NMR biomakromolekul RCSB PDB. Progr. NMR

Transkript

1 NMR biomakromolekul Typy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR proteiny a peptidy rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy omezení malou rozmanitostí chemického složení kombinace výše uvedených RSB PDB RSB PDB Progr. NMR

2 NMR Proteinů α ř

3 Stavba a struktura proteinů Ala Asp Asn Arg ys Glu Gln Gly is Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Vznik peptidové vazby: + + Ala1 Ala2 Ala1 Ala2 2 O

4

5 Struktura proteinů

6 Struktura proteinů U proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní struktura. Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k konci. Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovaná struktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb. helikální struktura (α-helix) extendovaná struktura (β-sheet) náhodné klubko (random coil) Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu. Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.

7 Využívaná jádra v biomakromolekulách 1 + vysoké přirozené zastoupení + vysoká citlivost (1,00) malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm) 13 + velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) nízké přirozené zastoupení (1,11 %) nízká citlivost (1, ); po 100% isotopovém obohacení 1, N střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) nízké přirozené zastoupení (0,37 %) nízká citlivost (3, ); po 100% isotopovém obohacení 1, speciální účely

8 Zdroje Proteinů Původní organismus + přirozená forma včetně všech modifikací - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy, složitá izolace,. Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců hemická syntéza + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným sbalením proteinu In-vitro translace + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení - drahé, posttranslační modifikace

9 Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí sledování průběhu biochemických dějů vysoce selektivní odezva na úrovni atomů Čím jsme omezeni: velikost molekuly (ovlivnění T 2 ) do 10 kda ( 10 kg mol 1 ) [< 70 AA] lze řešit přímo kombinací OSY, TOSY a NOESY experimentů do 20 kda [< 180 AA] nutné 100% isotopové obohacení 13 a 15 N do ~100 kda 100% isotopové obohacení 13, 15 N a částečné nebo úplné obohacení 2 (odstranění 1 jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13 ) větší proteiny přístupný pouze hrubý náhled na celkovou strukturu, sekundární struktura koncentrace vzorku alespoň 0,2 mm dlouhodobá stabilita vzorku několik týdnů

10 Vzorek proteinu pro NMR měření nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2 0,5 mmol l 1 (obecně více = lépe) používá se filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění úprava p pufrem (p typicky 4 8) vyšší p by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu signálů přidání redukčních činidel (R S) zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení vzorku přidání 5 10 % D 2 O referenční jádro pro spektrometr (lock) roztok vzorku µl

11 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

12 1. publikované NMR spektrum proteinu spektrum proteinu RNasy A, měřeno 40 Mz spektrometrem, Mz W spektrometr Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G. (1957) J. Am. hem. Soc. 79, 3289.

13 První 1Gz NMR spektrometr instalován firmou Bruker v entre de RMN à Très auts hamps, Lyon, France 1 NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem

14 Nutný krok potlačení signálu vody jako rozpouštědlo se používá 2 O, ne D 2 O z těchto důvodů: jde o fysiologické prostředí při použití D 2 O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium tím pádem je nutné potlačit dominantní signál 2 O, protože její signál je krát intensivnější než signály měřené látky spektrum proteinu bez potlačení 2 O:

15 Potlačení signálu 2 O metoda presaturace selektivní W-ozařování 2 O během relaxační periody Δ π/2 1 NMR spektrum proteinu po presaturaci vody zbytkový signál 2 O

16 Potlačení signálu 2 O metoda WATERGATE spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole 1 (π/2) x Δ π y (π/2) -y (π/2) -y sel. sel. Δ G z zbytkový signál 2 O 1 NMR spektrum proteinu po WATERGATE excitační profil selektivního π/2 pulsu

17 Jednodimensionální 1 NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1 signálů aminokyselin kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kda) 3 N peptidické aromatické N postranní α alifatické N R 1 AA1 O R 2 N O AA2 N R 3 AA3 O 1 spinové systémy ( 3 J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny =O skupinami 1D 1 spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1, 13 a 15 N

