energii také kvašením aminokyselin, pomocí Sticklandovy reakce, kdy dojde k oxidoredukci mezi dvěma aminokyselinami. Tyto reakce však vedou ke vzniku nepříjemně páchnoucích látek, které jsou ale typickým znakem klostridiových infekcí. Poznatky, o způsobu získávání energie, štěpení organických látek, můžeme využít v laboratorní diagnostice při identifikaci klostridií pomocí biochemických testů (Bednář, 1994) Toxigenita klostridií Toxiny jsou látky bílkovinného původu, které mají schopnost narušovat membránu buněk, ovlivňovat metabolické a regulační funkce buněk, blokovat proteosyntézu a způsobit až buněčnou smrt. Bakteriální toxiny se obecně dělí na exotoxiny a endotoxiny. Klostridia produkují různé exotoxiny, které patří do skupiny difuzibilních polypeptidů, které jsou uvolňovány do vnějšího prostředí ze živých bakteriálních buněk. Exotoxiny se vyznačují vysokou toxicitou, která se po částečné denaturaci formolem dá převést v toxoid, látku, která již nemá toxické účinky a využívá se při vakcinacích k prevenci tetanu. Po chemické stránce se polypeptidy skládají ze dvou podjednotek, z lehkého a z těžkého peptidového řetězce, kdy jeden řetězec zajišťuje průnik do buňky přes membránu a druhý řetězec je nositelem specifického toxinu, který je typický pro jednotlivé druhy klostridií. Podle mechanismu účinku je lze rozdělit: 15

16 cytotoxiny - způsobují nekrotické procesy tkání různého rozsahu a lokalizace enterotoxiny - které způsobují postižení střevní stěny doprovázené průjmy neurotoxiny - které blokují převody nervových vzruchů na synapsích. (Votava, 2005) 6. Clostridium difficile 6.1. Základní charakteristika Clostridium difficile (CD) je grampozitivní anaerobní tyčinka, se subterminálně uloženou sporou, která buňku lehce vydouvá. Velikostně je to velmi variabilní bakterie, vegetativní formy jsou buď drobné 0,6 x 4 6 µm nebo velké 1,2 1,6 x 6 16 µm. Název této bakterie vznikl spojením řeckého slova kloster (vřeteno) a latinského slova difficile (obtížný), které napovídá, že bakterie je obtížně kultivovatelná (Votava, 2003). Obrázek č.3 Mikroskopický nález Clostridium difficile Zdroj: autor Jedná se o oportunní bakterie, které se vyskytují běžně v tlustém střevě zdravých lidí. U dětí, kojenců a starších osob je výskyt těchto baktérií vyšší. V novorozeneckém věku je Clostridium difficile běžnou součástí střevní flóry u 1/3 zdravých jedinců, aniž by docházelo ke vzniku onemocnění. Důvod je nejasný, ale může zde sehrát roli odlišnost střevní flóry a nepřítomnost receptorů pro toxin A na enterocytech v novorozeneckém věku. Clostridium difficile se nachází dle epidemiologických studií ve stolici u 50 % hospitalizovaných pacientů, a to bez ohledu na léčbu antibiotiky. Riziko vzniku klostridiové kolitidy stoupá s délkou hospitalizace. Clostridium difficile patří mezi významné původce nozokomiálních infekcí, kde bránou vstupu do organizmu mohou být ruce zdravotnického personálu nebo kontaminované předměty (Bergmann, 2007). 16

17 Při potlačení většinové střevní mikroflóry tlustého střeva vlivem antibiotické léčby, imobilitou, poruchou slizniční imunity v GIT, účinkem cytostatik a vlivem vyššího věku, dojde k pomnožení a nástupu onemocnění, které je vázané na tvorbu toxinů produkovaných toxigenními bakteriemi (Beneš, 2012). Clostridium difficile produkuje dva termolabilní endogenní toxiny A a B, kdy oba toxiny jsou schopny způsobit postižení střeva pod obrazem průjmového onemocnění až po vyústění v pseudomembranózní kolitidu. Toxin A je enterotoxinem, který způsobuje destrukci buněk střevního epitelu a je původcem vodnatých průjmů, které jsou způsobeny kumulací vody ve střevě. Toxin B je nekrotizujícím cytotoxinem, který vede k nekróze poškozených buněk střevního epitelu. Patogenní kmeny produkují buď oba toxiny současně, nebo v malém procentu pouze toxin B. Kromě toxinů A a B produkují některé kmeny tzv. binární toxin, jehož význam v patogenezi onemocnění není zatím zcela vyjasněný. Kmeny, které neprodukují toxigenní látky, jsou považovány za nepatogenní (Chmelařová, 2010). V této části bych se chtěla ještě zmínit o existenci glutamát dehydrogenázy (GDH), kterou produkují všechny kmeny bakterie Clostridium difficile. Jde o enzym, který má klíčovou úlohu při fermentaci glutamátu těmito anaerobními bakteriemi. Při diagnostice klostridiové infekce se detekuje přítomnost enzymu GDH ve vzorku u toxigenních i netoxigenních kmenů Clostridium difficile. Z tohoto důvodu se GDH označuje jako společný antigen Genetické poznatky Obecně se bakteriální genetika zabývá dědičností a variabilitou bakterií. Této znalosti se využívá k zmapování bakteriálních genů, které kódují faktory virulence a patogenity. Důležité jsou výzkumy v oblasti bakteriálních mutací, odpovídající za vznik rezistence na antibiotika. Genetická informace bakterií je obsažena ve struktuře jedné cirkulární molekuly dvouvláknité DNA, a to v sekvencích nukleotidů neboli genů. Soubor všech genů se nazývá genom. Bakteriální genom je uložený na bakteriálním chromozomu nebo v plazminech, které mohou být hlavní příčinou šíření ATB rezistencí v bakteriální populaci. Bakteriální genom Clostridium difficile byl kompletně přečten v 90. letech 20. století. Geny kódující oba toxiny A a B, gen tcda a tcdb, jsou uloženy na tzv. lokusu patogenity neboli PaLoc komplexu. V těsné blízkosti těchto genů byl lokalizován gen tcdr, který reguluje 17

