Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí nukleových kyselin a proteinů.

Transkript

1 Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí nukleových kyselin a proteinů. doc. RDr. Miroslav Fojta, CSc. Olomouc, 23. června 2010

2 obelova cena za polarografii (Jaroslav Heyrovský) Elektrochemická aktivita DA (Emil Paleček)

3 Elektrochemické metody polarografie kapající rtuťová elektroda -I n e - X m X m-n kvantifikace (jaká je koncentrace) identifikace elektrochemicky aktivní látky (co to je) -E

4 Elektrochemické metody voltametrie -I X m n e - visicí rtuťová kapková elektroda pevné elektrody X m-n X m n e - X m-n -E

5 elektrochemie proteinů

6 Elektrochemie proteinů od dvacátých let XX. století (J. Heyrovský, R. Brdička)

7 UHLÍKOVÉ ELEKTRODY RTUŤOVÉ ELEKTRODY -I redukce vazby S-Hg katalytické vylučování vodíku prenatriová vlna pík H elektrochemická oxidace tryptofanu a tyrozinu E/V Y W redukce vazby S-S (cystin) signály peptidů a proteinů obsahujících cystein (cystin) Brdičkova reakce (v přítomnosti Co)

8 Katalytické vylučování vodíku (CHE) V této oblasti potenciálu je elektrochemicky generována katalyticky aktivní částice (R)

9 Brdičkova reakce Brdička, 1933: polarografické vlny v přítomnosti sérových proteinů a solí kobaltu

10 Brdičkova reakce a diagnostika rakoviny -kdysi poměrně rozšířený diagnostický test -dnes renesance tohoto přístupu -R. Kizek a spol (MEDELU) -rakovina a metalothioneiny

11 pík H: (pořád ještě) nový nástroj studia proteinů Tomschik et al., 1998

12 katalytický proces na rtuťové elektrodě, ne zcela objasněný mechanismus (dusíkaté skupiny; cystein není nezbytně nutný, ale výrazně přispívá) vysoká citlivost detekce peptidů a bílkovin citlivost k agregaci bílkovin denaturaci bílkovin změnám redox stavu peptidů a bílkovin (-SH vs. S-S-)

13 agregace a-synucleinu a-synuclein: hlavní součást tzv. Lewyho tělísek spojených s Parkinsonovou chorobou podléhá agregaci vedoucí k tvorbě fibrilárních struktur pochopení mechanismu agregace a nalezení možností jejího ovlivnění je důležité pro vývoj léčebných postupů zdá se, že hlavní toxický efekt mají nízkomolekulární agregáty v počáteční fázi agregace

14 ormalized fluorescence Peak height 1 Co vidí různé metody: AFM A pík H 0 h 24 h 48 h 72 h CD 0 h 3 weeks Wavelength (nm) Potential (V) pík H: unikátní citlivost k počátečním změnám vedoucím k agregaci Time (h) (Masařík a kol., 2004)

15 pík H DLS

16 Elektorchemie DA

17 Struktura DA 1953: James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins: dvoušroubovice DA 1962: obelova cena (JW, FC, MW) vysvětlení základních principů uchování, předávání a exprese dědičné informace

18 nukleotid pyrimidinové báze purinové báze dvoušroubovice O H 2 H 2 O H CH 3 H O R thymin (T) O H 2 R R R cytosin (C) adenin (A) guanin (G) 2-deoxyribóza CH 2 O base O -O P O O fosfát párování bazí v řetězcích DA

19 Emil Paleček: polarografie DA

20 current rtuťové nebo amalgamové elektrody (převážně) uhlíkové elektrody tvorba 7,8 dihydroguaninu H 2 H O oxidace R G + H 2 H O oxidace guaninu a adeninu R G ox A ox H 2 R potential/v vs. SCE H 2 H 2 O R R CA redukce cytosinu + adeninu -

21 tensametrické signály DA na rtuti ds, distorted doublestranded singlestranded E/V p.z.c. vysoká citlivost ke struktuře DA

22 Detekce poškození DA

23 ejčastější produkty poškození DA přerušení cukrfosfátové páteře DA přerušení -glykosidické vazby jednořetězcový zlom dvouřetězcový zlom kyslíkové radikály činnost nukleáz důsledek poškození bazí abazická místa spontánní hydrolýza (depurinace) důsledek poškození bazí

