Transkript

1 Hmotnostní spektrometrie peptidů ů a proteinů Petr Halada Mikrobiologický ústav AV ČR halada@biomed.cas.cz

2 Proč chceme znát molekulovou hmotnost? Všechny prvky a molekuly jsou charakterizovány 2 základními veličinami Frekvence (ν) Spektroskopie (UV, IR, fluorescence, NMR, ) Rentgenová difrakce Molekulová hmotnost (m) sedimentace/centrifugace chromatografie elektroforéza hmotnostní spektrometrie

3 Hmotnostní spektrometrie Metoda umožňující určit molekulovou hmotnost chemických látek Prvky a molekuly jsou charakterizovány svou hmotností a tou se vzájemně odlišují Měříme pseudomolekulární ionty v plynné fázi (M +, M+H +, M+Na +, M-H -, atd.)

4 Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometr generuje ze vzorku ionty v plynné fázi, rozdělí je podle poměru hmoty a náboje (m/z) a zaznamená hmotnostní spektrum = grafické znázornění četnosti iontů na hodnotě m/z Fragmentace iontů v hmotnostním spektrometru umožní získat strukturní informaci, která se využívá při: - identifikace látek - určení struktury

5 Hmotnostní spektrometr Normální tlak Snížený tlak Vložení vzorku Iontov tový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor tor Počítač m/z!

6 Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS fragmentace iontů Izolace iontu podle m/z Separace fragmentů podle m/z Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor 1 Hmotnostní analyzátor 2 Detektor tor Vznik iontů v plynné fázi Kolizní cela Detekce fragmentových iontů

7 Izotopy Chemické prvky se vyskytují v přírodě jako směs izotopů Uhlík: 98.90% 12 C 1.10% 13 C Monoizotopická hmotnost / Průměrná hmotnost Br 50.69% 79 Br 49.31% 81 Br Monoizotopická hmotnost / Průměrná hmotnost

8 Kolik hmotností máme? Celočíselná CH 3 Br: x = 95 Průměrná (vážený průměr všech izotopů daného prvku podle % zastoupení) CH 3 Br = x = Monoizotopická (součet přesných hmotností "nejlehčích" izotopů prvků) CH 3 Br = x =

9 Kolik hmotností máme? Monoizotopická vs. Průměrná MW M mono < M avg Glukosa C6H12O6 M mono = ; M avg = Peptid C113H171N27O31S1 M mono = ; M avg =

10 Přítomnost izotopů ( 13 C, 15 N, 18 O, ) se projeví na tvaru píku. 13 C je 1.1%, tj. na každých 100 uhlíků je jeden 13 C více uhlíků -> více 13 C, to se projeví na tvaru píku Intenzita druhého izotopu je 1.1 x počet C získáme % intenzity prvního píku.

11 Izotopický klastr 12 C: 98.90% 13 C: 1.10 % 10x 12 C, no 13 C C C x 12 C, 1x 13 C ,200 1,202 C 100 1,204 1, ,000 12,010 C x 12 C, 2x 13 C 12,020 12,030

12 Kouzla s izotopy 32 S a 34 S 79 Br a 81 Br

13 Hmotnostní spektrum Signály iontů ve spektru jsou charakterizovány: poměrem hmotnosti a náboje m/z intenzitou rozlišením 100% Základní pík Rel. intenzita m/z

14 Rozlišení R= m m m=fwhm Full Width at Half Maximum h m ½ h m Př. - rozlišení znamená, že odlišíme dvě látky, lišící se o 1/50000 MW a Jednotkové rozeznáme m/z 100 od 101 kvadrupóly a iontové pasti

15 Rozlišení R = 1000 (blue), 3000 (red), 10,000 (green) and 30,000 (black) IT vs. ToF vs. FT-ICR analyzátor

16 Absolutní Přesnost Da Dalton Relativní (mění se podle m/z) % ppm parts per million: ppm (Mteor - Mexp)/Mteor x Iontová past ppm TOF ppm FT-ICR ppm

17 Unikátní vlastnosti hmotnostní spektrometrie Specifita Rychlost Citlivost Jednoduchá interpretace dat

18 Čísla k zapamatování (1 mol ~ x molekul) molů zrnko soli ~ 1 ug ~ 20 nmol molekul pmol pro CBB 1 pmol pro Edmanovo odb. 100 fmol pro stříbrem - barvené gely 2 fmol: jedna kopie v 10 9 buněk amol: ICR FTMS zmol: Iontová past ( iontů) 10 3