18 pozitivně produkci toxinů. Naopak gen tcdc tuto pozitivní produkci omezuje a v posledních letech vlivem delece tohoto genu, propuklo ve světě mnoho infekcí způsobených hypervirulentními a fluorochinolon rezistentními kmeny Clostridium difficile. Pokud kmen produkuje tzv. binární toxin, nalézáme geny cdta a cdtb. Tyto poznatky můžeme využít k typizaci kmenů Clostridium difficile pro epidemiologická sledování. Pro tyto účely se používají molekulárně biologické metody toxinotypizace (analýza polymorfizmu lokusu patogenity), PCR ribotypizace (rrna) nebo pulzní genová elektroforéza (PFGE). Na přelomu tisíciletí byly zaznamenány v severní Americe a v některých vyspělých asijských zemích zprávy o výskytu CDI s těžkým průběhem onemocnění, s horší odpovědí na léčbu a s vyšší mortalitou. Při pátrání po příčinách tohoto jevu byl metodou PCR ribotypizace zachycen hypervirulentní kmen ribotyp 027, který je schopen produkovat 20krát větší množství toxinu. Pomocí pulzní gelové elektroforézy byl dourčen jako NAP1= North American pulsed-field type 1. Kmen NAP1/027 patří mezi hypertoxigenní bakterie s vysokou rezistencí vůči antibiotikům, s větší odolností spór a vysokou produkcí toxinů A i B. Tento epidemiologicky významný kmen má deleci na 117. místě regulačního tcdc genu. Analýzy ukázaly, že ve světě se s podobnými vlastnostmi nachází ribotypů více (Vojtilová, 2012). V roce 2006 byl tento ribotyp 027 zachycen i ve střední Evropě, konkrétně v Rakousku. V současnosti převažuje ve Velké Británii ribotyp 106, v Holandsku ribotyp 078, v asijských zemích ribotyp 017. V České republice je u těžkých forem CDI izolovaný ribotyp 176, který je označovaný jako 027 like. Důvodem tohoto označení jsou podobné genetické a biologické aktivity s ribotypem 027 (Beneš, 2012). 7. Onemocnění vyvolaná Clostridium difficile 7.1. Rizikové faktory pro vznik onemocnění Za nejvýznamnější faktor vyvolávající CDI je považována střevní dysmikrobie. Jak jsem již uvedla v kapitole 4., jde o narušenou rovnováhu střevní mikroflóry vlivem různých vnitřních nebo zevních činitelů: Antibiotická léčba Vliv antibiotické léčby je hlavním spouštěcím faktorem podporující rozvoj onemocnění CDAD. Za nejvíce riziková antibiotika jsou považovány cefalosporiny II. a vyšší generace, 18