18 Vícedimensionální NMR experimenty rozlišení informací obsažených v 1D spektrech korelace chemických posunů N propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení

19 1-15 N SQ otisk palce proteinu ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, nesbalený protein sbalený protein 15N (ppm) 15N (ppm) 1 (ppm) 1 (ppm)

21 Interpretace NMR spekter přiřazení resonancí přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule postup: 1.přiřazení hlavního řetězce ( N, N, α, α, O ) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1 a 13 ) N N O O N R 1 O R 2 N O N R 3 O β α β α označení jednotlivých atomů v aminokyselině je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

22 Přiřazení resonancí atomy hlavního řetězce pro přiřazení 1, 13 a 15 N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí ( 1 J, 2 J) základní experimenty (je mnoho dalších kombinací): N O O N NA N O O N N(O)A N O O N BAN N O O N BA(O)N modrá: jádra excitovaná i detekovaná zelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu) červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace

23 Přiřazení resonancí experimenty NA a N(O)A 1 O 13 β 15 N i α 13 ' 1 13 β 13 γ N γ α 11 < 1 i ' O NA po excitaci i N je magnetizace přenesena na N i ( 1 J N,N ) a dále současně na i α ( 1 J N,α ) a α i 1 ( 2 J N,α ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a α každá N skupina dává dva signály o frekvencích {ω( i N ), ω(n i ), ω( i α )} a {ω( i N ), ω(n i ), ω( α i 1 )} 13 γ N(O)A po excitaci i N je magnetizace je přenesena na N i ( 1 J N,N ), dále na i 1 ( 1 J N, ) a na i 1 α ( 1 J,α ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a α každá N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω( in ), ω(n i ), ω( α i 1 )} 1 O 13 β 15 N i α 13 ' 1 13 β 13 γ N α < 1 i ' O interakční konstanty J v z

24 Sekvenční propojení hlavního řetězce NA a N(O)A 2D řezy spektry NA a N(O)A v rovině na frekvencích jednotlivých amidických N N(O)A NA N(O)A NA N(O)A NA N(O)A NA N někdy chybí pík

25 Přiřazení signálů postranních řetězců různé implementace experimentů TOSY a OSY (O)N-TOSY ()-OSY γ O β N ' α α N ' β O γ

27 Interpretace NMR spekter přiřazení strukturních parametrů NOE meziatomová vzdálenost skalární interakční konstanta dihedrální úhel chemický posun chemické okolí residuální dipolární interakce vzájemná orientace vazeb vodíkové vazby detailní lokální struktura

28 Nukleární Overhauserův efekt (NOE) přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1, σ IS : γ τ c ω r IS... gyromagnetická konstanta 1... korelační čas molekuly... Larmorova frekvence... vzdálenost interagujících jader dosah interakce do 5 6 Å NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. ílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity. Např. (1,8 2,5) Å; (1,8 3,5) Å; (1,8 5) Å.

29 X-editované NOESY experimenty excitace pouze 1 atomů vázaných na atomy 15 N nebo 13, přenos magnetizace vlivem NOE na blízké atomy 1, detekce 1 řez 3D spektrem v rovině 1 N 1 na pozici 122 ppm v 15 N doméně = signál Tyr66 1 N

30

31 Skalární interakce zjištění dihedrálních úhlů peptidová vazba tvoří rovinu definovanou atomy O α N N vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformace páteře proteinu je určena dihedrálními úhly φ a ψ φ ( N α ) a ψ (N α N) Karplusova rovnice závislost velikosti interakce 3 J na dihedrálním úhlu (θ) konstanty A a B zjištěny pro různé kombinace interagujících jader problém: jedné hodnotě 3 J mohou odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního úhlu 3 J 10 8 N α N α O N α β N ' N ' 0 [z] O N α θ [deg]

32 hemický posun chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře přiřazení resonancí hlavního řetězce ( α, α a ') klesá α-helix chemický posun δ( α ) náhodné klubko roste β-sheet výpočet indexů chemického posunu (SI) odhad sekundární struktury podle lokální hustoty SI N istogram indexu chemického posunu jader α, α a ' sekvence proteinu helix I helix II helix III helix IV