19 Ionizační metody EI Electron Impact CI Chemical Ionization APCI / APPI Atmospheric Pressure Chemical Ionization / Photo Ionization FD Field Desorption PD Plasma Desorption FAB Fast Atom Bombardment ESI / nanoesi ElectroSpray Ionization MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

20 1988 Elektrosprej J.B. Fenn Fenn JB; Mann M; Meng CK; Wong SF; Whitehouse CM: Science 1989, 246, nanoelektrosprej M. Mann a M. Wilm

21 Ionizace elee lektrosprejemrejem Rozpouštědlo/Pufr ESI jehla (2-55 kv) Vstupní otvor (0-50 V) Vyhřívaná kapilára Iontový svazek

22 Ionizace elee lektrosprejemrejem Velmi měkká ionizace Malá nebo téměř žádná fragmentace Mnohonásobně nabité ionty 1, 2, 3, 60x Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery... Nekovalentní komplexy (proteinové komplexy, komplexy protein-ligand, atd.) Vhodná pro kvantifikaci Vysoká náročnost na čistotu Napojitelné na LC Spojení s jakýmkoliv analyzátorem

23 1987 Desorpce laserem za přítomnosti matrice K. Tanaka / M. Karas, F. Hillenkamp Karas M; Bachmann D; Bahr U; Hillenkamp F: Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 78, 53. Tanaka K; Waki H; Ido Y; Akita S; Yoshida Y; Yoshida T: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.

24 MALDI ionizační proces

25 MALDI ionizační proces 1 mm MALDI destička krystaly matrice a vzorku

26 MALDI ionizační proces MALDI matrice silná absorpce vlnové délky laseru ε (matrice) >> ε (analytu) stabilita ve vakuu, netěkavá přenos protonu (na analyt / z analytu) ionizace mísitelná se vzorkem v tuhé fázi vzorek : matrice = 1 : solventy : MeOH, EtOH, MeCN, H 2 O, THF, aceton... UV-MALDI 337 nm dusíkový laser 355 nm Nd:YAG 266 nm Nd:YAG solid state Hz IR-MALDI 2.94 mm Er:YAG laser 10.6 mm CO 2 laser

27 MALDI matrice kys. 2,5-dihydroxybenzoová (DHB) kys. α-kyano-4-hydroxyskořicová (CCA) kys. sinapová (SA) (kys. 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová) kys. ferulová (FA) (kys. 4-hydroxy-3-methoxyskořicová)

28 Nanesení vzorku na MALDI destičku analyt ( M) "Dried droplet" matrice (5-50 g/l) MS

29 Nanesení vzorku na MALDI destičku "Thin-layer" matrice (CCA, sinapová kys.) v acetonu, 1% voda analyt ( M) tenká homogenní vrstva krystalů promytí MS

30 MALDI matrice 1 mm 1 mm CCA - dried droplet DHB - dried droplet CCA - thin layer DHB - dried droplet špatná příprava

31 MALDI ionizační proces Měkká ionizace Malá nebo žádná fragmentace, jednoduchá interpretace Jednonásobně nabité ionty [M+H] + ; [M-H] - Analýza komplexních směsí Rychlá a jednoduchá příprava a analýza Proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy syntetické polymery... Tolerantní k detergentům, solím Krátké laserové pulsy; t ~ ns Spojeno s TOF analyzátorem ALE...

32 Analyzátory q, MSQ quadrupole (Mono Stage Quadrupole) TSQ Triple Stage Quadrupole (QqQ) qit quadrupole Ion Trap LT Linear Ion Trap Sector B/E geometry TOF Time Of Flight FT-ICR Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Hybridní (q-tof, TOF-TOF, q-ft-icr, LT-FT-ICR)

33 Linearní Time Of Flight (TOF) analyzátor E kin = ½ mv 2

34 Time Of Flight (TOF) Analyzátor s reflektronem

35 Post-Source ource Decay (PSD) získání PSD spektra - postupné snižování U reflektronu záznam segmentů velmi pracné a zdlouhavé

36 TOF/TOF - LIFT metoda

37

38 Kvadrupólový analyzátor a iontová past stejný princip - ovlivňování pohybu iontů oscilujícím elektrickým polem velmi rozšířené relativně jednoduchá obsluha a udržba vhodné pro rutinní spojení se separačními metodami