19 aminopenicilíny, linkosamidy a fluorochinolony vyšší generace. Schopnost indukovat pomnožení toxigenního kmene Clostridium difficile má prakticky jakékoliv antibiotikum bez ohledu na délku podání a velikost dávky. Výjimkou jsou antibiotika, která se nepodávají per os a po parenterální aplikaci se nevylučují do střev (Husa, 2013). I po vysazení ATB může dojít k rozvoji onemocnění, protože až 3 měsíce může trvat úplná revitalizace střevní mikroflóry. Na takovém oslabeném terénu může dojít u pacientů s imunitním deficitem k pomnožení CD a k vyvolání postantibiotické kolitidy (Bergmann, 2007) Imobilita Střevní imobilita vzniká např. jako důsledek pooperačních stavů v dutině břišní u polymorbidních pacientů nebo se vyskytuje u řady onemocnění, při kterých se zhoršuje pasáž trávicím traktem. U ischemického postižení tlustého střeva, stenózy střeva maligním nádorem, u idiopatických střevních zánětů dochází k atrofii střevní sliznice a vzniku terénu pro případné klostridiové infekce. Celková imobilita, vedoucí ke střevní dysmikrobii, vzniká u pacientů vyššího věku, kteří jsou dlouhodobě upoutáni na lůžko nebo u pacientů s revmatickými či nervovými chorobami omezující hybnost (Juránková, 2008) Vliv imunitního systému Imunitní systém střevní sliznice vytváří bariéru proti patogenním mikroorganizmům a imunogenům z potravy. Mezi základní vlastnosti slizničního imunitního systému patří převaha protilátek třídy IgA, předností osidlování sliznic buňkami střevních lymfatických folikulů a přenos imunoglobulinů do sekretu. Do této kapitoly patří onemocnění imunitního aparátu a s nimi spojená léčba, která ovlivňuje střevní ekosystém. Příkladem může být redukce slinné sekrece u Sjögrenova syndromu, snížená produkce žaludeční HCl u perniciózní anémie, diabetická gastroparéza, sklerodermie, nedostatečná tvorba slizničního IgA, ulcerózní kolitida, Morbus Crohn a maligní nádory. Radioterapie, chemoterapie, kortikoterapie, imunosupresivní léčba a malnutriční stavy u těchto onemocnění ničí buňky střevní sliznice, dochází k dysmikrobii a kolonizaci střeva patogenními mikroorganizmy (Juránková, 2008). 19

20 Ostatní vlivy Na kvalitu normální střevní mikroflóry má velký vliv věk. Vlivem stárnutí dochází k poklesu sekrece slin, polykání je méně časté a je snížena regenerace buněk slizničního epitelu. Dochází tak snadněji ke kolonizaci patogenními bakteriemi, snižuje se počet střevních bifidobakterií a začínají převažovat koliformní bakterie, klostridia a kandidy (Juránková, 2008). Mezi další zevní faktory ovlivňující složení střevního ekosystému patří výživa, stravovací návyky, ale i stres, deprese Patogeneze onemocnění Clostridium difficile nepatří mezi invazivní patogeny, pouze adheruje na stěnu tračníku. Je-li vytvořen terén pro pomnožení klostridií, a pokud se jedná o toxigenní kmeny produkující toxiny A i B, pak vlivem těchto toxinů dojde k poškození střevního epitelu až po hlubší vrstvy střevní stěny. Vzniká průjem, který je definován zvýšeným obsahem vody ve stolici, zvýšenou frekvencí defekace (2 a více řídkých stolic denně) a přítomností hlenu, krve nebo hnisu. Průjem u klostridiového onemocnění má samočistící funkci a je pro pacienta prospěšný. V případě, že se průjem nerozvine nebo vlivem účinků léků snižující střevní peristaltiku, může onemocnění přejít do fáze progrese. Vznikají ostrůvkovité ulcerace a jejich povrch se pokrývá pablánami. Toxin B působí na hladkou svalovinu a na vegetativní nervy ve střevní stěně a ovlivňuje střevní peristaltiku a vede k rozvoji ileu. Konečné stádium onemocnění se vyznačuje obrovským roztažením tračníku (megakolon), ztrátou bariérové funkce střevní sliznice a k rozvoji sepse s vysokou úmrtností (Husa, 2013). U onemocnění způsobená Clostridium difficile může dojít k rekurenci, a to v důsledku vnímavosti jedince k opětovnému přemnožení klostridií. To může nastat, buď opětovným vzplanutím infekce (relaps) ze spor, které zůstaly ve střevním traktu, nebo vlivem nové infekce z kontaminovaného prostředí (reinfekce). U tohoto jedince nedošlo ještě k obnovení kvalitní fyziologické střevní mikroflóry. K rekurenci obvykle dochází s pravděpodobností % do dvou měsíců od první ataky. Pokud se objeví více než dvě ataky, je pacient ohrožen na životě, v důsledku dehydratace, malnutrice, metabolického rozvratu a celkového vyčerpáním organizmu (Beneš, 2012). 20