24 ejčastější produkty poškození DA poškození bazí: chemické modifikace guanin H 2 H O R H 2 H O CH 3 O R H 2 H O CH 3 + R alkylace bazí oxidativní poškození deaminace bazí poškození UV zářením (sluneční světlo) reakce s metabolicky aktivovanými karcinogeny reakce s protinádorovými léky H 2 O H H 2 R O H 3 R adenin H 2 cytosin R H 3 Pt O H O R O R H H 2 H 2 + CH 3 O R H H 2 O R H O CH 3 CH 3 R R H O O R O H OH H H O R O O OH OH H O R CH 3 R CH 3 OH OH thymin

25 v podstatě jakékoli poškození DA lze v principu detekovat elektrochemicky

26 DA s konci a bez konců nadšroubovicová otevřená kružnicová lineární zlomy = poškození DA tedy možnost měřit poškození DA

27 Rtuťová elektroda modifikovaná kovalentně uzavřenou kružnicovou (nadšroubovicovou, sc) DA: senzor pro látky indukující zlomy v DA scda OH ocda ACV ACV E/V E/V -0.8

28 similar responses to DA damage like with the HMDE can be obtained with mercury film electrodes (Kubičárová 2000) with amalgam electrodes (Cahová-Kuchaříková, Fadrná, Yosypchuk, ovotný 2004) AC voltammograms of sc, linear ds and denatured DA at m-agsae 0 Cu(phen)2 changes in the peak 3 height (at m- AgSAE) due to scda exposure to a chemical nuclease Cu(phen) 2

29 nebojte se rtuti! nekouše!

30 Hybridizace DA (RA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců CGAATACGACCTTA hybridizační sonda sekvence sondy je navržena (syntetizována) vzhledem k sekvenci DA, která nás zajímá CGAATACGACCTTA GCTTATGCTGGAAT GCTTATGCTGGAAT cílová DA je pomocí sondy detekována

31 DA čipy ( arrays ): aplikace mnoha sond současně aplikace různých (různě barevných ) fluorescenčních značek

32 Elektrochemický senzor pro hybridizaci DA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu hybridizace s cílovou DA se provede stejně jako v případě optických senzorů odezvou na hybridizační událost je elektrochemický (proudový) signál I hybrid samotná sonda E

33 Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DA poté je zachycená cílová DA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena detekční elektroda povrch H

34 Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DA poté je zachycená cílová DA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena detekční elektroda

35 Magnetické částice ( kuličky ) nesoucí různé biorekogniční elementy : všestranné využití v biopreparacích a bioanalýze buňky specifická protilátka komplementární A řetězec biotinyl. ss OD antigen (protein) protilátky biotinylovaný ds OD streptavidin protein G protein A specifická protilátka DA-vazebný protein oligo(dt) n chelát kobaltu protein s His-tagem Co A řetězec s úsekem (A) n

36 magnetické částice další složka molekulárního sendviče výstup (separovaný vzorek k analýze) magnetická separace inkubace (vazba) odstranění nespecifických složek vzorku smíchání promývání vstup (původní vzorek+ matrice) proceduru lze snadno automatizovat kompatibilita s mikrofluidikou, laboratoř na čipu

37 povrch H detekční elektroda detekce cílová DA nespecifická DA magnetická kulička s hybridizační sondou hybridizace uvolnění cílové DA separace magnet

38 značení a sekven(c)ování DA

39 chemická modifikace DA oxokomplexy osmia

40 -selektivní značení ss konců -detekce abazických míst, nekanonických párů bazí, inzercí..

41 Inkorporace značených nukleotidů pomocí enzymů

42 napojování nukleotidů přes 5 -OH a 3 -OH F. Sanger značené dideoxy: navázání značky podle komplementární báze 2,3 -dideoxynukleotidy: terminátory syntézy DA (není kam napojit další nukleotid)

43 Syntéza DA in vitro ( primer extension ) templát primer Deoxynukleotid trifosfáty (dtp) DA polymeráza syntetizovaný úsek

44 vložení značek do DA pomocí DA polymeráz templát primer ZAČEÉ dtp DA polymeráza

45 -směs normálních deoxy a značených dideoxy -pro každou bázi jiná barva F. Sanger -různě dlouhé produkty, dělení elektroforézou -značka (barva) odpovídá koncové bázi

46 Detekce a identifikace mutací a polymorfismů -důležité pro diagnostiku (určité mutace v určitých pozicích jsou spojeny s určitým onemocněním) -zjišťuje se, jaká (jedna) báze je v konkrétní pozici templát G primer C T A G C T A