33 Residuální dipolární interakce (RD) přímá dipól dipólová interakce dvou jader v isotropním roztoku nedetekovatelná pozorovatelná v neisotropním prostředí u molekul částečně orientovaných vůči magnetickému poli tvorba neisotropního prostředí kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny (virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý polyakrylamidový gel samotné vnější magnetické pole příspěvek ke skalární interakci snadná měřitelnost velikost interakce D IS závisí na orientaci vazby vůči směru B 0 fosfolipidové bicely orientované v magnetickém poli Θ I r IS S Θ...úhel mezi vektorem I S a B 0

34 Vodíkové vazby identifikace: výměnné experimenty D teplotní závislosti chemických posunů charakterizace: měření skalární interakce (J) přes -vazbu stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami

36 Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce Identifikace prvků sekundární struktury Strukturní omezení z NMR parametrů vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant relativní orientace vazeb z dipolárních kaplingů případně další omezení Výpočet trojrozměrné struktury molekulová mechanika + simulované žíhání

37 Výpočet struktury proteinu molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice) použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (10 3 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. ílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie například pro NOE: energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnich/úhlů).

38 Vypočítané struktury obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně. Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu. struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti) vybraná reprezentativní struktura

39 Interakce proteinu s ligandem Protein-protein, protein-nk, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci) Farmaceutický průmysl Proteomické studie Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování -D chemické výměny N skupin Mapování pomocí paramagnetické látky Sledování změny dynamiky proteinu

40 Změny chemických posunů Titrace proteinu ligandem Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji N ) Interakční povrch Disociační konstanta

41 STD Saturation transfer difference Interakce protein-malá molekula Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce Přebytek ligandu Zjistíme, která část ligandu interaguje Odhad K D

42 STD Saturation transfer difference

43 Transferred NOESY r < 5 Å NOE chemická výměna r > 5 Å Princip: informace o struktuře ligandu ve vázaném stavu je pomocí chemické výměny přenesena na ligand ve volném stavu, kde je detekována Uspořádání: malý ligand, který je viditelný NMR spektroskopií a velký substrát (M w > 40 kda) neviditelný pro NMR Podmínka vhodná kinetika systému 10-8 > K d > 10-3 M -1 Využití: - struktura ligandu - nepřímo struktura vazebného místa - způsob vazby

44 Peptid antikolagulační kaskády Inhibitor trombinu

45 Interakce fragmentu trombomodulinu s trombinem 18 aminokyselin z vazebného místa trombomodulinu NOESY spektrum fragmentu trombomodulinu za přítomnosti trombinu NOESY spektrum samotného fragmentu trombomodulinu

46 Důležité NOE interakce dalekého dosahu ligandu TM52+5 v komplexu s thrombinem

47

48 Struktura omplex komplexu between thrombin thrombinu and TM52+5 a ligandu TM52+5

49 Intermolekulární NOE NOE efekt mezi dvěma molekulami U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE Rozdílné izotopové značení 13 filtrované 13 editované NOESY

50 13 filtrované 13 editované NOESY Vychází z 13 editovaného NOESY Obsahuje filtr, na NOE mezi 1 na 13 Projeví se NOE jen mezi 1 na 13 a 1 na 12 Neznačený ligand protein ( 13 značený)

51 13 filtrované 13 editované NOESY 13 editované NOESY 13 filtrované 13 editované NOESY 1 1 1

52 Studium dynamického chování molekul molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů možnost charakterizace časové škály pohybů různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních pohybů lokální pohyby globální pohyby příklady jevů pohyb N rotace 3 pohyb smyček pohyb domén transport, katalýza, další biologické děje... ps ns μs ms s > s relaxace R 1, R 2, het. NOE relaxace R 1ρ, PMG metody studia analýza tvaru signálu saturation transfer, NOESY výměna /D