21 7.3. Klinický obraz onemocnění Mezi základní klinické příznaky CDI patří průjem, horečka a bolest břicha. Průjem bývá kašovitý, často s příměsí hlenu, vylučován v malých porcích, velmi páchnoucí. Meteoristické břicho bývá difuzně bolestivé. Stav komplikuje postupné oslabování střevní peristaltiky. Rozvíjí se subileus až ileus s možnou perforací střeva a peritonitidou. Laboratorně bývá přítomna elevace zánětlivých markerů, typická je leukocytóza 15 x 10 9 l, neutrofílie s posunem doleva, mírně zvýšená hodnota CRP, vzestup kreatininu v séru, pokles albuminu. Fulminantní průběh onemocnění se vyznačuje výraznou leukocytózou nad 50 x 10 9 /l a vysokou hladinou laktátu v krvi nad 5,0 mmol/l. Pomocí zobrazovacích metod můžeme v pokročilých fázích onemocnění diagnostikovat vymizení plynu v tračníku a s tím související ileózní stav nebo patologické rozpětí tračníku a volnou tekutinu v dutině břišní (Vojtilová, 2012). Podezření na CDI by mělo být vysloveno v následujících situacích: akutní průjmové onemocnění u osob užívající antibiotika nebo po antibiotické léčbě akutní průjmové onemocnění provázené meteorizmem, bolestmi břicha, subileozním stavem, přičemž je vyloučena náhlá příhoda břišní akutní průjmové onemocnění, k němuž došlo při hospitalizaci, zejména jde-li o starší a imobilní osoby nebo se na daném oddělení toto onemocnění vyskytuje (Husa, 2013). Kvůli rostoucí nemocnosti a riziku úmrtnosti v důsledku CDI, byl sestaven na základě studie hodnotící účinnost fidaxomicinu, bodovací systém ATLAS bed-side skóre s cílem předvídat u starších pacientů úmrtnost CDI. Skórovací systém se skládá z pěti složek: věk, tělesná teplota, počet leukocytů, hladina albuminu v séru a léčba systémovými antibiotiky. Tento systém by měl být nápomocný v rychlé diagnostice CDI u lůžka pacienta. Tabulka č. 1 zobrazuje kategorizaci bodovacího systému, kdy každé proměnné je přiděleno 0-2 body. Výše skóre předpovídá mortalitu na infekci Clostridium difficile, kdy dle studie zemřeli ti pacienti, kteří měli medián skóre 6 bodů a ti kteří, měli medián 5 bodů, infekci přežili (Chopra,2010). 21

22 Tabulka č. 1 Skórovací systém ATLAS predikující mortalitu u pacientů CDI Zdroj: Měřený parametr 0 bodů 1 bod 2 body Věk < 60 let let > 80 let Tělesná teplota 37,5 C 37,6-38,5 C 38,6 C Leukocytóza (10 9 /l) < >25 Albumin v séru (g/l) > < 25 Systémová ATB během CDI > 1den ne - ano Postantibiotické průjmy a kolitidy Jak už název napovídá, jde zde o onemocnění vyvolané účinkem antibiotické léčby. První příznaky se mohou projevit za několik dní po zahájení léčby, ale mohou propuknout až za 6-8 týdnu po vysazení léčby. Důvody jsem již uvedla v předchozím textu. Ke vzniku tohoto onemocnění přispívá dlouhodobé užívání širokospektrých antibiotik, užívání více druhů antibiotik současně nebo po sobě jdoucí v krátkém intervalu. Takovou léčbu často podstupují hospitalizovaní pacienti, proto k výskytu onemocnění dochází při pobytu v nemocnici nebo krátce po návratu domů. Důležité je po objevení příznaků vysadit antibiotickou terapii. Někdy může onemocnění probíhat pod obrazem chřipky (teplota, nausea, průjem) a stanovení diagnózy tak může urychlit uvedení případné antibiotické léčby v anamnéze (Bergmann, 2007) Pseudomembranózní kolitida Takto označujeme těžkou formu klostridiové kolitidy, pro kterou jsou charakteristické pablány (pseudomembrány) na střevní sliznici. Tyto pseudomembrány jsou žlutě krémové barvy, tvořené směsí leukocytů, plazmatických a žírných buněk, fibrinu, mucinu a zbytků nekrotických buněk ze střevního epitelu. Není-li onemocnění ve fázi tvorby pablán, může vypadat endoskopický nález atypicky. Na střevní sliznici jsou patrná edematózní zánětlivá místa. Mikroskopický obraz pseudomembranózní kolitidy při CDI je někdy obtížně odlišitelný 22