47 Značení DA elektroaktivními skupinami mercury and amalgam electrodes 3 1 Os,L (farad) G G* Gox Aox T ox C ox AQ potential/v vs. SCE Fc conjugates [Os (bpy) 3 ] 3+/2+ CA Os,L (cat) nitrophenol carbon electrodes Proč, když je DA sama elektroaktivní? -odlišení řetězců (hybridizace DA: značení sond) -zvýraznění inkorporovaných bazí (monitorování syntézy, SP typing)

48 I [ A] Inkorporace do DA pomocí DA polymeráz, magnetická separace a jednoduchá elektrochemická analýza primer 5 3 template DA polymerase d Fc TP (+dtp) biotin 10 synthesized stretch CATGGGCGGCATGGGAU Fc AU Fc AU Fc AU Fc AU Fc A 8 primer 6 du Fc TP+dATP dutp+datp DB stv 4 2 U Fc G ox du Fc TP+dATP, no polymerase 0 washing heat or aoh measurement Fc label E [V] guanine cizí elektrochemicky aktivní skupina: nový signál

49 Identifikace jednonukleotidových polymorfismů pomocí elektrochemie Os 2+/3+ I/ A 4 2 PhO 2 ACCC GCCC ACCC PhH 2 GCCC 0-2 TCCC TCCC dtp mix: A PhO2 +C PhH2 +U Os +G E/V pomocí jednoduchých levných elektrod (ne drahých sekvenátorů) příslib pro levnou decentralizovanou diagnostiku

50 Enzymové značky: biokatalytická amplifikace signálu

51 obvykle se využívají biotinylované sondy a konjugáty (strept)avidinu s vhodným enzymem tvorba elektroaktivního indikátoru biokatalytická amplifikace: jedna molekula enzymu přemění mnoho molekul substrátu substrát substrát substrát substrát substrát substrát substrát substrát substrát produkt produkt produkt produkt substrát produkt produkt produkt produkt produkt produkt produkt produkt

52 Vícenásobná amplifikace signálu - příklad A hybridizace PEX inkorporace B electrode BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA O P jednorázové tištěné elektrody ALP STV OH ALP STV ALP STV BSA BSA BSA BSA e - tda biotinylated probe PEX-biotinylated DA pomocí PEX se inkorporuje více biotinylovaných nukleotidů na ně se naváže více molekul enzymu vyšší citlivost

53 Monitorování genové exprese I, A plant callus plant callus non-specific amplicon no probe A genomic DA transcription &splicing mra translation protein RA isolation DA isolation total RA total DA RT cda PCR PCR genomic DA PCR RT-PCR PEX B 1.8 RT-PCR gen 1.6 rbcl (expression) : exprimován 1.4 green plant 1.2 pouze 1 v zelených 0.8 rostlinných pletivech callus culture plant-expression callus-expression genomic DA controls PCR plant-gene callus-gene non-compl control no probe C fr rbcl

54 nanoparticle-based detection systems

55 nanoparticle-based detection systems dissolving label in suitable solvent x x x x x x x stripping amplification: each particle contains many molecules (atoms) of the tracer

56

57 Detection in solid state : magnetic attraction of the MB-DA-nanoparticle assembly to the electrode electrode

58

59 DA (protilátky) značené uhlíkovými nanotrubičkami modifikovanými alkalickou fosfatázou

60 Modifikace povrchů elektrod vodivé filmy (+funkční skupiny) nanočástice (Au) uhlíkové nanotrubky (bývaly populárnější) grafenové listy (hit sezóny) zvětšení aktivního povrchu, imobilizace sond zlepšení přenosu elektronů, elektrokatalytické vlastnosti mnoho autorů, mnoho publikací, některé dobré

61 Zdrsněné elektrody z grafitu nebo skelného uhlíku: -amplifikace signálů volných purinových bazí -i další purinové metabolity, které reakci s ionty mědi tak ochotně nedávají

62 výrazné (alespoň dva řády) zvýšení citlivosti pro některé analyty (kyselina močová, dopamin, ale nikoli např. kyselina askorbová) vysoká citlivost bez přídavku mědi není to jen efekt velikosti povrchu!!! selektivně ex situ!

63 kyselina močová XO xantin XO hypoxantin oxypurinol XO alopurinol

64 monitorování enzymových přeměn in vitro analýza moči pacientů

65 Děkuji za pozornost