39 Kvadrupólový analyzátor všechny ionty nerezonující iont + iont v rezonanci - - z iontového zdroje + do detektoru nerezonující iont iont v rezonanci - Rf

40 Trojnásobný kvadrupól N 2 RF Fokusace iontů Q1 Q2 Kolizní cela Q3 Detektor Prekursorové ionty Fragmentace (CAD) Produktové ionty

41 Sférická iontová past 3D z iontového zdroje do detektoru vstupní koncová elektroda středová prstencová elektroda výstupní koncová elektroda

42 Proč je v pasti helium? snížení kinetické energie iontů zvýšení citlivosti pomáhá udržet ionty ve středu iontové pasti zvýšení rozlišení a citlivosti slouží jako kolizní plyn, vyvolává fragmentaci

43

44 Q-TOF

45 FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Pohyb iontů v magnetickém poli - iont s hmotností m a nábojem q, pohybující se s rychlostí v v homogenním magnetickém poli se silou B: F = mv 2 /r F = qv x B

46 FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací A B + + Iont pohybující se po cyklotronové orbitě s frekvencí danou vztahem: 2πf = qb m Poloměr běžné cely: 1-3 cm Počáteční poloměr pohybu iontu: mm Běžná síla magnetického pole: 1-12 Tesla např. 7T magnet, m/z 100, 1 sec cyklů (30 km)

47 FT-ICR Iontově cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací Koherentní cyklotronový pohyb indukuje proudový obraz, který je amplifikován a detekován. Přítomnost iontů s různými m/z se projeví jako superpozice sinusoidalních signálů na detektoru. excelentní rozlišení (~ 10 6 ) a přesnost ppm

48 FT-ICR Rozlišení

49 Hmotnostní spes pektrometrie v analýze biomolekul Kontrola kvality/čistoty Určení MW Identifikace Sekvenování Charakterizace modifikací Studium nekovalentních komplexů Analýza směsí Relativní/absolutní kvantifikace Studium 3D struktury s nízkým rozlišením

50 Určení MW MALDI

51 100 Určení MW ESI 6+ R ~ % % m/z m/z

52 Relativní intensita NH 3 + A R NH 3 + G S S R A A R NH 3 + NH 3 + R S T R R NH 3 + NH 3 + V NH NH 3 + R A A R A R G S S NH NH 3 + R A A R A R R S T R R NH 3 + V G S S NH 3 + R S T R R V m/z

53 Určení MW ESI Dekonvoluce

54 Identifikace proteinů = otisk prstu člověka "fingerprint" = fingerprint proteinu/ů

55 Identifikace proteinp roteinu - princip

56 Štěpení proteinů Trypsin K/R- \-P Chymotrypsin Y/W/K/F- \-P AspN -D GluC E-, E/D- \-P ArgC R- \-P LysC K- \-P CNBr M-

57 Důležitá je přesnost Čím vyšší přesnost měření, tím méně peptidů potřebujeme pro bezchybnou identifikaci Iontová past ppm TOF ppm FT-ICR ppm

58

59

60

61

62

63

64

65 groel protein * ATP synthase

66 Parametry ovlivňující ID proteinu Databáze NCBInr Swissprot vlastní Taxonomie Fyzikálně-chemické Přesnost měření MW a pi (- odhad z 2D gelu), použitá proteáza závisí na spektrometru a kalibraci spektra Biochemické Neúplné štěpení Modifikace Např. trypsin : AFHYTDKILGCVR úplná alkylace cysteinu částečná oxidace methioninu

67 Identifikace proteinu Protein na gelu nebo v roztoku Štěpení proteinu Peptidové mapování/ Peptidový fingerprinting Bez výsledku Peptidové mikrosekvenování (PSD, MS/MS)

68 Peptidové sekvenování

69 Full MS Mass range(350 ( ) Scan 1479 Full MS/MS (CID) Scan 1480 Precursor 667.7

70 Data-Dependent Dependent MS & Dynamic Exclusion Relative Abundance m/z 2

71 Fragmentace peptidu b 1 b 2 b 3 R 1 R 2 R 3 R 4 NH 2 -CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO 2 H N-konec C-konec y 3 y 2 y 1