23 od ulcerózní kolitidy. Pro potvrzení pseudomembranózní kolitidy využíváme vyšetřovacích a zobrazovacích metod (sonografie, tomografie, endoskopie). Důležitou roli hraje v diagnostice onemocnění vhodný odběr bioptického materiálu a ověření CDI mikrobiologickými metodami. Pseudomembranózní kolitida je nebezpečná především pro starší a imunokompromitované pacienty, u kterých má kolitida velmi rychlý průběh a 44% úmrtnost (Vojtilová, 2012). Obrázek č. 4 Endoskopický obraz těžké pseudomembranózní kolitidy. Zdroj: 2/pseudomembranozni-kolitida.aspx Toxický megakolon Jde o nejtěžší formou klostridiové kolitidy. Charakteristická je enormní dilatace střev, při které dochází k poruše střevní peristaltiky a nahromadění plynu ve střevě. V důsledku toho hrozí perforace střeva a následné vylití střevního obsahu do dutiny břišní. Pacient je ohrožen na životě septicko-toxickým šokem a úmrtnost je 30-50%. Poslední možností léčby je v tomto případě chirurgické odstranění tračníku kolektomie (Beneš, 2012) Rekurentní onemocnění Po zvládnutí akutního stavu a vymizení příznaků onemocnění trvá několik týdnů dysmikrobie a organizmus je v tomto období citlivý k opětovnému přemnožení klostridií a ke vzniku relapsu nebo reinfekce. V léčbě ataky rekurentní infekce se doporučuje vankomycin 23

24 nebo metronidazol, je dobré k léčbě použít jiný přípravek než u předchozího onemocnění. U rekurentních infekcí je pacient ohrožen na životě v důsledku dehydratace, malnutrice, metabolického rozvratu a celkového vyčerpáním organizmu (Bergmann, 2007). 8. Léčba 8.1. Antibiotika Prvním krokem při léčbě infekce, způsobenou Clostridium difficile, je vysazení právě užívaného antibiotika a nasazení antibiotika nového, účinného na tento druh toxigenní bakterie Metronidazol Lékem první volby u lehké a středně těžké formy CDI je metronidazol. Patří do skupiny nitroimidazolových chemoterapeutik. Mechanizmus účinku tohoto antibiotika spočívá ve vzájemném působení citlivých patogenů s DNA a vede k inhibici syntézy nukleové kyseliny a tím k likvidaci mikroorganizmu. Metronidazol se podává v dávce 500 mg 3x denně perorálně nebo intravenózně po dobu dní. Při horší snášenlivosti se orální dávkování může snížit na 250 mg po 6 hodinách. Výhodou tohoto přípravku je jeho cena, nevýhodou menší selektivita a vyšší četnost rekurenci. Začínají se objevovat kmeny rezistentní k metronidazolu, zejména v souvislosti s ribotypem 027. Kontraindikací je těhotenství a neměl by být podáván dětem. Může vyvolávat nežádoucí účinky jako je nevolnost, zvracení, kovová pachuť v ústech, tlak v epigastriu, bolest hlavy, průjem (Bergmann, 2007) Vankomycin Druhým antibiotikem, které se používá u těžkých forem CDI, je vankomycin. Jde o glykopeptidové antibiotikum, které baktericidně zasahuje do syntézy bakteriální stěny, narušuje permeabilitu bakteriální membrány a blokuje syntézu RNA. Vankomycin neproniká po intravenózním podání do střev, proto se musí při léčbě pseudomembranózní kolitidy podávat 24

25 perorálně nebo pomocí nasogastrické sondy. Podává se v dávce 125 mg 4x denně per os po dobu dní. Vankomycin se může používat i v kombinaci s metronidazolem a následně pak pokračovat v postupném snižování dávek (Beneš, 2012) Nové antibiotické preparáty Rifaximin (Normix) - patří do skupiny novějších léčiv s poměrně širokým spektrem účinku. Minimálně se vstřebává po perorálním podání ze zažívacího traktu, a proto účinkuje cíleně na baktérie způsobující střevní infekce. Obvyklé dávkování je 200 mg 4 x denně po dobu 7 dní (Beneš, 2012). Fidaxomicin (Dificlir) - jedná se o nově syntetizované makrocyklické antibiotikum, které blokuje bakteriální enzym RNA polymerázu, který je nutný k syntéze RNA. Ve střevě působí selektivně na Clostridium difficile a minimálně ovlivňuje okolní fyziologickou střevní mikroflóru. Podává se perorálně 200 mg 2 x denně po dobu 10 dní. Klinický účinek je srovnatelný s vankomycinem, avšak nehrozí při této léčbě nárůst rezistentních enterokoků. Tato nová terapie má přinést nižší riziko recidiv a pokles případů úmrtí v důsledku CDI (Beneš, 2012). Cadazolid jedná se o experimentální antibiotikum, které po chemické stránce kombinuje složky oxazolidinonu a fluorochinolonů. Působí inhibici proteosyntézy Clostridium difficile, která vede k potlačení tvorby spor a produkcí toxinu. V současné době probíhá III. fáze klinického testování (Actelion, 2013). Surotomycin lipopeptidové antibiotikum proti CDI, které působí baktericidně a jeho účinek je silnější než vankomycin in vitro. Toto antibiotikum působí v místě infekce s minimálním systémovou absorpcí, která neovlivňuje fyziologickou střevní mikroflóru. V současné době také ve III. fázi testování (Cubist, 2014) Probiotika Jsou to látky, obsahující izolované nebo směsné kultury živých mikroorganismů, které prospěšně ovlivňují růst a složení fyziologické střevní mikroflóry. Mezi probiotika jsou v současné době řazeny 25

26 laktobacily, bifidobakterie, streptokoky, enterokoky a probiotický efekt byl prokázán také u kvasinek. Tyto kmeny musí splňovat několik základních požadavků. Musí být zdravotně nezávadné, netoxické a nepatogenní, musí mít schopnost přežívat a být aktivní v trávicím ústrojí, rezistentní vůči žaludeční kyselině, musí mít pozitivní vliv na zdraví jedince (Nevoral, 2010). Probiotika se většinou přidávají do kombinace s antibiotiky nebo po ukončení ATB léčby. Význam užívání probiotik u CDI není dosud zcela objasněný. Doporučují se ale v profylaxi postantibiotických průjmů. Studie uvádí přínos probiotik u CDI s přípravky obsahující živé kvasinky Saccharomyces boulardii (Beneš, 2012) Fekální bakterioterapie Jde o jednoduchou, zcela bezpečnou a levnou metodu, která se používá k léčbě chronických rekurentních forem klostridiových kolitid. Princip této metody je založen na poznatku, že stolice zdravého jedince obsahuje 80 % intestinální mikroflóry. Dárcem stolice bývá nejčastěji člen rodiny, kde se předpokládá obdobné složení intestinální mikroflóry. Pacienti jsou nejdříve léčení dnů perorálním vankomycinem a před podáním fekální bakterioterapie (FBT) je orálně podán inhibitor protonové pumpy, který redukuje gastrickou aciditu a podporuje přežití bakteriálních kmenů transplantované stolice. Homogenizovaná stolice zdravého dárce je pak podána jednorázově nasojejunální sondou. Úspěšnost FBT při použití 40 g aplikované dárcovské stolice je okolo 77,8 %. Jde o výsledky studie na Klinice infekčních chorob FN a LF MU Brno (Polák, 2011) Kolektomie Kolektomie se provádí u nejtěžších případů klostridiových infekcí, kdy dochází k selhání všech možností léčby a závažné komplikace ohrožují život pacienta. Jedná se o chirurgické odstranění části nebo celého tlustého střeva. V rámci CDI je kolektomie indikována u toxického megakolonu, při perforaci střeva, při rozvoji ileu, při vzniku sepse s důsledkem multiorgánového selhání nereagující na ATB léčbu. 26

27 9. Nozokomiální nákaza Pod pojmem nozokomiální nákaza (NN) se rozumí infekce endogenního nebo exogenního původu, která vznikla v souvislosti s pobytem nebo výkonem prováděným ve zdravotnickém zařízení v příslušné inkubační době. Tyto infekční komplikace zhoršují průběh základního onemocnění a mohou přerůst v trvalé následky nebo skončit úmrtím pacienta. NN mají také celospolečenský význam pro své nepříznivé ekonomické dopady, které zahrnují zvýšené finanční náklady na prodlouženou hospitalizaci a léčbu pacienta. Zdroje a cesty přenosu NN jsou rozmanité. U endogenních nákaz jsou zdrojem infekce mikroorganizmy normální mikroflóry pacienta, kdy v důsledku oslabení organizmu nebo vlivem léčby se stávají původcem infekčního onemocnění. Jde především o tzv. oportunní, příležitostné patogeny. K přenosu infekčního agens z místa osídlení do místa vzniku infekce nedochází prostřednictvím exogenního vektoru. Prevencí těchto nákaz je správná antibiotická terapie založená na spolupráci ošetřujícího lékaře a antibiotického střediska. (viz samostatná kapitola č. 10) U exogenních infekcí je původcem nákazy zdroj mimo mikrobiální kolonizaci nemocného a na přenosu se podílí exogenní vlivy např. kontaminované vybavení, znečištěný vzduch, nemocniční personál a pacienti (Maďar, 2006). Nejčastější přenos je zprostředkován kontaminovanýma rukama personálu, a to při výkonech jako jsou manipulace s drény, převazy, katetrizace, manipulace s použitým prádlem. K přenosu nákazy může dojít také kontaminací ovzduší, kde ale infekční dávka nebývá dostatečné velká k vyvolání NN, ale může vést ke kolonizaci. Za rizikové faktory jsou považovány výkony, při kterých dochází ke zvíření prachu např. úklid, stlaní, třídění prádla. Vznik exogenního typu nákazy je eliminován dodržováním hygienicko-epidemiologických opatření a bariérové ošetřovací techniky. Rozlišení endogenní nebo exogenní infekce nebývá snadné a nemusí se vždy podařit určit původ a cestu přenosu. Pacient může být kolonizován potenciálně patogenními mikroorganismy ve vyšetřených vzorcích biologického materiálu bez klinických známek infekce. Tato kolonizace je významná jak z epidemiologického tak klinického hlediska. Může být zdrojem endogenní infekce pro pacienta samotného nebo zdrojem exogenní infekce pro pacienty ostatní (Göpfertová, 1997). Cílem monitorování NN je především prevence vzniku onemocnění, sledování a kontrola nastavených protiepidemiologických opatření, aktivní vyhledávání zdrojů nákazy formou mikrobiologického monitoringu, snížení finančních prostředků spojené s léčbou NN. 27