72 Fragmentace ace peptidu S-P-A-F-D-S-I-M-A-E-T-L-K MH + = b-ions + y-ions S PAFDSIMAETLK SP AFDSIMAETLK SPA FDSIMAETLK SPAF DSIMAETLK SPAFD SIMAETLK SPAFDS IMAETLK SPAFDSI MAETLK SPAFDSIM AETLK SPAFDSIMA ETLK SPAFDSIMAE TLK SPAFDSIMAET LK SPAFDSIMAETL K 147.2

73 Přehled aminokyselin v číslech AK Hmotnost Boční řetězec Immoniové ionty G Gly A Ala S Ser P Pro V Val T Thr C Cys L Leu (72) I Ile (72) N Asn (70) D Asp Q Gln (84, 129) K Lys (129, 112, 84, 70) E Glu M Met (61) H His (166, 138, 123, 121, 82) F Phe (91) R Arg (112, 100, 87, 73, 70, 59) Y Tyr W Trp

74 m/z tryptic digest (-K/-R) [M+H] + = ends with -K AAAAAAAAAAAAAAGAAGK KG A A 6A G A A A A A A A A A A A A A A A A G A A A A 2A G K 2A

75

76 (our) MASCOT MS/MS

77 Bottom up vs. Top down identifikace proteinů Štěpení proteinu/směsi MS, MS/MS (na úrovni peptidů) LC-MS(/MS) DTB prohledávání na bázi PMF, MS/MS Pre-frakcionace Purifikace v plynné fázi Určení přesné MW MS/MS proteinu DTB prohledávání pomocí MW proteinu a sekvenčního tagu Zachována informace o PTM Vyžaduje FT-ICR MS

78 TopDown

79 Čichám Čichám PTMs PostTranslační Modifikace změna MW Disulfidické můstky (Cys-Cys) Glykosylace Fosforylace Acylace Oxidace Acetylace Zkrácení proteinu Ztráta N-konc.Met Glu -> pyro-glu

80 Disulfidické můstky A - určení zda jsou nebo nejsou přítomné diferenční alkylace B určení kolik Cys je volných a kolik vázaných 1. denaturace, alkylace činidlem I (u menších proteinů lze rovnou měřit MS) 2. redukce a alkylace činidlem II 3. štěpení a MS, LC-MS/MS určení C přímá identifikace disulfidů - štěpení + LC-MS (FT- ICR) hledání disulfidicky spojených peptidů podle přesné hmotnosti bez redukce/alkylace

81 Diferenční alkylace celý protein

82 Glykosylace N- a O-glykosylace 1. Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity 2. Nalezení míst glykosylace 3. Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa

83 N-glykosylace 1. Charakterizace sacharidových struktur+určení heterogenity 2. Nalezení míst glykosylace 3. Přiřazení struktur na jednotlivá glykosylační místa 1. a) uvolnění glykanu(-ů) enzymaticky PNGasa F, Endo H, Endo F1-3, postupné odštěpování pomocí exoglykosidas, Pronasa chemicky hydrazinolýza, alkalické štěpení, TMSF (pouze deglykosyluje ničí sacharid) b) charakterizace glykanů NMR, MS, MS/MS, permethylace+ms/ms, exoglykosidasy+ms 2. a) Edmanovo odbourávání nejlépe glykopeptidy peptidy po EndoH b) deglykosylace PNGasouF v H 2 16 O a H 2 18 O (+ štěpení AspN) PNGasa F mění Asn na Asp (vzniká zásahové místo pro AspN) 3. Štěpení proteinu izolace glykopeptidů a opakovaní postupu na jednotlivých glykopeptidech

84 Fosforylace Signalizace, aktivace, S, T, Y, H Ztráta (P) skupiny: -98, Směrovaná MS analýza (neutrální ztráta, precursor ion scanning, negativní mód) Nabohacení protilátky, IMAC, TiO 2 Působení fosfatázy + diferenční mapování

85 Fosforyla orylace A B Relative Abundance Relative Abundance Da neutrální ztráta Možné fosfopeptidy Tim e (m in)

86 IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography IDA (iminodiacetic acid) NTA (nitrilo-triacetic acid) Iont kovu Ga 3+, Fe 3+ Nespecifická vazba esterifikace

87 IMAC Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography P P Protein digestion P P P P Protein digestion P P Fe(3 + ) IMAC enrichment

88 Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO 2

89 Obohacení fosfopeptidů pomocí TiO 2