28 Při výskytu nozokomiální nákazy je třeba podle klinických příznaků nebo mikrobiologického monitoringu posoudit rizika infekce pro pacienta, začít s léčbou nebo profylaxí, pokusit se lokalizovat zdroj infekce a eliminovat jeho působení. Je třeba přezkoumat dodržování hygienicko-epidemiologických opatření a zabránit dalšímu šíření. Je zde důležitá spolupráce ošetřujícího lékaře a klinického mikrobiologa, kteří společně zhodnotí, zda se jedná o kolonizaci patogenním kmenem si suspektní NN (Maďar, 2006). Infekce vyvolané patogenními kmeny Clostridium difficile patří mezi nebezpečné nozokomiální nákazy převážně endogenního původu a jsou epidemiologicky velmi významné především kvůli rezistenci na antibiotika. Onemocnění, které Clostridium difficile vyvolává, je potenciálně nakažlivé, a proto se nabízí zvýšená pozornost při výskytu průjmu u hospitalizovaných pacientů. Při výskytu CDI je nutné provést opatření vedoucí k zábraně šíření infekce. Ačkoliv není klostridiová kolitida zahrnuta ve výčtu povinně hlášených infekcí, jsou poskytovatelé léčebné péče povinni její výskyt hlásit příslušným epidemiologickým oddělením Krajské hygienické služby. Toto nařízení je v souladu se zněním 62 Zákona 258/2000 Sb. o ochraně veřejného zdraví. Clostridium difficile se jako původce NN dostal v posledních letech na přední místa v počtu vyvolaných onemocnění spojených se zdravotní péčí (Beneš, 2012). 10. Prevence Hlavní význam v prevenci vzniku CDI má omezení užívání antibiotik, především cefalosporinů, aminopenicilínů, linkosamidů a fluorochinolonů. Pokud nelze přerušit antibiotickou léčbu, je vhodné používat ATB s užším spektrem účinnosti a nižším potenciálem pro vyvolání klostridiové kolitidy. Do preventivních opatření může být zařazeno užívání probiotik, kolitická dieta, omezující nadýmavé a dráždivé potraviny, mobilizace ohrožených pacientů. V případě prevence přenosu již vzniklé infekce je třeba provést izolaci pacienta a dodržování bariérového ošetřovatelského režimu s cílem minimalizovat rizika přenosu infekce mezi pacienty nebo personál. K základním zásadám bariérové ošetřovatelské péče patří: minimalizace počtu personálu zajišťující péči na izolačním pokoji používání jednorázových pomůcek důsledná a správná dekontaminace a dezinfekce vyčlenění sociálního zařízení pro izolovaného pacienta informovanost pracovníků úklidu 28

29 vyčlenění úklidových pomůcek pro izolovaný pokoj edukace pacienta o významu izolace a zajištění psychické podpory dodržování hygienicko-epidemiologických opatření Dalším krokem vedoucí k prevenci vzniku CDI je surveillance (sledování, dohled). Označuje se tak získávání informací o výskytu určité nemoci a sledování všech podmínek a faktorů, které výskyt a rozvoj daného onemocnění ovlivňují. Jedná se o řadu dlouhodobých a komplexních programů, ve kterých jsou zúčastněni odborníci různých medicínských oborů (epidemiologové, hygienici, mikrobiologové, klinici). Aktivní sledování výskytu CDI a jeho hlášení je důležité pro monitoring výskytu onemocnění v určitém časovém období, pro zjišťování závažnosti onemocnění a časných změn v epidemiologii (Džupová, 2008). Nejdůležitějším krokem v prevenci je zavedení kvalitní diagnostiky, která senzitivními diagnostickými metodami v co nejkratší době vede k odhalení onemocnění CDI v raném stádiu jeho výskytu. 11. Laboratorní diagnostika Clostridium difficile Odběr a uchovávání vzorku Odběr biologického materiálu cílený na průkaz Clostridium difficile je indikován převážně u hospitalizovaných pacientů, kteří mají tři a více průjmových stolic denně, mají v anamnéze antibiotickou terapii a vykazují klinické symptomy CDI. Vyšetření se neprovádí u dětí do 2 let, u kterých je známo vysoké procento kolonizace Clostridium difficile. Do široké sterilní zkumavky se odebírá stolice velikosti lískového ořechu cca 2 g nebo 2 ml v případě vodnaté konzistence. Optimálně by měl být vzorek zpracován do dvou hodin po odběru. Toxiny jsou méně stabilní a mohou způsobit falešnou negativitu vzorku. Proto je nutné vzorek uchovávat při chladničkové teplotě 2-8 C a vyšetřit nejpozději do 72 hod. Pro dlouhodobější uchování vzorku je nutné materiál zmrazit na -10 C. 29

30 11.2. Kultivační vyšetření Clostridium difficile patří mezi kultivačně náročné bakterie. Ke svému růstu potřebuje anaerobní prostředí a speciální půdy obsahující specifické substráty, které potlačí přerůstání Clostridium difficile jinými druhy klostridii, zejména Clostridium perfringens. Do roku 2007 byly vzorky stolic před vlastní kultivací zpracovávány metodou tzv. teplotního šoku, ale kvůli termolabilitě spor byl kultivační záchyt velice nízký a od této metodiky se upustilo. Nyní se využívá metoda tzv. alkoholového šoku, kdy je vzorek stolice smíchán s 96 % etanolem v poměru 1:1 a nechá se 30 minut inkubovat při pokojové teplotě. Alkohol zvyšuje citlivost metody tím, že přispívá ke stimulaci klíčení spór. K vlastní kultivaci se používají komerčně připravené selektivní půdy. Naočkované půdy jsou kultivovány v anaerostatech 48 hodin při teplotě C. Každý vykultivovaný kmen je třeba identifikovat, zda se jedná o bakterii Clostridium difficile a pomocí molekulární typizace určit toxicitu testovaného kmene. Nevýhodou kultivačního vyšetření bývá neschopnost primárně rozlišit toxické a netoxické kmeny, odlišit tak kolonizaci od probíhající infekce (Chmelařová, 2010) Průkaz glutamát dehydrogenázy Glutamát dehydrogenáza (GDH) je enzym, který je typický pro výskyt Clostridium difficile. Stanovení GDH ale nerozlišuje toxigenní a netoxigenní kmeny. U GDH negativních vzorků můžeme spolehlivě vyloučit přítomnost Clostridium difficile ve vzorku testované stolice. Stanoven může být samostatně nebo jako součást testů k průkazu toxinů A i B tzv. kombinované testy. K testování GDH se používají buď enzymové membránové imunoanalýzy, ELISA testy nebo chemiluminiscenční metody Průkaz toxinů A a B Metodika stanovení toxinů A a B je podobná jako při testování GDH. Většinou se stanovují oba toxiny současně a používají se metody enzymové membránové imunoanalýzy, chemiluminiscenční analýzy, ELISA nebo metody molekulární typizace. Pozitivita toxinů A a B signalizuje přítomnost toxigenního kmene ve vzorku. 30

31 11.5. Průkaz cytotoxicity Metoda cytotoxického testu, která prokazuje přítomnost toxinů na tkáňových kulturách fibroblastů, je považována za zlatý standard v diagnostice Clostridium difficile. Na buněčných kulturách můžeme pozorovat nekrotizující efekty toxinu B. Metoda je využívána pouze v referenčních a specializovaných laboratořích. Vyžaduje totiž specifické laboratorní vybavení a interpretační zkušenosti. Nevýhodou tohoto stanovení bývá dlouhá doba nutná k průkazu toxicity a možné riziko falešné pozitivity (Beneš, 2012) Průkaz genů pro tvorbu toxinů Pokud chceme vzorky otestovat na úrovni bakteriální DNA a chceme-li zjistit přítomnost genů, jejichž expresí dochází k tvorbě toxinů, používá se k těmto účelům metoda real-time PCR. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda založená na amplifikaci úseku DNA dle principu replikace nukleových kyselin a následně namnožená DNA slouží k analýze genové exprese. Geny kódující toxin A (tcda) a toxin B (tcdb) se nacházejí na lokusu patogenity (PaLoc). Tuto metodu můžeme využít také při detekci delecí vyskytující se u epidemiologicky významných ribotypů 027. PCR metoda slouží hlavně ke konfirmaci laboratorní diagnózy u těžkých forem CDI a u nejasných výsledků (Chmelařová, 2010). 12. Zobrazovací metody Endoskopická diagnostika Endoskopie umožňuje vyšetření tlustého střeva a přímé zobrazení střevní sliznice. Používaná je technika flexibilní sigmoideoskopie nebo kolonoskopie. Během vyšetření je možné, v případě chorobného nálezu, ihned provést odběr vzorků tkáně k histologickému vyšetření. U pacientů se středně těžkou formou CDI se na střevní sliznici objevují různě veliké ostrůvkovité pablány, které jsou natolik charakteristické pro klostridiovou kolitidu, že je nález nezaměnitelný s jinou diagnózou. Pouze v případě, není-li onemocnění ve fázi tvorby pablán, 31